Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Патогенетическая роль внутриутробных инфекций в формировании и клиническом проявлении врожденных пороков развития и хромосомной патологии

На правах рукописи

Терещенко Ирина Петровна

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ РОЛЬ ВНУТРИУТРОБНЫХ ИНФЕКЦИЙ П ФОРМИРОВАНИИ И КЛИНИЧЕСКОМ ПРОЯВЛЕНИИ ВРОЖДЕННЫХ ПОРОКОВ РАЗВИТИЯ И ХРОМОСОМНОЙ ПАТОЛОГИИ

14.00.16 - патологическая физиология 14.00.10- инфекционные болезни

Автореферат диссертации на соискание учеиои степени кандидата медицинских наук

2 4 МАЙ 2007

Томск- 2007

003060175

Работа выполнена в Новосибирском государственном медицинском университете Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Научные руководители

доктор медицинских наук

Максимова Юлия Владимировна

доктор медицинских наук, профессор

Краснова Елена Игоревна

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор

Уразова Ольга Ивановна

доктор медицинских наук, профессор

Кузнецова Вера Гавриловна

Ведущая организация ГУ Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РЛМН (г Новосибирск)

Защита состоится «_»

2007 года в__часов

на заседании диссертационного совета Д 208 096 01 Сибирского государственного медицинского университета (634050, г Томск, Московский тракт, д 2)

С диссертацией можно ознакомиться в Научно-медицинской библиотеке Сибирского государсгвенного медицинского университет (634050, г Томск, пр Ленина, д 107)

Автореферат разослан < <АЪ> (КиЬтМ 2007 г Ученый секретарь

диссертационного совета ^^Г Суханова Г А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования В последние годы отмечен рост частоты внутриутробных инфекций у новорожденных детей, связанный с неблагоприятной эпидемиологической ситуацией у женщин репродуктивного возраста (Куда-шов НИ и др , 2001) В то же время расширяется спектр изучаемых возбудителей, возрастает их верификация вследствие появления более информативных методов диагностики (бепсау М й а1, 2001) Использование современных методов изменило качество диагностики перинатальных инфекций и раскрыло новые возможности в изучении инфекционной патологии неонатального периода

Частота пороков развития в общей структуре врожденной патологии колеблется в пределах от 21 до 41 %, а показатели младенческой смертности при врожденных аномалиях развития в России составляют 405,7 на 100000 родившихся (Володин Н Н , 2004, Корсунский А А и др , 2005) На этом фоне увеличивается количество детей с хромосомной патологией (Бусуек Г П и др , 2006) Существующая система мониторинга пороков развития учитывает лишь син-дромную структуру перинатальной патологии, не предусматривая расшифровку ее этиологии В связи с этим требуется дальнейшее изучение их частоты, структуры, этиологии, патогенеза и клинических проявлений Известны связь аномалий развития с воздействием инфекционных факторов и данные, свидетельствующие о непосредственном влиянии вирусов на хромосомный аппарат клеток (Казанцев А П , Попова Н И , 1980, Бергман Р Е , Воган В К , 1987)

Решение проблем диагностики внутриутробных (особенно вирусных) инфекций и их профилактики на современном методическом уровне может повлиять на сохранение здоровья будущих поколений (ЕтЫск)п N Б , 2001, Дроздова С Г и др , 2004) Недооценка инфекционной природы заболеваний как ведущей причины патологии искчючает возможность реализовать наиболее эффективный этиотропный принцип лечения (Учайкин В Ф , 2003) Среди внутриутробных инфекций особое место занимает краснуха Проблема врожденной краснухи связана с тератогенным влиянием вируса на развитие эмбриона и плода (Вагшуа!а IЕ , 2004) Сведенья о врожденной краснухе дня большинства территорий России отсутствуют (Ясинский А А и др , 2004) По данным выборочных исследований, в 15 - 65,8 % случаев аномалий развития плод инфицирован вирусом краснухи (Малкова ЕМ и др , 2002)

Использование в диагностике внутриутробных инфекций молекулярно-биологических технологий позволяет глубже изучить тератогенное действие инфекционных агентов, найти методы предупреждения возникновения пороков развития, улучшить результаты их лечения Однако остается определенная неудовлетворенность результатами молекулярно-биолошческой диагностики при исследовании клинических образцов крови/сыворотки крови, мочи, спинномозговой жидкости В ряде случаев использование полимеразной цепной реакции при выраженных клинических проявлениях и отрицательных результатах бактериологического и серологического исследования не позволяет выявить этиологию внутриутробных инфекций В таких случаях можно предположить, что у

плода и новорожденного ребенка инфекционные патогены концентрируются в тканевом компартменте (Цинзерлинг А В , Цинзерлинг В А, 2002)

Увеличение числа аномалий развития связано с недостаточными знаниями

0 механизмах нарушений гистогенеза и воздействии различных факторов, приводящих к их возникновению Остается малоизученным действие микроорганизмов, рассматриваемых как тератогенные биологические факторы в патогенезе возникновения аномалий развития

Цель работы: определить роль внутриутробных инфекций в механизмах формирования врожденных пороков развития и хромосомной патологии, дать клинико-этиологическую и патоморфологическую характеристику внутриутробных инфекций у новорожденных детей с врожденными аномалиями и аутосомными трисомиями Задачи исследования-

1 Выявить роль внутриутробных инфекций в формировании врожденных пороков развития, хромосомной патологии и структуре перинатальных потерь

2 Оценить информативность метода полимеразной цепной реакции для выявления нуклеотидных последовательностей возбудителей внутриутробных инфекций в тканях плодов, мертворожденных и умерших новорожденных детей с врожденными аномалиями и аутосомными трисомиями

3 Провести клинико-этиологическое исследование внутриутробных инфекций у детей с изолированными и множественными пороками развития, хромосомной патологией

4 Установить механизмы формирования патологии органов и систем, связанные с локализацией в тканях возбудителей инфекций (вируса простого герпеса, ци-томегаловируса, вируса краснухи и Toxoplasma gondii)

5 Определить особенности структурных изменений органов плодов, мертворожденных и умерших новорожденных детей со сформированными аномалиями развития и хромосомной патологией на фоне течения внутриутробных инфекций

Научная новизна Впервые проведено комплексное клиническое, молекулярно-биологическое и патоморфологическое исследование у новорожденных детей с изолированными и множественными пороками развития и хромосомной патологией Показано, что в тканевом компартменте (центральной нервной, сердечно-сосудистой, мочевыделительной и пищеварительной системах) возбудители внутриутробных инфекций сохраняются в постнатальном периоде

Получены новые данные об основных патогенетических механизмах, связанных с присутствием инфекционных агентов в тканях плода, усиливающих тератогенное воздействие вирусов Проведенная оценка воспалительной реакции, возникшей в гестационном и постнатальном периодах, показала нарушение созревания и дифференцировки тканей, и активацию склерогенеза Получены данные фундаментального характера о взаимодействии вирусов с тканями плода, приводящих к дисрегуляции процессов эмбриофетогенеза

Впервые представлены новые данные о современных особенностях клинических проявлений врожденной краснушной инфекции

Практическая значимость Диагностика течения внутриутробных инфек-

ций у детей с врожденными аномалиями развития позволяет оценивать их как инфекционных больных и проводить этиотропную терапию, уменьшающую уровень инвалидизации и смертности в данной группе пациентов Определены основные клинико-лабораторные признаки течения внутриутробных инфекций у детей с врожденными аномалиями развития Предложены диагностические критерии внутриутробных инфекций у детей с врожденными пороками развития, основанные на современных методах исследования

Внедрение в практику. Результаты исследования используются в учебном процессе кафедры детских инфекционных болезней ГОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет, внедрены в работу МУЗ Детская городская клиническая больница №4 им В С Гераськова и Детская городская клиническая больница №1 г Новосибирска Положения, выносимые на защиту:

1 Формирование изолированных и множественных пороков развития, хромосомной патологии и прерывание беременности связаны с внутриутробными инфекциями, вызванными вирусами простого герпеса, цитомегалии, краснухи и Toxoplasma gondu

2 Выделение нуклеиновых кислот инфекционных патогенов из тканевых образцов и биологических жидкостей в перинатальном периоде является маркером инфекционного процесса

3 У новорожденных с пороками развития и аутосомными трисомиями инфекции, вызванные вирусами простого герпеса, цитомегалии, краснухи и Toxoplasma gondu проявляются тяжелым клиническим течением заболевания, обусловленным исходом внутриутробно протекающего воспалительного процесса

4 Непосредственное или опосредованное воздействия инфекционных агентов на ткани эмбриона и плода приводят к выраженным структурным изменениям пораженных органов

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и обсуждены на XIII, XIV научно-практических конференциях «Актуальные вопросы современной медицины» (Новосибирск, 2003, 2004), XI международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Ялта-Гурзуф, 2003), научно-практической конференции «Молеку-лярно-биологические технологии в медицинской практике» (Новосибирск, 2003), VI Российском съезде врачей-инфекционистов (С-Петербург, 2003), Третьем конгрессе педиатров-инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии у детей Инфекция и иммунитет» (Москва, 2004), на ежегодной конференции студентов и молодых ученых «Авиценна 2005» (Новосибирск, 2005), Российской научно-практической конференции «Инфекционные болезни проблемы здравоохранения и военной медицины» (С-Петербург, 2006), Всероссийской научно-практической конференции «Этапная реабилитация и профилактика инфекционных заболеваний у детей» (С-Петербург, 2006)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе 6 в центральных рецензируемых журналах

Объем и структура диссертации. Содержание диссертации изложено на 145 страницах машинописного текста Диссертационная работа состоит из вве-

дения, 6 глав, выводов и списка литературы, иллюстрирована 26 таблицами и 50 рисунками Библиография включает 141 отечественный и 219 зарубежных источников

Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан, проанализирован и описан лично автором

ХАРАКТЕРИСТИКА ОБСЛЕДОВАННЫХ БОЛЬНЫХ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Проведены анализ историй болезни, клиническое наблюдение и обследование 116 новорожденных детей, находившихся на лечении в инфекционном отделении патологии новорожденных и недоношенных детей Муниципальной детской клинической больницы № 4 (МДКБ№ 4) и хирургическом отделении Детской городской клинической больницы № 1 (ДГКБ № 1) (г Новосибирск) в 2002 - 2005 годах Практически все дети поступали в отделение в течение первой недели жизни Распределение больных по полу было следующим мальчиков 62 (53,4 %) и девочек 54 (46,6 %)

Проанализированы протоколы патологоанатомического исследования и изучены тканевые фрагменты 78 плодов и новорожденных детей, предоставленные прозектурой ДГКБ №1 Среди них 31 плод с гестационным возрастом 18 -27 недель, 10 мертворожденных детей и 37 детей с ВПР, умерших в неонаталь-ном и раннем младенческом периодах (рис 1)

Во всех 194 случаях использован молекулярно-биологический метод для определения этиологии ВУИ Среди новорожденных детей выделены три группы наблюдения (табл 1) В основу первых двух групп определен принцип распространенности в организме ВПР I группа - изолированные пороки, локализованные в одном органе (92 ребенка), II группа - множественные пороки развития, локализованные в органах двух и более систем (38 детей), III группа - аутосом-ные трисомии (64 человека)

Таблица 1

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКИХ ГРУПП И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Методы исследования Количество наблюдений Всего

I группа II группа III группа

Клинический 49 9 58 116

Патоморфологический 43 29 6 78

Молекулярно-биологический 92 38 64 194

Примечание 1 группа - изолированные пороки развития, 11 группа - множественные ВПР, 111 группа - аутосомные трисомии

В I группу были включены новорожденные со следующими пороками развития с пороками сердца - 36 человек, с пороками развития нервной системы -30 детей, с пороками развития опорно-двигательного аппарата 8 новорожденных, с пороками развития желудочно-кишечного тракта и передней брюшной стенки -8 детей, с пороками почек - 10 человек

Рис 1 Дизайн исследования

Примечание ВПС - врожденные пороки сердца, ОДС - опорно-двигательная система, МПС - мочеполовая система, ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

Во II группу наблюдения включены дети с множественными врожденными пороками развития (МВПР) органов и систем У 9 новорожденных исследовался клинический материал, в 29 случаях проведена диагностика секционного материала В III группу наблюдения вошли дети с аутосомными трисомиями 63 новорожденных с синдромом Дауна и один ребенок с синдромом Патау У всех детей с хромосомной патологией диагноз был подтвержден кариологическим анализом

Среди умерших основная часть больных новорожденных детей умерла в неонатальном периоде (62,2 %), из них 13,5 % новорожденных детей умерло в первые сутки жизни, в раннем неонатальном периоде - 37,8 % В 12 случаях (32,4 %) причиной смерти являлись пороки развития не совместимые с жизнью Среди плодов и умерших больных новорожденных детей было 51,3 % мальчиков и 48,7 % девочек

В проведенном анализе сведений о патологическом влиянии на организм родителей физико-химических факторов, наличия генетических и хромосомных заболеваний не обнаружено ни в одном случае В исследование не включали беременных с тяжелыми экстрагенитальными заболеваниями, эндокринными, аутоиммунными заболеваниями, иммуноконфликтной беременностью, с неблагоприятным воздействием лекарственных препаратов, которые сами по себе могли привести к акушерской патологии, пороку развития, либо затруднить молеку-лярно-биологическое исследование

Клинико-лабораторные методы обследования включали общие анализы крови и мочи, биохимическое исследование крови Инструментальные методы включали проведение рентгенологического и ультразвукового исследования Дети осматривались окулистом, невропатологом, кардиологом, отоларингологом, генетиком, хирургом

Метод молекулярно-биологической диагностики внутриутробных инфекций. Методом ПЦР проведено определение ДНК вируса простого герпеса (ВПГ), цитомегаловируса (ЦМВ), Toxoplasma gondii (Tg), а также возбудителей хламидиоза (Chlamydia trachomatis) РНК вируса краснухи (ВК) определялась методом ОТ-ТТЦР (обратной транскрипции) (Петрова ИД и др , 2000) Для исследования использовались образцы крови (100 мкл) и мочи (0,5 - 1,0 мл) Выделение ДНК из клинических образцов проводилось с помощью фенольного метода

Для ПЦР анализа архивного материала исследовали образцы тканей миокарда, печени, головного и спинного мозга, почек, тонкого кишечника, легких, залитых в парафиновые блоки Площадь исследуемого тканевого фрагмента 2-3 мм2 Получение ДНК инфекционных агентов из секционного материала проводилось после депарафинирования исследуемого образца ксилолом с последующей инкубацией в течение 1,5 часов, при температуре 56°С в буфере (ЮМ NaOH, 5М NaCl, 10% SDS, саркозил, 1ТЕ буфер)

При детекции РНК ВК из архивных образцов, после депарафинирования, фрагмент ткани инкубировался 1 час при температуре 56°С с использованием саркозила и 8М гуанидинхлорида В полученный гомогенат добавляли РНК-носитель Проведение экстракции продолжалось на холоде с использованием смеси, содержащей фенол кислый, хлороформ, изоамиловый спирт Для анализа

ПЦР-амплифицированной ДНК и РНК инфекционных агентов использовалась электрофоретическая детекция в 2% агарозном геле

Обследование выполнялось с письменного согласия родителей пациентов в соответствии с Хельсинской декларацией Всемирной медицинской ассоциации (2004) При постановке ПЦР использовали амплификационные наборы «Вектох-лами-ДНК-ампли-100», «Векто-ЦМВ-ДНК-ампли-100», «Векто-ВПГ-ДНК-ампли-100», «Векто-Рубелла-РНК-ампли-100», «ВектоТоксо-ДНК-ампли-100» Исследования проведены в клинико-диагностической лаборатории ЗАО «Вектор-Бест» (зав лаб - к б н ОН Гришаева)

Методы патолого-гистологического и ультраструктурного исследования. Для световой микроскопии образцы (всего 280) тканей фиксировали в 10 % растворе формалина, обезвоживали по стандартной методике и заливали в парафин Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином, по ван Ги-зону с докраской эластических волокон резорцин-фуксином Вейгерта Просмотр препаратов и микрофотосъемка проводились на световом микроскопе Axiol-magerZl (фирмы Carl Zeiss, Jena, Германия)

Для электронно-микроскопического исследования образцы (всего 90) тканей и пунктатов везикул при герпесвирусной инфекции помещали в раствор 4 % параформальдегида, приготовленном на питательной среде Игла, при температуре 4°С Образцы дофиксировали в 1 % растворе четырехокиси осмия, заливали в смесь эпона и аралдита С блоков, залитых в смесь эпоксидных смол, готовили полутонкие и ультратонкие срезы на ультратоме Ultracut, (фирмы Reichert-Jung, Австрия) Полутонкие срезы окрашивали 1 % раствором азура II Ультратонкие срезы контрастировали спиртовым раствором уранилацетата и цитратом свинца, просматривали в электронном микроскопе Hitachi-600 (Япония)

Иммуногнстохнмнческнй метод Для иммуногистохимических реакций использовали противокраснушную сыворотку с высоким титром IgM и IgG, в качестве положительного контроля брали культуру клеток, зараженную вирусом краснухи генотипа lg После депарафинизации срезы обрабатывали в микроволновой печи при температуре 120° в течение 7 минут, затем - 1,5 % водным раствором перекиси водорода Срезы инкубировали с блокирующей сывороткой Инкубацию срезов с краснушной сывороткой проводили 30 - 60 минут при комнатной температуре во влажной камере Промывали в фосфатном буфере (pH 7,2-7,4) Затем срезы инкубировали с биотинированными антителами (affinity-purified anti-immunoglobulin, panspecific), использовали авидин-биотиновый комплекс фирмы Novocastra Lab Ltd (United Kindom) Продукт реакции выявляли раствором диаминобензидина или VIP (наборы Vector Lab , USA)

Морфологические исследования выполнены в отделе микроскопических исследований, анализа вирусных маркеров и синтеза биологических реагентов (зав - д б н ЕИ Рябчикова) ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Статистическая обработка результатов. Статистическая обработка проведена с использованием программы для расчетов с помощью электронных таблиц Microsoft Excel в среде Windows ХР

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Актуальность и социальная значимость проблем ВУИ и ВПР требует изучения их этиологической структуры в различных группах новорожденных, уточнения степени риска инфицирования и частоты персистениии инфекции В течение последних лет прослеживается тенденция к увеличению доли ВПР среди остальной патологии от 19,4 до 42,8 %

Средний возраст матерей, родивших детей с пороками развития, составил в I группе - 24,4 ±1,1 лет, во Ii группе - 26,95 ± 2,2 лет, в 111 - группе 28,52 ± 1,7 лет (р<0,05) При изучении акушерско-гинекологического анамнеза у женщин выявлены различные воспалительные заболевания репродуктивной системы и органов малого таза (38,1 %) эндометрит, аднексит, периаднексит, сальпингит, сальпингоофорит, цистит, эрозии шейки матки, кольпит, вульвовагинит На контакт с больными манифестными формами острых респираторных вирусных инфекций указали 14,9 % беременных Признаки течения хронической ВМИ выявлены у 92,8 % обследованных женщин Угрозу прерывания беременности и фе-топлацентарную недостаточность диагностировали у 91,8 % человек

Из 194 беременностей 32 (16,5 %) закончились самопроизвольным выкидышем или бы ни прерваны по медицинским и социальным показаниям В двух случаях причиной согласия на прерывание беременности был контакт с больным манифестной формой краснухи. Родоразрешение на сроке 29-31 неделя произошло в 7 случаях, 32-34 недели - в четырех, 35-37 недель - у 13 женщин Средняя масса при рождении составила в I - группе - 2910,13±100,08 г, во II группе - 2762,8±235,8, в III - 3062,8±131,6 (р< 0,05) Несмотря на нарушение адаптации, инфекционный токсикоз, наличие порока развития, дефицит массы тела имели только 50 новорожденных детей (25,8 %)

В состоянии асфиксии извлечено 6 новорожденных, имевших пороки сердца и пороки развития ЦНС В тяжелом состоянии родился 41 ребенок, в основном - это новорожденные с тяжелыми пороками ЦНС и с тяжелыми пороками сердца Общее состояние было расценено как средней степени тяжести у 93 детей (47,9 %), в удовлетворительном состоянии родилось 19 человек (9,8 %)

Общее состояние всех детей уже через 12-24 часа после рождения ухудшалось развивались признаки инфекционного токсикоза, пневмония с дыхательной недостаточностью, изменялись гемодинамических показатели На момент поступления в больницу дети имели признаки интоксикации кожные покровы бледно-серого цвета или с мраморным рисунком, отмечались плохая прибавка массы тела, вялое сосание, синдром рвоты и срыгивания Среди новорожденных с ВПС состояние ухудшалось за счет поражения сердечно-сосудистой системы и развития кардиоваскулярных расстройств

В дальнейшем у детей отмечалось затяжное течение пневмонии с развитием дыхательной недостаточности, изменением гемодинамических показателей, застоем в малом круге кровообращения Объективно отмечались нарушения сердечного ритма (тахикардия, брадикардия, атриовенгрикулярные блокады), расширение границ относительной сердечной тупости, тенденция к артериальной

гнпотензин, пастозность подкожной клетчатки. Внутриутробная пневмония диагностирована у 98,8 % детей. У 59,4 % детей были конъюнктивит и омфалит.

Основными клинико-неврологическим И нарушениями у детей с изолированными пороками нервной системы были различные нарушения сознания, судорожный синдром, глазодвигательные расстройства, бульбарные и псендо-бульбарные парезы, центральные тетрапарезы и параларезы. Неврологические нарушения у детей со спинномозговой грыжей осложнялись течением восходящей инфекции с развитием менингеального синдрома.

Диагноз конъюгационной желтухи был выставлен в 87,4 % случаев. КлЯ-иически отмечалась жезггугиность кожных покровов различной интенсивности. При биохимическом исследовании крови был повышенный уровень непрямого билирубина. У 35 детей - изолированное повышение трансам иназ (АлТ, АсТ). речение фетального гепатита было диагностировано у 21 ребенка, учитывая ге-патомегалню, желтушный синдром, диффузные изменения паренхимы печени по данным ультразвукового исследования, повышенный уровень -Трансаминаз (АлТ, АсТ), гн пербн л и руб и н е м и ю за счет повышения прямой фракции.

Исследование клинического материала у новорожденных детей с пороками развития выявило в 56,8 % случаев наличие РНК ВК (рис, 2). В тканевых образцах плодов, мертворожденных и умерших детей РНК ВК выделялась в 20,5 % наблюдений, причем одинаково равно в группах детей с изолированными и множественными пороками развития.

JDPHK+ ■ РНК - ;

Рис. 2. Выделение РНК вируса краснухи из клинического материала

новорожденных детей с пороками развития и хромосомной патологией.

Обнаружение нуклеотидных последовательностей ПК в клиническом материале и в органах абор1усов и новорожденных детей подтвердило персистенцик» вируса. Длительное присутствие вируса в организме связано с наличием дефектных клеток иммунного ответа, уменьшением продолжительности жизни инфицированных клонов клеток, Ограничивающих экскрецию вируса после их элиминации, а также с селективной иммунной толерантность к белку Е) ВК (O'Shea S. etal., 1992; Mauracher С.Л. et al., 1993).

В тканях плода ВК снижает скорость размножения зараженных клеток, и сроки выживания этих клеток становятся значительно короче по сравнению со сроками выживания незараженных клеток (Аггеуа С.О, е1 а1., 2004). В результате происходит задержка тканевой ди ф ф ерен ц иров к и и развитие гипотрофии плода. ВК помимо подавления митоти ческой активности клеток, способен индуцировать апоптоз (НоАпапп I. е( а!,, 2000). При ультраструктурном исследовании органов детей с врожденной краснухой выраженные апоптотические изменения ядер клеток преобладали в лкмфоидных органах и гепатоцитах.

Сравнивая данные представленные в литературе с результатами собственного Исследования, можно высказать предположение об особенности и своеобразии течения клиники краснушной инфекции на современном этапе (рис, 3), В целом,, клиническое течение заболевания соответствовало генерализованной форме ВУИ, но не имело каких-либо специфических признаков, позволяющих диагностировать врожденную краснуху без использования современных методов исследования. В первую очередь, следует отметить увеличение частоты поражения центральной нервной системы и формирования ВИС, а также пороков опорно-двигательного аппарата. Мри этом не отмечено изменений гемограмм и появления экзантемы. Намного реже встречаются поражения глаз. В то же время в не-онагальном периоде трудно судить о поражении органов слуха и прогнозировать умственное развитие детей.

вич Л.Л. ц соавт., 1992; 3 - собственные данные.

Синдром Дауна (СД) является наиболее частой не летальной аномалией (Bell R et al, 2003) Популяционная частота СД составляет 1,32 1000 - 2 1000 Частота синдрома Патау (синдром трисомии 13) с учетом мергворождений составляет примерно 1 случай на 6000 (Лазюк Г И , 1979) С помощью молекуляр-но-биологических методов исследования крови и тканевых образцов детей с хромосомной патологией в 56,3 % наблюдений детектирована РНК ВК ДНК-содержащие вирусы выделены в 12,5 % случаев преимущественно в аутопсий-ном материале Наличие или отсутствие маркеров и клиники ВУИ не зависело от цитогенетической формы СД С ВУИ могут быть связаны изменения популяци-онной частоты СД Известно, что во времени она носит периодический характер, обусловленный многофакторностью причин его возникновения (Гинзбург Б Г , 1998, 2000) Предполагается, что цикличность возникновения СД в популяции может совпадать со вспышками вирусных заболеваний

На втором этапе выхаживания состояние 93,9 % детей с СД и положительными результатами ПЦР оценивалось как тяжелое или очень тяжелое Признаки типичного фенотипа СД сочетались с ВПС у 31 ребенка (93,9 %) Именно поражение сердечно-сосудистой системы и развитие недостаточности кровообращения обусловливало тяжесть состояния У больных СД поражение сердечнососудистой системы является наиболее частой и специфической аномалией и встречается в 40 % случаев (Sandri С et al, 2004) Среди ВПС преобладали атри-альные септальные дефекты (54,6 %) (дефекты межпредсердной перегородки и открытое овальное окно) и атриовентрикулярные септальные дефекты (21,2 %) (атрио-вентрикулярная коммуникация, дефект межпредсердной перегородки в сочетании с дефектом межжелудочковой перегородки), что соответствует литературным данным (Bell R et al, 2003)

Присутствие дополнительных пороков значительно увеличивало тяжесть состояния детей и риск неблагоприятного исхода В сочетании с ВПС выявлены атрезия прямой кишки (3,0 %), мембрана двенадцатиперстной кишки (3,0 %), синдактилия (3,0 %), микроцефалия (3,0 %), гидронефроз (6,1 %), атрезия хоан (3,0 %) В процессе наблюдения у всех детей с положительными результатами ПЦР отмечено течение сопутствующих заболеваний пневмонии (100 %), конъюнктивита (63,9 %), омфалита (36,1 %), везикулопустулеза (8,3 %)

При морфологическом исследовании и постановке иммуногистохимиче-ской реакции у детей с СД локализация краснушного антигена выявлена в цитоплазме нейронов головного мозга гранулы хромогена располагались вдоль внутренней поверхности цитоплазматической мембраны или в виде небольших скоплений на одном из полюсов цитоплазмы, находились в структуре стенок сосудов В тимусе выяваена инверсия слоев, опустошение мозгового и коркового вещества Выражен полиморфизм телец Гассаля, их количество увеличено и превышает 20-30 в одной дольке Преобладали тельца Гассаля незрелого типа с сохранившимися лимфоидными клетками В тимусе краснушный антиген выявлен в структуре отдельных тимических телец, а также в цитоплазме интердигитатных и эпителиальных медуллярных клеток В печени отмечена дископлексация печеночных балок, жировая дистрофия гепатоцитов, холестаз, умеренная лимфоци-тарная инфильтрация паренхимы, полнокровие, фиброз и крупные очаги лимфо-

цитарной инфильтрации в области ворот, интенсивная мононуклеарная инфильтрация на границе с паренхимой печени В печени небольшое количество крас-нушного антигена находилось в цитоплазме гепатоцитов

Детекция ДНК ВПГ, ЦМВ иТ§ в исследованных тканевых фра1 ментах 78 плодов и новорожденных детей с ВПР различных ор1 анов и систем предполагала как течение ВУИ, так и формирование ВПР, зависящее от инфицированносги плода Высокая частота распространенности данных патогенов в популяции, наличие латентного носительства и субклинического течения заболевания у женщин не позволили диагностировать инфекционный процесс в периоде беременности Положительные результаты ПЦР получены у умерших детей в 67 случаях (85,9 %) Отрицательные результаты ПЦР отмечены в 11 случаях (14,1 %) В 14 наблюдениях (17,9%) обнаружена ДНК ЦМВ В 10 случаях (12,8 %) ДНК ВПГ у 8 детей ВПГ 1 типа, у 1 ребенка - ВПГ 1 и 2 типа и в 1 случае ВПГ 2 типа В 6 наблюдениях (7,7 %) выделялась ДНК Tg

В 37 (47,4 %) случаях был найден нуклеиновый материал одновременно нескольких возбудителей Наиболее часто встречалось сочетание ВПГ и ЦМВ -в 19 наблюдениях (24,4 %), сочетание ВПГ и Tg - в 9 случаях (11,5 %), Tg и ЦМВ инфекции - в двух наблюдениях (2,6 %) В 7 случаях (8,97 %) обнаружена ДНК и ВПГ, и цитомегаповируса, и Tg Таким образом, подтверждена высокая степень тератогенноеги ВПГ, ЦМВ и Tg Возникновение врожденных аномалий при микст-инфекции в 47,4 % случаев предполагало усложнение механизма формирования порока за счет повышения антигенною воздействия

Среди плодов 18-27 недель гестации положительный результат получен в 29 наблюдениях (93,5 %) ДНК ЦМВ выделена в 8 случаях (25,8 %), ДНК Tg - в 4 (12,9 %), ДНК ВПГ - в 2 наблюдениях (6,5 %) Нуклеиновый материал одновременно двух возбудителей определялся в 11 случаях (35,5 %), одновременно трех возбудителей - в 4 (12,9 %) наблюдениях Практически в половине случаев (48,9 %) отмечалась микст-инфекция Наиболее часто у плодов поражались нервная (38,7 %) и мочеполовая система (19,4 %), в 19,4 % случаев выявлены МВГ1Р

У мертворожденных детей из 8 положительных результатов (80,0 %) ДНК ВПГ определялась у двоих детей, у одного ребенка выделена ДНК ЦМВ, у одного - ДНК Tg В четырех случаях у мертворожденных детей найдены сочетания ДНК ВПГ и ЦМВ (2 ребенка), а также ВПГ и Tg (2 ребенка) Преобладали нарушения формирования мочеполовой системы, а также развитие МВГ1Р Указанная, как основная причина смерти мертворожденных детей, анте- и интранатальная асфиксия являлась симптомокомплексом, отражающим течение ВУИ

Среди детей, умерших в неонатальном и раннем младенческом периодах, положительные результаты ПЦР получены у 30 (81,1 %) В 18 наблюдениях обнаружены различные сочетания возбудителей ДНК ВПГ и ЦМВ у 12 детей (32,4 %), ДНК ВПГ и Tg - у 3 (8,1 5%), ДНК одновременно трех возбудителей обнаружена у трех младенцев Наиболее часто (43,2 %) причиной смерти являлись МВПР, второе по частоте место занимали ВПС (32,4 %)

ДНК ЦМВ и ВПГ чаще выделялась из ткани печени и головного мозга, реже из ткани миокарда и легких ДНК Тц преимущественно определялась в образцах печени, реже в миокарде, головном мозге и других органах Детекция нук-

леогидных последовательностей инфекционных патогенов из тканей аномально развитых органов выявило ведущую роль инфекционного процесса в формировании ВПР При свегооптическом исследовании показаны воспалительные изменения исследуемых органов (течение гепатита с исходом в цирроз, вялотекущие энцефалиты, фиброэластоз миокарда, пневмонии), ультраструктурное исследование обнаружило наличие вирусов в пораженных органах

У детей с аномалиями развития желудочно-кишечного тракта, выявлены дисплазия и дистрофия эпителия, гетеротопия и изменения структуры ганглио-нарных образований Эпителий характеризовался полиморфизмом, прослеживались участки с цилиндрическим, кубическим и многослойным эпителием Основным патологическим процессом явилось воспаление на фоне атрофически-склеротического процесса, сопровождавшееся отеком, нарушениями микроциркуляции и воспалительно-клеточной инфильтрацией

Состояние респираторной ткани отличалось гетерогенностью В просветах альвеол встречались десквамированные альвеолоциты с выраженными дистрофическими изменениями цитоплазмы, макрофаги и лимфоциты, их количество значительно увеличивалось при развитии пневмонии Наличие лейкоцитов в просветах альвеол характерно для всех наблюдений и соответствовало присоединившейся или развившейся внутриутробной пневмонии Выявленные метаплазия и гиперплазия эпителия бронхов, длительно существующий ателектаз, интраальвеолярный и интерстициальный отек, склероз межальвеолярных перегородок, деэндотелизация и мускуларизация сосудов системы легочной артерии свидетельствовали о развитии бронхолегочной дисплазии, связанной с инфекциями перинатального периода

Присутствие в тканях нуклеотидных последовательностей инфекционных агентов может рассматриваться как проявление инфекционного процесса Продолжающееся влияние инфекционного агента на ребенка и после родов усугубляет тяжесть уже имеющейся врожденной патологии

В основе межклеточных влияний у эмбриона лежит интеграция белков в группах клеток и формирование объединений более сложного порядка Экзогенные факторы, воздействующие на эмбрион, а также эндогенные воздействия, определяющиеся состоянием гомеостаза организма матери, могут вмешиваться во взаимодействия клеток, нарушая нормальный процесс эмбриогенеза Особое влияние на эмбриофетогенез оказывают вирусные инфекции, которые выступают в роли внешних поражающих факторов (при течении острой инфекции или при восходящем инфицировании), и воздействуют на плод изменениями в репродуктивной системе женщины, снижением иммунологических резервов

Вирусемия и бактериемия при течении пренатального инфекционного процесса, кроме непосредственного воздействия на плод после адсорбции возбудителей на эпителии плодных оболочек и контаминации околоплодных вод, вызывают сложный комплекс патологических процессов в организме беременной женщины, исходом которых является гипоксия, приводящая к инициации целого ряда процессов и появлению факторов, негативно воздействующих на клетку и индуцирующих апоптоз

В качестве индукторов апоптоза выступают вирусы, а так же белковые и

окислительные продукты поврежденной вирусом клетки Нарушающийся процесс апоптоза приводит к повреждениям структур эмбриона, а изменения на тканевом уровне исключают возможность полноценного функционирования органа в постнатальном периоде Таким образом, через механизм апоптотической реакции проявляется опосредованное действие инфекции на формирование аномалий развитая Увеличенное количество ядер с морфологическими признаками апоптоза характеризовало его дисрегуляцию Ультраструктурный анализ выявил большое число апоптозных клеток в лимфоидных и других органах

В фетальном периоде при инфицировании и заболевании плода наблюдаются дистрофические и некробиотические процессы, а также нарушения кровообращения, усугубляющие течение гипоксии и поддерживающие персистенцию инфекционных агентов Полиорганность поражения плода определяется существованием хронической инфекции Нарушая процесс морфогенеза, инфекционный агент способен сохраняться в организме плода и поддерживать течение инфекции, что при онтогенетическом развитии полноценного воспалительного ответа приведет в постнатальном периоде к формированию аномалий

Морфологически нарушения развития плода выражались в ряде основных процессов задержке роста, формировании гипоплазии или гиперплазии отдельных тканей, органов и систем Выявленные нами в аномально развитых органах признаки дисплазии и гипертрофии эпителия, наличие интенсивного склерозирования паренхиматозных тканей и слизистых оболочек представляет собой процесс дисрегенерации соединительной ткани вследствие пренатального воспаления Ответная реакция плода на любое повреждение, включая инфекцию, стереотипна, и определяется этапом онтогенеза, состоянием механизмов реализации воспаления, неспецифической иммунологической реактивности, способностью к специфическому иммунному и тканевому ответу Известно, что воспалительная реакция в развернутом виде невозможна на ранних этапах эмбриогенеза (рис 4) В тканях умерших детей выявлены вирусные частицы или их нуклеотидные последовательности и воспалительная реакция могла развиться в любые сроки при неблагоприятных условиях, вызвав течение воспаления на фоне сформированного ВПР В вилочковой железе у ребенка с СД был обнаружен антиген ВК, что предполагало повреждение вирусом дендритных клеток и развитие иммуноде-фицитного состояния ВК найден и в тканях спинного мозга у больного с синдромом Верднига-Гохмана, прослежено влияние вируса на процесс деструкции миелиновых волокон В целом, формирование ВПР можно рассматривать как исход инфекционного процесса, морфологическим субстратом которого являются признаки воспаления или его последствий

Таким образом, развитие инфекции у беременных женщин может сопровождаться следующими исходами гибелью эмбриона или плода, преждевременным прерыванием беременности, мертворождением, развитием ВУИ или эрадикацией инфекции (рис 5) При развитии ВУИ возбудители вызывают патологические изменения, которые проявляются в виде прямого цитопатического воздействия и деструкции клеток, воспаления, дисрегуляции апоптоза и, в конечном итоге, нарушения резорбции провизорных органов и процессов их формирования В результате этого возникают ВПР Однако

пластичность системы мать-плацента-плод оставляет вероятность течения ВУИ без развития аномалий Наличие инфекционных патогенов в тканях способствует их прогрессивной альтерации Исходом данных процессов может быть течение ВУИ, гибель новорожденного ребенка, а также формирование аномальных структур уже в постнаталыюм периоде

Рис 4 Механизм формирования пороков развития на фоне течения воспалительной реакции во внутриутробном периоде

Обследование беременных женщин на наличие цитомегаловирусной инфекции, герпеса и токсоплазмоза (напряженность иммунитета, сероконверсия), вакцинация против краснухи, а также грамотный подход к планированию беременности, методам обследования беременной женщины, антенатальная, прена-тальная диагностика (комплексные диагностические мероприятия) могут снизить рождение детей с ВИР Кроме того, проведение соответствующих профилактических мер уменьшит число детей с СВК, являющихся резервуаром инфекции (выделяющих вирус в течение 1-3 лет), и позволит, в общем, снизить заболеваемость краснухой, далее прогнозировать ситуацию, и, в конечном счете, подойти к ликвидации данной инфекции

Инфекция у матери

Рис 5 Схема формирования пороков развития при внутриутробных инфекциях

ВЫВОДЫ

1 Врожденные пороки развития и хромосомная патология у детей связаны с внутриутробными инфекциями, возбудители которых (вирус простого герпеса, цитомегаловирус, вирус краснухи и Toxoplasma gondii) способны к длительному сохранению в пораженных органах Выделение нуклеотидных последовательностей вирусов простого герпеса, цитомегалии, краснухи и Toxoplasma gondii из тканей 93,5% плодов подтверждает их роль в прерывании беременности

2 Использование метода полимеразной цепной реакции при исследовании тканей плодов, мертворожденных и умерших детей с пороками развития и аутосом-ными трисомиями позволил в 88,5% случаев определить локализацию возбудителей инфекций гестационного периода

3 В структуре внутриутробных инфекций, вызванных вирусом простого герпеса, цитомегаловирусом, вирусом краснухи и Toxoplasma gondii, у новорожденных детей с аномалиями развития и хромосомной патологией преобладает врожденная краснуха (56,8%) Внутриутробные инфекции у детей с пороками развития и новорожденных с хромосомной патологией характеризуются признаками воспалительных заболеваний в постнатальном периоде

4 В основе формирования врожденных аномалий развития выявлены прямое ци-топатическое действие, альтеративно-продуктивное воспаление, изменение процесса апоптоза, обусловленные нахождением инфекционных патогенов в тканях плода и приводящие к нарушению резорбции провизорных органов и процессов формообразования

5 У абортированных плодов, мертворожденных и умерших детей с врожденными пороками развития и ауюсомными трисомиями течение воспалительного процесса сопровождается развитием деструктивных, дистрофических, диспла-стических и гипертрофических изменений, склерозом и нарушением кровообращения в аномально развитых органах

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 У новорожденных детей с врожденными пороками развития и хромосомной патологией необходимо проводить обследование для обнаружения и определения локализации маркеров инфекций (вирусов простого герпеса 1 и 2 типов, цитомегало-вируса, вируса краснухи и Toxoplasma gondii)

2 В первые дни после рождения ребенка с пороками развития или с хромосомной патологией для детекции инфекционных патогенов необходимо использовать метод полимеразной цепной реакции и иммуногистохимическое исследование

3 При положительном результате полимеразной цепной реакции показана кроме корригирующей, противовирусная и/или антибактериальная терапия с учетом выделенных возбудителей

4 Рождение ребенка с пороками развития и хромосомной патологией требует обследования женщины с использованием полимеразной цепной реакции и иммуно-ферментного анализа для выявления этиологии хронических вирусных инфекций и проведения соответствующей коррекции с целью планирования последующих беременностей

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 ПЦР-диагностика микст-инфекций у новорожденных детей /ЕМ Майкова, О Н. Гришаева, М П Гришаев и др // Генодиагностика в современной медицине -Москва, 2000 - С 16-17

2 Стереоморфометрическое исследование респираторной ткани легких у недоношенных детей при синдроме дыхательных расстройств /ЕМ Малкова, П И Коломейцев, П В Терещенко и др // Новые методы диагностики, лечения заболеваний и управления в медицине - Новосибирск, 2000 - С 154-155

3 Изучение роли краснухи при врожденных пороках развития /ЕМ Малкова, О Н Гришаева, И Я Извекова и др // Актуальные вопросы современной медицины - Новосибирск, 2003 — С 83-84

4 Комплексная лабораторная диагностика краснухи / МП Гришаев, М А Смердова, О Н Гришаева и др // Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии Материалы XI международной конференции — Ялта-Гурзуф, 2003 - С 262-263

5 Современные проблемы диагностики краснухи /ЕМ Малкова, М П Гришаев, М А Смердова и др // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике - Новосибирск, 2003 - С 182-196

6 Влияние вируса краснухи на возникновение врожденных пороков развития / Е М Малкова, О Н Гришаева, И Я Извекова и др // VI Российский съезд врачей-инфекционистов - Санкт-Петербург, 2003 - С 229

7 Значение молекулярно-биологической диагностики вирусных инфекций у детей с врожденными пороками развития / К Е Скляр, Е М Малкова, И П Терещенко и др // Актуальные вопросы современной медицины — Новосибирск, 2004 - С 1У-9

8 Изучение роли вируса краснухи в формировании врожденных пороков развития методом РТ-ПЦР /ЕМ Малкова, И П Терещенко, О Н Гришаева и др // Детские инфекции -2004 -№3 -С 5-8

9 Редкие варианты клинических форм хламидийной инфекции у новорожденных /ЕМ Малкова, О Н Гришаева, Г Д Корабельщиков и др // Детские инфекции - 2004 - № 4 - С 74-76

10 Определение взаимосвязи внутриутробных инфекций и врожденных пороков развития по результатам исследования секционного материала / И П Терещенко, Е М Малкова, Е И Краснова и др // Актуальные вопросы инфекционной патологии у детей (инфекция и иммунитет) - Москва, 2004 - С 222-223

11 Терещенко И П Определение взаимосвязи внутриутробных инфекций и врожденных пороков развития по результатам исследования секционного материала / И П Терещенко // Материалы ежегодной конференции студентов и молодых ученых «Авиценна2005»-Новосибирск, 2005 -С 151

12 Роль внутриутробных инфекций в механизмах формирования врожденных пороков развития/ К Е Скляр, Е М Малкова, Н В Рязанцева и др // Бюллетень сибирской медицины - 2005 - № 1 - С 80-84

13 Детекция нуклеиновых кислот инфекционных патогенов в тканях детей с врожденными пороками развития /ЕМ Малкова, И П Терещенко, О Н Гришае-

ва и др // Инфекционные болезни проблемы здравоохранения и военной медицины - С-Петербург , 2006 - С 202-203

14 Выделение ДНК Toxoplasma gondii в тканевых образцах у детей с пороками развития / И П Терещенко, Е М Малкова, О Н Гришаева и др // Инфекционные болезни проблемы здравоохранения и военной медицины - С-Г1етербург , 2006 -С 286-287

15 Диагностика внутриутробных инфекций с использованием полимеразной цепной реакции у детей с врожденными пороками развития и хромосомной патологией / И П Терещенко, Е М Малкова, О Н Гришаева и др // Этапная реабилитация и профилактика инфекционных заболеваний у детей - С-Петербург,

2006 - С 69

16 Механизмы формирования врожденных аномалий развития при внутриутробных инфекциях /ЕМ Малкова, К Е Скляр, О Н Гришаева и др // Детская хирургия - 2006 - №4 - С 25-27

17 Врожденная краснуха у ребенка с болезнью Дауна / ЕМ Малкова, И П Терещенко, О Н Гришаева и др // Детские инфекции - 2006 - №3 - С 7476

18 Обнаружение ДНК возбудителей внутриутробных инфекций в тканях детей с врожденными пороками развития / И П Терещенко, Е М Малкова, О Н Гришаева и др // Инфекционные болезни - 2006 - № 3 - С 30-34

19 Обнаружение маркеров внутриутробных инфекций у детей с синдромом Дауна / Е М Малкова, И П Терещенко, И Д Петрова и др // Детские инфекции -

2007 - №1 -С 42-45

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВПГ- вирус простого герпеса ВПР - врожденные пороки развития ВПС - врожденный порок сердца ВК - вирус краснухи ВУИ - внутриутробные инфекции ДНК - дезоксирибонуютеиновая кислота ЖКТ - желудочно-кишечный тракт МПС — мочеполовая система

МВПР - множественные врожденные пороки развития

ОДС - опорно-двигательная система

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК — рибонуклеиновая кислота

СД - синдром Дауна

СВК - синдром врожденной краснухи

ЦМВ — цитомегаловирус

ЦНС - центральная нервная система

Tg - Toxoplasma gondii

Отпечатано в типографии Новосибирского государственного технического университета 630092, г Новосибирск, пр К Маркса, 20, тел /факс (383) 346-08-57 формат 60x84/16, объем 1,5 п л , тираж 100 экз , заказ Д подписано в печать 27 04 07 г