Автореферат и диссертация по медицине (14.00.10) на тему:Патогенетическая характеристика метаболизма железа у больных хроническим гепатитом С

На правах рукописи

КОЗЛОВ Константин Вадимович

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТАБОЛИЗМА ЖЕЛЕЗА У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ГЕПАТИТОМ С

14.00.10 — инфекционные болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ОО^'ю I—

Санкт-Петербург - 2009

003467525

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ

Научный руководитель:

доктор медицинских наук профессор ЖДАНОВ Константин Валерьевич Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор АНТОНОВА Тамара Васильевна доктор медицинских наук профессор ЯКОВЛЕВ Алексей Авенирович

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится 18 мая 2009 года в 10 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 215.002.01 при ФГОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ (194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 6)

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГОУ ВПО «Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова» МО РФ

Автореферат разослан «Ь » апреля 2009 года

Ученый секретарь совета доктор медицинских наук профессор

пономм

Николаевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В настоящее время в мире проживает не менее 170 млн. человек, инфицированных вирусом гепатита С (ВГС), что составляет около 3% населения планеты, Поэтому IICV-инфекция представляет собой глобальную медико-социальную проблему, которая обусловлена стабильным уровнем заболеваемости и высокими затратами на диагностический и лечебный процессы [Яковлев А.А., 2002; Шахгильдян И.В. и соавт., 2003; Лобзин Ю.В. и соавт., 2006; Deugcnier Y et al., 2007].

Особенностью гепатита С (ГС) является его скрытое бессимптомное течение, что имеет существенное как эпидемиологическое, так и клиническое значение. К основным путям заражения ВГС относятся различные парентеральные вмешательства (внутривенное употребление наркотиков, переливания крови и её препаратов, татуаж, пирсинг, оперативные вмешательства, инвазивные процедуры, а также. профессиональное инфицирование медицинского персонала). В то же время значение естественных путей передачи (половой, вертикальный) при HCV-инфекции значительно ниже [Балаян М.С., 1999; Антонова Т.В., 2002; Рахманова А.Г. и соавт., 2003; Souza R.M., 2006]. Персистенция ВГС длится многие годы по типу медленной инфекции и представляет собой последовательность следующих клинических форм: острый гепатит, хронический гепатит (стадии отсутствия фиброза, слабого, умеренного и тяжелого фиброза, цирроза), печеночно-клеточная карцинома [Соринсон С.Н., 1999; Жданов К.В., 2000; Сологуб Т.В., 2002; Napoli J. et al, 1996; Poynard T. et al., 2004].

Инфекционный процесс, инициируемый вирусом ГС, в отличие от такового при вирусном гепатите В, сопровождается характерными изменениями в обмене железа, что проявляется сдвигом метаболизма этого микроэлемента в сторону перегрузки [Никитин И.Г. и соавт., 2000; Arber N. et al., 1994; Poynard T. et al., 1996; Sartori M. et al., 1998; Deugenier Y, et al., 2007]. Для всех живых организмов железо является фундаментальным микроэлементом. Железо -важнейший кофактор для энзимов в митохондриальной дыхательной цепи, в цитратном цикле, в синтезе ДНК, играет центральную роль в связывании и транспорте кислорода гемоглобином и миоглобином; железосодержащие белки необходимы для метаболизма коллагена, тирозина и катехоламинов [Румянцев А.Г. и соавт., 2004; Andrews N.C., 2000].

Наблюдаемые многими авторами изменения в метаболизме железа при хроническом гепатите С (ХГС) рассматриваются как неблагоприятные для течения и прогноза заболевания, а также эффективности противовирусной терапии [Кулагина Е.А., 2001; Arber N. et al., 1995; Fargion S. et al., 1997; Kageyama F. et al., 1998; Shiratori Y et al., 2000; Distante S. et al., 2002]. Однако в недавних экспериментальных работах было описано ингибирующее влияние железа на репликацию вируса ГС в культуре ткани человеческой гепатомы (Huh 7) [Fillebecn С. et al., 2005, 2007].

Как показал анализ опубликованных результатов многочисленных исследований, посвященных изменению метаболизма железа при HCV-инфекции, выводы по данной проблеме во многом противоречивы. Нет единого

мнения о причинах наблюдаемой «перегрузки железом», о влиянии вируса гепатита С на его обмен и наоборот. Неоднозначно оцениваются показатели, отражающие метаболизм этого микроэлемента с диагностической и прогностической сторон.

Все вышеизложенное и предопределило цель и задачи настоящего диссертационного исследования.

Цель исследования. На основании комплексного клинико-лабораторного, морфологического, вирусологического и генетического обследования дать патогенетическую характеристику метаболизма железа у больных хроническим гепатитом С.

Задачи исследования

1. Проанализировать изменения основных биохимических показателей, характеризующих метаболизм железа, на разных стадиях заболевания и в зависимости от активности воспаления в ткани печени, а также установить их взаимосвязи с основными клинйко-лабораторными показателями у больных хроническим гепатитом С.

2. Изучить распределение железа в ткани печени в зависимости от выраженности фиброза, некровоспалитеяьной активности и выявить корреляции с основными клинико-лабораторными показателями, связанными с изменением метаболизма микроэлемента при НСУ- инфекции.

3. Выявить взаимосвязь между носительством мутантных аллелей гена наследственного гемохроматоза С282У и НбЗО и изменениями в метаболизме железа у больных хроническим гепатитом С.

4. Оценить динамику показателей, отражающих метаболизм железа, на фоне противовирусной терапии хронического гепагита С.

Научная новизна исследования. Выявлены взаимосвязи между основными клинико-лабораторными, морфологическими и генетическими показателями, характеризующими метаболизм железа, и параметрами, отражающими течение хронического гепатита С. Показано, что повышение уровня железа сыворотки крови представляет собой компенсаторно-приспособительную реакцию организма человека на НСУ инфекцию, особенно на ее ранних стадиях.

Обнаружено, что железо в ткани печени больных ХГС в отличие от больных гемохроматозом выявляется преимущественно в клетках Купфера и нарастает с увеличением стадии заболевания и степени воспаления печеночной ткани. При этом обнаружение железа методом Перлса в макрофагах печени и, особенно, в клетках воспалительного инфильтрата соотносится с лабораторными сдвигами, характеризующими перегрузку железом. В то время как выявление гранул микроэлемента в печеночных' клетках статистически значимо не отражает биохимических изменений в обмене железа.

Установлено, что наличие изученных мутантных аллелей гена наследственного гемохроматоза не взаимосвязано с уровнями сывороточных железа и ферритина и не соотносится с некровоспалительной активностью и стадией заболевания.

Продемонстрировано, что терапия пегилированным интерферононом а2-а и рибавирином сопровождается снижением содержания сывороточных железа, трансферрина, ферритина, гаптоглобина и церулоплазмина независимо от ответа на лечение. При этом устойчивый вирусологический ответ (УВО) прямо коррелирует с более высокими уровнями железа и церулоплазмина сыворотки крови до терапии, на ее фоне и в процессе наблюдения.

Практическая значимость. Определение в крови содержания сывороточных железа, , ферритина, трансферрина, гаптоглобина, церулоплазмина, общей железо-связывающей способности сыворотки (ОЖСС), коэффициента насыщения трансферрина (КНТ) железом, тестирование на носительство мутантных аллелей гена наследственного гемохроматоза С282У и НбЗВ может использоваться для неинвазивной оценки степени активности и стадии патологического процесса у больных ХГС.

Показано, что при проведении морфологического исследования гепатобиоптатов пациентов с ХГС целесообразно выполнять окраску по методу Перлса с целью выявления железа как фактора, усиливающего фиброз ц воспалительную активность в ткани печени.

На основании многофакторного диекриминантного анализа разработаны информативные и. статистически значимые математические модели, позволяющие без проведения пункционной биопсии печени выявлять пациентов с минимальной активностью воспаления (ИГА<3 балла) и ранними стадиями фиброза, которым комбинированная противовирусная терапия может быть отсрочена.

Личное участие автора в получении результатов. Автор ом проведен сравнительный анализ и выполнено исследование взаимосвязей основных клинико-лабораторных, морфологических и генетических параметров, характеризующих метаболизм железа на различных стадиях ХГС и этапах мониторинга противовирусной терапии, разработана математическая модель для выявления группы пациентов, которой комбинированная противовирусная терапия может быть отсрочена.

Автор осуществлял планирование исследования, принимал непосредственное участие в клиническом обследовании больных, организовывал проведение всех лабораторно-инструментальных и гистологических исследований, самостоятельно выполнял нункционкые биопсии печени. Автором лично сформирована база данных, проводилась статистическая обработка и обобщение полученных результатов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Наблюдаемые изменения в метаболизме железа на ранних стадиях НСУ-инфекции характеризуют компенсаторно-приспособительную реакцию организма человека, а на поздних стадиях - иммуноопосредованное повреждение гепатоцитов.

2. Мутантные аллели гена наследственного гемохроматоза С282У и НбЗО не являются основной причиной развития изменений в метаболизме железа у больных хроническим гепатитом С.

3. Современная противовирусная терапия хронического гепатита С

более эффективна при сдвиге метаболизма железа в сторону перегрузки.

Реализация и внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в научную, учебную, лечебно-диагностическую работу кафедры и клиники инфекционных болезней ВМедА им. С.М. Кирова.

Апробация и публикация материалов исследования. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Российской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» (Санкт-Петербург, 2004); Всероссийской научной конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные вопросы инфекционной патологии» (Санкт-Петербург, 2005, 2008); Российской научно-практической конференции, посвященной 110-летию кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова (Санкт-Петербург, 2006); VII Российском Съезде инфекционистов (Н.Новгород, 2006); Юбилейной - Российской научной конференции с международным участием, посвященной 175-летию со дня рождения С.П. Боткина (Санкт-Петербург, 2006); на 12 и 13 Российской конференции «Гепатология сегодня» (Москва, 2007, 2008); симпозиуме гепатологов Беларуси (Витебск, 2008).

По материалам • исследования опубликовано 12 печатных работ, в том числе 1 сгатья в реферируемом журнале.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 133 страницах компьютерного набора, состоит из введения, 5 глав (обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трёх глав результатов собственных исследований), заключения, выводов и практических рекомендаций. Указатель литературы включает 162 источника, 6 том числе 31 отечественные и 131зарубежные. Текст содержит 33 таблицы, 4 формулы, 15 рисунков и 1 клинический пример.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования. Под наблюдением находилось 111 больных ХГС (анти-HCV «+», РНК HCV «+») на различных стадиях заболевания в возрасте от 18 до 59 лет, в среднем 33±1,5 года. Большинство обследованных являлись лицами мужского пола - 84 человека (75,7%), женщины составили 27 человек (24,3%).

Все больные поступали в клинику инфекционных болезней для углубленного обследования в связи с обнаружением в крови антител к ВГС. В подавляющем большинстве случаев сывороточные маркеры HCV-инфекции выявлялись случайно при плановом обследовании по поводу каких-либо других заболеваний, участии в донорстве или диспансеризации. Все обследованные лица отрицали перенесенный ранее вирусный гепатит и считали себя «практически здоровыми». Диагноз ХГС, включая и стадию компенсированного цирроза печени, устанавливался при обследовании впервые.

Необходимо отметить, что лица с острым ГС и больные на стадиях суб- и декоМпенсированного цирроза печени, а также наркозависимые и употребляющие алкоголь пациенты в исследование не включались.

Распределение больных по стадии HCV-инфекции проводилось на

основании оценки выраженности фиброза в гепатобиоптате в соответствии со стандартизированной системой «МЕТАУШ» (Т1 - слабый (портальный) фиброз - 40 человек (36%), Р2 - умеренный (с порто-портальными септами) - 37 человек (33,3%), БЗ - тяжелый (с порто-центральными септами) - 25 человек (22,5%) и Р4 - цирроз - 9 человек (8,2%)).

Комплексное обследование включало в себя клинический осмотр больного по органам и системам, общие клинические анализы крови и мочи, биохимическое исследование крози, в том числе показателей, характеризующих метаболизм железа (сывороточные железо, трансферрин, ферритин, гаптоглобин, ОЖСС, КНТ железом), исследование крови на специфические маркеры вирусных гепатитов в ИФА, молекулярно-биологические исследования крови с использованием ПЦР для оценки качественного и количественного содержания РНК ВГС и его генотипирования, а так же определения мутантных аллелей гена наследственного гемохроматоза С282У и НбЗБ. Всем больным выполнялись УЗИ органов брюшной полости, пункционная биопсия печени с последующим морфологическим исследованием гепатобиоптата й окраской его по методу Перлса для качественного и полуколичественного определения железа.

Для сравнения были проанализированы показатели метаболизма железа у 20 здоровых человек (13 мужчин и 7 женщин) в возрасте от 19 до 55 лет, в среднем - 32+0,9 года.

Результаты исследования и их обсуждение В ходе исследования было установлено, что у больных ХГС средние показатели сывороточных железа и ферритина были выше референтных величин как у мужчин, так и у женщин (табл. 1). -

Таблица 1

Средние концентрации изученных показателей обмена железа (М±8е)

Железо сыворотки ОЖСС Трансферрин Ферритин Церуло-плазмин Гаптоглобин КНТ железом

мкмояь/л мкмоль/л г/л нг/мл мг/л мг/дл %

Норма

<3-14,3-25,( $-10,7-21,'. 30,6-80 2-3,8 в- 94-149 34-76 220-610 30-220 20-52

Полученные результаты в исследуемой группе

с?26,6±0,8* $23±1,2* 53,4±2,4 3,2±1,2 б'204,9±13* ?147,5±28* 458,6±24 225,6±17 51,8±8,2*

Полученные результаты в группе контроля

с?21,5±0,7* $16,4±0,5* 56,7±5,2 2,8±1,5 ¿?120±12 * $73,1±11* 404,9±56 199,9±34 41,4±9,2*

* - различия исследуемой и контрольной групп достоверны, р<0,05.

Так, железо сыворотки было повышено у 54 человек (38 мужчин и 16 женщин) - 48,6%, а сывороточный ферритин - у 65 (51 мужчины и 14 женщин) -58,6%.

У обследованных пациентов, железо сыворотки крови которых превышало референтные величины, как и ожидалось, статистически значимо были больше средние значения эритроцитов крови (4,8±0,04х1012/л) и гемоглобина (146,5±1,3 г/л) по с равнению с больными, у которых данные показатели отмечались в пределах нормы (4,6±0,04х1012/л, 142,1 ±2,1 г/л, соответственно, р<0,05). У пациентов, сывороточный ферритин которых был повышен, наблюдались достоверно более высокие относительные значения моноцитов (6,8±0,18 %, р<0,05).

У больных с повышенным содержанием в сыворотке крови железа концентрации сывороточных билирубина (20,5±1 мкмоль/л), креатинина (76,7±1,5 ммоль/л), холестерина (4,7±0,1 ммоль/л), активность в крови АЛТ (183±17,5 Е/л), ACT (74,8±5,6 Е/л), ЩФ (98,6±4,8 Е/л), ГГТП (50,2±5 Е/л), трипсина (0,4±0,03 ммоль ч.л.) были статистически значимо выше (р<0,05), чем у пациентов, железо сыворотки крови которых не превышало референтных величин. В то же время больные., ферритин сыворотки крови которых определялся выше референтных величин, достоверно различались по сравнению с группой пациентов, показавших нормальные значения данного показателя, только по активности в сыворотке крови ACT (67,7±5,4 Е/л; 52,6±5 Е/л, соответственно, р<0,05), ГГТП (48,8±5,6 Е/л; 33,6±5 Е/л, соответственно, р<0,05), трипсина (0,4±0,06 ммоль ч.л,; 0,3±0,04 ммоль ч.л., соответственно, р<0,05), амилазы (79±9,7 Е/л; 58,2±4,6 Е/л, соответственно, р<0,05) и уровню тимоловой пробы (4,2±0,3 ед; 3,3±0,4 ед, соответственно, р<0,05).

У больных с высокой репликативной активностью вируса (более 800000 мЕ в мл) содержание ферритина сыворотки крови статистически значимо превышало таковое у пациентов с уровнем репликации вируса в крови менее 800000 мЕ в мл. Так, в первой группе средняя его концентрация составила 216,5±19,6 нг/мл, во второй - 155,7±21,9 нг/мл, р<0,05. Также была установлена обратная умеренная взаимосвязь между КНТ железом и репликативной активностью ВГС (мЕ/мл), г=-0,4, р<0,05, что косвенно отражало снижение вирусной репликации по мере увеличения в сыворотке крови железа.

Наблюдаемые сдвиги в метаболизме железа происходили на фоне снижения активной вирусной репликации по мере прогрессирования ХГС. Так, если на первых трех стадиях «вирусная нагрузка» колебалась на уровне 1 млн. мЕ/мл, а количество больных с высокой виремией превышало 50%, то на стадии цирроза уровень виремии составлял порядка 500000 мЕ/мл и значимо преобладали пациенты с низкой «вирусной нагрузкой» (85,7%)

При анализе показателей обмена железа в зависимости от стадии заболевания (F1-F4) и активности воспаления в ткани печени (АО - минимальная активность, AI - слабовыраженная активность, А2 - умеренная активность) были выявлены статистически значимые различия. По мере прогрессирования фиброза наблюдалось достоверное нарастание сывороточного ферритина, на

фоне снижения гаитоглобина. Между группами пациентов с F1 и F2 определены достоверные различия по содержанию гаптоглобина (293,4±32 и 202,7=25, соответственно; р<0,05). У 6оле.ных с F1 и тяжелым фиброзом (F3) - но гаптоглобину (293,4±32 мг/дл и 184,8±34,8 мг/дл, соответственно; р<0,05) и ферритину (145±15,2 иг/мл и 236±27,3 нг/мл, соответственно; р<0,05). У пациентов с F1 и F4 достоверно различались показатели сывороточного ферритина (145±15,2 нг/мл и 270,7±57 нг/мл, соответственно; р<0,05). А с увеличением степени некровоспалительной активности в ткани печени отмечалось статистически значимое нарастание сывороточного железа и снижение церулоплазмина и гаптоглобина крови. Так, между пациентами с АО и А1 статистически значимо различались показатели гаптоглобина (31б,8±38,7 мг/дл и 198,4±17,8 мг/дл, соответственно; р<0,05), Между больными с А1 и А2 — сывороточное железо (23,9±1,3 мкмоль/л и 27,9±2 мкмоль/л, р<0,05), гаптоглобин (316,8±38,7 мг/дл и 183,6±34,2 мг/дл, р<0,05) и церулоплазмин (548±5б мг/л и 410,7±35,9 мг/л, р<0,05).

Таким образом, повышение сывороточного железа и ферритина крови наблюдалось у большинства больных ХГС. При этом у мужчин чаще отмечалось увеличение содержания ферритина, а у женщин - железа сыворотки. Также наблюдаемые изменения в метаболизме железа отражали активность цитолиза гепатоцитов, при этом сывороточный ферритин нарастал по мере усиления фиброгенеза.

Полученные данные косвенно отражали снижение вирусной репликации по мере увеличения общего содержания железа в организме. Так, установленная обратная корреляционная взаимосвязь между КНТ железом и репликативной активностью вируса согласуется с результатами недавних экспериментальных исследований на культуре ткани Huh 7, в которых обнаружено непосредственное влияние железа на активность РНК зависимой РНК-полимеразы вируса гепатита С, что приводило к нарушению функции последней [Fillebeen С. et al., 2005, 2007]. В свою очередь, наблюдаемое нарастание ферритина в сыворотке крови по мере усиления репликации вируса тоже не противоречило полученным результатам и литературным данным, поскольку этот железо-связывающий протеин, являясь своего рода комплексообразующим элементом, вероятно, выводит свободное железо из циркуляции. Так же было показано, что по мере прогрессирования инфекционного процесса угнеталась белково-синтетическая функция печени, при этом наблюдаемые изменения в метаболизме железа усиливались.

При окрашивании гепатобиоптатов 40 больных (31 мужчины и 9 женщин) с типичными лабораторными признаками изменений в обмене железа по методике Перлса железо в клетках Купфера было выявлено у 31 человека (26 мужчин и 5 женщин), что составило 77,5%. В макрофагах и гепатоцитах железо определялось у 23 человек (19 мужчин и 4 женщин), что составило 57,5%. В макрофагах, гепатоцитах и клетках воспалительного инфильтрата портального тракта железо верифицировалось у 8 человек (7 мужчин и 1 женщины) - 20%. У двух мужчин микроэлемент был выявлен в клетках Купфера и воспалительном инфильтрате (5%).

Особое внимание обращало на себя соотношение распределения железа между макрофагами и гепатоцитами у больных ХГС и гемохроматозом. При ХГС данное соотношение приблизительно составило 1:1, с незначительным сдвигом в сторону тканевых макрофагов, тогда как у больных гемохроматозом -1:4.

Полученные в ходе исследования данные свидетельствовали, что распределение железа в ткани печени больных ХГС происходило преимущественно в клетках Купфера. В целом, содержание железа в ткани печени было статистически значимо больше в гепатобиоптатах больных гемохроматозом без гепатита С. Однако соотношение клетки КупфераУгепатоциты оказалось в пользу тканевых макрофагов у пациентов с ХГС.

Степень активности воспаления в ткани печени, выражаемая ИГА по Кпо(1е11, статистически значимо была выше у больных ХГС, в гепатобиоптатах которых железо выявлялось, по сравнению с группой пациентов, у которых исследуемый элемент в ткани органа не определялся. По стадии заболевания были получены схожие результаты. У пациентов, гепатобиоптаты которых окрашивались по методу Перлса, фиброз был достоверно более выраженный по сравнению с группой больных, где гепатосидероза не наблюдалось (табл.2).

Таблица 2

Сравнительный анализ стадии фиброза и ИГА у больных ХГС в зависимости от наличия, либо отсутствия железа в ткани печени, Мо (иС?-ЬО)

Показатели Железо в ткани печени

Выявляется Не выявляется

Фиброз * Mo(UQ-LQ) 3(2-3) 2 (1,5-2,5)

ИГА баллы * Mo(UQ-LQ) 6 (4-9) 4(3-5)

* - различия статистически значимы, р<0,05

Сывороточные железо, трансферрин, ферритин, гаптоглобин, церулоплазмин, ОЖСС, КНТ железом, активность AJIT, ACT, ГГТП, ЩФ, концентрации билирубина и глюкозы в крови были проанализированы у пациентов, в гепатобиоптатах которых железо выявлялось в клетках Купфера, гепатоцитах и клетках воспалительного инфильтрата, и больных, ткань печени которых по методике Перлса не окрашивалась. В группе пациентов, железо у которых определялось в клетках Купфера статистически значимо были выше (р<0,05) медианная концентрация ферритина сыворотки - 219,0 нг/мл (149,2362,0) - и медианная активность ГГТП - 38,0 МЕ/мл (26,0-123,0) - по сравнению с больными, железо в печени у которых не определялось, соответственно, 147,1 нг/мл (55,0-242,0) и 20,0 МЕ/мл (6,7-50,0).

Между группой пациентов, у которых железо определялось в гепатоцитах, и группой больных, в печеночных клетках которых оно не выявлялось,

статистически значимых различий по изучаемым биохимическим показателям обнаружено не было.

В зависимости от локализации железа в клетках воспалительного инфильтрата портального тракта были получены статистически значимые различия. Так, у больных, железо в клетках воспалительного инфильтрата которых определялось, медианная сывороточная концентрация элемента составила 33,3 мкмоль/л (26,7-36,1), а у лиц, у которых оно не верифицировалось - 17,0 мкмоль/л (12,5-29,3), р<0,05. По ферритину сыворотки наблюдалась аналогичная картина. У первой группы больных (железо в клетках воспалительного инфильтрата определялось) медианная его концентрация составила 362,4 нг/мл (316,5-426,9), а у пациентов второй группы (железо в клетках воспалительного инфильтрата не выявлялось) - 179,9 нг/мл (107,0-267,0), р<0,05. Так же у больных первой группы отмечалась статистически значимая более высокая активность ACT, ГГТП и ЩФ - 97,7 и/1 (66,6-119,8), 65,2 и/1 (38,2128,0), 91,0 и/1 (81,8-119,7), соответственно, по сравнению с пациентами второй группы - 45,6 и/1 (35,4-69,6), 27,3 и/1 (17,6-61,0), 74,2 и/1 (48,9-106,2), соответственно, р<0,05. Медианные показатели билирубина сыворотки крови у больных, железо в клетках воспалительного инфильтрата которых выявлялось, были достоверно более высокими - 22,0 мкмоль/л (18,9- 24,0) - по сравнению с пациентами, в гепатобиоптатах которых оно не было обнаружено - 14,5 мкмоль/л (10,3-19,8).

Кроме того, были установлены прямая умеренная взаимосвязь между выявлением железа в клетках Купфера (полуколичественная оценка) и КНТ железом (R=0,3- р<0,05), обратная - с ОЖСС (R=-0,3- р<0,05) и умеренная обратная взаимосвязь между выявлением железа в клетках воспалительного инфильтрата и концентрацией в сыворотке крови гаптоглобина (R— 0,3; р<0,05).

Таким образом, распределение железа в ткани печени при хронической HCV-инфекции преимущественно происходило в макрофагах (Купферовских клетках и макрофагах воспалительного инфильтрата). Содержание его нарастало по мере прогрессирования заболевания. С одной стороны, это характеризовало срыв компенсаторно-приспособительных возможностей организма, борющегося с HCV-инфекцией, а с другой - указывало на активное участие иммунопатологических процессов в патогенезе ХГС на более поздних этапах заболевания. Данные наблюдения были подтверждены при анализе морфологических И биохимических параметров, характеризующих метаболизм железа. В частности было установлено, что клинико-лабораторные изменения обмена этого микроэлемента у больных ХГС не всегда сопоставимы с морфологическими. Было отмечено, что выявление железа методом Перлса в макрофагах печени и, особенно, в клетках воспалительного инфильтрата, соотносилось с лабораторными сдвигами, характеризующими перегрузку железом. В тоже время выявление его. гранул в печеночных клетках статистически значимо не отражало биохимических изменений в метаболизме железа. 'Снижение же активной вирусной репликации происходит по мере увеличения степени фиброза, особенно на поздних его стадиях. С учетом

вышеизложенного, возможность железа влиять на репликацию возбудителя становится обоснованной.

Таким образом, лабораторные сдвиги показателей метаболизма железа в сторону перегрузки наблюдались у большинства больных ХГС как на ранних, так и на поздних стадиях заболевания, а морфологические проявления выявлялись лишь на поздних. Это может характеризовать угнетение компенсаторных возможностей организма и свидетельствовать об активном участии в патогенезе заболевания иммунноопосредованиых механизмов повреждения печени.

Группа из 40 человек с хроническим вирусным гепатитом С, у которых были повышены содержания железа и ферриткна в сыворотке крови, была обследована на носительство. мутантных аллелей ' гена наследственного гемохроматоза. Выявлены 1 гетерозиготный носитель С282У и 9 гетерозиготных носителей НбЗБ, то есть 25% всех обследованных. Гомозигот и компаунд гетерозигот выявлено не было. Клинических проявлений, характерных для наследственного гемохроматоза (гиперпигментации кожи, артропатий, признаков застойной сердечной недостаточности), у исследуемых больных не наблюдалось. В то же время, у пациентов, у которых выявлялись мутации гена наследственного гемохроматоза, отмечалось статистически значимое увеличение железа в ткани печени - 2,0 клетки в 10 полях зрения (1,6-3,2), достоверное снижении ОЖСС - 50,0 мкмоль/л (10,0-52,0) и трансферрина сыворотки крови -2,0 г/л (1,6-3,2) по сравнению с пациентами, мутантные аллели у которых выявлены не были (0,4 клетки в 10 полях зрения (0,2-0,8); 55,0 мкмоль/л (51,058,0); 2,6 г/л (2,3-2,8), соответственно; р<0,05). Кроме того, была отмечена недостоверная тенденция к увеличению скорости развития фиброза (СРФ), рассчитываемой по Роупагг! (стадия фиброза по МЕТАУГО., разделенная на предполагаемую длительность инфицирования в годах), у пациентов, имеющих в генотипе мутантные аллели С282У и НбЗЭ - 0,3 (0,2-0,4). У больных с нормальным генотипом по данным мутациям скорость развитая фиброза составила 0,2 (0,2-0,3). Морфологическая активность, стадия фиброза, сывороточные железо, ферритин, гаптоглобин,. церулоплазмин, билирубин, глюкоза, активность сывороточных трансаминаз, ГГТП, ЩФ в зависимости от наличия либо отсутствия мутантных аллелей гена наследственного гемохроматоза статистически значимо не изменялись.

Таким образом, полученные результаты свидетельствовали, что мутантные аллели гена наследственного гемохроматоза были выявлены лишь у четверти обследуемых больных ХГС с лабораторными признаками изменения метаболизма железа. Отмечено, что наличие изученных мутаций не влияло на уровни сывороточных железа и ферритина и не соотносилось с некровоспалительной активностью и стадией заболевания. В то же время наличие генотипов С282У и Н63Б приводило к достоверному увеличению содержания железа в ткани печени, уменьшению ОЖСС и трансферрина сыворотки крови в пределах референтных значений, что отражало сдвиг гомеостаза в сторону перегрузки организма железом. Учитывая полученные данные, закономерно встает вопрос, являются ли: мутации гена НРБ основной

причиной наблюдаемых сдвигов в гомеостазе железа? Вероятно, нет. Полученные результаты показали, что у большинства больных (75%) с повышенным содержанием железа и/или ферритина в сыворотке крови не было выявлено мутаций гена наследственного гемохроматоза.

У 50 больных ХГС с 1Ь генотипом возбудителя и изменением метаболизма железа были проанализированы сывороточные концентрации железа, трансферрина, ферритина, гаптоглобина, церулоплазмина, ОЖСС, КНТ железом перед началом противовирусной терапии, на ее этапах (24 и 48 недели) и в периоде наблюдения (полгода после завершения лечения - 72 недели). Все пациенты получали стандартную комбинированную противовирусную терапию пегшшрованным интерферононом а2-а (180 мкг в 1 раз в неделю) и рибавирином (1,0 - 1,2 г в сутки) в течение 48 недель.

На фоне комбинированной противовирусной терапии выявлено снижение показателей, характеризующих метаболизм железа, за исключением ОЖСС (табл. 3). Так, перед началом лечения медианные концентрации железа сыворотки составили 31,0 мкмоль/л (22,1-33,5), церулоплазмина - 420,0 мг/л (238,0-606,0), гаптоглобина - 138,8 мг/дл (91,0-187,0) и КНТ - 38,0 % (26,9-51,6) превышали значения, зарегистрированные на этапах контроля противовирусной терапии и в периоде наблюдения (р<0,05).

Таблица 3

Изменения показателей метаболизма железа на этапах контроля противовирусной терапии у больных ХГС, Ме (и<3-ЬС2)

Показатели Начало терапии 24 недели 48 недель 72 недели

1 2 1 3 4

Сывороточное железо (мкмоль/л) 31,0 (22,1-33,5) 17 7 **и2 (13,5-26,0) 20,5 *1и"' (14,5-24,0) ^ ^ *1 И4 (14,0-22,6)

Трансферрин (г/л) 2,6 (2,3-3,2) 2 1 *'1,2 (1,8-2,4) ^ 7 *1и! (1,4-1,9) - 1,2 *'144 (0,9-1,9)

ОЖСС (мкмоль/л) 58,0 (51,3-60,2) 59,8 (55,1-64,0) 54,0 (51,3-57,9) 55,5 (36,0-58,0)

КНТ% 38,0 (26,9-51,6) 25,8 *1и2 (21,0-3,1) 36,7 (26,1-41,1) 28,0 *,и4 (25,3-49,2)

Ферритин (иг/мл) 152,8 (67,8-301,0) 229,5 *1и2 (127-382) 143,0**'1,3 (101-277) 66,3 (40,0-76,5)

Церулоплазмин (мг/л) 420,0 (238,0-606,0) 204,0 *1и2 (119,0-253,0) 93,0 * (40,0-203,0) 40,0*11,4 (40,0-160,0)

Гаптоглобин (мг/дл) 138,8 (91,0-187,0) 60,9*'1,2 (48,0-115,0) 104 *'и3;2и3 (76,0-150,0) 120 *' и4-'!и4 (90,0-130,0)

* - р <0,05

Обращала на себя внимание нормализация уровня железа сыворотки уже к 24 неделе лечения - 17,7 мкмоль/л (13,5-26,0) и стабильно нормальные

медианные концентрации на 48 неделе терапии - 20,5 мкмоль/л (14,5-24,0) и в периоде набгаодения - 17,3 мкмоль/л (14,0-22,6). Кроме того, было отмечено „ 4 статистически значимое повышение концентрации сывороточного ферритина к 24 неделе лечения - 229,5 нг/мл (127,0-382,0) по сравнению с показателями на старте терапии - 152,8 нг/мл (67,8-301,0), 48 и 72 неделях - 143 нг/мл (101,0277,0) и 66,3 нг/мл (40,0-76,5), соответственно, р<0,05.

Данные наблюдения характеризовали нормальное (скомпенсированное) насыщение сыворотки крови железом больных ХГС как до лечения, так и в процессе наблюдения притом, что до терапии железо сыворотки и ферритин чаще превышали референтные величины у большинства больных ХГС. Это позволило предположить, что увеличение содержания железа в крови происходило в первую очередь за счет свободного, несвязанного с белками плазмы микроэлемента, необходимого для участия в противовирусном ответе на НСУ - инфекцию |ТШеЬееп С. е1 а1., 2005, 2007], что подтверждалось значительным его снижением к концу лечения.

Стабильно низкие показатели сывороточных церулоплазмина и трансферрина в периоде наблюдения характеризовали угнетение белкового обмена в организме на фоне лечения ПИНФ. Пик изменений в белковом обмене, вероятно, приходился на середину лечения, что находило отражение в максимальном снижении в этот период синтезируемого в печени гаптоглобина. Нарастание же к 24 неделе наблюдения в сыворотке крови ферритина наблюдалось только у мужчин и коррелировало с началом снижения железа. Вероятно, данный белок связывал избыток микроэлемента, который наблюдался до лечения.

При анализе параметров, характеризующих метаболизм железа в зависимости от активности сывороточных трансаминаз, также были получены статистически значимые результаты (р<0,05). Более низкие показатели ОЖСС и трансферрина сыворотки крови у пациентов, имевших нормальную активность АЛТ к 72 неделе мониторинга лечения (36,5 мкмоль/л (32,3-37,0) и.0,9 г/л (0,81,0)), отражали большую насыщенность организма железом, чем у больных, активность АЛТ которых в этот период превышала референтные значения (53,5 мкмоль/л (46,7-60,0) и 1,5 г/л (1,2-2,0)).

Установлены определенные закономерности и при анализе лабораторных характеристик обмена железа в зависимости от УВО. Медианные концентрации сывороточных железа и церулоплазмина на этапах мониторинга терапии у больных, достигших УВО, были достоверно выше (р<0,05), по сравнению с пациентами,, вирусологический ответ к 72 неделе у которых отсутствовал. У достигших УВО пациентов на старте лечения железо составило 31,2 мкмоль/л (23,0-34,8), церулоплазмин - 453,0 мг/л (291,0-548,0); на 24 неделе соответственно - 16,9 мкмоль/л (13,0-28,9) и 222 мг/л (155,0-253,0); на 48 неделе - 24,0 мкмоль/л (16,5-29,0) и 117,0 мг/л (80,0-173,0); через полгода после окончания лечения - 22,3 мкмоль/л (16,8-29,0) и 78,0 мг/л (40,0-216,0). При этом через полгода после окончания терапии железо и церулоплазмин сыворотки достоверно были выше у пациентов, РНК вируса в крови у которых не выявлялась. Железо и церулоплазмин у достигпих УВО больных составили,

соответственно, 22,3 мкмоль/л (16,8-29,0) и 78,0 мг/л (40,0-216,0); при отсутствии УВО - 15,8 мкмоль/л (11,8-20,6) и 40,0 мг/л (40,0-101,0). Кроме того, в группе больных, достигших УВО, медианные концентрации сывороточных железа и церулоплазмина на старте терапии - 31,2 мкмоль/л (23,0-34,8) и 453,0 мг/л (291,0-548,0) - были статистически значимо выше, чем у пациентов, не достигших УВО - 25,7 мкмоль/л (21,9-33,0) и 291,0 мг/л (203,0-448,0). Также на 72 неделе мониторинга противовирусной терапии статистически значимо различались медианные значения ОЖСС: у пациентов с УВО - 37,0 мкмоль/л (32,3-57,0), у не достигших УВО - 46,7 мкмоль/л (39,0-59,0). Концентрация трансферрина сыворотки у бол ьных, результатом лечения которых явился УВО, была достоверно ниже на 24 - 1,8 г/л (1,6-2,0) - и 48 неделях - 1,3 г/л (1,2-1,8) -по сравнению с группой пациентов, не достигших ответа, соответственно - 2,2 г/л (1,9-2,4) и 1,8 г/л (1,6-1,9), р<0,05.

Таким образом, современная комбинированная терапия ХГС сопровождалась снижением содержания сывороточных железа, трансферрина, ферритина, гаптоглобина, церулоплазмина и ОЖСС независимо от ответа на лечение. Тем не менее, УВО прямо коррелировал с более высокими уровнями железа и церулоплазмина сыворотки крови до терапии, на ее фоне и в процессе наблюдения. В конце курса терапии и через полгода после его завершения пациенты, достигшие УВО, имели более низкие показатели ОЖСС и трансферрина сыворотки по сравнению с больными, не ответившими на терапию, что косвенно указывало на большую насыщенность крови железом у пациентов, результатом противовирусного лечения которых явился УВО.

В зависимости от динамики морфологических изменений были получены аналогичные результаты. 33 пациентам из обследованной группы морфологическое обследование проводилось до начала терапии и через полгода после ее завершения. Оценивался морфологический ответ (МО), под которым понималось отсутствии прогрессирования или снижение фиброза и некровоспалителыюй активности в ткани печени по данным парных биопсий. Он прослеживался у 21 больного. Медианные концентрации трансферрина сыворотки крови на 24 и 48 неделях лечения у пациентов, достигших МО, были достоверно ниже (р<0,05), чем у больных, у которых улучшения морфологической картины в паши печени добиться не удалось: 2,0 г/л (1,8-2,1) и 2,2 г/л (1,7-2,4) на 24 неделе; 1,5 г/л (1,3-1,9) и 1,9 г/л (1,5-2,5) по завершении курса лечения. Такая же тенденция прослеживалась и с показателями ОЖСС: у лиц, у которых наблюдалась положительная морфологическая динамика, данный показатель на 72 неделе мониторинга лечения был ниже, чем в группе, где пациенты не достигли МО (31,3 мкмоль/л (28,0-36,0) и 57,0 мкмоль/л (49,0-58,0), соответственно, р<0,05). Кроме того, в периоде наблюдения КНТ железом статистически значимо был выше у лиц с положительной морфологической динамикой - 51,6% (31,0-58,0) - по сравнению с показателями больных, не достигших МО - 33% (18.4-35,0), р<0,05. Обращали на себя внимание достоверно более высокие медианные концентрации • сывороточного церулоплазмина перед началом терапии и в периоде наблюдения у больных, у которых имело место улучшение морфологической картины ткани печени. На

старте лечения - 429,0 мг/л (311,0-731,0) и 206,0 мг/л (122,0-263,0), соответственно, у больных, достигших и не достигших МО, р<0,05; на 72 неделе наблюдения - 59,0 мг/л (40,0-216,0) и 40,0 мг/л (40,0-80,0), соответственно, р<0,05.

В настоящее время пункционная биопсия печени является «золотым стандартом» диагностики хронических диффузных заболеваний печени, включая ХГС. С её помощью оценивается активность патологического процесса и стадия фиброза. Наряду с этим, нередко возникает ситуация, когда проведение данной диагностической манипуляции невозможно по различным причинам (наличие противопоказаний, категорическое несогласие пациента, отсутствие квалифицированного врача-специалиста). Подобная ситуация требует поиска новых возможностей для неинвазивной оценки патологических изменений в печени. Кроме того, определенной группе больных ХГС (со слабым фиброзом и минимальной активностью патологического процесса (ИГА<3 балла по Knodell)) противовирусная терапия может быть отсрочена. В таких случаях они расцениваются, как пациенты с низкими темпами прогрессирования заболевания и нуждаются в динамическом наблюдении и патогенетической терапии. Решение задачи по выявлению таких больных возможно лишь с применением методов многофакторного статистического анализа, в том числе дискриминантного, позволяющего отнести изучаемый объект (больной ХГС) к одной из нескольких групп: на основе измерения у него некоторого числа признаков (клшшко-лабораторные параметры). В ходе анализа статистически достоверных ЛДФ (линейных дискриминантных функций) для каждой стадии фиброза и степени некровоспалительной активности получить не удалось. Однако при объединении слабого и умеренного фиброза (77 человек) и тяжелого фиброза с циррозом (34 человека) в две группы, а так же объединения группы пациентов со слабовыраженной и умеренной воспалительной активностью в ткани печени (74 человека) были получены достоверные ЛДФ. В математическую модель для прогнозирования фиброза у больных ХГС (помимо возраста) вошли четыре параметра, характеризующих метаболизм железа: сывороточные гаптоглобин, церулоплазмин, трансферрин и наличие мутантных аллелей гена наследственного гемохроматоза; для прогнозирования активности воспаления в печеночной ткани (помимо пола и возраста пациента) в ЛДФ вошли два параметра: сывороточные ферритин и гаптоглобин.

Полученные линейные дискриминантные функции для прогнозирования стадии заболевания имели следующий вид:

Для стадии слабого и умеренного фиброза:

ЛДФ1. у= 0,362 • Xi + 0,061 • Х2 + 0,036 «Х3 + 0,157 • Х4+ 264,44 • Х5 - 250,7 Для стадии тяжелого фиброза и цирроза:

ЛДФ2. у= 0,449 • Xi + 0,055 • Х2 + 0,038 • Х3 + 0,187 • Х4 + 267,366 • Х5 - 260,1

Где X] - возраст (год); Х2 - гаптоглобин (мг/дл); Х3 - церулоплазмин (мг/л); Х4 - трансферрин (г/л); Х5 - мутации гена НГХ (есть-1/нет-2).

Для минимальной активности:

ЛДФ1. у= 0,134 • XI + 7,033 • Х2+ 0,065 • Х3+ 0,095 • Х4- 25,5

Для слабовыраженной и умеренной активности:

ЛДФ2. у= 0,161 .Х(+6,617 -Х2+ 0,062 -Х3+ 0,089 -Х4-23,3

Где Х1 - возраст (год); Х2- пол (1- мужской, 2- женский); Хз - ферритин (нг/мл); Х4 - гаптоглобин (мг/дл).

Точность диагаостики в среднем характеризовалась высокой чувствительностью. Для группы Р1-Р2 она составила 96,1%, для - РЗ-Р4 -79,4%, для группы АО - 70,3% и для группы А2-АЗ - 79,7%. Конкретный больной относился к той группе, где значение "у" было наибольшее.

Таким образом, результаты диссертационного исследования свидетельствуют о высокой диагностической и прогностической значимости изученных параметров, характеризующих метаболизм железа.

В целом, изучение метаболизма железа у больных' ХГС позволило раскрыть некоторые патогенетические механизмы течения НСУ-инфекции. В частности, полученные данные свидетельствовали о том, что наблюдаемые сдвига в метаболизме железа, с одной стороны, были сопряжены с более тяжелыми морфологическими изменениями в ткани печени, а с другой -являлись компенсаторно-приспособительной реакцией организма на НСУ-инфекцию.

ВЫВОДЫ

1. Сывороточные железо и ферритин повышены у большинства больных хроническим гепатитом С (48,6%, 58,6%, соответственно), достоверно коррелируют с биохимической активностью инфекционного процесса и нарастают на фоне прогрессировали заболевания, снижения уровня виремии, а также уменьшения количества гаптоглобина и церулоплазмина.

2. Повышение содержания железа, сыворотчного ферритина. снижение уровня трансферрина, общей жеяезо-связывающей способности сыворотки крови свидетельствуют о развитии компенсаторно-приспособительных процессов в организме человека, особенно на ранних стадиях НСУ-инфекции.

3. При хроническом гепатите С железо , в ткани печени преимущественно локализуется в клетках Купфера и макрофагах воспалительного инфильтрата, соотносится с биохимическими изменениями его метаболизма и накапливается по мере увеличения выраженности фиброза и некровоспалительной активности, являясь одним из признаков иммуноопосредованного повреждения печени. При этом выявление гранул микроэлемента в гепатоцитах не отражает наблюдаемых в крови сдвигов, характеризующих перегрузку железом.

4. Наличие мутантных гетерозиготных аллелей гена наследственного гемохроматоза С282У и Н63П не влияет на уровни сывороточных железа ферритина, однако приводит к достоверному увеличению содержания железа в ткани печени, уменьшению трансферрина и общей железо-связывающей способности сыворотки крови у больных хроническим гепатитом С.

5. Терапия больных, хроническим гепатитом С пегилированным интерфероном - а-2а в сочетании с рибавирином сопровождается снижением содержания сывороточных железа, трансферрина, ферритина, церулоплазмина, гаптоглобина, насыщения трансферрина железом независимо от ответа на лечение. Тем не менее, устойчивый вирусологический, а также биохимический и морфологический ответы значимо выше у пациентов с более высоким уровнем железа и церулоплазмина сыворотки крови до терапии, на ее фоне и в процессе наблюдения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Пкциентам с ХГС для неинвазивной оценки активности воспаления и стадии фиброза в печени следует определять в крови следующие показатели, характеризующие метаболизм железа: сывороточные железо, трансферрин, ферритин, гаптоглобин, церулоплазмин, ОЖСС, КНТ железом.

2. При проведении морфологического исследования гепатобиоптатов больных ХГС целесообразно выполнять окраску по методике Перлса с целью выявления . железа как фактора, усиливающего фиброз и воспалительную активность в ткани печени.

- 3. Генотипирование больных ХГС с изменениями в метаболизме железа на носительство мутаций наследственного гемохроматоза С282У и Н630 целесообразно проводить при наличии клинических признаков перегрузки железом и/или выявлении гранул микроэлемента в ткани печени.

4. Для оценки показаний к назначению противовирусной терапии при наличии противопоказаний к проведению пункционной биопсии печени или отсутствии возможности для её выполнения рекомендовано использование следующих линейных дискриминантньк функций (ЛДФ):

ЛДФ1. у= 0,362 • XI + 0,061 • Х2 + 0,036 • Х3 + 0,157 • Х4+ 264,44 • Х5 - 250,7

ЛДФ2. у= 0,449 • X, + 0,055 • Хг + 0,038 • Х3 + 0,187 • Х4 + 267,366 • Х5 - 260,1

Где X; - возраст (год); Хг - гаптоглобин (мг/дл); Х3 - церулоплазмин (мг/л); Х4 - трансферрин (г/л); Х5 - мутации гена НГХ (есть-1/нет-2).

Если ЛДФ1>ЛДФ2, следовательно, у пациента ранние стадии фиброза (Пили Р2).

Если ЛДФ1<ЛДФ2, следовательно, у пациента поздние стадии заболевания (ТЗ или Р4).

ДЦФЗ. у= 0,134 • X, + 7,033 • Х2+ 0,065 • Х3+ 0,095 • Х4 - 25,5 ЛДФ4. у= ОД61 • Х,+ 6,617 • Х2+ 0,062 • Х3+ 0,089 • Х4- 23,3

Где X) - возраст (год); Х2- пол (1- мужской, 2- женский); Х3 - ферритин (нг/мл); Х4 - гаптоглобин (мг/дл).

Если ЛДФЗ>ЛДФ4, следовательно, у пациента ИГ А<3.

Если ЛДФЗ<ЛДФ4, следовательно, ИГА>3 баллов.

Таким образом, если конкретный пациент относится к группе с минимальной воспалительной активностью в ткани печени (ИГА<3 баллов) и заболевание находится на ранней стадии (Fl или F2), то противовирусная терапия может быть отсрочена. В остальных случаях больному следует рекомендовать проведение курса противовирусного лечения при отсутствии к . нему противопоказаний.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБ ЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гусев Д.А. Исследование диагностической и прогностической значимости определения сывороточного железа у больных хроническим гепатитом С / Д.А. Гусев, К.В. Козлов, К.В. Жданов // Узловые вопросы борьбы с инфекцией: Тез. докл. Рос. науч.- практ. конф. - СПб., 2004. - С.70-71.

2. Гусев Д.А. Синдром «перегрузки железом» при хроническом гепатите С / Д.А. Гусев, К.В. Козлов // Актуальные вопросы инфекционной патологии-2005: Тез. докл. Всерос. науч. конф. молодых ученых с междунар. участием. - СПб., 2005.-С.16.

3. Жданов К.В. Диагностическая значимость показателей обмена железа у больных хроническим гепатитом С / К.В. Жданов, Д.А. Гусев, К.В. Козлов, Л.В.Замятина // Тез. Докл. Рос. науч.-практ. конф., посвященной 110-летию кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова. - СПб., 2006. - С.112-113.

4. Жданов К.В. Показатели обмена железа при хроническом гепатите С / К.В. Жданов, Д.А. Гусев, К.В. Козлов, Л.В.Замятина // Тез. Докл. VII Рос. Съезда инфекционистов. -Н.Новгород, 2006. - С.113-114.

5. Жданов К.В. Прогностическая значимость показателей обмена железа для лечения больных хроническим гепатитом С / К.В. Жданов, Д.А. Гусев, К.В. Козлов // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатолопш, кололроктологии. - 2007. -Т.17, №1. Прилож.27. - С.27.

6. Жданов К.В. Клинико-лабораторные и морфологические показатели метаболизма железа у больных хроническим вирусным гепатитом С / К.В. Жданов, Д.А. Гусев, К.В. Козлов // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2008. - Т.18, №1. Прилож.31. - С.27.

7. Жданов К.В. Значение показателей обмена железа для прогнозирования ответа на противовирусную терапию при хроническом вирусном гепатите С / К.В. Жданов, Д.А. Гусев, К.В. Козлов // Тез. Докл. Юбил. Рос. науч. конф. с междунар. участием., поев. 175-летию со дня рождения С.П. Боткина. - СПб., 2007. - С.238-239.

8. Козлов К.В. Изменения метаболизма железа у больных хроническим гепатитом С / К.В. Козлов И Актуальные вопросы инфекционной патологии-2008; Тез.докл. Всерос. науч. конф. молодых ученых с международным участием. - СПб., 2008. - С.16,

9. Жданов К.В. Динамика показателей метаболизма железа у больных хроническим гепатитом С на фоне противовирусной терапии / К.В. Жданов, Д.А.

Гусев, К.В. Козлов // Тез. докл. 7 междунар. симп. гепатологов Беларуси.-Витебск, 2008,- Т2 . - С.76-77.

10. Жданов К.В. Клинико-лабораторные и морфологические показатели метаболизма железа у больных хроническим гепатитом С / К.В. Жданов, Д.А. Гусев, К.В. Козлов // Тез. докл. 7 междунар. симп. гепатологов Беларуси.-Витебск., 2008,-Т2 . - С.77-78.

11. Жданов К.В. Характеристика показателей метаболизма железа у больных хроническим гепатитом С в зависимости от результатов противовирусной терапии / К.В. Жданов, Д.А. Гусев, К.В. Козлов, Чирский B.C., Д.М. Шахманов // Тез. Докл. Рос. научно-практ. конф. инфекционные болезни: современные проблемы диагностики и лечения. - СПб., 2008. - С. 80.

12. Жданов К.В. Характеристика метаболизма железа у больных хроническим гепатитом С / К.В. Жданов, Д.А. Гусев, B.C. Чирский, К.В. Козлов, A.B. Шкуро, A.B. Лавров // Клинические перспективы гастроэнтерологии, гепатологии. -2009.-№1.-С.10-17.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВГС - вирус гепатита С

ИГА - индекс гистологической активности

ИФН - интерферон

КНТ железом - коэффициент насыщения трансферрина железом МО - морфологический ответ

ОЖСС - общая железо-связывающая способность сыворотки

ПИНФ - пегилированный интерферон

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

ХГС - хронический гепатит С

УВО1-устойчивый вирусологический ответ

Актуальность исследования. В настоящее время в мире проживает не менее 170 млн. человек, инфицированных вирусом гепатита С (ВГС), что составляет около 3% населения планеты. Поэтому HCV-инфекция представляет собой глобальную медико-социальную проблему, которая обусловлена стабильным уровнем заболеваемости и высокими затратами на диагностический и лечебный процессы [14, 24, 27, 28, 31].

Особенностью гепатита С (ГС) является его скрытое бессимптомное течение, что имеет существенное как эпидемиологическое, так и клиническое значение. К основным путям заражения ВГС относятся различные парентеральные вмешательства (внутривенное употребление наркотиков, переливания крови и её препаратов, татуаж, пирсинг, оперативные вмешательства, инвазивные процедуры, а также профессиональное инфицирование медицинского персонала). В то же время значение естественных путей передачи (половой, вертикальный) при HCV-инфекции значительно ниже [1, 2, 13, 19, 23, 27, 91]. Персистенция ВГС длится многие годы по типу медленной инфекции и представляет собой последовательность следующих клинических форм: острый гепатит, хронический гепатит (стадии отсутствия фиброза, слабого, умеренного и тяжелого фиброза, цирроза), печеночно-клеточная карцинома [6, 20, 26, 117, 131, 132].

Инфекционный процесс, инициируемый вирусом ГС, в отличие от такового при вирусном гепатите В (ВГВ), сопровождается характерными изменениями в обмене железа, что проявляется сдвигом метаболизма этого микроэлемента в сторону перегрузки [17, 40, 41, 59, 79, 94, 130, 138]. Для всех живых организмов железо является фундаментальным микроэлементом. Железо - важнейший кофактор для энзимов в митохондриальной дыхательной цепи, в цитратном цикле, в синтезе ДНК, играет центральную роль в связывании и транспорте кислорода гемоглобином и миоглобином; железосодержащие белки необходимы для метаболизма коллагена, тирозина и катехоламинов [16, 22].

Многими авторами наблюдаемые изменения в метаболизме железа при хроническом гепатите С (ХГС) рассматриваются как неблагоприятные для течения и прогноза заболевания, а также эффективности противовирусной терапии [40, 62, 69, 77, 85, 93, 144]. Однако в недавних экспериментальных работах было описано ингибирующее влияние железа на репликацию вируса ГС в культуре ткани человеческой гепатомы (Huh 7) [71, 72].

Как показал анализ опубликованных результатов многочисленных исследований, посвященных изменению метаболизма железа при HCV-инфекции, выводы по данной проблеме во многом противоречивы. Нет единого мнения о причинах наблюдаемой «перегрузки железом», о влиянии вируса гепатита С на его обмен и наоборот. Неоднозначно оцениваются показатели, отражающие метаболизм этого микроэлемента с диагностической и прогностической сторон.

Все вышеизложенное и предопределило цель и задачи настоящего диссертационного исследования.

Цель исследования. На основании комплексного клинико-лабораторного, морфологического, вирусологического и генетического обследования дать патогенетическую характеристику метаболизма железа у больных хроническим гепатитом С.

Задачи исследования.

1. Проанализировать изменения основных биохимических показателей, характеризующих метаболизм железа, на разных стадиях заболевания и в зависимости от активности воспаления в ткани печени, а также установить их взаимосвязи с основными клин и ко-лабораторными показателями у больных хроническим гепатитом С.

2. Изучить распределение железа в ткани печени в зависимости от выраженности фиброза, некровоспалительной активности и выявить корреляции с основными клинико-лабораторными показателями, связанными с изменением метаболизма микроэлемента при HCV- инфекции.

3. Выявить взаимосвязь между носительством мутантных аллелей гена наследственного гемохроматоза C282Y и H63D и изменениями в метаболизме железа у больных хроническим гепатитом С.

4. Оценить динамику показателей, отражающих метаболизм железа, на фоне противовирусной терапии хронического гепатита С.

Научная новизна исследования. Выявлены взаимосвязи между основными клинико-лабораторными, морфологическими и генетическими показателями, характеризующими метаболизм железа, и параметрами, отражающими течение хронического гепатита С. Показано, что повышение уровня железа сыворотки крови представляет собой компенсаторно-приспособительную реакцию организма человека на HCV инфекцию, особенно на ее ранних стадиях.

Обнаружено, что железо в ткани печени больных ХГС в отличие от больных гемохроматозом выявляется преимущественно в клетках Купфера и нарастает с увеличением стадии заболевания и степени воспаления печеночной ткани. При этом обнаружение железа методом Перлса в макрофагах печени и, особенно, в клетках воспалительного инфильтрата соотносится с лабораторными сдвигами, характеризующими перегрузку железом. В то время как выявление гранул микроэлемента в печеночных клетках статистически значимо не отражает биохимических изменений в обмене железа.

Установлено, что наличие изученных мутантных аллелей гена наследственного гемохроматоза не взаимосвязано с уровнями сывороточных железа и ферритина и не соотносится с некровоспалителыюй активностью и стадией заболевания.

Продемонстрировано, что терапия пегилированным интерферононом а2-a и рибавирином сопровождается снижением содержания сывороточных железа, трансферрина, ферритина, гаптоглобина и церулоплазмина независимо от ответа на лечение. При этом устойчивый вирусологический ответ (УВО) прямо коррелирует с более высокими уровнями железа и церулоплазмина сыворотки крови до терапии, на ее фоне и в процессе наблюдения.

Практическая значимость. Определение в крови содержания сывороточных железа, ферритина, трансферрина, гаптоглобина, церулоплазмина, общей железо-связывающей способности сыворотки (ОЖСС), коэффициента насыщения трансферрина (КНТ) железом, тестирование на носительство мутантных аллелей гена наследственного гемохроматоза C282Y и H63D может использоваться для неинвазивной оценки степени активности и стадии патологического процесса у больных ХГС.

Показано, что при проведении морфологического исследования гепатобиоптатов пациентов с ХГС целесообразно выполнять окраску по методу Перлса с целью выявления железа как фактора, усиливающего фиброз и воспалительную активность в ткани печени.

На основании многофакторного дискриминантного анализа разработаны информативные и статистически значимые математические модели, позволяющие без проведения пункционной биопсии печени выявлять пациентов с минимальной активностью воспаления (ИГА<3 балла) и ранними стадиями фиброза, которым комбинированная противовирусная терапия может быть отсрочена.

Личное участие автора в получении результатов. Автором проведен сравнительный анализ и выполнено исследование взаимосвязей основных клинико-лабораторных, морфологических и генетических параметров, характеризующих метаболизм железа на различных стадиях ХГС и этапах мониторинга противовирусной терапии, разработана математическая модель для выявления группы пациентов, которой комбинированная противовирусная терапия может быть отсрочена.

Автор осуществлял планирование исследования, принимал непосредственное участие в клиническом обследовании больных, организовывал проведение всех лабораторно-инструментальных и гистологических исследований, самостоятельно выполнял пункционные биопсии печени. Автором лично сформирована база данных, проводилась статистическая обработка и обобщение полученных результатов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Наблюдаемые изменения в метаболизме железа на ранних стадиях HCV-инфекции характеризуют компенсаторно-приспособительную реакцию организма человека, а на поздних стадиях - иммуноопосредованное повреждение гепатоцитов.

2. Мутантные аллели гена наследственного гемохроматоза C282Y и H63D не являются основной причиной развития изменений в метаболизме железа у больных хроническим гепатитом С.

3. Современная противовирусная терапия хронического гепатита С более эффективна при сдвиге метаболизма железа в сторону перегрузки.

Реализация и внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в научную, учебную, лечебно-диагностическую работу кафедры и клиники инфекционных болезней ВМедА им. С.М. Кирова.

Апробация и публикация материалов исследования. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Российской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» (Санкт-Петербург, 2004); Всероссийской научной конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные вопросы инфекционной патологии» (Санкт-Петербург, 2005, 2008); Российской научно-практической конференции, посвященной 110-летию кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова (Санкт-Петербург, 2006); VII Российском Съезде инфекционистов (Н.Новгород, 2006); Юбилейной Российской научной конференции с международным участием, посвященной 175-летию со дня рождения С.П. Боткина (Санкт-Петербург, 2006); на 12 и 13 Российской конференции «Гепатология сегодня» (Москва, 2007, 2008); симпозиуме гепатологов Беларуси (Витебск, 2008).

По материалам исследования опубликовано 12 печатных работ, в том числе 1 статья в реферируемом журнале.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 133 страницах компьютерного набора, состоит из введения, 5 глав (обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трёх глав результатов собственных исследований), заключения, выводов и практических рекомендаций. Указатель литературы включает 162 источника, в том числе 31 отечественный и 131 зарубежный. Текст содержит 33 таблицы, 4 формулы, 15 рисунков и 1 клинический пример.

112 ВЫВОДЫ

1. Сывороточные железо и ферритин повышены у большинства больных хроническим гепатитом С (48,6%, 58,6%, соответственно), достоверно коррелируют с биохимической активностью инфекционного процесса и нарастают на фоне прогрессирования заболевания, снижения уровня виремии, а также уменьшения количества гаптоглобина и церулоплазмина.

2. Повышение содержания железа, сыворотчного ферритина, снижение уровня трансферрина, общей железо-связывающей способности сыворотки крови свидетельствуют о развитии компенсаторно-приспособительных процессов в организме человека, особенно на ранних стадиях HCV-инфекции.

3. При хроническом гепатите С железо в ткани печени преимущественно локализуется в клетках Купфера и макрофагах воспалительного инфильтрата, соотносится с биохимическими изменениями его метаболизма и накапливается по мере увеличения выраженности фиброза и некровоспалительной активности, являясь одним из признаков иммуноопосредованного повреждения печени. При этом выявление гранул микроэлемента в гепатоцитах не отражает наблюдаемых в крови сдвигов, характеризующих перегрузку железом.

4. Наличие мутантных гетерозиготных аллелей гена наследственного гемохроматоза C282Y и H63D не влияет на уровни сывороточных железа ферритина, однако приводит к достоверному увеличению содержания железа в ткани печени, уменьшению трансферрина и общей железо-связывающей способности сыворотки крови у больных хроническим гепатитом С.

5. Терапия больных хроническим гепатитом С пегилированным интерфероном - а-2а в сочетании с рибавирином сопровождается снижением содержания сывороточных железа, трансферрина, ферритина, церулоплазмина, гаптоглобина, насыщения трансферрина железом независимо от ответа на лечение. Тем не менее, устойчивый вирусологический, а также биохимический и морфологический ответы значимо выше у пациентов с более высоким уровнем железа и церулоплазмина сыворотки крови до терапии, на ее фоне и в процессе наблюдения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Пациентам с ХГС для неинвазивной оценки активности воспаления и стадии фиброза в печени следует определять в крови следующие показатели, характеризующие метаболизм железа: сывороточные железо, трансферрин, ферритин, гаптоглобин, церулоплазмин, ОЖСС, КНТ железом.

2. При проведении морфологического исследования гепатобиоптатов больных ХГС целесообразно выполнять окраску по методике Перлса с целью выявления железа как фактора, усиливающего фиброз и воспалительную активность в ткани печени.

3. Генотипирование больных ХГС с изменениями в метаболизме железа на носительство мутаций наследственного гемохроматоза C282Y и H63D целесообразно проводить при наличии клинических признаков перегрузки железом и/или выявлении гранул микроэлемента в ткани печени.

4. Для оценки показаний к назначению противовирусной терапии при наличии противопоказаний к проведению пункционной биопсии печени или отсутствии возможности для её выполнения рекомендовано использование следующих линейных дискриминантных функций (ЛДФ):

ЛДФ1. у= 0,362 • Xt+ 0,061 • Х2+ 0,036 • Х3+ 0,157 • Х4+ 264,44 • Х5 - 250,7 ЛДФ2. у= 0,449 -XL + 0,055 • Х2+ 0,038 • Х3 + 0,187 • Х4+267,366 • Х5 - 260,1

Где Xi - возраст (год); Х2 - гаптоглобин (мг/дл); Х3 - церулоплазмин (мг/л); Х4 - трансферрин (г/л); Х5 - мутации гена НГХ (есть-1/нет-2).

Если ЛДФ1>ЛДФ2, следовательно, у пациента ранние стадии фиброза (Пили F2).

Если ЛДФ1<ЛДФ2, следовательно, у пациента поздние стадии заболевания (F3 или F4).

ЛДФЗ. у= 0,134 • Xi + 7,033 • Х2+ 0,065 • Х3 + 0,095 • Х4 - 25,5 ЛДФ4. у= 0,161 • Xt + 6,617 • Х2+ 0,062 • Х3+ 0,089 • Х4- 23,3

Где Xi - возраст (год); Х2— пол (1- мужской, 2- женский); Х3 - ферритин (нг/мл); Х4 - гаптоглобин (мг/дл).

Если ЛДФЗ>ЛДФ4, следовательно, у пациента ИГА<3.

Если ЛДФЗ<ЛДФ4, следовательно, ИГА>3 баллов.

Таким образом, если конкретный пациент относится к группе с минимальной воспалительной активностью в ткани печени (ИГА<3 баллов) и заболевание находится на ранней стадии (F1 или F2), то противовирусная терапия может быть отсрочена. В остальных случаях больному следует рекомендовать проведение курса противовирусного лечения при отсутствии к нему противопоказаний.

116