Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Патофизиологическое обоснование критериев ранней диагностики и прогнозирования тяжести нарушения функции печени

На правах рукописи

ТИШКОВА

Яна Владимировна

ПАТОФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ КРИТЕРИЕВ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ И ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЯЖЕСТИ НАРУШЕНИЯ ФУНКЦИИ ПЕЧЕНИ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

^ £ г ' г Г,

Казань -2012

005042485

005042485

Работа выполнена на кафедре патологической физиологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования '"Смоленская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор Молотков Олег Владимирович

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой патологической физиологии ГБОУ ВПО НижГМА Минздравсоцразвития России

Кандидат медицинских наук, ассистент кафедры патофизиологии ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздравсоцразвития России

Потемина Татьяна Евгеньевна

Фархутдннов Альберт Мансуровнч

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздравсоцразвития России (г. Москва)

Защита состоится _2012 г. в_часов на заседании диссертационного

совета Д 208.034.01 при ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздравсоцразвития России по адресу. 420012, Россия, Татарстан, г. Казань, ул. Бутлерова. 49.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздравсоцразвития России (420012. Россия, Татарстан, г. Казань, ул. Бутлерова, 49е).

Автореферат разослан Э i ОАУрб^ЬХ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Залялютдинова Л.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Патология печени занимает ведущее место среди болезней органов пищеварения (Ивашкин В.Т и др., 2006; Хазанов А.И., 2005). По данным медицинских экспертов, осуществлявших анализ общей заболеваемости в 2008 году (в сравнении с предыдущим периодом), на фоне общего снижения показателей заболеваемости органов пищеварения, регистрируется рост летальных исходов, связанных с острыми поражениями печени (Ивашкин В.Т., 2009).

Несмотря на определенные успехи в познании природы острых заболеваний печени, а также практические достижения в их профилактике и лечении, заболеваемость гепатитами остается высокой в глобальном масштабе и в РФ, в частности (Подымова С.Д. и др., 2005; Павлов Ч.С., 2006).

Исследуемая проблема важна и в социальном плане, поскольку патология печени часто приводит к инвалндизации и развитию летальных исходов среди населения трудоспособного возраста (Зиганшина Л.Ф., 2007;. Калинин A.B. и др., 2007).

Существует множество причин, вызывающих подобную патологию, однако наиболее часто встречающимися являются инфекционные (вирусные гепатиты), алкогольные и токсические поражения (Иванов Ю.В. и др.. 2003; Морозов С.Ю., 2009).

Поскольку до настоящего времени проблема лечения больных с нарушением функции печени остается чрезвычайно острой и. подчас, трудно решаемой, важнейшими представляются меры, направленные на раннюю диагностику печеночной недостаточности, достоверную оценку тяжести течения процесса и эффективности проводимых терапевтических мероприятий.

Известно, что печень играет ключевую роль в регуляции углеводного гомеостаза в организме, обеспечивая оптимальный уровень содержания глюкозы в крови, что необходимо для энергообеспечения клеток практически всех органов и тканей (Безбородкина H. Н., 2008; Городецкий В.К., 2006).

Показано, что о состоянии печени можно судить по результатам проведения печеночных проб на состояние гликогенсинтернческой функции печени (глюкозотолерантный, галактозотолерантный и адреналиновый тесты), поскольку любое значимое нарушение функции и структуры печеночных клеток приводит к изменению скорости синтеза гликогена (Древаль A.B., 2006; Сас Е.И ., 2007; Bain V. et al., 2004).

Однако в современной клинической практике функциональные печеночные пробы используются нечасто, поскольку появились иные критерии, позволяющие судить о поражении печени (изменение биохимических показателей крови, УЗИ, биопсия и др.). Вместе с тем. показано, что нередко степень повреждения клеток печени не соответствует клиническим проявлениям, что вынуждает продолжать работу по изысканию и совершенствованию методов функциональной диагностики состояния печени.

Цель работы

Экспериментально обосновать использование функциональных печеночных проб в условиях острого токсического повреждения печени и выработать критерии оценки степени тяжести поражения гепатоцитов и прогноза течения патологии. Задачи исследования:

1. Изучить особенности морфофункционального состояния клеток печени в динамике ее токсического поражения, вызванного введением различных доз четыреххлористого углерода.

2. Модифицировать функциональные пробы (глюкозотолерантный, галактозотолерантный и адреналиновый тесты) для повышения их информативности в оценке степени тяжести острого токсического повреждения гепатоцитов.

3. Провести сравнительный анализ диагностических возможностей указанных модифицированных проб в условиях острого токсического поражения печени.

4. На основании полученных результатов разработать критерии оценки степень тяжести поражения гепатоцитов и прогноза течения патологии. Научная новизна

В работе впервые показано, что внутрибрюшинное введение 50% масляного раствора ЧХУ в дозах 0,25 и 0,5 мл на 100 г массы тела сопровождается изменением морфологической картины ткани печени и биохимических показателей крови, отражающих токсическое повреждение гепатоцитов, максимальная выраженность которых наблюдалась в конце 1 суток исследования; в конце 5 суток обнаруживались морфологические и биохимические признаки происходящей репарации.

Впервые проведен анализ возможности использования модифицированных нами глюкозотолерантного, галактозотолерантного и адреналинового тестов, а также разработан алгоритм совместной оценки указанных тестов (глюкозотолерантного и галактозотолерантного, глюкозотолерантного и адреналинового тестов) для характеристики особенностей течения острого токсического поражения печени, на основании чего разработаны наиболее информативные критерии указанных тестов, характеризующие как усугубление патологического процесса, так и начало процессов регенерации.

Теоретическая и практическая значимость.

Экспериментально обоснована эффективность использования функциональных проб: модифицированных ГТТ и ГалТТ, а также сочетанного применения глюкозотолерантного и адреналинового тестов для характеристики острого токсического поражения печени и оценке течения восстановительных процессов.

Основные положения, выносимые на защиту:

Введение экспериментальным животным 50% масляного раствора ЧХУ в дозах 0,25 и 0.5 мл на 100 г массы вызывает острое токсическое повреждение

печени с максимальной выраженностью проявлений через 24 часа после индукции поражения и постепенным развитием репаративных процессов к 5 суткам наблюдения.

Применение глюкозотолерантного и галактозотолерантного тестов в нашей модификации позволяет выявить ранние стадии токсического поражения печени и оценить динамику развития патологии. Разработанный алгоритм совместной оценки функциональных проб (глюкозотолерантного и галактозотолерантного, глюкозотолерантного и адреналинового) позволяет детализировать особенности течения острого токсического поражения печени.

Личный вклад автора

Приведенные в работе данные получены при личном участии автора на всех этапах работы, включая составление плана, постановку задач, выбор методов, проведение исследований, статистическую обработку результатов исследований и оформление публикаций.

Апробация работы

Основные положения работы изложены и представлены на 35-й конференции молодых ученных СГМА (Смоленск - 2007), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и студентов по медицине (Тула - 2009).

Публикации по теме диссертации

По теме кандидатской диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 3 статьи в центральных рецензируемых журналах из списка рекомендованного ВАК. Зарегистрировано 2 рационализаторских предложения (удостоверение на рационализаторское предложение № 1537 от 27.02.2009 и №1549 от 09.02.2010). Получены 2 патента на изобретение № 2382595 и № 2442226.

Структура н объем диссертации

Диссертация изложена на 120 страницах компьютерного набора и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования. 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы. Список литературы включает в себя 172 источников, из них 114 отечественных и 58 иностранных. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 12 рисунками.

Работа выполнена в соответствии с планом НИР ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития Российской Федерации (№ государственной регистрации 012008077462).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования. Работа выполнена на 262 белых беспородных крысах обоего пола массой 180-260 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария при естественном световом режиме, свободном доступе к лабораторному корму и воде соответственно нормативам ГОСТа «Содержание экспериментальных животных в питомниках НИИ». В

контрольные и опытные группы отбирали крыс одинаковой массы. Каждая экспериментальная группа включала не менее 7 животных.

Исследования проводили в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985). правилами лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ от 19.06.2003 № 267), и законом «О защите животных от жестокого обращения» гл.У, ст. 10, 4679 - II ГД от 01.12.1999 г.

Для индукции токсического поражения печени опытным животным вводили внутрибрюшинно четыреххлорпстый углерод (ЧХУ) в виде 50% масляного раствора.

Выбор четыреххлористого углерода в качестве индуктора печеночного поражения обусловлен и тем фактом, что воздействие этого гепатотоксина является одной из наиболее отработанных экспериментальных моделей для изучения реакции печени на повреждение. Известно (СагуаШо Я.А е1 а1., 2003), что отравление экспериментальных животных этим ксенобиотиком приводит к морфологическим и биохимическим изменениям, которые аналогичны острым поражениям печени различной этиологии у человека.

Было проведено 4 серии опытов, причем в каждой серии были предусмотрены одна контрольная и две опытные группы животных.

Крысам 1-й опытной группы ЧХУ вводили однократно в/б в дозе 0,25 мл на 100 г, животным 2-й опытной группы - в дозе 0,5 мл на 100 г массы. Контрольные животные получали в/б растительное масло в дозе 0,5 мл на 100 г массы.

Все исследования проводили в конце 1-х, 3-х и 5-х суток после введения

ЧХУ.

В первой серии опытов, выполненной на 88 животных, изучали изменение функции клеток печени в динамике токсического поражения с помощью модифицированного глюкозотолерантного теста. С целью обеспечения максимальной нагрузки на гликогенсинтетическую функцию печени в процессе предварительной работы была подобрана доза вводимой глюкозы, которая оказалась в 2 раза выше обычно применяемой и она составила 2 г/кг массы тела. Для проведения теста животным после определения тощакового уровня глюкозы крови внутрибрюшинно вводили 40% раствор глюкозы в указанной дозе и регистрировали изменение уровня гликемии ежечасно на протяжении 3-х часов.

Во второй серии экспериментов (п=61) функциональное состояние гепатоцитов после индукции поражения печени изучали при помощи модифицированного нами галактозотолерантного теста. Как и в первой серии, предварительно была подобрана оптимальная доза галактозы, позволяющая выявить даже небольшие нарушения способности клеток печени превращать этот моносахарид в глюкозу и далее - в гликоген. Она составила 4 г/кг массы тела, что превышает обычно применяемую в клинике дозу в 4 раза. Изменение концентрации глюкозы в крови крыс проводили до и через 1, 2 и 3 часа после

внутрибрюшинного введения 40% раствора галактозы.

В третьей серии экспериментов (п=35) производили оценку функционального состояния печени в конце 1-х, 3-х и 5-х суток после введения ЧХУ с помощью адреналинового теста. Для этого определяли содержание глюкозы в крови животных до и на 30, 45 и 60 минуте после внутрибрюшинного ведения крысам 0,5 мл 0,001% раствора адреналина.

Четвертая серия опытов (п=78) была посвящена разработке двойного нагрузочного теста для более полной оценки способности гепатоцитов аккумулировать глюкозу в виде гликогена. Этот тест предусматривал последовательное проведение ГТТ и адреналинового теста. Принимая во внимание, что при проведении ГТТ у контрольных крыс максимальные цифры содержания глюкозы в крови наблюдались через 30 минут после начала исследования, а через 3 часа происходило нормализация концентрации глюкозы в крови, регистрацию уровня гликемии проводили через 30 и 45 минут после ее в/б введения в дозе 0.5 мл на 100 г массы тела, а также в конце 3 часа теста. Сразу после этого крысам в/б вводили 0,001% раствор адреналина и через 30 минут вновь определяли концентрацию глюкозы в крови.

Кроме этого, у части животных контрольной, а также 1-й и 2-й опытных групп был проведен анализ суточной мочи на наличие глюкозурии. Для этого после 12-часовой голодной паузы крысам вводили 40% раствор глюкозы в дозе 0,5 мл на 100 г массы тела и для сбора мочи животных на 24 часа фиксировали в специальном боксе, обеспечивая свободный доступ к воде. Наличие глюкозы в моче определяли полуколичественным методом с помощью индикаторных полосок Multistix.

Все манипуляции (взвешивание, введение препаратов, декапитацию) осуществляли утром с 9.00 до 12.00 после 12-14 часов голодания с целью исключения влияния суточных колебаний метаболизма.

Забор крови осуществляли из хвостовой вены, содержание в ней глюкозы регистрировали с помощью глюкометра One Touch Ultra фирмы «Джонсон & Джонсон» согласно инструкции, предложенной фирмой -производителем.

Забой грызунов осуществляли путем одномоментной декапитации под эфирным наркозом с целью получения ткани печени для морфологического исследования и забора крови для биохимического анализа.

Материал для биохимических исследований забирали сразу после забоя животных. Сыворотку крови получали путем центрифугирования цельной негепаринизированной крови в течение 10 минут при частоте 3000 об/мин. Активность аспартаттрансамнназы (ACT) и аланинтрансаминазы (АЛТ оценивали по методу Реймана, Френкеля, а щелочной фосфотазы (ЩФ) -кинетическим методом с АМП-буфером.

Количество общего белка в сыворотке крови определяли биуретовым методом. Уровень альбумина изучали по методике с бромкрезоловым зеленым.

Для общегистологического изучения печень фиксировали в 10%

забуференном формалине и подвергали стандартной гистологической проводке с последующей заливкой в парафин. С помощью санного микротома готовили срезы толщиной 5-6 мкм, которые окрашивали по общепринятой методике гематоксилином и эозином (обзорная окраска). Обзорную оценку гистологических срезов печени проводили на микроскопе типа «Биололам» по общепринятой методике. Полученные материалы документировали, фотографировали на микроскопе с помощью цифровой камеры.

Все исследования проводили в ЦНИЛ (центральная научно-исследовательская лаборатория) Смоленской государственной медицинской академии (заведующий - Федоров Г.Н.).

Полученные результаты обрабатывали общепринятыми методами вариационной статистики при помощи программы «Excel» из программного пакета «Office ХР» и «Statgraphics Plus». Она включала вычисление среднеарифметической (М) и её стандартной ошибки (т), построение граф ических изображений. Достоверность различий между количественными показателями вычисляли с использованием критерия Стьюдента, результаты считали статистически достоверными при р<0,05. При распределении отличного от нормального, использовали непараметрические показатели: критерий Wilcocxon для анализа различий между связанными выборками и критерий Kruskal-Wallis для исследования различия нескольких независимых выборок.

Результаты исследования и чх обсуждение

Введение экспериментальным половозрелым крысам обоего пола 50% масляного раствора ЧХУ в дозе 0,25 и 0,5 мл на 100 г массы привело к мофологически и биохимически значимым нарушениям в гепатоцитах и периферической крови, которые сохранялись в течение всего времени исследования. Причем, наиболее выражены эти изменения были у животных в конце 1 и 3 суток после введения обеих доз ЧХУ.

Так, при морфологическом изучении состояния печени крыс обеих опытных групп в конце первых суток после воздействия ЧХУ выявлены характерные для токсического повреждения изменения, в виде центролобулярных зон некроза. В последующие сроки наблюдения (3 и 5 сутки после введения ЧХУ) на фоне гистологической картины продуктивного воспаления наблюдались признаки клеточной регенерации, сохранялись и дистрофические изменения в клетках печени.

При биохимическом исследовании сыворотки крови крыс обеих опытных групп в конце 1 суток после введения ЧХУ обнаружено резкое повышение активности трансаминаз АЛТ и ACT (рис.1): у животных 1-й группы активность АЛТ и ACT оказалась выше контрольных цифр соответственно в 2,75 и 1,8- раза, а у крыс 2-й группы - в 2.5 и 2,1 раза (р<0,05 во всех случаях).Характерно, что в этот срок исследования у крыс 1-й группы, которым ЧХУ ввели в дозе 0,25 мл на 100 г массы тела, другие изученные биохимические показатели крови по сравнению с контрольными животными были существенно не изменены, в то время как в крови животных 2-й группы.

получивших ЧХУ в дозе 0,5 мл на 100 г массы тела, помимо повышения активности АЛТ и ACT, наблюдалось существенное увеличение активности ЩФ (в 2 раза по сравнению с контрольными цифрами) и снижение концентрации альбуминов (в 1,2 раза, р<0,05 во всех случаях).

АЛТ

11 группа I 2 группа г контроль

Примечание:* р<0.05 по сравнению с контролем

*#р<0.05 при сравнении результатов крыс 1-й и 2-й опытных групп Рисунок 1. Изменение активности АЛТ и ACT в крови крыс в разные сроки после токсического воздействия ЧХУ

С конца 3 суток исследования все изучаемые биохимические показатели крови крыс опытных групп значимо отличались от контрольных значений. Так, у животных 1-й опытной группы на фоне сохраняющейся высокой активности ACT и АЛТ крови, активность ЩФ на 31% превысила значения контрольных крыс (р<0,05), а концентрация общего белка и альбуминов крови оказались ниже контрольных величин на 6% и 13% соответственно (р<0,05 в обоих случаях, рис.2).

У крыс 2-й опытной группы в этот срок наблюдения выявлено снижение содержание альбуминов крови (на 27% ниже контрольных цифр. р<0.05), и концентрации общего белка - на 7% (р<0.05).

На 5 сутки после введения ЧХУ, изученные биохимические параметры крови крыс 2 группы существенно не изменились по сравнению с 3 сутками исследования, тогда как у крыс 1-й группы произошло дальнейшее уменьшение содержания альбуминов крови - на 19% по сравнению с контролем (р<0,05). Вместе с тем активность ЩФ оказалась в 1.7 раза выше значений, полученных у контрольных крыс (р<0,05).

В процессе дальнейшей работы были изучены возможности модифицированных нами функциональных проб на гликогенспнтетическую функцию печени для характеристики тяжести токсического поражения печени.

Предварительно, для достижения максимальной нагрузки на гликогенсинтетическую функцию печени, что, очевидно, должно позволить выявить наиболее ранние и относительно небольшие ее изменения, была

подобрана доза вводимой глюкозы. Она составила 2 г/кг массы тела, что в 2 раза выше обычно применяемого для этой цели количества глюкозы.

Примечание:* р<0.05 по сравнению с контролем

#*р<0.05 при сравнении результатов крыс 1-й и 2-й опытных групп Рисунок 2. Изменение содержания в крови крыс общего белка и альбуминов в разные сроки после воздействия ЧХУ

Говоря о результатах ГТТ, подчеркнем, что у контрольных крыс «сахарные кривые» в целом соответствовали данным литературы (Древаль A.B., 2006). У этих животных через 1 час от начала теста концентрация глюкозы в крови увеличилась по сравнению с исходным уровнем в 1.6 раза (р<0,05), через 2 часа ее концентрация превышала тощаковые значения на 6% (р<0,05), а через 3 часа уже существенно не отличалась от контрольных величин.

Кроме этого, мы посчитали необходимым у части животных контрольной и опытных групп провести анализ суточной мочи на содержание глюкозы. С этой целью после 12-часовой голодной паузы крысам внутрибрюшинно вводили названную выше дозу глюкозы. Затем животных помещали в специальный контейнер для сбора мочи, обеспечивая при этом свободный доступ к воде. Было установлено, что у контрольных крыс глюкоза в суточной моче отсутствовала, тогда как в конце 1 суток после введения ЧХУ у опытных животных глюкоза в моче обнаруживалась во всех наблюдениях, в конце 3 суток она присутствовала в моче у всех крыс 2-й группы и у 30% крыс 1-й группы. В конце 5 суток в моче опытных животных глюкоза не обнаружена.

Что касается результатов ГТТ, полученных у опытных животных, то как у крыс 1-й группы, которым ЧХУ был введен в дозе 0,25 мл на 100 г массы тела, так и 2-й группы, получивших ЧХУ в дозе 0,5 мл на 100 г массы тела.

максимальные изменения гликемических кривых были обнаружены через 24 часа после индукции токсического повреждения печени.

Так, в конце первых суток после введения ЧХУ исходный уровень глюкозы крови у крыс обеих опытных групп был значительно ниже контрольных величин: у животных 1-й группы на 14,5%, а у крыс 2-й группы -на 35% (р<0,05 в обоих случаях). При проведении ГТТ содержание глюкозы в крови животных 1-й группы превысило аналогичные величины контрольных крыс в конце 1, 2 и 3 часа теста на 13%, 27% и 15% соответственно (рис. 3), а у крыс 2-й группы - на 18%, 12% и 13% (р<0,05 во всех случаях).

В конце 3 суток после введения ЧХУ тощаковый уровень глюкозы крови у животных как 1-й, так и 2-й опытных групп был на 17% ниже контрольных значений (р<0.05). Через 1 час от начала ГТТ концентрация глюкозы в крови животных 1-й опытной группы соответствовала контрольным цифрам, однако ее содержание в крови в конце 2 и 3 часа, оставались выше, чем у контрольных животных на 10% и 11% соответственно (р<0.05 в обоих случаях); у крыс 2-й опытной группы в конце 1, 2 и 3 часа ГТТ концентрация глюкозы крови оставалась выше контрольных цифр на 13%. 10% и 11% соответственно (р<0,05 во всех случаях) .

10

В контроль и 1 группа и 2 группа

1 ; 3 ! 5 суткисуткисутки

1 3 | 5 сутки сутки|сутки

сутки;сутки сутки

I 1 час 2 час 3 час

Примечание: » р<0,05 по сравнению с контролем

**р<0,05 при сравнении результатов крыс 1-й и 2-й опытных групп Рисунок 3. Концентрация глюкозы в крови животных 1 и 2 опытных групп в динамике ГТТ, проведенного в разные сроки после введения ЧХУ

В конце 5 суток после введения ЧХУ у крыс 1 группы концентрация глюкозы в крови через 1 и 2 часа от начала ГТТ не отличалась от аналогичных значений крыс контрольной группы, и только в конце 3 часа она оказалась выше контрольных величин на 10% (р<0,05).

Что касается крыс 2-й группы, то в этот срок наблюдения содержание глюкозы в крови при проведении ГТТ превышало подобные значения контрольных крыс в конце 1 и 3 часа исследования на 15% и 10%

II

соответственно (р<0,05 в обоих случаях).

Отметим, что различия в результатах ГТТ у крыс 1-й и 2-й опытных групп касались преимущественно 1 часа исследования, когда уровень глюкозы в крови животных 1-й группы оказался ниже аналогичных значений крыс 2-й группы в конце 3 и 5 суток после введения ЧХУ на 13% и 15% соответственно (р<0,05 в обоих случаях).

Расчет гипергликемического и гипогликемического коэффициентов у опытных крыс 1-й и 2-й группы показал, что гипергликемический коэффициент (соотношение уровня глюкозы в крови в конце 1 часа ГТТ к его тощаковым значениям) оказался значительно выше нормы практически во все сроки наблюдения, в то время как гипогликемический коэффициент (соотношение уровня глюкозы в крови в конце 2 часа ГТТ к его тощаковым значениям) был изменен только в конце 1 суток после введения ЧХУ (табл. 1).

Таблица 1

Результаты расчета гипергликемического и гипогликемического коэффициентов при проведении ГТТ у опытных крыс в конце 1, 3 и 5 суток _после введения ЧХУ

Контроль Сутки после введения ЧХУ

1 3 5

1 группа 2 группа 1 группа 2 группа 1 группа 2 группа

Гипергликемический коэффициент 1,61 ± 0,02 2,13 ± 0,04* 2,84 X 0,07*, ** 2,05 ± 0,02* 2,12 ± 0,06* 1,72 ± 0,03 2,05 ± 0.03*

Гипо- 1,22 1,62 1,83 1.22 1,41 1,10 1.21

гликемический ± ± ± ± ± ± ±

коэффициент 0,04 0,02* 0,05 * 0,08 0,06 0,06 0.05

Примечание: * р<0,05 по сравнению с контролем

** р<0,05 при сравнении результатов разных опытных групп

Это позволяет рекомендовать использовать расчет гипергликемического коэффициента при интерпретации результатов ГТТ в динамике после острого токсического поражения печени.

Принимая во внимание, что при выполнении работы часть животных 2 опытной группы, получивших более высокую дозу ЧХУ, не доживала до конца 2 суток, мы посчитали необходимым провести ретроспективный анализ результатов ГТТ теста у таких крыс.

У крыс 2-й группы, павших через 12-20 часов после проведения теста были выявлены низкие цифры тощаковых значений глюкозы крови (3,2 ± 0,17ммоль/л), а через 1 час от начала ГТТ концентрация глюкозы в крови оказалась на 20%, выше контрольных величин (р<0,05). однако эти результаты существенно не отличались от полученных у крыс, оставшихся жить. А вот

через 2 и 3 часа от начала ГТТ уровень глюкозы в крови животных, погибших через 12-20 часов после проведения теста значительно превысил цифры как контрольных (на 43% и 33% соответственно, р<0,05 в обоих случаях), так и выживших крыс 2-й группы (на 22% и 15% соответственно, р<0,05).

Расчет гипергликемического и гипогликемического коэффициентов у опытных крыс 2-й группы подгруппа А (павших через 12-20 часов после проведения теста) и подгруппа Б (оставшихся жить показал, что гипергликемический коэффициент у животных обеих подгрупп был равен 2.8, в то время как гипогликемическнй коэффициент у крыс подгруппы А (2.3) оказался значительно выше по своему значению, чем у крыс группы Б (1.8). Это позволяет рекомендовать использовать расчет гипогликемического в качестве одного из критерия прогноза неблагоприятного течения патологии.

Таким образом, полученные результаты позволяют говорить о том, что высокие цифры содержания глюкозы в крови при выполнении глюкозотолерантного теста, и, прежде всего, через 2 и 3 часа от его начала, в сочетании с выраженной тощаковой гипогликемией, свидетельствуют о серьезных нарушениях в печени под влиянием применённого гепатропного яда, и могут служить критерием неблагоприятного течения патологии.

Следующим этапом работы было изучение диагностических возможностей модифицированного нами галактозотолерантного теста в условиях экспериментального токсического повреждения печени.

Предварительно было установлено, что у здоровых животных через 1 час от начала ГалТТ уровень глюкозы в крови увеличился в 1,3 раза по сравнению с тощаковым уровнем (р<0,05), максимальные значения концентрации глюкозы в крови наблюдались через 2 часа после введения галактозы (в 1,5 раза выше исходных цифр, р<0,05).Через 3 часа от начала теста уровень глюкозы в крови контрольных крыс относительно 2 часа исследования незначительно снижался.

Иная динамика изменения концентрации глюкозы в крови при выполнении ГалТТ выявлена у крыс, получивших ЧХУ: у этих животных практически отсутствовала разница в значениях концентрации глюкозы в конце 1 и 2 часа теста, а к 3 часу исследования она снижалась более значительно (рис 4).

Характерно, что максимальные изменения гликемической кривой при проведении ГалТТ у животных как 1-й, так и 2-й опытных групп также были выявлены через 24 часа после индукции токсического повреждения печени. В этот срок наблюдения содержание глюкозы в крови крыс 1 группы в конце 1, 2 и 3 часа ГалТТ был ниже контрольных значений на 17%, 29% и 28% соответственно, а у крыс 2-й группы - на 30%, 38% и 36% (р<0.05 во всех случаях). Необходимо также отметить, что все результаты теста у крыс 2-й группы были существенно ниже по сравнению с животными 1-й опытной группы (соответственно на 16%, 13% на 12%. р<0,05 во всех случаях).

Что касается 3 суток после введения ЧХУ, то и в этот срок наблюдения V животных 1-й опытной группы уровень глюкозы в крови при выполнении

ГалТТ оставался ниже показателей контрольных крыс в конце 1 часа исследования на 9%, а через 2 и 3 часа - на 20% и 22,5% соответственно (р<0,05 во всех случаях). У животных 2-й группы через 1 час от начала ГалТТ подобные различия с контрольными значениями составили 20%, через 2 часа -29%, а через 3 часа - 31% (р<0,05 во всех случаях).

1 сутки 3 сутки 5 сутки

! / / т £ '/ * ■ т Ач

*

исх. 1 час 2 час Зчас исх. 1 час 2 час Зчас исх 1 час 2 час 3 час

—*—1 группа — >—2 группа — А- иоптрэль

Рисунок 4. Результаты ГалТТ в конце 1, 3 и 5 суток после введения ЧХУ

В конце 5 суток исследования концентрация глюкозы в крови у крыс 1 группы в конце 1 часа ГалТТ приблизилась к цифрам контрольных животных, хотя в конце 2 и 3 часа исследования содержание глюкозы в крови этих животных было по-прежнему ниже контрольных величин (соответственно на 12% и 20%, р<0,05 в обоих случаях).

Характерно, что у крыс 2-й опытной группы в этот срок наблюдения концентрация глюкозы в крови в конце 1, 2 и 3 часа ГалТТ была значительно ниже, чем у животных контрольной группы (соответственно на 8%. 16% и 10%, р<0,05 во всех случаях).

При сопоставлении результатов ГалТТ у крыс 1-й и 2-й опытных групп выявились существенные различия в содержании глюкозы крови во все сроки исследования.

Так, в конце 1 суток после введения ЧХУ у животных 1-й группы концентрация глюкозы крови при проведении ГалТТ в конце 1, 2 и 3 часа была на 16%, 13% и 12% соответственно выше аналогичных величин крыс 2 опытной группы (р<0,05 во всех случаях); в конце 3 суток (спустя 1 и 3 часа теста) - на 12 % (р<0,05 в обоих случаях), а в конце 5 суток (1, 2 и 3 час теста) - на 8%. 16% и 10% (р<0,05 во всех случаях).

Что касается результатов ГалТТ. проведенного через 24 часа после введения ЧХУ у животных 2-й группы, которые в течение 12-20 часов после

проведения ГалТТ погибли, то существенных различий по сравнению с таковыми у выживших крыс не выявлено.

Таким образом, полученные в процессе выполнения этой части работы результаты позволяют говорить о том, что галактозотолерантный тест является более информативным по сравнению с ГТТ.

Действительно, при проведении ГалТТ уже с первых суток после индукции токсического повреждения печени гликемические кривые у крыс 1-й и 2-й опытных групп, получивших различные дозы ЧХУ, существенно различались.

Отметим также, что при анализе гликемических кривых, полученных при выполнении ГТТ и ГалТТ у животных двух опытных групп, оказалось, что в обоих случаях для оценки состояния печени при ее токсическом повреждении наиболее информативными являются результаты 1 часа исследования.

Причем, более наглядным является использование предложенного нами коэффициента, отражающего соотношение концентрации глюкозы в крови в конце 1часа при проведении ГТТ и ГалТТ. Так, у контрольных животных он не превышает 1,2, в то время как у крыс 1-й опытной группы этот коэффициент в конце 1 суток равнялся 1,6, в конце 3 суток - 1,3, а в конце 5 суток не отличался от контрольных величин. У крыс 2-й опытной группы в конце 1 суток этот коэффициент был равен 2, в конце 3 суток - 1,7 и в конце 5 суток -1,5.

Следующим этапом нашей работы было изучение диагностических возможностей адреналинового теста при экспериментальном повреждении печени.

Для проведения теста адреналин вводили животным внутрибрюшинно в стандартной дозе 0,5 мл 0,001 % раствора. Уровень глюкозы в крови крыс определяли через 30, 45 и 60 минут. У контрольных животных концентрация глюкозы в крови на 30 минуте теста на 30% превысила исходные значения (р<0,05) н к 60 минуте происходила ее нормализация.

Что касается крыс обеих опытных групп, то при проведении этого теста на протяжении всего периода наблюдения после введения ЧХУ содержание глюкозы в крови были значительно ниже по сравнению с аналогичными величинами у животных контрольной группы.

Так, в конце 1 суток после введения ЧХУ через 30 минут после введения адреналина концентрация глюкозы крови животных 1-й группы оказалась ниже по сравнению с аналогичными показателями контрольных крыс на 30%. (р < 0,05), на 45 и 60 минуте теста - на 27% (р < 0,05 в обоих случаях). У животных 2-й группы уровень глюкозы после введения адреналина на 30, 45 и 60 минуте теста оказался ниже аналогичных значений контрольных крыс соответственно на 30% , 27% и 37% (р < 0,05 во всех случаях).

В конце 3 суток после введения ЧХУ у крыс 1-й группы концентрация глюкозы в крови через 30 и 45 минут после введения адреналина была на 25% и 22% соответственно, а через 60 минут - на 27% ниже, чем у контрольных

животных (р < 0,05 во всех случаях); у крыс 2-й группы на 30, 45 и 60 минуте адреналинового теста содержание глюкозы в крови оказалось ниже контрольных цифр на 31%, 25% и 30% соответственно (р < 0,05 во всех случаях).

В конце 5 суток после введения ЧХУ через 30, 45 и 60 минут от начала адреналинового теста содержание глюкозы в крови животных 1-й группы оказалось меньше, чем у крыс контрольной группы на 17% , 12% и 13% соответственно, а у крыс 2-й группы - на 19% , 11% и 22% соответственно (р<0,05 во всех случаях).

Отметим также, что результаты теста у животных разных опытных групп через 30 и 45 минут после ведения адреналина практически не различалась между собой во все сроки исследования. Однако, на 60 минуте теста содержание глюкозы в крови крыс 2-й группы в конце 1 суток после введения ЧХУ оказалось ниже, чем у животных 1-й группы на 14%, а в конце 5 суток -на 17% (р< 0,05 в обоих случаях).

Что касается результатов теста у крыс 2-й группы, которые погибли через 12-20 часов после его проведения, то различия выявлены лишь на 45 минуте после введения адреналина, когда концентрация глюкозы в крови этих животных оказалась на 16% ниже, чем у выживших крыс (р<0,05).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что проба с введением адреналина подтверждает факт нарушения именно гликогенсинтетической функции печени в результате ее токсического повреждения. Больше того, они позволяют говорить, что, очевидно, прогностически неблагоприятным является низкий уровень прироста концентрации глюкозы крови через 30 минут после введения адреналина.

В дальнейшей работе мы посчитали желательным последовательное проведение ГТТ и адреналинового теста, что, по нашему мнению, позволит более точно оценить состояние печени у животных после введения различных доз ЧХУ.

Для этого после внутрибрюшинного введения глюкозы в процессе выполнения ГТТ и динамического определения ее содержания в крови в течение 3-х часов, животным вводили раствор адреналина и через 30 минут вновь определяли концентрацию глюкозы в крови.

Обнаружено, что у крыс контрольной группы через 30 минут после введения глюкозы ее содержание в крови оказалось 10,6 ммоль/л. то есть в 2,2 раза больше исходного уровня (р< 0,05). Через 45 минут уровень глюкозы крови оказался в 1,85 раза больше тощаковых значений (р< 0,05). Подчеркнем, что это на 16% меньше, чем в предыдущий срок исследования (р< 0,05). Через 3 часа проведения ГТТ концентрация глюкозы крови не отличалась от исходных значений.

Через 30 минут после введения адреналина концентрация глюкозы в крови контрольных животных вновь увеличилась и оказалась в 1.9 раза выше исходных величин (р< 0,05).

Результаты проведения комбинированного (ГТТ и адреналин) теста у

животных, получивших ЧХУ в дозе 0,25 мл на 100 г массы тела (1 группа) свидетельствуют, что в конце 1, 3 и 5 суток наблюдения тощаковый уровень глюкозы крови оказался соответственно на 19%, 15% и 6% меньше, чем у крыс контрольной группы (р < 0,05 во всех случаях).

Уровень глюкозы крови у крыс 1-й группы через 45 минут после ее внутрибрюшинного введения оказался меньше, чем у животных контрольной группы в конце 1 суток после введения ЧХУ на 7%, а в конце 3 и 5 суток - на 9% (р < 0,05 во всех случаях).

Однако, через 3 часа после внутрибрюшинного введения глюкозы, ее концентрация в крови опытных крыс оказалась больше, чем у контрольных животных во все сроки исследования (1,3 и 5 сутки) соответственно на 17%, 13% и 11% (р < 0,05 во всех случаях).

После введения адреналина уровень глюкозы крови у животных 1-й группы, получивших ЧХУ в дозе 0,25 мл на 100 г массы тела, увеличивался менее значительно, чем у крыс контрольной группы. Так на 1, 3 и 5 сутки наблюдения содержание глюкозы в крови после введения адреналина у животных 1-й группы было меньше, чем в контроле соответственно на 39%, 24% и 18% (р < 0,05 во всех случаях).

У крыс 2-й группы, получивших ЧХУ в дозе 0.5 мл на 100 г массы тела тощаковый уровень глюкозы крови был меньше, чем в контрольной группе в конце 1 и 3 суток после введения ЧХУ на 29% и 7% соответственно (р<0,05 в обоих случаях), а на 5 сутки показатели у опытных и контрольных животных существенно не различались.

Через 45 минут после внутрибрюшинного введения глюкозы, ее содержание в крови крыс 2-й группы оказалось меньше, чем в контроле на 3 и 5 сутки после введения ЧХУ соответственно на 7% (р<0,05 в обоих случаях).

Через 3 часа после введения глюкозы ее концентрация в крови крыс 2-й группы оказалась больше, чем у контрольных животных на 1,3 и 5 сутки после введения ЧХУ соответственно на 20%, 11% и 9% (р <0,05 во всех случаях).

Таким образом, в целом динамика уровня глюкозы крови крыс 1-й и 2-й опытных групп на фоне проведения модифицированного ГТТ была аналогичной.

Введение адреналина крысам 2-й опытной группы вызвало еще менее значительный прирост уровня глюкозы крови, чем у животных 1-й группы.

Так на 1-е сутки после введения ЧХУ введение адреналина вообше не изменило концентрацию глюкозы крови (по сравнению с предыдущим сроком исследования). На 3 сутки после введения ЧХУ животным 2-й группы уровень глюкозы крови после введения адреналина был меньше, чем в контроле на 30%, а на 5 сутки наблюдения - на 28% (р<0,05 в обоих случаях).

Отметим, что проведение сочетанного ГТТ и адреналинового теста позволило выявить различия между животными 1-й и 2-й опытных групп.

Так на фоне введения адреналина уровень глюкозы крови животных 2-й группы был меньше, чем у крыс 1-й группы на 1, 3 и 5 сутки после введения

ЧХУ соответственно на 13% 7% и 12% (р < 0,05 во всех случаях), что может свидетельствовать о высокой чувствительности данного теста к степени повреждения гликогенсинтетической функции печени после введения использованного гепатотропного яда.

Что касается результатов названного двойного теста у животных 2 группы (павших в дальнейшем), то ретроспективный анализ выявил еще более низкий уровень глюкозы на 45 минуте ГТТ (6,8 ммоль/л) и в конце 3 часа исследования (3,7 ммоль/л) и эти цифры оказались соответственно на 37% и 49% ниже, чем аналогичные результаты крыс, оставшихся жить (р<0,05 в обоих случаях). Через 30 минут после введения адреналина эти различия также были более существенны: у крыс, погибших через 12-20 часов после проведения теста, содержание глюкозы в крови было на 41% меньше, чем у выживших животных (р< 0,05).

В заключении следует подчеркнуть, что полученные результаты свидетельствуют о возможности использования модифицированных нами функциональных проб и, прежде всего, предложенного двойного теста (ГТТ + адреналин) на состояние гликогенсинтетической функции печени в качестве одного из скрининговых методов оценки как степени ее острого токсического повреждения, так и, очевидно, развития процессов репарации либо прогрессирующего повреждения.

ВЫВОДЫ

1. В конце 1, 3 и 5 суток после введения крысам 50% масляного раствора четыреххлористого углерода в дозе 0,25мл и 0,5 мл на 100 г массы тела морфологическая картина ткани печени характеризуется развитием центролобулярных некрозов и жировой дистрофией гепатоцитов; в плазме переферической крови - повышена активность АСТ, АЛТ, ЩФ и снижена концентрация общего белка и альбуминов; имеет место существенное изменение гликемических кривых, полученных при проведении глюкозотолерантного, галактозотолерантного и адреналинового тестов. Максимальная выраженность таких изменений наблюдалась в конце 1 и 3 суток после введения четыреххлористого углерода в обеих примененных дозах.

2. Модифицированный глюкозотолерантный тест позволяет выявить самые ранние стадии токсического поражения печени; причем гипергликемический коэффициент в большей мере характеризует степень повреждения гепатоцитов, а динамика изменения гипогликемического коэффициента может быть использована для прогнозирования течения патологии. Проведение модифицированного галактозотолерантного теста при экспериментальном токсическом поражении печени позволяет характеризовать не только степень тяжести повреждения гепатоцитов, но и оценивать динамику развития патологии.

3. Предложенный коэффициент, отражающий соотношение концентрации глюкозы в крови в конце 1-го часа глюкозотолерантного теста к аналогичному

значению глюкозы при выполнении галактозотолерантного теста, может служить дополнительным критерием, характеризующим выраженность нарушения функционального состояния клеток печени при ее остром токсическом повреждении. Увеличение этого коэффициента выше 2,0 свидетельствует о тяжелом поражении гепатоцитов.

4. Нарушение гликогенсинтетнческой функции печени при ее токсическом повреждении наиболее полно выявляется при предложенном совместном применении функциональных проб (глюкозотолерантный тест и через 3 часа от его начала - введение адреналина). Увеличение концентрации глюкозы в крови на 30 минуте исследования более чем в 3 раза по сравнению с исходным уровнем с последующим снижением к 45 минуте теста более чем на 20%, отсутствие увеличения уровня глюкозы в крови в ответ на введение адреналина указывает на неблагоприятный прогноз течения токсического гепатита.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомендуется при использовании глюкозотолерантного теста в качестве одного из скрининговых методов оценки степени острого токсического повреждения печени проводить дополнительно расчет гипергликемического и гипогликемического коэффициентов.

2. Для динамического контроля за течением репаративных процессов в печени после ее острого токсического повреждения целесообразно использовать глюкозотолерантный и галактозотолерантный тесты с расчетом коэффициента, отражающего соотношение концентрации глюкозы в крови в конце 1-го часа глюкозотолерантного теста к аналогичному значению глюкозы при выполнении галактозотолерантного теста.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Тишкова Я.В. Разработка и использование тестов для оценки степени поражения печени / Я.В. Тишкова // Сборник материалов 35-конференции молодых ученых и научных работ 59-научной студенческой конференции СГМА (часть-2). - 2007.- С,- 47.

2. Тишкова Я.В. Изменение некоторых биохимических показателей крови в динамике токсического поражения печени / Я.В. Тишкова // Вестник Смоленской медицинской академии. - 2007. - №3. - С.-99-100.

3. Тишкова Я.В. К вопросу об эффективности использованного модифицированного глюкозотолерантного теста для ранней диагностики поражения печени / Я.В. Тишкова, О.В. Молотков // Вестник Смоленской медицинской академии. - 2008. - №3. - С. 43-46.

4. Тишкова Я.В. Показатели глюкозотолерантного теста в динамике развития токсического гепатита / Я.В. Тишкова, Я.И. Шарапов // Вестник Смоленской медицинской академии. - 2008. - №3. - С. 96-97.

5. Тишкова Я.В. Сравнительный анализ результатов проведения ГТТ с уровнем глюкозурии у крыс, подвергнутых воздействию ЧХУ I Я.В.

Тишкова, M.B. Тимофеева, O.A. Подгорная // Вестник Смоленской медицинской академии,- 2009. - №2. - С. 84.

6. Тишкова Я.В. Возможности использования глюкозотолерантного и адреналинового тестов для характеристики степени токсического поражения / Я.В. Тишкова // Вестник новых медицинских технологий, приложение к журналу. Сборник материалов VIII Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученных по медицине.- 2009. - Т. 16, №2. - С. 168-169.

7. Тишкова Я.В. Об использовании глюкозотолерантного и адреналинового тестов для определения функционального состояния печени при ее токсическом поражении / Я.В. Тишкова, О.В. Молотков, Э.Э. Ферамузова // Медицинский вестник Башкортостана. - 2009. - № 2. -С. 167-169.

8. Тишкова Я.В. Использование глюкозотолерантного и галактозотолерантного тестов в динамике острого экспериментального токсического поражения печени / Я.В. Тишкова, О.В. Молотков // Саратовский научно-медицинский журнал.- 2010. - Т.6, №6. - С. 309-313.

9. Тишкова Я.В. К вопросу об эффективности использования глюкозотолерантного теста для характеристики функционального состояния печени при ее токсическом поражении / Я.В. Тишкова, О.В. Молотков // Вестник Смоленской медицинской академии. - 2011. - №1. - С. 71-73.

10. Тишкова Я.В. использование галактозотолерантного теста для характеристики функционального состояния печени при ее токсическом поражении./ Я.В. Тишкова, О.В. Молотков // Медицинский вестник Башкортостана. - 2011. - № 5. - С. 110-112.

Патент на изобретение

1. Способ диагностики токсического гепатита в эксперименте /Леонов С.Д., Тишкова Я.В., Федоров Г.Н.// Пат. 2382595 РФ МПК А61 В5/05, G 09 В23/28,- № 2009142783/14; заявл. 28.10.2008; опубл.27.02.2010.Бюл. № 6.

2. Способ оценки тяжести острого поражения печени в эксперименте /Тишкова Я.В., Молотков О.В. // Пат. 2442226 РФ МПК G 09 В23/28. -№2010113391/14; заяв. 06.04.2010; опубл. 10.02.2012. Бюл. № 4.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АЛТ - аланинаминоттансфераза

ACT - аслартатаминотрансфераза

В/б - внутрибрюшинно

ГТТ - глюкозотолерантный тест

ГалТТ - галактозотолерантный тест

ЩФ - щелочная фосфотаза

ЧХУ - четыреххлористый углерод

Дата сдачи в печать 19.04.2012 г. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Объем 1,0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 2790/1.

Отпечатано в ООО «Принт-Экспресс», г. Смоленск, пр-т Гагарина, 21. Тел.: (4812) 32-80-70