Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Патофизиологические механизмы онкостатического действия мелатонина и метформина при экспериментальных неоплазиях

На правах рукописи

005013706

Маньчева Татьяна Александровна

ПАТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ОИКОСТАТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ МЕЛАТОШША И МЕТФОРМИІІА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ІІЕОПЛАЗИЯХ

14.03.03 - патологическая физиология

1 5 мдр ¿0:2

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Нижний Новгород 2012

005013706

Работа выполнена на кафедре патологии с курсом патологической физиологии Мордовского государственного университета имени Н.П. Огарева

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Плотникова Надежда Алексеевна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Потсмнна Татьяна Евгеньевна (Нижегородская государственная медицинская академия, г. Н. Новгород)

доктор медицинских наук, профессор Мосина Лариса Михайловна

(Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева, г. Саранск)

Ведущая организация: Российский университет дружбы народов, г. Москва.

Защита диссертации состоится «_»_2012 года в _часов на заседании

диссертационного совета Д 208.061.03 при Нижегородской государственной медицинской академии Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 603005, г. Нижний Новгород, пл. Минина, д. 10/1.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Нижегородской государственной медицинской академии Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (603104, г. Нижний Новгород, ул. Медицинская, д. За).

Автореферат разослан «__»_2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

Е.А. Дурново

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. К числу наиболее значимых направлений современной медицины относятся исследования закономерностей канцерогенеза и возможной фармакологической коррекции развития злокачественных новообразований. (Анисимов В.Н., 2008). Важно отметить, что любая из стадий канцерогенеза является потенциально реверсибелыюй, и воздействие на эти стадии будет иметь значительно больший успех, нежели воздействие на уже сформировавшуюся опухоль. Особая роль в процессе канцерогенеза принадлежит ангиогенезу, который играет ведущую роль в пролиферации солидных опухолей и метастазировании (Ferrara N., 2002).

Пролиферативная способность клеток опухоли не только мишень для изыскания новых лекарственных химиотерапевтических средств и совершенствования известных методов лечения злокачественных новообразований, но и достоверный непосредственный морфологический критерий эффективности терапии, а также один из ведущих показателей степени патоморфоза.

В настоящее время установлена ведущая роль свободнорадикалыюго механизма повреждения клеточных структур при ряде патологических процессов, в том числе и неопластических. Общеизвестно, что злокачественный клеточный рост сопровождается образованием свободных радикалов кислорода.

В последние годы большое внимание уделяется изучению биологических эффектов гормона эпифиза - мелатонина и антидиабетического бигуанида -метформина. Данные препараты обладают широким спектром физиологических влияний (Комаров Ф.И. и соавт., 2004; Claustrat В. et al., 2005; Арушанян Э.Б., 2005; Anisimov V.N.et al., 2006; Анисимов C.B. и соавт., 2002; Anisimov S.V., Popovic N., 2004). Основными функциями мелатонина в организме являются биоритмологическая, антиоксидантная и иммуномодулирующая. Кроме того, мелатонин является одним из сильнейших эндогенных поглотителей свободных радикалов (Комаров Ф.И. и соавт., 2004). В литературе имеются данные об ан-

тиокислительном действии антидиабетических бигуанидов (Anisimov V.N. et al., 2006), их прямом действии на митохондрии (Анисимов C.B. и соавт., 2002).

Несмотря на то, что противоопухолевая активность метформина и мела-тонина известна довольно давно, в течение длительного периода времени их действие изучалось только in vitro на культурах опухолевых клеток различного гистогенеза (Cos S., Sanchez-Barcelo E.J., 2000). Изучение механизмов антиканцерогенного действия мелатонина и метформина, их влияние на процессы опухолевого роста и неоангиогенеза, на модели индуцированного канцерогенеза, а также исследование их совместного влияния является актуальным направлением современной экспериментальной онкологии.

Цель исследования. Изучение патофизиологических механизмов онко-статического действия мелатонина и метформина в условиях экспериментального опухолевого роста.

Основные задачи исследования.

1. Изучение влияния мелатонина и метформина на частоту, множественность и размеры опухолей кожи, индуцированных бенз(а)пиреном у мышей.

2. Оценка влияния мелатонина и метформина на динамику морфологических изменений в ткани изучаемых опухолей.

3. Исследование воздействия мелатонина и метформина на процессы ангиогенеза в ткани экспериментальных неоплазий.

4. Изучение влияния метформина и мелатонина на пролиферативную активность в опухолевой ткани.

5. Исследование влияния мелатонина и метформина на выживаемость опухоленосителей и средний латентный период развития опухолей в условиях индуцированного канцерогенеза.

Научная новизна. В работе впервые проведено сравнительное исследование влияния мелатонина и метформина на индуцированный опухолевый рост in vivo, продемонстрировано ингибирующее действие изучаемых препаратов на развитие опухолей кожи и их метастатическую активность. Представлена мор-

фологическая характеристика изменений при использовании препаратов метаболического типа действия на бснз(а)пиреновой модели опухолей кожи.

Показано достоверное снижение абсолютного числа новообразований кожи при использовании в эксперименте мелатонина и метформина - препаратов, обладающих антиоксидантиой активностью.

В работе впервые дана оценка динамики процессов ангиогенеза и проли-феративной активности в опухолевой ткани при использовании мелатонина и метформина в условиях экспериментальных неоплазий.

Проанализировано действие применяемых препаратов на выживаемость опухоленосителей и средний латентный период развития опухолей.

Научно-практическая значимость. Результаты проведенных исследований расширяют представления о морфофункциональных особенностях экспериментальных неоплазий.

Полученные результаты могут быть использованы для дальнейшего экспериментального исследования антиканцерогенного, антиангиогенного и анти-пролиферативного действия мелатонина и метформина. Данные проведенных исследований могут быть использованы в системе практического здравоохранения, организации помощи онкологическим больным, разработок рекомендаций по применению мелатонина и метформина с целью профилактики и в составе комплексной терапии новообразований.

Основные положения, выносимые на защиту. Применение мелатонина и метформина при индуцированном бенз(а)пиреном опухолевом росте у мышей значительно уменьшает общую частоту развития опухолей кожи, снижает количество злокачественных неоплазий и их способность к метастазированию, угнетает процессы ангиогенеза и пролиферативную активность в тканях экспериментальных опухолей.

Внедрение результатов исследования в практическую деятельность. Работа выполнялась в соответствии с научной тематикой кафедры патологии с курсом патологической физиологии Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарева «Изучение антиканцерогенного действия анти-

оксидантов. Использование антиоксидантов с целью лечения онкологических заболеваний и профилактики побочных эффектов химиотерапии злокачественных опухолей». Номер государственной регистрации 01200004102.

Результаты исследования внедрены в научно-исследовательскую работу и учебный процесс кафедры патологии с курсом патологической физиологии Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарева.

Апробация работы. Основные результаты диссертационного исследования доложены и обсуждены на XXXV - XXXIX научно-практической конференции Мордовского государственного университета им. Н.П.Огарева «Ога-ревские чтения» (Саранск, 2007 - 2011); XII - XVI Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов Мордовского государственного университета им. Н.П.Огарева (Саранск, 2007 - 2011); VIII - XI Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2007 - 2010); XVI межрегиональной научной конференции памяти академика Н.И. Бурденко «Актуальные вопросы современного практического здравоохранения» (Пенза, 2008); 4-й, 5-й и 6-й Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения» (Санкт-Петербург, ФГУ-НИИ онкологии Росмедтехнологий им. H.H. Петрова, 2008 - 2010); VII - X Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2008 - 2011);

Публикации. По теме диссертационного исследования имеется 28 публикаций, в том числе 3 - в изданиях, рецензируемых ВАК РФ.

Структура и объем диссертационной работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной описанию материалов и методов исследования, главы, в которой анализируются результаты собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка реферированной литературы, включающего в себя 294 научных источника, в том числе 214 зарубежных. Материал диссертации изложен на 147 страницах текста компьютерного набора, документирован 9 таблицами, иллюстрирован 11 диаграммами и 45 рисунками.

ОСНОВНОЕ .СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование выполнено на базе кафедры патологии с курсом патологической физиологии медицинского института Мордовского государственного университета имени Н.П. Огарева (г. Саранск, зав. кафедрой д.м.н., профессор Плотникова H.A.), совместно с лабораторией канцерогенеза и онкогеронтоло-гии Научно-исследовательского института онкологии имени профессора H.H. Петрова (г. Санкт-Петербург, руководитель д.м.н., профессор Анисимов В.Н.) и лабораторией Научно-исследовательского института экспериментальной диагностики и терапии опухолей Российского онкологического центра имени H.H. Блохина (руководитель д.м.н., профессор Барышников А.Ю.).

Экспериментальные исследования проводились на 220 самках нелинейных белых мышей в соответствии с этическими требованиями по работе с экспериментальными животными. Для введения в эксперимент 200 мышей в возрасте трех месяцев ранжировали по массе тела с разбросом не более 10% у разных особей на 4 группы по 50 животных, оставшиеся 20 мышей (пятая группа) не подвергались каким-либо воздействиям и служили интактным контролем.

Животным первых четырех групп два раза в неделю наносили на предварительно выбритый участок кожи спинки диаметром 1,5-2 см (межлопаточная область) бенз(а)пирен (Fluka, Busch, Швейцария) в концентрации 0,05%, растворенный в ацетоне в дозе 0,2 мл на мышь.

Со следующего после введения канцерогена дня животные второй группы получали с питьевой водой в ночные часы мелатонин в концентрации 2 мг/л. Экспериментальные мыши третьей группы получали с питьевой водой в течение всего дня метформин в концентрации 200 мг/л. Животные четвертой группы получали с питьевой водой в течение всего дня метформин в концентрации 200 мг/л и в ночные часы мелатонин в концентрации 2 мг/л. Животные первой группы составили контрольную группу по канцерогену и получали питьевую воду без добавления мелатонина и метформина.

Длительность эксперимента составила 6 месяцев. У мышей из каждой группы животных, подвергшихся воздействию бенз(а)пирена, и у интактных мышей была забрана ткань опухоли кожи, а также ткани и органы, подозрительные на наличие новообразований, для гистологических и иммуногистохи-мических исследований. Выжившие животные были выведены из эксперимента путем декапитации, сопровождавшейся адекватной анестезией с использованием передозировки эфирного наркоза.

Для патогистологического исследования опухоли, возникшие на месте аппликации канцерогена, вырезали в пределах окружающих нормальных тканей. Все опухолевые узлы, а также ткани и органы, подозрительные на наличие новообразований, были иссечены и зафиксированы в 10% нейтральном формалине. После обычной гистологической обработки с обезвоживанием в спиртах и хлороформе, кусочки ткани были залиты в парафин. Тонкие, 5-7 мкм гистологические срезы были окрашены гематоксилином и эозином и исследованы светооптически. Для обнаружения метастазов во внутренних органах делали послойные разрезы. Неоплазии классифицировались согласно рекомендациям Международного агентства по исследованию рака (МАИР).

Определение основных маркеров ангиогенеза проводили с помощью им-муногистохимического анализа срезов парафиновых блоков опухолей, предназначенных для стандартного морфологического исследования. Ангиогенную активность опухоли определяли как по экспрессии белков, запускающих процесс ангиогенеза (экспрессия VEGF), так и по количеству микрососудов в опухоли (количество CD31+ микрососудов). Для оценки пролиферативной активности опухоли подсчитывали количество Ki-67+ опухолевых клеток, приходящихся на 200 - 300 опухолевых клеток. В микропрепаратах опухолевой ткани животных экспериментальных групп производили определение митотического индекса по общепринятой методике (Л.П. Дьяконов, В.И. Ситьков, 2000).

Макропрепараты фотографировали цифровой фотокамерой Nikon Coolpix 4500 в макрорежиме. Микропрепараты тканей опухолей фотографировали цифровой камерой Nikon Coolpix 4500 с помощью микроскопа Микмед-2 при уве-

личении xlOO, х200 и х400. Полученные микрофотографии обрабатывали с помощью пакета программ Adobe Photoshop 7.0.

Полученные цифровые данные обрабатывали общепринятыми методами статистики с определением достоверности различий между данными в опытных и контрольных группах на основе расчета критерия t Стыодента. Вычисления производили на CPU 1900 MHz «Intel Pentium-4» с использованием пакета прикладных программ Microsoft Office 2003, «МедСтатистика» и «Биостат». Динамика показателей отражена на графиках, построенных с использованием программы электронных таблиц Microsoft Excel 2003.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Экспериментальные исследования позволили установить, что пинеапьный гормон мелатонин и антидиабетический бигуанид метформин оказывают широкий спектр физиологических эффектов, включая онкостатическое действие в условиях экспериментального канцерогенеза. Окончательно противоопухолевые механизмы указанных препаратов не изучены. В доступной нам литературе не встречается данных об угнетающем действии на ангиогенез и пролифера-тивную активность в ткани неоплазий.

Влияние мслатонина и мстформнна на развитие опухолей кожи, индуцируемых аппликациями беш(а)пирена.

Частота развития опухолей кожи меньше на 19% при введении мелато-нина, при коррекции метформином - на 6%, при одновременном применении мелатонина и метформина - на 26% (р<0,01). При этом, частота злокачественных опухолей уменьшилась в 1,5 раза у мышей, получавших мелатонин; в 1,3 раза - при введении метформина и в 2,1 раза - при коррекции мелатонином и метформином совместно (р<0,01), тогда как частота развития доброкачественных опухолей существенно не отличается от группы контроля.

Мелатонин и метформин вызывают достоверное уменьшение среднего и максимального размеров опухолей кожи, а также выраженность вторичных изменений в опухолях. Данные представлены в таблице 1.

Таблица 1

Влияние мслатонина и метформина на развитие опухолей кожи, индуцируемых _аппликациями бенз(я)пирена___

Показатель Бенз(а)пир ен + вода Бенз(а)пи рен + мелатонин Бенз(а)ни рен + метформин Бенз(а)пиреи + мелатонин + метформин

Число животных, шт. 50 50 50 50

Эффективное число животных*, шт. 46 47 49 45

Общее число животных с опухолями, (%) 31 (67,4%) 25 (53,2%) 30 (61,2%) 20 (44,4%)6

Число животных со злокачественными опухолями, (%) 23 (50,0%) 16(34,0%) 18 (36,7%) 11 (24,4%)6

Число животных с папилломами, (%) 16(34,8%) 13 (27,7%) 14 (28,6%) 12 (26,7%)

Среднее число опухолей на 1 мышь-опухоленосителя, М± ш 3,4 ± 0,4 2,4 ± 0,4 2,1±0,3* 2,3 ± 0,4

Средний диаметр опухолей, см, М+ш 3,4 ± 0,2 1,6 ±0,2* 2,1 ±0,2б 2,0 ± 0,36

* Число животных, доживших до времени обнаружения 1-й опухоли в опыте. Различие с соответствующим показателем для группы бенз(а)пирсн + вода достоверно: " р <0,05;6 р < 0,01;' р < 0,001.

Среднее число опухолей на 1 мышь-опухоленосителя при применении мелатонина уменьшилось на 29% по сравнению с контролем. В группе животных, получавших метформин данный показатель меньше показателя контрольной группы на 38%, различия достоверны (р<0,05). при совместном применении метформина и мелатонина среднее число опухолей на 1 мышь-опухоленосителя уменьшилось на 32% меньше (по сравнению с контролем).

Средний диаметр опухолей в группе мышей, получавших мелатонин меньше на 53%, чем в контрольной группе (р<0,001). При применении метформина данный показатель уменьшился на 38% по сравнению с контролем, при применении метформина и мелатонина одновременно средний диаметр опухолей на 41% меньше, чем у животных группы контроля. Различия достоверны (Р<0,01).

Число животных с метастазами в легкие в группе контроля составило 2 (6,5%); в группе мышей, получавших мелатонин - 1 (4%). При коррекции мет-формином и совместно с мелатонином метастазы выявлены не были.

Влияние мелатонина и метформина на патоморфологию опухолей кожи у мышей.

На 84 сутки от начала аппликаций бенз(а)пиреном у мышей контрольной группы сформировались узелки в месте воздействия канцерогена. По своей структуре опухолевидные образования плотноэластической консистенции, выступающие над поверхностью неизмененных кожных покровов округлой или округло-овальной формы, размером не более 2 мм. В экспериментальных группах введение мелатонина и метформина не привело к статистически значимому изменению времени появления первого опухолевого узла и составило в среднем 86 суток.

По мере роста новообразования становились бугристыми, приобретали неправильную форму, развивались выраженные явления гиперкератоза. Опухоли, первоначально подвижные, по мере увеличения в размерах становились фиксированными к подлежащим тканям. В подавляющем большинстве случаев наблюдалось изъязвление опухолевых узлов.

В опухолевых образованиях тонкой кожи у мышей контрольной группы были выражены вторичные изменения в виде нагноения и распада с формированием язвы с подрытыми плотными краями и западающим дном с обильными темными наложениями и явлениями гиперкератоза. Вокруг опухолей кожи выражено перифокапьное воспаление.

В динамике узлы теряли подвижность, становились не смещаемыми и увеличивались в размерах, изъязвлялись с формированием язв с подрытыми плотными краями и западающим дном. Макроскопически опухолевые узлы у животных экспериментальных групп не отличались от таковых у мышей в контроле.

На заключительных этапах эксперимента опухолевые узлы достигали максимальных размеров (до 5 см в диаметре), и язвенные дефекты занимали большую часть поверхности спинки мыши. Наблюдались вторичные изменения в тканях опухолей с явлениями нагноения и распада.

У ряда мышей контрольной группы опухолевидные образования располагались не только в месте непосредственного воздействия канцерогена, но и на отдаленных участках.

Метастатические очаги имели вид множественных мелких узлов желтоватого цвета плотной консистенции, расположенных преимущественно суб-плеврально.

При изучении микроскопического строения опухолей можно было выявить различные стадии их морфогенеза. На ранних этапах канцерогенеза отмечается диффузное разрастание покровного эпителия и его дериватов. Впоследствии появляются атипические разрастания, имеющие склонность к ороговению в центре. Из подобных очаговых пролифератов возникают сформировавшиеся опухоли.

Сформированные опухолевые узлы микроскопически представляют собой очаги дифференцированного многослойного плоского эпителия, четко отграниченные от окружающих тканей с выраженными явлениями гиперкератоза. Клетки, составляющие такие очаги, значительно крупнее по сравнению с окружающими эпителиоцитами кожи, имеют светлую цитоплазму и крупное ядро с несколькими ядрышками.

Повсеместно в опухолевых очагах по мере прогрессирования опухолевого роста были выявлены вторичные изменения в виде некроза и нагноения. В большинстве случаев, опухолевые узлы имели признаки усиленного ороговения. Как правило, выявлялись различные формы дискератоза и всегда выраженный гиперкератоз.

Опухолевые эпителиоциты имели различную степень дифференцировки. Подобное строение отражает начало инфильтративного роста и формирование типичного плоскоклеточного рака. В поверхностных слоях эпителия обнаруживались некробиотические изменения, участки изъязвления неоплазий.

При морфологическом исследовании злокачественных опухолевых узлов плоскоклеточный рак кожи представлен атипичными, полиморфными, гипер-хромными опухолевыми клетками разной степени дифференцировки. В подав-

ляющем большинстве случаев это плоскоклеточный ороговевающий рак. Процессы ороговения характеризуются формированием типичных для этого вида рака «жемчужин» из рогового вещества. В центральной части опухолевых про-лифератов выявляются очаги некроза, явления стаза и полнокровия кровеносных сосудов в строме неоплазий. В отдельных случаях была выявлена морфологическая картина плоскоклеточного нсороговевающего рака кожи без наличия «раковых жемчужин».

Метастазы плоскоклеточного рака кожи в легкие микроскопически были представлены очаговыми скоплениями мелких, гиперхромных, полиморфных опухолевых клеток, расположенных, главным образом, периваскулярно.

Несмотря на инвазивный рост метастазов, опухолевые пролифераты были достаточно четко отграничены от окружающей ткани легкого. В метастатических узлах отмечалось явное преобладание паренхимы над стромой опухоли. Легочная ткань в окружности узлов находилась в коллабированном состоянии.

При изучении патогистологической структуры индуцированных бенз(а)пиреном опухолей кожи у мышей на фоне коррекции мелатонином и метформином увеличилось количество выявленных промежуточных стадий опухолевого роста. Не встречались случаи плоскоклеточного неороговевающе-го рака. Плоскоклеточный ороговевающий рак кожи считается более дифференцированной формой опухоли, имеет более благоприятный прогноз, и лучше поддается противоопухолевой терапии.

Полученные данные свидетельствуют о снижении темпов опухолевой прогрессии на фоне применения мелатонина и метформина.

Влияние мелатонина и метформина на процессы ангиогенеза в ткани опухолей кожи у мышей.

Интенсивность процессов неоангиогенеза в опухоли оценивалась по двум характеристикам: экспрессия основного стимулятора ангиогенеза УЕОБ и по среднему количеству СБЗН- сосудов в опухоли (таблица 2).

Таблица 2

Влияние мелатонина и метформина на процессы неоангиогенеза в опухолевой _ткани кожи у мышей___

Показатель Бенз(а)пи рен + вода Бепз(а)пи рен + мелатонин Бенз(а)пи рен + мстфор- М1Ш Бенз(а)пире п + мелатонин + метфор-мин

Количество СБ31+ сосудов в поле зрения, т±М 15±3 10±5 8±3" 8±3"

Интенсивность окрашивания УЕСР, т±М ++ +/++ + +

Различие с соответствующим показателем для группы бенз(а)пирен + вода достоверно: " р <0,05;6 р < 0,01;' р < 0,001.

Под влиянием мелатонина количество СБ31+ (положительных) сосудов уменьшилось на 33%. При использовании метформина и комбинации мелатонина и метформина результаты составили - 8±3, что еще меньше (на 47%) по сравнению с контролем (р<0,05) и группой, получавшей мелатонин (на 20%).

В группе контроля интенсивность окрашивания опухолевых клеток на УЕвР составила ++ - как средняя интенсивность окрашивания, под воздействием мелатонина - +/++ - как показатель средней и низкой интенсивности окрашивания, а при использовании метформина и комбинации мелатонина и метформина результат составил + - низкая интенсивность окрашивания.

Влияние мелатонина и метформина на пролиферативную активность опухолевой ткани кожи у мышей по уровню экспрессии молекулярно-биологического маркера Кь67.

Пролиферативная активность опухолевой ткани определялась по индексу К>67 - антигену, присутствующему только в пролиферирующих клетках в вь йг и М фазах клеточного цикла.

В нормальной эпителиальной ткани кожи обнаруживается низкий уровень экспрессии Кь67. Экспрессия Кл-67 локализуется преимущественно в ба-зальных слоях эпителия, где средний индекс Й-67-положительных клеток не превышает 7±4%. При нарастании признаков клеточного атипизма в опухолевых узлах кожи мышей, индуцированных аппликациями бенз(а)пирена, увели-

чивается количество И-67-положительных клеток, что свидетельствует об усилении пролиферативной активности опухоли.

В группе контроля средний индекс Кл-67-положительных клеток во много превышает показатель в нормальной ткани. При применении мелатонина индекс Кь67 снизился на 29% (р<0,01). В группе животных, получавших метфор-мин, отмечалось еще большее уменьшение пролиферативной активности -10±7% (на 86%), а при совместном применении мелатонина и метформина данный показатель ниже на 89% (р<0,001), что свидетельствует о еще более низкой пролиферативной активности по сравнению с другими группами (таблица 3).

Таблица 3

Влияние мелатонина н метформина на пролнферативную активность опухолевой ткани кожи у мышей по уровню экспрессии молекулярно-

Показатель Бенз(а)пи рсн + вода Бснз(а)пи рен + мелато- N1111 Бснз(а)пи рен + метфор-мнн Бенз(а)пнре н + мелато-нин + мет-формин

Средний индекс К1-67, %, ш±М 70±12 50±106 10±7 8±5"

Различне с соответствующим показателем для группы бенз(а)пирсн + вода достоверно: * р <0,05;6 р < 0,01;" р < 0,001.

Иммуногистохимическое выявление высокого показателя пролиферации Кл-67 и максимальная числовая плотность Кл-67-положительных ядер является независимым фактором прогноза, более существенным по своему значению, чем толщина опухоли или число митозов по отдельности.

Влняние мелатонина и метформина на митотичсский индекс в опухолевой ткани кожи у мышей.

Для оценки пролиферативной потенции опухолевой ткани целесообразно производить подсчет митотического индекса, который отражает интенсивность деления по наличию клеток в фазе роста (делящихся клеток): чем выше значение, тем интенсивнее происходит процесс деления клеток и наоборот.

На фоне коррекции индуцированного опухолевого роста мелатонином митотический индекс в ткани опухолей кожи мышей достоверно уменьшился на 35% (р<0,05 по сравнению с группой контроля).

Применение метформина и совместное воздействие мелатонина и мет-формина сопровождалось снижением митотического индекса. Однако, статистической достоверности полученные данные не имели (рП0,05).

Полученные экспериментальные данные представлены в таблице 4.

Таблица 4

Влияние мелатонина и метформина на митотическнй индекс в опухолевой ткани _кожи у мышей____

Показатель Бенз(а)пи рен + вода Бенз(а)пи рен + мелатонин Бенз(а)пи рен + метформин Бснз(а)пнрс п + мелато-...... + метформин

Митотическнй индекс, ш±М 1,06±0,25 0,69±0,20я 0,63±0,18 0,59±0,25

Различие с соответствующим показателем дли группы бенз(а)пирси + вода достоверно: " р <0,05;6 р < 0,01;" р < 0,001.

Влияние мелатонина и метформина на выживаемость опухоленосн-телей после появления новообразований и средний латентный период развития неоплазий.

Мелатонин и метформин, а также их комбинация не оказывали достоверного влияния на средний латентный период развития опухолей и на продолжительность жизни животных с опухолями, но при этом наблюдалась тенденция к увеличению данных показателей (Таблица 5). Продолжительность жизни животных после обнаружения опухолевых узлов составляет 100 ± 2,5 суток в группе животных, получавших мелатонин, что на 4,0% больше, чем в группе контроля. При применении одного метформина, и совместно с мелатонином данные показатели на 7,3% и 7,2% больше, чем в контрольной группе соответственно.

Средний латентный период развития опухолей равен 126 ± 3,9 суток в группе контроля (минимальный период развития опухолей - 84 суток, максимальный - 156 суток). В группе животных, получавших мелатонин, показатель на 8,4% больше, чем в контроле. При применении метформина на 4,5% увеличился средний латентный период развития опухолей (по сравнению с контролем). В группе животных, получавших метформин и мелатонин, данный показатель на 6,7% больше, чем в контроле.

Таблица 5

Влияние мелатонина и метформина на выживаемость опухоленосителсй после появления новообразований и средний латентный период развитии неоплазий

Показатель Бенз(а)пи рен + вода Беиз(а)пи рен + мел атонии 1>енз(а)пи рен + метфор-мин Бепз(а)пире н + мелато-нин + мет-формин

Число животных, шт. 50 50 50 50

Эффективное число жнвотных*, шт. 46 47 49 45

Средняя продолжительность жизни мышей после выявления опухолей, сут. 96 ± 2,5 100 ±2,5 103 ±2,5 103 ±3,5

Средний латентный период опухолей, сут. 126 ±3,9 137 ±5,4 132 ±5,3 135 ± 6,6

* Число животных, доживших до времени обнаружения 1-й опухоли в опыте. Различие с соответствующим показателем для группы бснз(а)пирсн + вода достоверно: я р <0,05;5 р < 0,01;в р < 0,001.

Нами отмечен более выраженный онкостатический эффект при совместном использовании мелатонина и метформина. При этом онкостатическая активность у данных препаратов достоверно высока по сравнению с контролем.

Основные патогенетические механизмы влияния мелатонина и метформина на развитие опухолей кожи у мышей, индуцированных бенз(а)пиреном представлены на схеме.

Схема коррекции индуцированного опухолевого poeta

- -VnCHV >■ ' Гк- íí>OpiV. í!

: .' v. : ; : \ ІМІ^КІИІ. * и ■ • 'г етжшежж

Рис. 1.1. Схема коррекции индуцированного опухолевого роста кожи ме-латонином и метформином

Анализ полученных результатов и сравнение их с показателями контрольной группы (индуцированный канцерогенез) позволяет предположить, что совместное применение эндогенного гормона мелатонина и антидиабетического бигуанида метформина оказывает более выраженный корригирующий эффект на процессы опухолевого роста, ангиогенеза и пролиферативной активности в ткани опухолей кожи у мышей в сравнении с использованием данных препаратов по отдельности.

Полученные нами результаты подтверждают онкостатическое действие мелатонина и метформина на изучаемые опухоли. Ранее подобное действие было продемонстрировано in vivo в отношении опухолей печени (Dakshayani К.В., Subramanian P., 2005; Imaida К. et al., 2000; Rahman K.M. et al., 2003; Sugie S. et al., 1998), кожи (Kumar A.C., Das U.N., 2000), и мягких тканей (Bartsch H., Bartsch С., 1981; Lapin V., Ebels I., 1976), легких (Weisburger J.H. et al„ 2003), шейки матки и влагалища (Anisimov V.N. et al., 2000, 2008), ободочной кишки (Анисимов В.Н. и соавт., 1997; Anisimov V.N., 2001а; Weisburger J.H. et al., 2003), эндометрия (Deerberg F. et al., 1997) и молочной железы (Anisimov V.N. et al, 2003a, 2003b; Bartsch С. et al., 2001; Baturin D.A. et al, 2001; Blask D.E. et al., 1986; Kothari L., 1987; Kothari A. et al., 1997; Lenoir V. et al., 2005; Mediavilla M.D. et al, 1997; Musatov S.V. et al., 1999).

Полученные результаты дополняют представления о способности мелатонина и метформина угнетать развитие новообразований in vivo. Дальнейшее изучение мелатонина и метформина на моделях химического канцерогенеза in vivo и in vitro позволит глубже понять механизмы их онкостатического действия.

ВЫВОДЫ

1.. На модели экспериментального опухолевого роста, индуцируемого аппликациями бенз(а)пирена у мышей, установлено, что мелатонин и метформин оказывают выраженный онкостатический эффект, проявляемый в уменьшении частоты, множественности и размеров опухолей кожи, а также снижении количества злокачественных новообразований и их способности к

метастазированию.

2. На фоне коррекции мелатонином и метформином индуцированных бенз(а)пиреном опухолей кожи у мышей наблюдается уменьшение числа животных с гистологически верифицированными карциномами кожи.

3. Применение исследуемых препаратов способствовало снижению активности ангиогенеза в ткани индуцированных неоплазий.

4. Мелатонин и мстформин обладают способностью уменьшать пролиферативную активность опухолей в эксперименте.

5. Совместное применение мелатонина и метформина оказывает более выраженный онкостатический эффект на динамику изучаемых показателей в условиях индуцированного опухолевого роста.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные результаты могут быть использованы для дальнейшего экспериментального исследования антиканцерогенного, антиангиогенного и анти-пролиферативного действия мелатонина и метформина, разработки научно обоснованных рекомендаций по использованию мелатонина и метформина с целью профилактики и в составе комплексной терапии новообразований.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Маньчсва Т.А. Онкопротекторное действие антидиабетического бигуа-нида - метформина / Маньчева Т.А., Демидов Д.В., Плотникова H.A. // Здоровье и образование в XXI веке: Материалы VIII Международной научно-практической конференции. Москва: Изд-во РУДН, 2007. С. 411-412.

2. Демидов Д.В. Изучение онкопротекторного действия мелатонина в условиях экспериментального канцерогенеза / Демидов Д.В., Маньчева Т.А., Плотникова H.A. // Здоровье и образование в XXI веке: Материалы VIII Международной научно-практической конференции. Москва: Изд-во РУДН, 2007. С. 234-235.

3. Демидов Д.В. Противоопухолевый эффект мелатонина в условиях экспериментального бенз(а)пиренового канцерогенеза / Демидов Д.В., Маньчева Т.А., Плотникова H.A. // XXXVI Огаревские чтения. Материалы научной конференции в 3-х частях. Часть 2 естественные науки. Саранск. Изд-во Морд. ГУ, 2008. С. 92-93.

4. Плотникова H.A. Влияние мелатонина и метформина на развитие опухолей кожи, индуцируемых бенз(а)пиреном у мышей / Плотникова H.A., Маньчсва Т.А., Демидов Д.В., Харитонова Т.В., Кемайкин С.П., Харитонов C.B., Анисимов В.Н. // Вопросы онкологии. Научно-практический журнал. Тезисы 4-й Российской конференции по фундаментальной онкологии. 2008. - Том 54, №2. С. 20.

5. Демидов Д.В. Антиканцерогенное действие мелатонина в условиях экспериментального опухолевого роста. Актуальные проблемы патофизиологии / Демидов Д.В., Маньчева Т.А., Плотникова H.A., Харитонова Т.В. // Тезисы XIV Межгородской конференции молодых ученых. СПб.: Изд-во СПбМАПО, 2008. С. 36-37.

6. Маньчсва Т.А. Изучение влияния антидиабетического бигуанида метформина на процессы опухолевого роста / Маньчева Т.А., Демидов Д.В.. Харитонова Т.В. // Актуальные проблемы патофизиологии. Тезисы XIV межгородской конференции молодых ученых. СПб.: Изд-во СПбМАПО, 2008. С. 5859.

7. Демидов Д.В. Динамика процессов канцерогенеза, индуцируемого бенз(а)пиреном под влиянием мелатонина / Демидов Д.В., Маньчева Т.А., Плотникова H.A., Кемайкин С.П., Харитонов C.B., Харитонова Т.В. // Российский биотерапевтический журнал. №1. Том 7. М.: Изд. труппа РОНЦ, 2008. С. 8-9.

8. Маньчева Т.А. Изучение влияния метформина на процессы морфогенеза опухолей дермы в условиях экспериментального опухолевого роста / Маньчева Т.А., Демидов Д.В., Плотникова H.A., Кемайкин С.П., Харитонов C.B.,

Харитонова T.B. // Российский биотерапевтический журнал. №1. Том 7. М.: Изд. группа РОНЦ, 2008. С. 9.

9. Демидов Д.В. Изучение влияния мелатонина на процессы экспериментального бенз(а)пиренового опухолевого роста / Демидов Д.В., Маньчсва Т.А., Плотникова H.A., Харитонов C.B., Кемайкин С.П., Харитонова Т.В. // Материалы XVI межрегиональной научной конференции памяти академика Н.И. Бурденко «Актуальные вопросы современного практического здравоохранения». Пенза, 2008. С. 83.

10. Маньчсва Т.А. Мелатонин и метформин как противоопухолевые препараты в условиях экспериментального канцерогенеза / Маньчсва Т.А., Демидов Д.В., Плотникова H.A. // Материалы XVI межрегиональной научной конференции памяти академика Н.И. Бурденко «Актуальные вопросы современного практического здравоохранения». Пенза, 2008. С. 95.

11. Демидов Д.В. Геропротекторный и антиканцерогенный эффект мелатонина и метформина в условиях экспериментального канцерогенеза / Демидов Д.В., Маньчсва 'Г.А., Плотникова H.A. // Здоровье и образование в XXI веке: Материалы IX Международной научно-практической конференции. Москва: Изд-во РУДН, 2008. С. 201.

12. Демидов Д.В. Изучение влияния мелатонина на процессы уретанового и бенз(а)пиренового канцерогенеза в эксперименте / Демидов Д.В., Маньчсва Т.А., Плотникова H.A. // Материалы XIII научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарева: в Зч. 4.2: Естеств. науки. Саранск, 2008. С. 42-44.

13. Маньчсва Т.А. Исследование влияния метформина на динамику мор-фофункциональных изменений опухолей кожи в условиях экспериментального

канцерогенеза / Маньчсва Т.А., Демидов Д.В., Плотникова H.A. // Материалы

: i

XIII научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарева: в Зч. 4.2: Естеств. науки. Саранск, 2008. С. 49-51. •

14. Демидов Д.В. Морфофункциональная характеристика дермы экспериментальных животных. Актуальные проблемы патофизиологии / Демидов Д.В., Маньчсва Т.А., Харитонова Т.В., Кемайкин С.П., Харитонов C.B., Плотникова H.A. // Тезисы XV Межгородской конференции молодых ученых. СПб.: Изд-во СПбМАПО, 2009. С. 32-33.

15. Демидов Д.В. Влияние эндогенного гормона мелатонина на модели экспериментального канцерогенеза, индуцируемого уретаном и бенз(а)пиреном у мышей / Демидов Д.В., Маньчева Т.А., Харитонова Т.В, Плотникова H.A., Кемайкин С.П., Харитонов C.B. // Российский биотерапевтический журнал. №2. Том 8. М.: Изд. группа РОНЦ, 2009. С. 7-8.

16. Демидов Д.В. Морфометрическая динамика опухолей кожи у мышей в эксперименте / Демидов Д.В., Маньчсва Т.А., Харитонова Т.В, Плотникова H.A., Кемайкин С.П., Харитонов C.B. // Сборник научных трудов студентов и молодых ученых Всероссийской конференции с международным участием (Актуальные вопросы медицинской науки). Ярославль, 2009. С. 43-44.

17. Маньчсва Т.А. Ингибирующее влияние некоторых антиоксидантов на динамику опухолевого роста при экспериментальных неоплазиях / Маньчсва Т.А., Демидов Д.В., Анисимов В.Н., Плотникова H.A. // Здоровье и образование в XXI веке: Материалы X Международной научно-практической конференции. Москва: Изд-во РУДН, 2009. С. 1255.

18. Демидов Д.В. Геропротекторный эффект метформина и мелатонина в условиях экспериментального канцерогенеза кожи у мышей / Демидов Д.В., Маньчева Т.А., Плотникова H.A. // Пушковские чтения. Тезисы докладов IV научно-практической геронтологической конференции с международным участием, посвященной памяти Э.С. Пушковой. / Под ред. В.Н. Анисимова, A.JI. Арьева. - СПб., 2008. С. 202-204.

19. Маньчева Т.А. Оценка противоопухолевой активности ряда антиоксидантов на модели экспериментальных нсоплазий / Маньчсва Т.А., Демидов Д.В., Анисимов В.ІІ., Плотникова H.A., Харитонова Т.В, Харитонов,

C.B., КсмаГікин С.П. // Морфологические ведомости. Международный морфологический журнал. № 3-4. Москва, 2009. С. 92-96.

20. Демидов Д.В. Использование мелатонина и метформина в качестве он-ко- и геропротекторов в условиях экспериментального канцерогенеза / Демидов Д.В., Мапьчева Т.Л. // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины: Материалы 67-й открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием. - Волгоград, 2009. С. 219-220.

21. Демидов Д.В. Влияние мелатонина на частоту, множественность и размеры опухолей кожи у мышей в условиях экспериментального канцерогенеза / Демидов Д.В,, Мапьчева Т.А., Плотникова H.A., Анисимов В.Н. // Вопросы онкологии. Научно-практический журнал. Тезисы 5-й Российской конференции по фундаментальной онкологии. 2009. - Том 55, №2. С. 16.

22. Демидов Д.В. Некоторые клинико-морфологические показатели экспериментальных неоплазий / Демидов Д.В., Мапьчева Т.А., Харитонова Т.В. // III Международный молодежный медицинский конгресс. Санкт-Петербургские научные чтения - 2009. Тезисы докладов. СПб., 2009. С. .192.

23. Мапьчева Т.А. Влияние мелатонина и метформина на процессы пе-рекисного окисления липидов при экспериментальных новообразованиях / Мапьчева Т.А., Демидов Д.В., Анисимов В.Н., Плотникова H.A., Харитонова Т.В. // Российский биотерапевтический журнал. №1. Том 9. М.: Изд. группа РОНЦ, 2010. С. 74.

24. Демидов Д.В. Динамика показателей перекисного окисления липидов при канцерогенезе кожи у мышей, индуцируемом бензо(а)пиреном: влияние мелатонина и метформина / Демидов Д.В., Мапьчева Т.А., Плотникова H.A., Пашкевич И.В., Анисимов В.Н. // Вопросы онкологии. Научно-практический журнал. Тезисы 7-й Российской конференции по фундаментальной онкологии. 2011. - Том 57, №2. С. 22-23.

25. Мапьчева Т.А. Мелатонин и метформин подавляют пролифератив-ную активность и процессы ангиогенеза при канцерогенезе кожи, индуцируе-

мом бензо(а)пиреном у мышей / Маньчева Т.Л., Демидов Д.В., Плотникова НА., Анисимов В.Н. // Вопросы онкологии. Научно-практический журнал. Тезисы 7-й Российской конференции по фундаментальной онкологии. 2011. - Том 57, №2. С. 46-47.

26. Маньчева Т.А. Мелатонин и мстформин угнетают канцерогенез кожи и псрскиснос окисление лнпидов, индуцируемые бснз(а)пирсном у самок мышей / Маньчева Т.А., Демидов Д.В., Плотникова II.A., Харитонова Т.В., Пашкевич И.В., Анисимов В.Н. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2011. - Том 151, № 3. С. 339-343.

27. Mancheva Т.А. Morphological and functional patterns of melatonin and metformine oncostatic actions in experimental tumors / Mancheva T.A., Demidov D.V., Plotnikova N.A.// University of Northern California, Biomedical engineering, Santa Rosa. Collection of Pappies by conference «The Biology of Cancer: Microenvironment, Metastasis & Therapeutics meeting». 2011. - P. 123-127.

28. Маньчева Т.А. Мелатонин и мстформин подавляют опухолевый рост при индуцированных беш(а)пирсном неоплазиях у мышеи / Маньчева Т.А., Плотникова II.A. // Российский бнотерапевтичсский журнал. №2. Том 10. М.: Изд. группа РОНЦ, 2011. С. 73-79.

Подписано в печать 29.12.11. Объем 1,5 п. л. Тираж 100 экз. Заказ X? 32. Типография Издательства Мордовского университета 430005, г. Саранск, ул. Советская, 24