Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Угнетающее влияние мелатонина и метформина на канцерогенез, индуцируемый (бенз(а)пиреном в различных тканях самок мышей

004604650 На правах рукописи

(Ц

ДЕРЯБИНА Ольга Николаевна

УГНЕТАЮЩЕЕ ВЛИЯНИЕ МЕЛАТОНИНА И МЕТФОРМИНА НА КАНЦЕРОГЕНЕЗ, ИНДУЦИРУЕМЫЙ БЕНЗ(А)ПИРЕНОМ В РАЗЛИЧНЫХ ТКАНЯХ САМОК МЫШЕЙ

14.01.12 — онкология 14.03.02 — патологическая анатомия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

гЗиЮН 2010

Санкт-Петербург 2010

004604650

Работа выполнена па кафедре патологии с курсом патологической физиологии ГОУВПО «Мордовский государственный университет им. Н. П. Огарева» и в отделе канцерогенеза и онкогероптологии ФГУ НИИ онкологии им. Н. Н. Петрова Росмедтехпологий

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

Анисимов Владимир Николаевич;

доктор медицинских паук, профессор Плотникова Надежда Алексеевна

Официальные оппоненты: члеп-корреспопдент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой патологической анатомии Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И. И. Мечникова Аничков Николай Мильевич;

доктор медицинских паук Забежинский Марк Абрамович

Ведущее научное учреждение: Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова

Защита диссертации состоится «_» июня 2010 г. в_часов па

заседании диссертационного совета № Д 208.052.01 при НИИ онкологии им. Н. Н. Петрова Росмедтехпологий по адресу: 197758, Санкт-Петербург, Песочный-2, ул. Ленинградская, д. 68.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института и на сайте (www. niioncologii.ru) с_

Автореферат разослан апреля 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских паук Е. В. Бахидзе

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Общеизвестно, что злокачественные новообразования занимают второе место среди причин смертности населения. Увеличение количества онкозаболеваний делает проблему лечения новообразований значимой и актуальной в современной онкологии. Повышение качества жизни больных с иеоплазиями является одной из основных задач паллиативной терапии.

В настоящее время большое внимание уделяется поиску новых эффективных противоопухолевых химиотерапевтических препаратов, обладающих минимальными побочными эффектами.

Как известно, в течение всей жизни на человека воздействует большое число канцерогенов как экзогенного, так и эндогенного происхождения. Кроме того, постоянно создаются условия для инициации канцерогенеза в тех или иных органах и тканях. В связи с этим с целью профилактики опухолевого роста наиболее физиологичным является использование естественных эндогенных онкопротекторов.

Канцерогенез — многостадийный процесс, в течение которого нормальная стволовая клетка проходит последовательно несколько стадий, прежде чем станет злокачественной. Это сопровождается многообразными нарушениями внутреннего гомеостаза, изменениями нервной, иммунной и эндокринной систем (Аиисимов В. Н. и соавт., 2000). Временные интервалы канцерогенеза точно не определены. Считается, что с момента молекулярной и генетической нестабильности до появления первой опухолевой клетки проходят многие годы, а появление первых клинических симптомов опухоли отделено от периода инициации канцерогенеза интервалом от 5 до 15 лет.

Необходимость латентного периода при неоплазии — фундаментальное свойство, отличающее опухолевой рост от других гипербиотических явлений. Обнаружение предраковых поражений на много лет опережает формирование самого рака. Данные закономерности показывают, что опухолевую трансформацию нельзя понимать как разовое событие, безотносительно к жизненному циклу и обновлению клеточных клонов и популяций (Зайчик А. III., Чурилов Л. П., 2002). Любая из стадий канцерогенеза является потенциально реверсибельной, и воздействие на эти стадии будет иметь значительно больший успех, нежели на уже сформировавшуюся опухоль.

В последние годы наиболее популярна свободнорадикальная теория, которая объясняет не только механизм старения, но и широкий круг патологических процессов, таких как сердечно-сосудистые заболевания, возрастные иммунодепрессии, дисфункции мозга, катаракта, рак и некоторые другие (Анисимов В. Н., 2003). Известно, что свободные радикалы (молекулы или атомы, имеющие на внешней электронной орбите один или несколько неспаренных электронов) являются одним из канцерогенных факторов, присутствуя на всех стадиях разви-

тия опухоли (Kramer К. et al., 1994). Они обладают высокой активностью и способны вызывать повреждение липидного бислоя клеточных мембран и молекул ДНК.

Свободные радикалы непрерывно образуются как побочные продукты клеточного метаболизма. При оксидативном фосфорилирова-нии в митохондриях 1—5 % кислорода редуцируется не полностью, давая начало активным формам кислорода, к которым можно отнести радикалы супероксида, гидроксила, синглетиый кислород, перекись водорода и многие другие.

Мелатонин — основной гормон, синтезируемый в пинеальной железе, преимущественно в ночное время.

Основными функциями мелатонина в организме являются биоритмологическая, антиоксидантная и иммуномодулирующая (Комаров Ф. И. и соавт., 2004).

В ходе многолетних исследований было установлено, что наиболее важными физиологическими эффектами мелатонина являются: стимуляция метаболических процессов; ингибируюхцее действие на пигментный метаболизм; контроль циркадных и сезонных ритмов; седа-тивное действие на центральную нервную систему; подавление клеточной пролиферации и противоопухолевое действие по отношению ко многим экспериментальным неоплазиям. Кроме того, мелатонин является одним из сильнейших эндогенных поглотителей свободных радикалов (Комаров Ф. И. и соавт., 2004).

В настоящее время известно, что антидиабетические бигуаниды (метформин (сиофор), буформин, фенформип), наряду с гипоглике-мическим действием, обладают способностью улучшать утилизацию глюкозы в тканях, снижать использование организмом жирных кислот в качестве энергетического субстрата. Кроме того, эти вещества способны угнетать неоглюкогенез, снижать его биосинтез, уменьшать концентрацию в крови холестерина, триглицеридов и инсулина, а также биосинтез холестерина и снижать массу тела (Дильман В. М., 1984). Эти свойства антидиабетических бигуанидов, а также их способность устранять явления метаболической иммунодепрессии послужили основанием для использования их в онкологической клинике для нормализации некоторых нарушений обмена, свойственных онкологическим больным (Дильман В. М., 1984).

Для более полного понимания действия мелатонина и метформи-на на канцерогенез, для выявления закономерностей их онкостатиче-ского действия необходимы исследования на большем количестве моделей с использованием канцерогенов разной органной специфичности и различного механизма действия.

Особая роль в процессе канцерогенеза принадлежит ангиогенезу. Общеизвестно, что неоангиогенез — это процесс образования новых кровеносных сосудов в органах и тканях. Ангиогенез — неотъемлемая часть нормального эмбриогенеза и онтогенеза. Нарушение его приводит к развитию доброкачественных и злокачественных опухо-4

лей (невуса Спитца, саркомы Капоши и др.). Он играет важную роль в пролиферации солидных опухолей и метастазировании (Ferrara N., 2002).

Противоположным ангиогенезу является процесс антиангиогене-за, т. е. блокировка образования новых сосудов, что уменьшает кровоснабжение опухоли, замедляя тем самым ее рост (Jung Y., Ahmad S., Akagi Y. et al., 2000). Известно, что трофика опухолей небольших размеров (1 — 2 мм) осуществляется путем диффузии питательных веществ из окружающих тканей. Тогда как более крупные опухоли нуждаются в дополнительном кровоснабжении, что происходит за счет гиперэкспрессии ангиогенных факторов, таких как VEGF (ангиоген-ный «переключатель») (Bergers G. et al., 2002).

VEGF — фактор роста эндотелия сосудов — влияет на развитие новых (ангиогенез) и выживание незрелых кровеносных сосудов (сосудистая поддержка). Незрелые кровеносные сосуды существуют преимущественно на этапе развития, а у взрослых индивидуумов — лишь в некоторых ситуациях, например в процессе заживления ран или заболеваний, характеризующихся аномальным ангиогенезом, таких как онкологические. В отсутствие ростовых сигналов эндотелиальные клетки этих незрелых кровеносных сосудов подвергаются программированной клеточной гибели (апоптозу). VEGF препятствует апоп-тозу эндотелиальных клеток в незрелых кровеносных сосудах, тем самым сохраняя их жизнеспособность (Ferrara N., 2002).

VEGF крайне важен для роста опухолей, размеры которых превышают 1 — 2 мм. Доказано, что многие опухоли экспрессируют VEGF, способствующий развитию и поддержанию сосудистого русла опухолевой ткани (FerraraN., 2002).

При многих видах опухолей усиление экспрессии VEGF коррелирует с неблагоприятным прогнозом, в том числе с агрессивным ростом опухоли, рецидивами, метастазированием и уменьшением выживаемости. Кроме того, экспрессия VEGF коррелирует с повышением плотности микрососудистой сети в опухоли, что само по себе служит индикатором прогноза при различных онкологических заболеваниях (Ferrara N., 2002).

Понимание механизмов ангиогенеза способствует повышению эффективности лечения опухолей различной локализации.

Таким образом, изучение действия мелатонина и метформина иа моделях индуцированного канцерогенеза является важным направлением экспериментальной онкологии на современном этапе.

В соответствии с вышесказанным были сформулированы цель и задачи работы.

Цель исследования

Изучение влияния мелатонина и метформина при раздельном и сочетанном применении на канцерогенез кожи, мягких тканей, шейки матки, индуцируемый бенз(а)пиреном у мышей.

Задачи исследования

1. Изучение влияния мелатонина и метформина па частоту, множественность и размеры опухолей кожи, мягких тканей и шейки матки, индуцированных бенз(а)пиреном у мышей.

2. Исследование воздействия мелатонина и метформина на выживаемость опухоленосителей и средний латентный период развития опухолей в условиях индуцированного канцерогенеза.

3. Изучение влияния мелатонина и метформина на показатели перекисного окисления липидов (ПОЛ) в сыворотке крови и опухолевой ткани.

4. Исследование воздействия мелатонина и метформина на процессы ангиогенеза в ткани рака шейки матки.

Научная новизна

В работе впервые исследовано влияние комбинированного введения мелатонина и метформина на канцерогенез кожи, мягких тканей и шейки матки in vivo. Продемонстрировано подавляющее действие мелатонина и метформина на развитие индуцированных бепз(а)шгре-ном опухолей кожи, мягких тканей и шейки матки и их митотическую активность. В работе впервые показано снижение активности ангиогенеза в ткани индуцируемых неоплазий шейки матки под влиянием мелатонина и метформина. В исследовании проанализировано влияние мелатонина и метформина на процессы ПОЛ в условиях индуцированного канцерогенеза и показан антиоксидантный эффект изучаемых препаратов.

Научно-практическая значимость работы

Полученные результаты могут служить экспериментальным обоснованием для дальнейшего изучения онкопротекторпого потенциала мелатонина и метформина, разработки научно обоснованных рекомендаций по применению мелатонина и метформина с целью профилактики и лечения злокачественных новообразований.

Апробация диссертации

Результаты работы были доложены и обсуждены на VIII Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2007); IX Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2008); X Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2009); VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2008); VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2009); 4-й Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения» (Санкт-Петербург, ФГУНИИ онкологии Росмедтехпологий им Н. Н. Петрова, 2008); XIII и XIV научных конференциях 6

молодых ученых, аспирантов и студентов Мордовского государственного университета им. Н. П. Огарева (Саранск, 2008, 2009); XXXVI и XXXVII Огаревских чтениях (научной конференции Мордовского государственного университета им. Н. П. Огарева, Саранск, 2008, 2009).

Положения, выносимые на защиту

Введение мелатонина и метформина значительно уменьшает множественность и размеры опухолевых узлов кожи, индуцируемых бен-з(а)пиреиом (БП) у мышей.

Совместное воздействие мелатонином и метформином увеличивает латентный период развития опухолей мягких тканей и выживаемость опухоленосителей.

Введение мелатонина и метформина уменьшает множественность и размеры опухолевых узлов, увеличивает выживаемость опухоленосителей и латентный период развития опухолей шейки матки.

Использование мелатонина и метформина способствует снижению активности ангиогеиеза в тканях индуцируемых неоплазий шейки матки.

Введение мелатонина приводит к большему замедлению процессов ПОЛ в ткани индуцированных опухолей кожи, мягких тканей и шейки матки по сравнению с применением метформина и совместным использованием мелатонина и метформина.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 142 страницах компьютерного текста, документирована 14 таблицами и иллюстрирована 61 рисунком. Работа состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материала и методов исследования (глава 2), изложения собственных результатов (глава 3), обсуждения полученных результатов (глава 4), выводов и библиографического указателя, включающего 236 источников, в том числе 28 отечественных и 208 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы

Животные. В опытах использовано 380 самок белых мышей БНИ в возрасте 2 мес. массой 20—22 грамма. Животных содержали в стандартных условиях вивария при режиме освещения (12 часов свет, 12 часов темнота). Они получали стандартный лабораторный корм без ограничения.

Схема экспериментов. В возрасте 3 месяцев мыши были рандо-мизированко разделены на 3 группы по 120 животных, оставшиеся 20 мышей (4-я группа) не подвергались каким-либо воздействиям и использовались в качестве интактного контроля. Соответственно было проведено 3 серии экспериментов.

В первой серии опытов изучали влияние мелатонина и метформи-на на развитие опухолей эпидермалыюго гистогенеза на модели индуцированных опухолей кожи. 120 мышей были поделены иа 4 группы: 3 опытные группы по 30 животных, 30 животных составили контрольную группу по канцерогену. Животным всех четырех групп наносили иа предварительно выбритый участок кожи спинки (межлопаточиой области) диаметром 1,5—2 см бенз(а)пирен (БП) (Fluka, Busch, Швейцария) в концентрации 0,05 %, растворенный в ацетоне в дозе 0,2 мл на мышь, два раза в неделю.

Со следующего дня после введения канцерогена животные 1-й группы получали с питьевой водой в ночные часы (с 19:00 до 07:00) мелатонин (Sigma, St. Louis; MS, США) в дозе 2 мг/л. Раствор мелатонина готовился ежедневно ex tempore. Мелатонин растворяли в нескольких каплях 96% этилового спирта и доводили до нужной концентрации водопроводной водой. Животные 2-й группы получали с питьевой водой в течение всего дня метформин (БЕР-ЛИН-ХЕМИ АГ/МЕНАРИНИ ГРУПП, Германия) в дозе 200 мг/л. Раствор метформииа (сиофор 500) готовился ежедневно ex tempore. Метформин растворяли в нескольких миллилитрах теплой воды и доводили до нужной концентрации водопроводной водой. Животные 3-й группы получали с питьевой водой в течение всего дня метформин в дозе 200 мг/л и в ночные часы (с 19:00 до 07:00) мелатонин в дозе 2 мг/л.

Животные 4-й группы составили контрольную группу по канцерогену и получали питьевую воду без добавления мелатонина и метформииа.

Во второй серии экспериментов изучали влияние мелатонина и метформина на развитие опухолей мягких тканей мезенхимального гистогенеза на модели индуцированных сарком подкожной клетчатки. 120 мышей были разделены на 4 группы: 3 опытные группы по 30 животных, 30 животных составили контрольную группу по канцерогену. Животным всех четырех групп однократно вводился канцероген — БП. Бенз(а)лиреи растворяли в стерилыюм оливковом масле и вводили под кожу поясничной области в дозе 2 мг на мышь в объеме 0,1 мл.

Со следующего дня после введения канцерогена животные 1-й группы получали мелатонин. Мышам 2-й группы давали с питьевой водой в течение всего дня метформин. Животные 3-й группы получали с питьевой водой в течение всего дня метформин и мелатонин. Животные 4-й группы составили контрольную группу по канцерогену и получали питьевую воду без добавления мелатонина и метформина.

В третьей серии экспериментов изучали влияние мелатонина и метформина на индуцированный канцерогенез шейки матки. 120 мышей были разделены на 4 группы: 3 опытные группы по 30 животных, 30 животных составили контрольную группу по канцерогену. Живот-

ным всех четырех групп во влагалище вводились поролоновые губки размерами 3x3 мм, смоченные БП в дозе 0,2 мл на мышь, растворенном в растворе диметилсульфоксида 0,05%, два раза в неделю.

Со следующего дня после введения канцерогена животные 1-й группы получали мелатоиин. Животным 2-й группы давали с питьевой водой в течение всего дня метформин. Животные 3-й группы получали с питьевой водой в течение всего дня метформин и мелато-нин. Животные 4-й группы составили контрольную группу по канцерогену и получали питьевую воду без добавления мелатонина и мет-формина.

Длительность эксперимента — 26 недель, после чего оставшиеся в живых мыши были умерщвлены путем декапитации.

Патоморфологические методы исследования. Все погибшие животные и мыши, которые были выведены по истечении срока эксперимента, вскрывались и подвергались тщательному патоморфо-логическому исследованию. На аутопсии исследовались кожные покровы, внутренние органы и шейка матки. Производился подсчет общего числа опухолевых узлов кожи и шейки матки, определялись их размеры.

Все опухолевые узлы, а также ткани и органы, подозрительные на наличие новообразований, были иссечены и зафиксированы в 10% нейтральном формалине. После обычной гистологической обработки кусочки ткани были залиты в парафин. Тонкие (5 — 7 мкм) гистологические срезы были окрашены гематоксилином и эозином и исследованы микроскопически. В микропрепаратах опухолевой ткани животных определяли митотический индекс (Дьяконов Л. П., Ситьков В. И., 2000). Подсчитывали число митозов в опухолевых клетках (в 5 полях зрения) при увеличении х400.

Иммуногистохимическое исследование. Изучались экспрессия ангиогенных факторов в ткани индуцированных опухолей, экспрессия УЕОР и количество кровеносных сосудов, окрашенных антителами к С031, с использованием коммерческих антител и проявочных тест-систем. Подсчитывали количество СБ31+ микрососудов в опухоли не менее чем в 3 полях зрения при увеличении х20. Экспрессию УЕОР определяли в интенсивности окрашивания опухолевых клеток как 1+ — при низкой и 2+ — при средней интенсивности окрашивания.

Биохимические методы исследования. У всех интактных мышей в сыворотке крови определяли содержание малонового диаль-дегида (МДА) (Кошохова С. Г., 1989) и активность каталазы (Королюк М. А., 1988). У 5 — 8 мышей из каждой группы животных, подвергшихся воздействию канцерогена, определяли содержание малонового диальдегида и активность каталазы в сыворотке крови и гомогенатах опухолевой ткани. МДА представляет собой вторичный (промежуточный) продукт реакций перекисного окисления липидов (ПОЛ). Катазала является одним из основных ферментов антиокси-

даитиой системы организма, катализирует восстановление перекиси водорода до воды, тем самым уменьшая образование свободных радикалов (Конторщикова К. Н., 2000).

Статистические методы исследования. Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием ^критерия Стыодента, точного метода Фишера, х2 и теста Колмогорова — Смирнова (Гублер Е. Г., 1978), с помощью пакета прикладных программ «МедСтатистика» и «Биостат».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние мелатонина и метформина на канцерогенез кожи, индуцируемый бенз(а)пиреном у мышей

Основные результаты опытов представлены в таблице 1.

По завершении эксперимента рассчитывали средний латентный период развития опухолей и выживаемость опухоленосителей. Средний латентный период развития опухолей равен 96 ± 8,6 суток в группе контроля. В группе животных, получавших мелатонин, данный показатель увеличился на 28,1 % (р < 0,05). При применении метформина средний латентный период развития опухолей возрос на 29,2 % по сравнению с контролем. В группе мышей, получавших метформин и мелатонин, данный показатель увеличился на 39,4 % (р < 0,05).

Таблица 1

Влияние мелатонина и метформина на канцерогенез кожи, индуцируемый БП у мышей

Показатель БП БП + + мелатонин БП + + метформин БП + + мелатонин + + метформин

Средний латентный период развития опухолей, сут, М ± ш 96 ± 8,6 123+ 5,2* 124+5,3 134+5,6*

Общее число животных с опухолями, % 25 (83%) 20 (67 %)* 18(60%)* 15(50%)*

Средний диаметр опухолей, см, М + m 3,4 ± 0,2 2,1 + 0,2*** 2 + 0,3*** 1,6+0,2***

Среднее число опухолей на 1 мышь-опухоленоситсля, М ± т 3,4 ± 0,4 2,4+0,4* 2,1 + 0,3* 2,3+0,4*

Число животных с папилломами, % 8(27 %) 9(30%)* 12(40%)* 9(30%)*

Число животных со злокачественными опухолями, % 17 (57 %) И (37%)* 6 (20%)*** 6 (20%)***

Продолжительность жизни животных после обнаружения опухолевых узлов, сут, М ± m 66 + 6,91 86 ±3,1 95 ± 4,2* 102 ± 3,3*

Различия с группой контроля достоверны (тест Стьюдента): * — р < 0,05, ** — р<0,01, *** - р<0,00!.

Через 90 суток от начала аппликаций бенз(а)пиреном у мышей контрольной группы сформировались узелки в месте воздействия канцерогена. По структуре опухолевидные образования плотноэласти-ческой консистенции, несколько выступающие над поверхностью неизмененных кожных покровов. Форма — округлая или округло-овальная. Размеры не превышают 2 мм. В экспериментальных группах введение мелатошша и метформина не привело к статистически значимому изменению времени появления первого опухолевого узла — в среднем 93 дня. В динамике узлы теряли подвижность, становились несме-щаемыми и увеличивались в размерах, изъязвлялись с формированием язв с подрытыми плотными краями и западающим дном. Макроскопически опухолевые узлы у животных экспериментальных групп не отличались от таковых у мышей в контрольной группе. На заключительных этапах эксперимента опухолевые узлы достигали значительных размеров и язвенные дефекты занимали большую часть поверхности спинки мыши. Наблюдались вторичные изменения в тканях опухоли с явлениями нагноения и распада. У части мышей контрольной группы опухолевидные образования располагались не только в месте непосредственного воздействия канцерогена, но и на отдаленных участках.

Под влиянием БП в месте аппликации у 25 из 30 мышей контрольной группы развивались опухоли кожи (83 %). При введении мышам, подвергшимся воздействию БП, одного мелатошша опухоли кожи развились у 20 из 30 животных (67 %), что в 1,2 раза меньше по сравнению с группой контроля; при введении одного метформина — у 18 из 30 мышей (60 %), что в 1,4 раза меньше, чем в группе контроля; и при комбинации метформина с мелатонином — в 50 % случаев, что в 1,7 раза меньше по сравнению с группой контроля.

Средний диаметр опухолей составил 3,4 ± 0,2 см в группе контроля, в группе, получавшей мелатонин — меньше на 38 %, чем в группе контроля; при применении метформина данный показатель снизился на 41 % по сравнению с контролем. При применении мелатоиина и метформина одновременно средний диаметр опухолей уменьшился на 53 % по сравнению с животными в группе контроля. Различия достоверны (р < 0,001).

Среднее число опухолей на 1 мышь-опухоленосителя в группе контроля составило 3,4 ± 0,4, а при применении мелатоиина данный показатель уменьшился на 29,5 % по сравнению с контролем. В группе животных, получавших метформин, показатель снизился на 38 %, а при совместном применении мелатоиина и метформина среднее число опухолей па 1 мышь-опухолеиосителя уменьшилось на 32 % по сравнению с контролем. Все различия с группой контроля достоверны (р < 0,05).

При микроскопическом исследовании наблюдалась гистологическая картина, характерная для плоскоклеточного ороговевающего рака и папиллом кожи. Патогистологическая структура плоскоклеточного

рака и папиллом кожи в группе контроля и в группах, получавших мелатонин и метформин, была одинаковой. Сформированные папилломы микроскопически представляют собой очаги дифференцированного эпителия, четко отграниченные от окружающих тканей с выраженными явлениями гиперкератоза. При малигнизации папиллом они приобретают характерные черты. Атипичные эпителиальные клетки погружаются в рыхлую соединительнотканную основу, глубоко идущие тяжи эпителия проникают через ножку папилломы. При этом они достигают подлежащих участков дермы и прорастают в них. Выявлялись различные формы дискератоза и всегда выраженный гиперкератоз. Для плоскоклеточных ороговевающих карцином кожи было характерно формирование раковых «жемчужин» из рогового вещества.

Митотический индекс в ткани злокачественных опухолей у мышей, подвергшихся воздействию БП, составил 0,97 ± 0,21. При введении мелатонина данный показатель был равен 0,52 ± 0,16, метформи-на — 0,64 ± 0,17, мелатонина и метформина — 0,47 ± 0,15 (р > 0,05).

Число животных с гистологически верифицированными папилломами кожи составило в контроле 27 %. При коррекции мелатони-ном число папиллом достигало 30 % (р > 0,05). В группе животных, получавших метформин, количество папиллом кожи — 40 %. При совместном применении мелатонина и метформина число животных с папилломами составляет 30 %. Различия с группой контроля достоверны (р < 0,05) (рис. 1). По данным гистологического исследования, в контрольной группе число животных со злокачественными опухолями (плоскоклеточный ороговевающий рак и папиллома с очагами малигнизации) — 57 % от всех животных с опухолями. При введении мелатонина в дозе 2 мг/л число животных со злокачественными опухолями составило 37 %, различия с группой контроля достоверны (р < 0,05) (рис. 2). При применении мелатонина совместно с метфор-мином данный показатель равнялся 20 и 20 % соответственно. Различия достоверны (р < 0,001).

■ БП «БП+МЛТ ш БП+МФ К БП+МЛТ+МФ

Рис. 1. Влияние* мелатонина и метформина на частоту папиллом кожи у мышей. По оси ординат — число мышей с папилломами кожи, %. Различия с группой контроля достоверны (тест Стьюдента): * — р < 0,05

■ БП К БП+МЛТ ВБГЬМФ ■ ЕП+МЛТШФ

Рис. 2. Влияние мелатонина и мстформина на частоту злокачественных

новообразований кожи у мышей. По оси ординат — число мышей со злокачественными опухолями кожи, %. Различия с группой контроля достоверны (тест Стьюдента): * — р < 0,05, *** —р < 0,001

Продолжительность жизни животных после обнаружения опухолевых узлов составила 86 + 3,1 суток, что на 30,3 % больше в группе, получавшей мелатонин, чем в группе контроля, но различия статистически недостоверны. При применении как одного метформина, так и совместно с мелатонином данные показатели увеличились соответственно на 43,9 и 54,6 % по сравнению с контрольной группой (р < 0,05).

Так, при экспериментальном канцерогенезе кожи в результате введения БП содержание МДА возросло на 18,3 % в сыворотке крови, но не в ткани опухолей. Активность каталазы была увеличена на 85,9 % в сыворотке крови и на 24,5 % в опухолевой ткани по сравнению с соответствующими показателями в контроле. Мелатонин угнетал процессы ПОЛ в сыворотке крови, а метформин — в опухолевой ткани. При совместном использовании мелатонина и метформина процессы ПОЛ в сыворотке крови и опухолевой ткани активизировались. Применение мелатонина снижало активность каталазы в сыворотке крови и опухолевой ткани, а использование метформина — повышало (таблица 2).

Таблица 2

Содержание МДА и активность каталазы в сыворотке крови и ткани опухоли кожи у животных, вызванной БП, при коррекции мелатонином и метформином и в интактном контроле

№ группы Воздействие Уровень МДА, ммоль/л Активность каталазы, мккат/л

Сыворотка крови Ткань опухоли Сыворотка крови Ткань опухоли

1 2 3 4 5 6

1 Интактный контроль 4,98+0,58 - 0,41 ± 0,02

2 БП 5,89 ± 0,86 11,8 ± 1,01 35,15 ± 4,43 11,00 ± 0,45

Окончание табл. 2

1 2 3 4 5 6

3 БП + мелатонин 2 мг/л 2,13 ± 0,51 5,66 ± 1,26 4,28 ± 0,40 5,68 ± 1,69

4 БП + метформин 200 мг/л 4,85 ± 0,57 4,12 ±0,99 22,50 ± 4,02 28,33 ± 2,46

5 БП + мелатонин 2 мг/л + + метформин 200 мг/л 7,02 ± 0,88 4,98 ± 1,42 7,91 ± 1,42 9,36 ± 2,04

Достоверность различия между группами,р Р. ,<0,05 Р, ,<0,01 Р, ,<0,01 Р3_5< 0,001 Р2 4 <0,05 Р, ,<0,001 Р2 ,<0,001 Р4 ,<0,001 Р, ,<0,05 Р <0,001 Р2_3< 0,001 Р, .<0,001 Р2 <0,01 Р, ,<0,001 Р4 3< 0,001

Таким образом, мелатонин и метформин обладают онкостатиче-ским действием иа опухолевый рост в коже, индуцируемый бенз(а)пи-реном у мышей. Частота развития опухолей кожи в эксперименте уменьшилась иа 16 % при введении мелатонина; при коррекции мет-формином — на 23 %; а при одновременном применении мелатонина и метформина — иа 33 %. При этом частота злокачественных опухолей снизилась в 1,5 раза у мышей, получавших мелатонин, в 2,8 раза — при введении метформина и в 2,8 раза — при коррекции мела-тонином и метформином совместно, тогда как частота развития папиллом не отличалась от группы контроля. Мелатонин и метформин вызывали достоверное уменьшение среднего и максимального размеров опухолей кожи, а также выраженность вторичных изменений в них. Введение мелатонина и метформина существенно не влияло на латентный период развития опухолей. Применение данных препаратов способствует уменьшению числа животных с опухолями, снижению частоты, множественности и размеров опухолей кожи в условиях экспериментального опухолевого роста, а также потенцирует увеличение средней продолжительности жизни мышей после обнаружения опухолевых узлов. Введение мелатонина способствует замедлению процессов ПОЛ в ткани индуцированных опухолей кожи в большей мере по сравнению с метформином и совместным использованием мелатонина и метформина.

Ранее А. С. Kumar и U. N. Das (2000) показали угнетающее действие мелатонина иа развитие опухолей кожи на двустадийной модели канцерогенеза, индуцируемого аппликациями БП и кротоиового масла у мышей Swiss. При ежедневном введении мелатонина в дозе 10 мкг на мышь отмечались уменьшение частоты развития папиллом кожи в 2 раза, а также снижение их множественности. В данном исследовании также сообщается, что под действием БП и кротонового масла у мышей развивались папилломы кожи. Однако в нашей работе в большинстве случаев был диагностирован плоскоклеточиый рак кожи. Указанные различия, возможно, обусловлены особенностями модели

канцерогенеза. А. С. Kumar и U. N. Das (2000) индуцировали опухоли однократным введением БП в дозе 50 мкг с последующими аппликациями кротонового масла в качестве опухолевого промотора. В нашей работе разовая и суммарная дозы БП была значительно больше: 100 мкг 2 раза в неделю на протяжении 6 месяцев.

Расчеты показывают, что доза мелатонина в опытах A.C. Kumar и U. N. Das (2000) — 10 мкг на мышь — соответствует примерно 0,4 мг/кг, тогда как в наших опытах достоверный угнетающий эффект на большинство показателей оказывала значительно меньшая доза — 2 мг/л, что соответствует 0,25 мг/кг.

Влияние мелатонина и метформина на канцерогенез мягких тканей, индуцируемый бенз(а)пиреном у мышей

Основные результаты опытов представлены в таблице 3.

По завершении эксперимента рассчитывали средний латентный период развития опухолей и выживаемость опухоленосителей. Средняя длительность латентного периода опухолей в группе контроля составила 150 ± 2,8 суток. Первые опухоли появились через 126 суток после применения канцерогена. При введении мелатонина и метформина отмечено увеличение латентного периода развития опухолей. Так, у мышей, получавших оба препарата, средний латентный период развития опухолей увеличился на 13,3 % по сравнению с контролем (р < 0,05). В группе мышей, получавших метформин, средняя длительность латентного периода возросла на 11,2 %.

Таблица 3

Влияние мелатонина и метформина на канцерогенез мягких тканей, иидуцируемый БП у мышей

Показатель БП БП + + мелатонин БП + + метформин БП + + мелатонин + метформин

Средний латентный период развитая опухолей, сут, М ± ш 150 ± 2,8 165 ± 0,9* 169 ± 1,7 173± 1,5*

Общее число животных с опухолями, % 24 (80 %) 18(60%)** 14 (46,7 %)*** 12 (40%)**

Средний размер опухоли, мм, М ± ш 29,1 ± ± 1,28 29,3 ± 0,81* 28,1 ± 1,2* 27 ± 1,05*

Среднее число опухолей на 1 мышъ-опухоленосителя, М ± m 3,2 ± 0,4 2,8 ± 0,4* 2,4± 0,3** 2,6 ± 0,4*

Продолжительность жизни животных после обнаружения опухоли, сут, М ± ш 12,4± 2,2 20,6 ± 4,08* 16,2 ± 1,4* 22,3± 3,1**

Различия с группой контроля достоверны (тест Стьюдента): * — р < 0,05, ** — р < 0,01, *** - р< 0,001.

Начиная со 126-х суток после введения канцерогена у животных данной группы па спине в области введения БП возникали опухолевидные образования округлой формы, с достаточно четкими границами, серовато-белого цвета, плотной консистенции с неровной поверхностью, подвижные при пальпации. По мере увеличения размеров опухолевые узлы теряли подвижность, становились фиксированными к подлежащим тканям. Кожные покровы над опухолью во всех случаях были изъязвлены, волосяной покров отсутствовал. Среди опухолей, возникающих после короткого латентного периода (126 — 140 суток), преобладали опухоли большого размера. В подобных случаях часто наблюдались явления распада, некроза и кровоизлияний в опухолевой ткани. В группе животных, получавших метформин, при макроскопическом исследовании новообразований в нескольких случаях отмечалось изъязвление опухолевой ткани. В группе мышей, которым вводили метформин и мелатонин, изъязвление опухолевого узла было обнаружено лишь в одном случае. В группе животных, получавших мелатонин, во всех случаях на поверхности опухоли присутствовал волосяной покров с сохранением целостности кожных покровов. При исследовании post mortem опухолевые узлы плотно спаяны с окружающими тканями, с эпидермисом, при этом кожные покровы были неотделимы от подлежащей ткани новообразований. На разрезе опухолевая ткань беловато-серого цвета, имеет вид «рыбьего мяса», режется с хрустом. В большинстве случаев макроскопически в опухолевых узлах были обнаружены фокусы некроза и кровоизлияний. Во всех опытных группах в половине случаев опухолевые узлы имели капсулу, четкие границы и не распространялись в подлежащие и окружающие ткани. Кожные покровы при этом были легкоотделимы от поверхности иеоплазий. При макроскопическом исследовании экспериментальных мышей трех опытных групп, получавших мелатонин и метформин, признаки метастатического поражения внутренних органов не были обнаружены. Под действием мелатонина значительно изменялась макроскопическая картина опухолей в виде уменьшения или полного отсутствия изъязвления кожных покровов и сохранности волосяного покрова над поверхностью опухоли.

При введении мелатонина число животных с опухолями составило 60 % (18 животных из 30) и было в 1,3 раза меньше по сравнению с контролем (р < 0,01). При введении метформина частота развития опухолей уменьшилась в 1,7 раза по сравнению с контролем и составила 46,7 % (14 животных из 30) (р < 0,001). При совместном использовании мелатонина и метформина число животных с опухолями составило 40 % (12 животных из 30), что в 2 раза меньше по сравнению с контролем (р < 0,01).

Размеры опухолевых узлов под влиянием мелатонина и метформина существенно не изменялись. Так, в группе контроля средний размер опухолей составил 29,1 ± 1,28 мм. Аналогичные показатели фиксировались в группах, получавших мелатонин, метформин, совме-

стно мелатонин и метформин, — соответственно 29,3 ± 0,81; 28,1 ± ± 1,2 и 27 ± 1,05 мм (р < 0,05).

Среднее число опухолей на 1 мышь-опухоленосителя в группе контроля составило 3,2 ± 0,4, а при применении мелатонина данный показатель уменьшился на 12,5 % по сравнению с контролем. В группе животных, получавших метформин, показатель снизился на 25 %, а при совместном применении мелатонина и метформина среднее число опухолей па 1 мышь-опухоленосителя уменьшилось на 18,8 % по сравнению с контролем. Все различия с группой контроля достоверны (р < 0,05).

При микроскопическом исследовании в большинстве случаев встречались типичные (фиброзные) формы злокачественной гистиоцитомы, представленные фибробласто- и гистиоподобными клеточными типами. При этом опухолевые клетки, имеющие преимущественно верете-новидпую форму, образуют характерные «муаровые» структуры. В опухолевой ткани встречаются также округлые, полиморфные и гигантские клетки. В ряде случаев в опухолевой ткани преобладали многочисленные гигантские полинуклеарные клетки типа остеокластов с ядрами причудливой формы. В отдельных опухолях выражена картина миксоматоза стромы, при этом очаги ослизнепия занимают не менее половины площади среза опухолевой ткани. Встречаются также опухоли, представленные скоплениями ксантомных клеток и выраженной очаговой или диффузной воспалительной инфильтрацией.

Митотический индекс в ткани злокачественных опухолей у мышей, подвергшихся воздействию БП, составил 0,98 ± 0,24. При введении мелатонина данный показатель уменьшился до 0,46 ± 0,16. Под действием метформина он достоверно снижался до 0,55 ± 0,19. При введении мелатонина и метформина митотический индекс также уменьшился до 0,59 ± 0,21 (р > 0,05).

Средняя продолжительность жизни мышей после появления опухолей составила 12,4 ± 2,2 суток. При введении мелатонина и метформина средняя продолжительность жизни после развития опухолей увеличилась на 44,4 % по сравнению с группой контроля (р < 0,05); при введении метформина — на 23,5 % (р < 0,05), мелатонина — на 39,8 % (р < 0,05).

Введение мелатонина мышам, которым были сделаны подкожные инъекции БП, уменьшало уровень МДА и активность каталазы как в сыворотке крови, так и в ткани опухолей подкожной клетчатки. После введения БП отмечалась значительная интенсификация процессов ПОЛ, о чем свидетельствует повышение уровня МДА как вторичного продукта липопероксидации. Так, данный показатель достоверно увеличился по сравнению с контролем в 2,6 раза в сыворотке крови и в 1,1 раза в опухолевой ткани. Введение мелатонина вызывало достоверное уменьшение уровня МДА в сыворотке крови на 63,9 % по сравнению с контролем и в 0,6 раза по сравнению с интактным контролем; в опухолевой ткани данный показатель уменьшился на 40,5 %

по сравнению с группой контроля. Введение метформина незначительно вызывало достоверное уменьшение уровня МДА в сыворотке крови на 2,1 % по сравнению с контролем и увеличение уровня МДА в 2,6 раз по сравнению с интактным контролем (р > 0,05); уровень МДА в опухолевой ткани увеличился на 77 % по сравнению с группой контроля (р < 0,05) (таблица 4).

Таблица 4

Содержание МДА и активность каталазы в сыворотке крови у животных при канцерогенезе мягких тканей, вызванном БП, при коррекции мелатонином и метформином и в интактном контроле

№ группы Воздействие Уровень МДА, ммоль/л Активность каталазы, мккат/л

Сыворотка крови Ткань опухоли Сыворотка крови Ткань опухоли

1 Интактный контроль 4,98 ± 0,58 (п = 6) - 0,41 ± 0,02 (п = 6) -

2 БП 13,1 + 0,63а (п = 10) 9,38+ 0,266 (п = 5) 0,51 ±0,05 а (п = 9) 0,77 + 0,13а (п = 5)

3 БП + мелатонин 2 мг/л 3,18+0,15* (п = 6) 5,58 ±0,55** (п = 5) 0,35 + 0,05 <п = 6) 0,3+0,04* (п = 5)

4 БП + метформин 200 мг/л 12,83+0,55 ++ (п = 7) 16,67+1,68* (п = 5) 4,29 ± 0,58*+ (п = 7) 4,27 + 0,35*+ (п = 5)

5 БП + мелатонин 2 мг/л + + мстформин 200 мг/л 8,89 + + 0,92** +++ (п= 10) 32,5 + 1,02 (п = 5) 4,44 ± ± 0,31** + (п = 10) 4,0 + 0,31** (п = 5)

Различия с группой интактного контроля достоверны (тест Стьюдента): а — р < 0,05, б - р < 0,01.

Различия с группой животных, подвергнутых воздействию БП, достоверны (тест Стьюдента): * - р < 0,05, ** - р < 0,01.

Различия между группами, получавшими мелатонин, мстформин или их комбинацию, достоверны: + - р < 0,05, ++ - р < 0,01, +++ - р < 0,001.

Введение мелатонина и метформина также вызывало достоверное уменьшение уровня МДА в сыворотке крови на 32,1 % по сравнению с контролем и увеличение данного показателя в 1,8 раза по сравнению с интактным контролем (р < 0,01). Содержание МДА в опухолевой ткани увеличилось в 3,5 раза по сравнению с группой контроля. После введения БП активность каталазы достоверно возрастала в сыворотке па 24,4 % (р < 0,05), в опухолевой ткани — на 5,5 % (р > 0,05).

Введение мелатонина вызывало достоверное уменьшение активности каталазы в сыворотке по сравнению с контролем на 31,4 % и уменьшение в 0,9 раза — с интакпым контролем; активность каталазы в опухолевой ткани снижалась на 61 % по сравнению с группой контроля. Введение метформина вызывало значительное увеличение

активности каталазы в сыворотке по сравнению с контролем — в 8,4 раза и в 10,5 раза по сравнению с иптактным контролем; в опухолевой ткани данный показатель был выше в 5,5 раза, чем в группе контроля. Введение мелатонииа и метформина также вызывало значительное увеличение активности каталазы в сыворотке — по сравнению с контролем в 8,7 раза и в 10,8 раз по сравнению с иптактным контролем; в опухолевой ткани — в 5,2 раза (см. таблицу 4).

Таким образом, введение мелатонииа, не влияя на размеры опухолей, уменьшало частоту развития сарком в 1,3 раза; в 1,7 раза — применение метформина и в 2 раза — совместное использование мелатонииа и метформина. Кроме того, совместное применение мелатонииа и метформина вызывало увеличение продолжительности жизни мышей после появления опухолей. Введение метформина увеличивало латентный период опухолей на 11,2 % по сравнению с контрольной группой. На экспериментальной модели канцерогенеза мягких тканей подкожное введение БП мышам приводило к достоверному повышению содержания МДА в сыворотке крови в 2,6 раза ив 1,1 раза в опухолевой ткани. Введение мелатонииа вызывало достоверное снижение содержания МДА в сыворотке крови на 63,9 % и в опухолевой ткани на 40,5 % по сравнению с контролем. Активность каталазы достоверно уменьшалась при введении мелатонииа на 31,4 и 61 % в сыворотке крови и опухолевой ткани соответственно.

В исследованиях Г. М. Веснушкина (2007) при изучении влияния мелатонииа на развитие индуцированных БП опухолей мягких тканей введение мелатонииа уменьшало частоту развития сарком в 2,3 раза. Мелатонин увеличивал выживаемость животных после появления опухолей и латентный период опухолей. Не оказывая влияния на гистологическую структуру опухолей, мелатонин в дозе 2 мг/л уменьшал их пролиферативную активность в 1,67 раза (Веснуш-кинГ. М., 2007).

Влияние мелатонииа и метформина на канцерогенез шейки матки, индуцируемый бенз(а)пиреиом у мышей

Основные результаты опытов представлены в таблице 5.

По завершении эксперимента рассчитывали средний латентный период развития опухолей и выживаемость опухоленосителей. Средний латентный период развития опухолей был равен 85 ± 3,9 суток в группе контроля. В группе животных, получавших мелатонин, данный показатель возрос на 31,8 % по сравнению с контролем. При применении метформина на 35,3 % увеличился средний латентный период развития опухолей (по сравнению с контролем) (р < 0,05). В группе мышей, получавших метформин и мелатонин, данный показатель увеличился на 47,1 % по сравнению с контрольной группой (р < 0,05).

Влияние мелатошша и метформина на развитие опухолей шейки матки, индуцируемых бенз(а)пиреном

Показатель БП БП + + мелатонин БП + + метформин БП + +мелатонин + + метформин

Средний латентный период развития опухолей, сут, М ± m 85 ± 3,9 112 ±5,1 115 ± 5,3* 125 ± 4,2**

Общее число животных с опухолями, % 27 (90%) 24(80%)* 20 (67 %) 18(60%)**

Средний диаметр опухолей, см, М ± ш 0,6 ±0,2 0,4 ± 0,2*** 0,2 ± 0,3*** 0,2 ±0,2***

Среднее число опухолей на 1 мышь-опухоленосителя, М ± ш 4,2 ± 1,2 4 ±0,4* 3,4 ±0,4* 2,4 ± 0,4*

Продолжительность жизни животных после обнаружения опухолевых узлов, сут, М ± ш 59 ± 2,5 79 ± 3,4 88 ± 4,5* 95 ± 3,5*

Различия с группой контроля достоверны (тест Стьюдента): * — р < 0,05, ** — р < 0,01, *** - р < 0,001.

В контрольной группе у мышей развивались опухоли шейки матки с частотой 90 % (27 животных из 30). При введении мелатонина число животных с опухолями составляло 80 % (24 животных из 30), что в 1,1 раза меньше по сравнению с контролем (р < 0,05). При введении метформина частота развития опухолей уменьшилась в 1,3 раза по сравнению с контролем и составила 67 % (20 животных из 30) (р < 0,001). При совместном применении мелатонина и метформина число животных с опухолями составило 60 % (18 животных из 30), что в 1,5 раза меньше по сравнению с контролем (р < 0,01).

Средний диаметр опухолей в группе контроля — 3,4 ± 0,2 см. В группе, получавшей мелатонин, данный показатель уменьшился на 38 % по сравнению с группой контроля; при применении метформина — на 41 %. При использовании мелатонина и метформина одновременно средний диаметр опухолей был на 53 % меньше, чем у животных контрольной группы. Различия достоверны (р < 0,001).

Среднее число опухолей на 1 мышь-опухоленосителя в группе контроля составляет 3,4 ± 0,4, а при применении мелатонина данный показатель уменьшился на 29 % по сравнению с контролем. В группе животных, получавших метформин, показатель снизился на 38 %, а при совместном применении мелатонина и метформина среднее число опухолей на 1 мышь-опухоленосителя было на 32 % меньше по сравнению с контролем. Все различия достоверны (р < 0,05).

При микроскопическом исследовании диагностирован плоскоклеточный рак шейки матки. Различают два основных гистологических

варианта плоскоклеточного рака: ороговевающий и неороговевающий. Микроскопически для ороговевающего плоскоклеточного рака характерно образование опухолевыми клетками кератиновых гранул и раковых «жемчужин». В плоскоклеточном неороговевающим раке опухолевые клетки имеют округло-овальную или полигональную форму с эозинофилыюй цитоплазмой. Ядра опухолевых клеток в большинстве случаев мономорфпые, в отдельных очагах имеют выраженный полиморфизм. Межклеточные мостики или контакты не определяются.

Через 4 месяца от начала эксперимента у 20 мышей при морфологическом исследовании опухоли шейки матки была выявлена диспла-зия легкой степени. В группе контроля она отмечалась у 8 мышей; в группе животных, получавших мелатонин, — у 4; метформин — у 5; мелатонин и метформин — у 3. Микроскопически дисплазия легкой степени представлена нарушением пролиферации и гистологической дифференцировки многослойного плоского эпителия с появлением признаков клеточного атипизма. У 9 мышей через 5 месяцев был выявлен «рак на месте». В группе контроля он отмечался у 4 мышей; в группе животных, получавших мелатонин — у 2; метформин — у 2; мелатонин и метформин — у 1. Микроскопически «рак на месте» отличается появлением атипичных полиморфных опухолевых клеток, занимающих полностью всю толщу эпителиального пласта, не выходя за пределы базальиой мембраны.

Через б месяцев у 7 мышей обнаружен плоскоклеточный рак с инвазией. В группе контроля он отмечался у 5 животных; в группе мышей, получавших мелатонии — у 1; метформин — у 1; мелатонин и метформин — не был обнаружен. Инвазивный плоскоклеточный рак характеризуется врастанием тяжей анаплазированного эпителия за ба-зальную мембрану, в подлежащие ткани.

Митотический индекс в ткани злокачественных опухолей у животных, подвергнутых воздействию БП, составил 0,98 ± 0,25. При коррекции мелатонином митотический индекс уменьшился до 0,69 ± 0,21 (р > 0,05). Под влиянием метформина данный показатель достоверно уменьшался по сравнению с контрольной группой и составил 0,45 ± ± 0,17 (р < 0,01). При введении мелатонина и метформина митотический индекс также снижался по сравнению с контрольной группой до 0,53 ± 0,19 (р > 0,05).

Интенсивность ангиогенеза в ткани индуцированных опухолей шейки матки оценивалась по двум характеристикам: экспрессии основного стимулятора ангиогенеза УЕСТ (сосудистый фактор роста эндотелия) и по среднему количеству сосудов в опухоли (таблица 6).

Влияние мелатонила и метформина на показатели ангиогенеза у мышей в опухолях шейки матки, индуцированных бенз(а)пиреном

Препарат Количество СБ31+ сосудов в поле зрения Интенсивность окрашивания УЕОК

Контроль 15 ± 3 2+

Мелатоиин 10 ± 5 1+/2+

Мстформин 8± 3 1+

Мелатоиин + метформип 8± 3 1+

В группе контроля показатель интенсивности окрашивания УЕвР составил 2+. Под влиянием мелатопина, метформина и совместного использования мелатопина и метформина интенсивность окрашивания УЕОИ уменьшилась до 1. В группе контроля количество СОЭ1+ сосудов в поле зрения составило 15 ± 3; под воздействием мелатопина — 10 ± 5; под влиянием мелатопина и совместного использования мелатопина и метформина — уменьшилось до 8 ± 3. Полученные результаты свидетельствуют о том, что применение мелатопина и метформина способствует снижению активности ангиогенеза в ткани индуцированных неоплазий.

Продолжительность жизни животных после обнаружения опухолевых узлов составляет 79 ± 3,4 суток, что на 33,7 % больше в группе, получавшей мелатоиин, чем в группе контроля (59 ± 2,5 суток), но различия статистически недостоверны. При применении метформина как одного, так и совместно с мелатонином данные показатели увеличились соответственно на 49,2 и 61 % по сравнению с контрольной группой (р < 0,05) (рис. 3).

Рис. 3. Влияние мелатопина и метформина на продолжительность жизни животных после обнаружения опухолевых узлов в шейке матки. Различия с группой контроля достоверны (тест Стьюдента): * — р < 0,05

При моделировании опухолей шейки матки введение БП мышам сопровождалось увеличением содержания МДА в 4,8 раза в сыворотке крови. Введение мелатоиина достоверно уменьшало данный показатель на 20,7 % в сыворотке крови и увеличивало в 3,7 раза по сравнению с интактным контролем. Активность каталазы в сыворотке крови мышей, подвергшихся воздействию БП, возросла в 4,3 раза. Введение мелатоиина достоверно вызывало увеличение активности каталазы на 11 % в сыворотке крови и в 9,1 раза по сравнению с интактным контролем (таблица 7).

Таблица 7

Содержание МДА и активность каталазы в сыворотке крови у животных с опухолями шейки матки, вызванными БП, при коррекции мелатонином и метформином и в интактном контроле

№ группы Воздействие Уровень МДА, ммоль/л Активность каталазы, мккат/л

1 Интактный контроль 4,98 ± 0,58 0,41 ± 0,02

2 БП 23,67 ± 1,52 1,78+0,11

3 БП + мелатонин 2 мг/л 18,77 ± 1,66 3,76+0,52

4 БП + мстформип 200 мг/л 26,36+ 1,29 2,63+ 0,26

5 БП + мелатонин 2 мг/л + + метформии 200 мг/л 20,50 ± 0,5 2,22 ± 0,31

Достоверность различия между группами, р Р2_3 < 0,05 Р4_3< 0,001 Р, "„<0,01 3 — 4 Р2 3 < 0,01 Р2 4<0,01 Р2_5<0,1

Таким образом, частота развития опухолей шейки матки в эксперименте уменьшилась на 10 % при введении мелатоиина; при коррекции метформином — на 23 %; а при одновременном применении мелатоиина и метформина — на 30 %. При этом частота злокачественных опухолей снизилась в 1,4 раза у мышей, получавших мелатонин, в 2,2 раза — при введении метформина и в 2,2 раза — при коррекции мелатонином и метформином совместно, тогда как частота развития папиллом не отличалась от группы контроля. Мелатонин и метфор-мип вызывали достоверное уменьшение среднего и максимального размеров опухолей шейки матки, а также выраженность вторичных изменений в опухолях. Введение мелатоиина и метформина способствует уменьшению числа животных с опухолями, снижению частоты, множественности и размеров опухолей шейки матки в условиях индуцированного экспериментального опухолевого роста, а также приводит к увеличению средней продолжительности жизни мышей после обнаружения опухолевых узлов. Введение мелатоиина способствует замедлению процессов ПОЛ в ткани индуцированных опухолей кожи по сравнению с метформином и совместным использованием мелато-

нина и метформина. Применение мелатонина и метформина способствует снижению активности ангиогенеза в ткани индуцированных неоплазий шейки матки.

В. Н. Анисимов и соавт. (2000) в опытах на самках мышей СВА наблюдали угнетающее действие мелатонина на канцерогенез шейки матки и влагалища. Канцерогенез индуцировали иптравагинальными аппликациями полиуретановой губки с раствором ДМБА в триэти-ленгликоле 2 раза в неделю в течение 2 месяцев. Мелатонин вводился с питьевой водой в единственной дозе 20 мг/л в ночное время (с 18:00 до 09:00) в течение 4 месяцев. Длительность эксперимента составила б месяцев. Введение мелатонина мышам полностью предотвращало развитие карцином влагалища, а также опухолей шейки матки. Кроме того, мелатонин препятствовал развитию пренеопластических про-лиферативных процессов в эпителии влагалища и шейки матки (Анисимов В. Н. и соавт., 2000).

ВЫВОДЫ

1. На модели канцерогенеза кожи, индуцируемого БП у мышей, установлено, что сочетанное использование мелатонина и метформина оказывает более выраженный онкостатический эффект, проявляющийся в уменьшении множественности и размеров опухолевых узлов.

2. Мелатонин и метформин оказывают антиканцерогенное действие в отношении опухолей мягких тканей, индуцируемых БП у мышей, увеличивая латентный период развития опухолей и выживаемость опухоленосителей.

3. Мелатонин и метформин угнетают канцерогенез шейки матки, индуцируемый БП у мышей, что проявляется уменьшением множественности и размеров опухолевых узлов, увеличением выживаемости опухоленосителей и латентного периода развития опухолей шейки матки.

4. Введение мелатонина и метформина способствует снижению активности процессов ангиогенеза в тканях индуцируемых неоплазий шейки матки.

5. Установлено, что введение мелатонина способствует замедлению процессов ПОЛ в ткани индуцированных опухолей кожи, мягких тканей и шейки матки в большей степени по сравнению с метформи-ном и совместным использованием мелатонина и метформина.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Антиканцерогенное действие мелатонина в условиях экспериментального опухолевого роста / О. Н. Дерябина, Н. А. Плотникова, Д. В. Демидов [и др.] // Актуальные проблемы патофизиологии :

тезисы XIV межгород, конф. молодых ученых. — СПб., 2008. — С. 36-37.

2. Влияние мелатонина на продолжительность жизни у мышей при экспериментальном опухолевом росте / О. Н. Дерябина, Н. А. Плотникова, Т. В. Харитонова, Е. О. Букаева // Здоровье и образование в XXI веке : материалы IX Междунар. конгр. — М.,

2008. - С. 579.

3. Влияние эндогенного гормона мелатонина на модели экспериментального канцерогенеза, индуцируемого уретаном и бенз(а)пире-ном у мышей / О. Н. Дерябина, Н. А. Плотникова, С. П. Кемайкин [и др.] // Рос. биотерапевт, жури. .: материалы VIII Всерос. науч.-практ. копф. «Отечественные противоопухолевые препараты». —

2009. -№ 2. - С. 7-8.

4. Сравнительная характеристика антиоксидантной активности мексидола и мелатонина на модели экспериментального уретанового канцерогенеза / О. Н. Дерябина, Н. А. Плотникова, Т. В. Харитонова [и др.] // Рос. биотерапевт, жури. : материалы VIII Всерос. науч.-практ. конф. «Отечественные противоопухолевые препараты». - 2009. - № 2. - С. 13-14.

5. Особенности влияния антиоксидантов на продолжительность жизни мышей при экспериментальных иеоплазиях / О. Н. Дерябина, Н. А. Плотникова, Т. В. Харитонова [и др.] // Актуальные вопросы медицинской науки : сб. науч. тр. студентов и молодых ученых Всерос. конф. с междунар. участием. — Ярославль, 2009. — С. 45.

6. Влияние мелатонина на продолжительность жизни мышей при экспериментальном опухолевом росте / О. Н. Дерябина, Н. А. Плотникова, Т. В. Харитонова [и др.] // Материалы XXXVII Огаревских чтений. — Саранск, 2009. — С. 136.

7. Влияние мелатонина и метформина на развитие опухолей кожи, индуцируемых бенз(а)пиреном у мышей / О. Н. Дерябина, Н. А. Плотникова, В. Н. Анисимов [и др.] // Вопр. онкологии. —

2008. - Т. 54, № 2. - С. 20.

8. Динамика процессов канцерогенеза, индуцируемого бенз(а)пи-реном под влиянием мелатонина / О. Н. Дерябина, Н. А. Плотникова, Т. В. Харитонова [и др.] // Рос. биотерапевт, журн. : материалы VII Всерос. науч.-практ. конф. «Отечественные противоопухолевые препараты». — 2008. — № 12. — С. 8.

9. Оценка эффективности некоторых препаратов с антиоксидант-нойактивностыо при экспериментальных неоплазиях / О. Н. Дерябина, Н. А. Плотникова, Т. В. Харитонова [и др.] // Здоровье и образование в XXI веке : материалы X Междунар. конгр. — М.,

2009. - С. 122.

10. Дерябина О. Н. Онкостатическое и геропротекторное действие мелатонина и метформина в условиях экспериментальных неоплазиях / О. Н. Дерябина, Н. А. Плотникова, В. Н. Анисимов // Здоро-

вье и образование в XXI веке : материалы X Междунар. конгр. — М., 2009. - С. 123.

11. Иммуногистохимическое исследование процессов ангиогенеза при экспериментальном индуцированном опухолевом росте / В. Н. Карпова, Н. А. Плотникова, О. Н. Дерябина [и др.] // Здоровье и образование в XXI веке : материалы X Междунар. конгр. — М., 2009. - С. 857.

12. Влияние мелатонина и сиофора на динамику индуцированного цервиковагииалыюго канцерогенеза / П. В. Кудрявцев, Н. Ф. Си-иякин, О. Н. Дерябина [и др.] // Здоровье и образование в XXI веке : материалы X Междунар. конгр. — М., 2009. — С. 853.

13. Дерябина О. Н. Влияние мелатонина и метформина на продолжительность жизни у мышей при экспериментальном опухолевом росте / О. Н. Дерябина, Н. А. Плотникова // Вопр. онкологии. — 2009. - Т. 55, № 2. - С. 24.

14. Дерябина О. Н. Мелатонин и метформин угнетают канцерогенез кожи, индуцируемый бенз(а)пиреном у мышей / О. Н. Дерябина, Н. А. Плотникова, В. Н. Анисимов // Вопр. онкологии. — Направлена в печать 09.02.2010.

15. Мелатонин и метформин угнетают развитие опухолей шейки матки и влагалища, индуцируемых бега(а)пиреном у мышей / О. Н. Дерябина, Н. А. Плотникова, Т. В. Харитонова [и др.] // Морфол. вед. (Самара, направлена в печать, декабрь 2009 г.).

Подписано в печать 28.04.10. Объем 1,5 п. л. Тираж 100 экз. Заказ № 728. Типография Издательства Мордовского университета 430005, г. Саранск, ул. Советская, 24

Актуальность исследования. Общеизвестно, что злокачественные новообразования занимают второе место среди причин смертности населения. Увеличение онкозаболеваний делает проблему лечения новообразований значимой и актуальной в современной онкологии. Повышение качества жизни больных с неоллазиями является одной из основных задач паллиативной терапии.

В настоящее время большое внимание уделяется поиску новых эффективных противоопухолевых химиотерапевтических препаратов, обладающих минимальными побочными эффектами.

Как известно, в течение всей жизни на человека воздействует большое число канцерогенов, как экзогенного, так и эндогенного происхождения. Кроме того, постоянно создаются условия для инициации канцерогенеза в тех или иных органах и тканях. В связи с этим, с целью профилактики опухолевого роста наиболее физиологичным является использование естественных эндогенных онкопротекторов.

Канцерогенез — многостадийный процесс, в течение которого нормальная стволовая клетка проходит последовательно несколько стадий, прежде чем станет злокачественной. Это сопровождается многообразными нарушениями внутреннего гомеостаза, изменениями нервной, иммунной и эндокринной систем (Anisimov V.N. et al., 2000). Временные интервалы канцерогенеза точно не определены. Считается, что с момента молекулярной и генетической нестабильности до появления первой опухолевой клетки проходят многие годы, а появление первых клинических симптомов опухоли отделено от периода инициации канцерогенеза интервалом от 5 до 15 лет.

Необходимость латентного периода при неоплазии фундаментальное свойство, отличающее опухолевый рост от других гипербиотических явлений. Обнаружение предраковых поражений на много лет опережает формирование самого рака. Данные закономерности показывают, что опухолевую трансформацию нельзя понимать как разовое событие, безотносительно к жизненному циклу и обновлению клеточных клонов и популяций (Зайчик А.Ш., Чурилов Л. П., 2002). Любая из стадий канцерогенеза является потенциально реверсибельной, и воздействие на эти стадии будет иметь значительно больший успех, нежели воздействие на уже сформировавшуюся опухоль.

В последние годы наиболее популярна свободнорадикальная теория, которая объясняет не только механизм старения, но и широкий круг патологических процессов, таких как сердечно-сосудистые заболевания, возрастные иммунодепрессии, дисфункции мозга, катаракта, рак и некоторые другие (Анисимов В.Н., 2003). Известно, что свободные радикалы (молекулы или атомы, имеющие на внешней электронной орбите один или несколько неспаренных электронов) являются одним из канцерогенных факторов, присутствуя на всех стадиях развития опухоли (Kramer К. et al., 1994). Они обладают высокой активностью и способны вызывать повреждение липидного бислоя клеточных мембран и молекул ДНК.

Свободные радикалы непрерывно образуются как побочные продукты клеточного метаболизма. При оксидативном фосфорилировании в митохондриях 1-5 % кислорода редуцируется не полностью, давая начало «активным формам кислорода», к которым можно отнести радикалы супероксида, гидроксила, синглетный кислород, перекись водорода и многие другие.

Мелатонин - основной гормон, синтезируемый в пинеальной железе, преимущественно в ночное время.

Основными функциями мелатонина в организме являются биоритмологическая, антиоксидантная и иммуномодулирующая (Комаров Ф.И. и соавт., 2004).

В ходе многолетних исследований было установлено, что наиболее важными физиологическими эффектами мелатонина являются: стимуляция метаболических процессов; ингибирующее действие на пигментный метаболизм; контроль циркадных и сезонных ритмов; седативное действие на центральную нервную систему; подавление клеточной пролиферации и противоопухолевое действие по отношению ко многим экспериментальным неоплазиям. Кроме того, мелатонин является одним из сильнейших эндогенных поглотителей свободных радикалов (Комаров Ф.И. и соавт., 2004).

В настоящее время известно, что антидиабетические бигуаниды (метформин (сиофор), буформин, фенформин), наряду с гипогликемическим действием, обладают способностью улучшать утилизацию глюкозы в тканях, снижать использование организмом жирных кислот в качестве энергетического субстрата. Кроме того, эти вещества способны угнетать неоглюкогенез, снижать его биосинтез, снижать концентрацию в крови холестерина, триглицеридов и инсулина, а также биосинтез холестерина и уменьшать массу тела. (Dilman V.M., Anisimov V.N., 1980). Эти свойства антидиабетических бигуанидов, а также их способность устранять явления метаболической иммунодепрессии послужили основанием для использования их в онкологической клинике для нормализации некоторых нарушений обмена, свойственных онкологическим больным (Dilman V.M., Anisimov V.N., 1980).

Для более полного понимания действия мелатонина и метформина на канцерогенез, для выявления закономерностей их онкостатического действия, необходимы исследования на большем количестве моделей с использованием канцерогенов разной органной специфичности и различного механизма действия.

Особая роль в процессе канцерогенеза принадлежит ангиогенезу. Общеизвестно, что неоангиогенез - это процесс образования новых кровеносных сосудов в органах и тканях. Ангиогенез - неотъемлемая часть нормального эмбриогенеза и онтогенеза. Нарушение его приводит к развитию доброкачественных и злокачественных опухолей (невуса Спитца, саркомы Капоши и др.). Ангиогенез играет важную роль в пролиферации солидных опухолей и метастазировании (Ferrara N., 2002).

Противоположным ангиогенезу является процесс анти-ангиогенеза, т.е. блокировка образования новых сосудов, что уменьшает кровоснабжение опухоли, замедляя тем самым, ее рост (Jung Y, Ahmad S, Akagi Y, et al., 2000). Известно, что трофика опухолей небольших размеров (1-2 мм) осуществляется путем диффузии питательных веществ из окружающих тканей. Тогда как более крупные опухоли нуждаются в дополнительном кровоснабжении, что происходит за счет гиперэкспрессии ангиогенных факторов, таких как VEGF (ангиогенный «переключатель») (Breier G.,2000).

VEGF — фактор роста эндотелия сосудов - влияет на развитие новых (ангиогенез) и выживание незрелых кровеносных сосудов (сосудистая поддержка). Незрелые кровеносные сосуды существуют преимущественно на этапе развития, а у взрослых индивидуумов - лишь в некоторых ситуациях, например, в процессе заживления ран или заболеваний, характеризующихся аномальным ангиогенезом, таких как онкологические. В отсутствие ростовых сигналов эндотелиальные клетки этих незрелых кровеносных сосудов подвергаются программированной клеточной гибели апоптозу). VEGF препятствует апоптозу эндотелиальных клеток в незрелых кровеносных сосудах, тем самым сохраняя их жизнеспособность (FerraraN., 2002).

VEGF крайне важен для роста опухолей, размеры которых превышают 1-2 мм. Доказано, что многие опухоли экспрессируют VEGF, способствующий развитию и поддержанию сосудистого русла опухолевой ткани (Ferrara N., 2002).

При многих видах опухолей усиление экспрессии VEGF коррелирует с неблагоприятным прогнозом, в том числе с агрессивным ростом опухоли, рецидивами, метастазированием и уменьшением выживаемости. Кроме того, экспрессия VEGF коррелирует с повышением плотности микрососудистой сети в опухоли, что само по себе служит индикатором прогноза при различных онкологических заболеваниях (Ferrara N., 2002).'

Понимание механизмов ангиогенеза способствует повышению эффективности лечения опухолей различной локализации.

Таким образом, изучение действия мелатонина и метформина на моделях индуцированного канцерогенеза является важным направлением экспериментальной онкологии на современном этапе.

Цель исследования — изучение влияния мелатонина и метформина при раздельном и сочетанном применении на канцерогенез кожи, мягких тканей, шейки матки, индуцируемый бенз(а)пиреном у мышей.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

1. Изучение влияния мелатонина и метформина на частоту, множественность и размеры опухолей кожи, мягких тканей и шейки матки, индуцированных бенз(а)пиреном у мышей.

2. Исследование воздействия мелатонина и метформина на выживаемость опухоленосителей и средний латентный период развития опухолей в условиях индуцированного канцерогенеза.

3. Изучение влияние мелатонина и метформина на показатели перекисного окисления липидов (ПОЛ) в сыворотке крови и опухолевой ткани.

4. Исследование воздействия мелатонина и метформина на процессы ангиогенеза в ткани рака шейки матки.

Научная новизна работы. В работе впервые исследовано влияние комбинированного введения мелатонина и метформина на канцерогенез кожи, мягких тканей и шейки матки in vivo. Продемонстрировано подавляющее действие мелатонина и метформина на развитие индуцированных бенз(а)пиреном опухолей кожи, мягких тканей и шейки матки и их митотическую активность.

В работе впервые показано снижение активности ангиогенеза в ткани индуцируемых неоплазий шейки матки под влиянием мелатонина и метформина.

В исследовании проанализировано влияние мелатонина и метформина на процессы ПОЛ в условиях индуцированного канцерогенеза и показан антиоксидантный эффект изучаемых препаратов.

Практическая ценность работы состоит в том, что полученные результаты могут служить экспериментальным обоснованием для дальнейшего изучения онкопротекторного потенциала мелатонина и метформина, разработки научно-обоснованных рекомендаций по применению мелатонина и метформина с целью профилактики и лечения злокачественных новообразований.

Результаты исследования внедрены в научно-исследовательскую работу и учебный процесс кафедры патологии и кафедры онкологии

10

ГОУВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева», отдела канцерогенеза и онкогеронтологии НИИ онкологии проф. Н.Н. Петрова.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Введение мелатонина и метформина значительно уменьшает множественность и размеры опухолевых узлов кожи, индуцируемых БП у мышей.

2. Совместное воздействие мелатонином и метформином увеличивает латентный период развития опухолей мягких тканей и выживаемость опухоленосителей.

3. Введение мелатонина и метформина уменьшает множественность и размеры опухолевых узлов, увеличивает выживаемость опухоленосителей и латентный период развития опухолей шейки матки.

4. Использование мелатонина и метформина способствует снижению активности апгиогенеза в тканях индуцируемых неоплазий шейки матки.

5. Введение мелатонина способствует снижению процессов ПОЛ в ткани индуцированных опухолей кожи, мягких тканей и шейки матки по сравнению с метформином и совместным использованием мелатонина и метформина.

Апробация работы. Результаты работы были доложены и обсуждены на VIII Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2007); IX Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2008); X Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2009). VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2008); VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2009); 4-й Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения» (Санкт-Петербург, ФГУНИИ онкологии Росмедтехнологий им Н.Н. Петрова, 2008); XIII и XIV научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарева (Саранск, 2008,2009); XXXVI и XXXVII Огаревских чтениях (научной конференции Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарева, Саранск, 2008,2009).

По теме диссертации опубликовано 14 работ

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 142 страницах компьютерного текста, документирована 14 таблицами и иллюстрирована 61 рисунком. Работа состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материала и методов исследования (глава 2), изложения собственных результатов (глава 3), обсуждения полученных результатов (глава 4), выводов и библиографического указателя, включающего 236 источников, в том числе 28 отечественных и 208 иностранных.

выводы

1. На модели канцерогенеза кожи, индуцируемого БП у мышей установлено, что мелатонин и метформин оказывают выраженный онкостатический эффект, проявляемый в уменьшении множественности, размеров опухолевых узлов и выживаемости опухоленосителей.

2. Мелатонин и метформин оказывают антиканцерогенное действеи в отношении опухолей мягких тканей, индуцируемых БП у мышей, увеличивая латентный период развития опухолей и выживаемость опухоленосителей.

3. Мелатонин и метформин угнетают канцерогенез шейки матки, индуцируемый БП у мышей, что проявляется уменьшением множественности и размеров опухолевых узлов и увеличением выживаемости опухоленосителей.

4. Введение мелатонина и метформина способствует снижению активности ангиогенеза в тканях индуцируемых неоплазий шейки матки.

5. Установлено, что введение мелатонина препятствует развитию окислительного стресса, что сопровождается снижением процессов ПОЛ в сыворотке крови и в тканях-мишенях.