Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Динамика патоморфологических изменений в тканях экспериментальных неоплазий на фоне применения мелатонина и мексидола

Канаев Павел Михайлович

ДИНАМИКА ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ

В ТКАНЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ НЕОПЛАЗИЙ НА ФОНЕ ПРИМЕНЕНИЯ МЕЛАТОНИНА И МЕКСИДОЛА

14.03.02 - патологическая анатомия

Автореферат

диссертации па соискание ученой степени кандидата медицинских наук

5 АВГ 2015

Саратов - 2015

005571284

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении высшего профессионального образования «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева» Министерства образования и науки Российской Федерации.

Научный руководитель

доктор медицинских наук, профессор Плотникова Надежда Алексеевна. Официальные оппоненты:

Мозеров Сергеи Алексеевич - доктор медицинских наук, профессор, филиал Национального исследовательского ядерного университета «МИФИ» Обнинского института атомной энергетики, кафедра морфологии, занеду iош и й кафсдрой;

Артифексова Анна Алексеевна - доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Минздрава России, кафедра патологической анатомии, заведующий кафедрой.

Ведущая организация Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится_2015 г. в_часов на заседании диссертационного

совета Д. 208.094.01. при ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Минздрава России по адресу: 410012, Саратов, ул. Большая Казачья, д. 112.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Минздрава России на сайте организации wvvw.sgmu.ru

Автореферат разослан » UlÜU¿^ 2015 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

Маслякова Г.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Общеизвестно, что злокачественные новообразования занимают ведущее место в структуре заболеваемости и смертности населения. Как известно, канцерогенез представляет собой многостадийный процесс, в течение которого нормальная стволовая клетка трансформируется в атипичную.

В настоящее время одной из общепризнанных является свободнорадикальная теория опухолевого роста. Согласно которой в процессе морфогенеза опухолевого роста, с одной стороны, происходят ускорение и активизация процессов перекисного окисления липидов, а с другой стороны, наблюдается снижение запасов собственной антиоксидантной системы организма (Анисимов В.Н., 2009).

В онкологической практике большое внимание уделяется поиску новых эффективных онкостатических средств. Одним из представителей синтетических антиоксидантов является препарат мексидол - производный 3-оксипиридина. В основе его антиоксидантного эффекта лежит способность подавлять темпы оксидантного стресса, синтез свободных радикалов на стадии инициации, тем самым снижая возможность развития неоплазии (Анисимов В.Н., 2012).

Мелатонин - основной гормон, который синтезируется преимущественно в ночное время в ткани пинеальной железы. Основными функциями мелатонина в организме являются антиоксидантная, иммуномодулирующая и биоритмологическая (Комаров Ф.И. и др., 2004).

Для более полного понимания действия мелатонина и антиоксиданта мексидола на процессы опухолевого роста, выявления механизмов и закономерностей их возможного подавляющего действия на морфогенез неоплазий необходимы экспериментальные исследования на значительном

количестве экспериментальных моделей с применением веществ разнообразной органной специфичности и различного механизма действия.

В развитии опухолевого роста немаловажная роль отводится процессу формирования новообразованных кровеносных сосудов. Ангиогенез -обязательная составляющая часть нормального онто- и эмбриогенеза. При таких патологических процессах, как псориаз, диабет, ангиопатия, опухолевый рост, характерным является патологическое новообразование сосудов (Bates D.O., 2009).

Согласно современным представлениям, VEGF является главным и ведущим ростовым фактором, который участвует в процессе опухолевого ангиогенеза (Ferrara N., 2009). Известно, что VEGF оказывает активное влияние на процесс формирования новых кровеносных сосудов и на так называемую поддержку, т.е. сохранение недифференцированных кровеносных сосудов. Понимание механизмов ангиогенеза может способствовать повышению эффективности лечения опухолей различной локализации.

Таким образом, изучение действия мелатонина и антиоксиданта мексидола в условиях индуцированного опухолевого роста считается одним из значимых направлений экспериментальной онкологии в современных условиях.

Цель исследования: изучение процессов морфогенеза опухолей кожи и мягких тканей в условиях индуцированного канцерогенеза на фоне раздельного и сочетанного применения мексидола и мелатонина.

Задачи исследования:

1. Выявление динамики частоты и размеров опухолей кожи и мягких тканей в условиях индуцированного бенз(а)пиреном опухолевого роста у мышей на фоне использования мексидола и мелатонина.

2. Исследование продолжительности жизни экспериментальных животных в условиях индуцированного бенз(а)пиреном опухолевого роста и на фоне применения изучаемых препаратов.

3. Изучение воздействия мелатонина и мексидола на динамику патоморфологических изменений в тканях экспериментальных неоплазий.

4. Исследование влияния мелатонина и мексидола на показатели оксидантного стресса в сыворотке крови и опухолевой ткани.

5. Изучение воздействия мелатонина и мексидола на процессы ангиогенеза в опухолевой ткани мезенхимального происхождения.

Научная новизна. В работе исследовано влияние сочетанного введения мелатонина и мексидола на процессы морфогенеза опухолей кожи и мягких тканей спины и задних конечностей. Продемонстрировано подавляющее действие мелатонина и мексидола на развитие экспериментальных (индуцируемых бенз(а)пиреном) опухолей кожи, мягких тканей спины и нижних конечностей.

Показано снижение активности процессов ангиогенеза в ткани индуцируемых неоплазий мезенхимального генеза на фоне совместного приема мелатонина и мексидола.

В исследовании проанализировано влияние мелатонина и мексидола на показатели липопероксидации в условиях индуцированного экспериментального опухолевого роста и представлено совместное действие изучаемых препаратов, подавляющее темпы развития оксидативного стресса.

Научно-практическая значимость работы заключается в том, что представленные результаты могут быть использованы в качестве экспериментальной базы для последующего исследования возможного онкостатического потенциала мелатонина и мексидола, разработки научно-обоснованных рекомендаций по применению изучаемых препаратов с целью снижения темпов опухолевой прогрессии новообразований кожи и мягких тканей спины и нижних конечностей.

Апробация диссертации. Результаты исследования опубликованы и представлены на конференциях, съездах, форумах, конгрессах российского и международного уровней: Международный конгресс «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2010; 2011; 2013; 2014); Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2011; 2012; 2013; 2014); Российская конференция по фундаментальной онкологии «Петровские чтения» (Санкт-Петербург, 2013); Научная конференция молодых ученых, аспирантов, студентов Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарева (Саранск, 2010; 2011; 2012; 2013; 2014).

Положения, выносимые на защиту:

1. Совместное использование мексидола и мелатонина значительно уменьшает частоту и размеры опухолевых узлов кожи и мягких тканей, индуцируемых БП у мышей, а также достоверно увеличивает продолжительность жизни экспериментальных животных.

2. Применение мелатонина и мексидола характеризуется замедлением темпов опухолевой прогрессии в тканях экспериментальных новообразований.

3. Использование мексидола и мелатонина способствует снижению темпов развития оксидантного стресса в ткани индуцированных опухолей кожи и мягких тканей спины и нижних конечностей.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 138 страницах компьютерного текста, содержит 7 таблиц и 53 рисунка. Работа состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материала и методов исследования (глава 2), изложения собственных результатов (глава 3), обсуждения полученных результатов (глава 4), выводов, практических рекомендаций и библиографического списка, включающего 337 источников (в том числе 98 отечественных и 239 иностранных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы. Эксперимент проводился на 260 нелинейных белых мышах в возрасте 2 мес; массой 20 - 22 г. Содержались животные в обычных условиях вивария. Проведено две серии экспериментов. Мыши были разделены на две группы по 120 мышей в каждой. Оставшиеся 20 мышей составили интактную группу (не подвергались действию канцерогена и получали чистую воду без добавления мелатонина и мексидола).

В первой серии эксперимента изучали влияние мелатонина и мексидола на опухоли мезенхимального гистогенеза на модели индуцированных злокачественных фиброзных гистиоцитом подкожной клетчатки. Сто двадцать мышей были разделены на четыре группы: по 30 мышей в каждой группе, 3 опытные группы, 1 группа контроля. Всем экспериментальным животным четырех групп был однократно введен бенз(а)пирен, предварительно растворенный в стерильном оливковом масле в дозе 2 мг из расчета на одну мышь в объеме 0,1 мл подкожно в районе поясничной области. На следующий день после введения бенз(а)пирена экспериментальные животные 1-й опытной группы получали мелатонин в дозе 2 мг/л. Для проведения эксперимента ежедневно готовили раствор мелатонина ex tempore. Для этого препарат растворяли в 2 - 3 каплях 96% этилового спирта и затем разбавляли водопроводной водой, доводя до необходимой концентрации. Экспериментальные животные 2-й опытной группы в течение всего дня получали мексидол в дозе 0,1 мг/кг вместе с питьевой водой. Мышам 3-й группы давали одновременно и мелатонин в дозе 2 мг/л, и мексидол в дозе 0,1 мг/кг в течение суток вместе с питьевой водой. Контрольная группа по канцерогену была представлена мышами 4-й группы, которые получали питьевую воду без добавления исследуемых препаратов.

Во второй серии эксперимента изучали воздействие мелатонина и мексидола на морфогенез неоплазий эпидермального происхождения. Мыши

7

(120) были разделены на 4 группы: 30 животных составили группу контроля по изучаемому канцерогенному веществу (бенз(а)пирену), остальные три опытных группы по 30 мышей. Всем животным опытной и экспериментальной групп на кожу спинки в межлопаточной области капали из шприца по 1 капле бенз(а)пирена в дозе 0,2 мл на мышь. Препарат наносили в концентрации 0,05%, растворяли в ацетоне, кратностью 2 раза в неделю. На следующий день после нанесения бенз(а)пирена мыши 1-й опытной группы вместе с питьевой водой получали мелатонин в дозе 2 мг/л. Характерно, что способ приготовления раствора, дозы изучаемых препаратов, способ и режим введения были аналогичны таковым в первой серии экспериментов. Мыши 2-й группы получали мексидол в дозе 0,1 мг/кг. Мышам 3-й опытной группы давали мексидол в дозе 0,1 мг/кг и мелатонин в дозе 2 мг/л одновременно. Мыши 4-й группы получали питьевую воду без добавления изучаемых препаратов и представили контрольную группу по канцерогену. Эксперимент длился 26 недель.

Патоморфологические методы исследования. Все экспериментальные животные и мыши, умершие и выведенные из эксперимента по окончании срока, подвергались аутопсии, подробному макроскопическому исследованию. На вскрытии подробно были исследованы кожные покровы, индуцированные новообразования на коже, а также ткань внутренних органов. При этом подсчитывалось общее число неоплазий на коже и в мягких тканях спины и нижних конечностей, выявлялись их параметры и размеры. Ткани всех индуцированных опухолей иссекались и затем фиксировались в 10%-м растворе формалина. Все кусочки подвергались стандартной патогистологической обработке и заливались в парафин. В последующем гистологические срезы толщиной 5-7 мкм окрашивались гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван Гизону и исследованы микроскопически.

Иммуногмстохимическое исследование. Иммуногистохимически были изучены экспрессии факторов ангиогенеза в ткани экспериментальных неоплазий и УЕОР, а также выявлено число кровеносных сосудов. Подобные определяемые кровеносные сосуды окрашивались антителами к СОЗ1+, для чего использовались специфические тест-системы. При этом в опухолевой ткани определялось и подсчитывалось число СОЭ1+ сосудов микроциркуляции в полях зрения не менее трех, при увеличении х 20. Исследуемая интенсивность окрашивания опухолевых клеток верифицировалась как оценка экспрессии УЕОР. В частности, низкая интенсивность окрашивания обозначалась как 1+, высокая - как 3+.

Биохимические методы исследования. У всех интактных мышей, а также у 5-8 мышей из каждой группы животных, подвергшихся воздействию канцерогена, определяли содержание малонового диальдегида (МДА) ( Конюхова С.Г., 1989) и активность каталазы (Королюк М.А., 1988) в сыворотке крови и гомогенатах опухолевой ткани. Малоновый диальдегид представляет собой вторичный (промежуточный) продукт реакций перекисного окисления липидов (ПОЛ). Катазала является одним из основных ферментов антиоксидантной системы организма, катализирует восстановление перекиси водорода до воды, тем самым уменьшая образование свободных радикалов (Конторшикова К.Н., 2000).

Статистические методы исследования. Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием критериев I Стьюдента, точного метода Фишера, х 2 и теста Колмогорова-Смирнова (Гублер Е.Г., 1978) с помощью пакета прикладных программ «МедСтатистика» и «Биостат».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Морфогенез опухолей мягких тканей, индуцируемый бенз(а)пиреном у мышей на фоне применения мелатонина и мексидола.

По завершению эксперимента рассчитывали средний латентный период развития опухолей и выживаемость опухоленосителей. Основные результаты опытов представлены в табл. 1.

Таблица 1

Воздействие мелатонина и мексидола на экспериментальный индуцированный бенз(а)пиреном опухолевый рост мягких тканей

Показатели Бенз(а)пирен Бенз(а)пирен+ мелатонин 5енз(а)пирен+мексидол Зенз(а)пирен+мелат онин+мексидол

Количество экспериментальных животных 30 30 30 30

Количество мышей с индуцированными неоплазиями, % 22 (73%) 17 (57%)** 15 (50%)*** 11 (37%)**

Показатели средних размеров опухолевых узлов, мм, М+ш 27 ±0,2 27 ±0,81* 27,1 ± 1,2* 26 ± 1,05*

Показатели среднего периода формирования опухолевых узлов, сут., М+т 148 ± 0,8 164 ±0,9* 167 ±0,7* 172 ±0,5*

Количество выживших в эксперименте мышей, % 3 (10%) 7 (23,3%) 8 (26,7%) 12(40%)***

Выживаемость мышей после выявления индуцированных опухолевых узлов, сут., М+ш 11,4 ±2,2 18,6 ±4,08 15,2 ± 1,4 23,3 ±3,1**

Показатели митотического индекса 0,96 ± 0,24* 0,44 ±0,16* 0,52 ±0,19* 0,57 ±0,21*

Примечание: Отличия по сравнению с группой контроля достоверны (тест Стыодента): * — р < 0,05, **- р < 0,01, ***-р<0,001.

Экспериментальные животные с опухолями на фоне применения мелатонина составляли 57% (17 мышей из 30), что на 16,67% меньше в сравнении с группой контроля (р < 0,01). Под влиянием мексидола частота формирования опухолевых узлов составила 50% (15 мышей из 30), что меньше на 23,3% , чем в контрольной группе (р < 0,001). При сочетанном введении мелатонина и мексидола количество мышей с опухолевыми узлами составлено 36,6% (11 мышей из 30), что в сравнении с группой контроля меньше на 40% (р < 0,01) (рис.1).

25

20

£ о о о

«! 10

х §

X

5

О

БП БП+МЛТ БП+МК БП+МЛТ+МК

Рис. 1. Воздействие мелатонина и мексидола на частоту развития опухолей у мышей мезенхимального гистогенеза.

Примечание: С группой контроля различия достоверны (тест Стьюдента): ** - р < 0,01, ***-р <0,001

При воздействии мексидола и мелатонина размеры опухолевых узлов в большинстве случаев не изменялись. В контрольной группе средний диаметр опухолей составил 27 ± 0,2 мм. В группах экспериментальных животных, которые получали мелатонин, мексидол, а также совместно мелатонин и мексидол данные показатели составили соответственно 27 ± 0,81 мм; 27,1 ± 1,2 мм; и 26 ± 1,05 мм (р < 0,05). Таким образом, совместное использование

мелатонина и мексидола снижало частоту опухолевых узлов на 40%, средний размер опухолевых узлов уменьшался на 3,7%.

Введение мелатонина и мексидола в большинстве случаев увеличивало выживаемость мышей, получивших БП. До окончания эксперимента дожили 3 мыши (10%) в контрольной группе, тогда как в группах мышей, получавших мелатонин - 7 мышей (23,3%), (р < 0,05), из получавших мексидол - 8 мышей (26,7%), (р < 0,05), мелатонин и мексидол - 12 мышей (40%), (р< 0,001) (рис. 2).

Рис. 2. Влияние мелатонина и мексидола на число мышей, которые дожили до конца эксперимента.

Примечание: С группой контроля различия достоверны (тест Стыодента): * — р < 0,05, ** - р < 0,01, ***- р < 0,001

В эксперименте при введении бенз(а)пирена подкожным путем у мышей диагностирована мягкотканная опухоль спины и нижних конечностей фиброгистиоцитарного генеза по типу злокачественной фиброзной гистиоцитомы. Микроскопически опухоль построена из овальной формы фибробластов, миофибробластов, овальных или округлых гистиоцитов.

Местами опухолевые клетки складываются в короткие пучки, формируя при этом типичные муаровые структуры.

В опухолевых узлах контрольной группы микроскопически было выявлено две формы злокачественной фиброзной гистиоцитомы: поверхностная и глубокая. При поверхностной кожной локализации фиброзной гистиоцитомы более выражен клеточный полиморфизм с наличием в строме воспалительных инфильтратов и вторичных изменений, таких как кровоизлияния и некрозы. При глубокой форме злокачественной фиброзной гистиоцитомы преобладал миофибробластный компонент. В опухоли также выявлялись гемангиоперицитарные структуры, многоядерные остеокластоподобные, ксантомные клетки, клетки Тутона, встречались очаги миксоматоза и гиалиноза стромы.

Микроскопическое строение ткани опухоли на фоне совместного применения мелатонина и мексидола отмечалось характерным полиморфным клеточным составом, в частности, формированием веретеновидных клеток, наличием фибробластопободных и гистиоподобных элементов. В отдельных случаях встречались клетки, содержащие липиды, крупные многоядерные макрофаги типа клеток Тутона и типа остеокластов. Обнаруживались также единичные очаги межуточной лимфомакрофагальной инфильтрации и очаги соединительнотканного замещения. Участки ослизнения и миксоматоза стромы не выявлялись.

При выявлении митотического индекса у мышей, которые подверглись действию бенз(а)пирена, показатель митотического индекса в ткани мягкотканных опухолей составил 0,96 ± 0,24. На фоне введения мелатонина данный показатель снизился до 0,44 ±0,16. При действии мексидола данный показатель достоверно уменьшился до 0,52 ± 0,19. На фоне сочетанного введения мелатонина и мексидола значение митотического индекса снизилось до 0,57 ± 0,21. Различия статистически недостоверны (р > 0,05) во всех случаях отличия от контрольной группы.

13

В результате введения бенз(а)пирена наблюдалось повышение активности перекисного окисления липидов, о чем говорит возрастание значения МДА как вторичного продукта липопероксидации (таб. 2). Данный показатель увеличился в 2,6 раза в сыворотке крови по сравнению с группой контроля и в 1,1 раза в ткани опухоли (р < 0,01). Применение мелатонина вызывало уменьшение уровня МДА на 21,1% в сыворотке крови по сравнению с группой контроля (р < 0,05). Уровень МДА в ткани неоплазий на фоне применения мелатонина снизился на 14,5% (р < 0,01) в сравнении с группой контроля и составил 4,58 ± 0,55 ммоль/л. На фоне применения мексидола уровень малонового диальдегида в сыворотке крови уменьшался на 2,06% по сравнению с группой контроля (р > 0,05). В опухолевой ткани уровень МДА уменьшился на 56% по сравнению с контрольной группой (р < 0,05). Сочетанное применение мексидола и мелатонина также вызывало достоверное снижение показателей малонового диальдегида на 10,3% в сыворотке крови по сравнению с группой контроля (р < 0,01). В ткани опухоли уровень МДА снизился на 82% по сравнению с группой контроля (р < 0,05). На фоне использования канцерогена (бенз(а)пирена) активность каталазы в сыворотке крови достоверно повышалась на 24,4%, (р < 0,05), а в опухолевой ткани увеличивалась на 5,5% (р > 0,05).

На фоне применения мелатонина в сыворотке крови по сравнению с группой контроля активность каталазы снизилась на 52,4% (р < 0,05). В ткани опухоли показатели активности каталазы уменьшились на 61% по сравнению с контрольной группой (р < 0,01). При применении мексидола отмечалось большее повышение уровня активности каталазы в сыворотке крови на (96%) в сравнении с группой контроля (р < 0,05). В ткани опухоли активность каталазы повысилась в 2 раза по сравнению с контрольной группой по канцерогену, составив 1,2 ± 0,35 мккат/л (р < 0,05). Сочетанное применение мелатонина и мексидола вызывало повышение показателей активности каталазы в сыворотке крови в четыре раза по сравнению с

14

контрольной группой (р < 0,01). При этом в ткани опухолевых узлов активность каталазы также увеличилась в четыре раза по сравнению с контрольной группой (р < 0,01) (табл.2).

Таблица 2

Активность каталазы и уровень МДА в сыворотке крови и в опухолевой ткани у экспериментальных животных в контроле и на фоне применения

мелатонина и мексидола

№ группы Воздействие Уровень МДА, ммоль/л Активность фермента каталазы, мккат/л

Сыворотка крови Ткань неоплазий Сыворотка крови Ткань неоплазий

1 Группа интактпого контроля 3,88 ±0,58 7,3 ±0,18 0,31 ±0,02 0,71 ±0,03

2 БП 12,1 ±0,63 а 8,38 ± 0,26 аа 0,61 ±0,05 а 0,53 ±0,13 а

3 БП + мелатонин 2 мг/л 3,08 ±0,15* 4,58 ±0,55** 0,25 ± 0,05 0,3 ± 0,04*

4 БП + мексидол 0,1 мг/кг 11,53 ±0,55++ 3,67 ± 1,68* 3,29 ± 0,58*+ 1,2 ±0,35*+

5 БП + мелатонин 2 мг/л+ мексидол 0,1 мг/кг 7,89 ±0,92**+++ 1,5 ±1,02 3,44 ±0,31**+ 3,17±0,31**

Примечания:

- с группой интактпого контроля различия достоверны (тест Стыодеита): а— р < 0,05, аа — р < 0,01;

- с группой бенз(а)пирена различия достоверны (тест Стьюдента): * — р < 0,05, **- р < 0,01;

- отличия по показателям в группах на фоне применения мелатонина и мексидола и в комбинациях достоверны:+ —р < 0,05,++— р < 0,01, +++ — р < 0,001.

В ткани индуцированных опухолей мезенхимального гистогенеза интенсивность ангиогенеза была представлена двумя характеристиками: количеством сосудов в опухолевой ткани и наличием УЕСР. Полученные результаты представлены в табл. 3.

Таблица 3

Снижение ангиогенеза в группе животных на фоне раздельного и _сочетанного применения мелатонина и мексидола_

Препарат Число СЭ31+ сосудов в поле зрения Экспрессия УЕСР

Контроль 17 ± 0,31 3+

Мелатонин 12 ±0,21 2+

Мсксидол 10 ±0,23* 1 +

Мелатонин + Мсксидол 8 ± 0,22** 1 +

Примечания. С группой контроля различия достоверны (тест Стыодепта): * — р < 0,05, ** - р < 0,01.

В контрольной группе экспрессивность окрашивания УЕОР оказалась 3+. На фоне применения мексидола и совместного использования мелатонина и мексидола экспрессивность окрашивания УЕОР снизилась до 1+. В контрольной группе число С031 + сосудов в поле зрения составляет 17 ± 0,31. На фоне применения мелатонина данное значение составило 12 ± 0,21. При использовании мексидола подобный показатель составил 10 ± 0,23; при совместном использовании мелатонина и мексидола число С031+ сосудов уменьшилось до 8 ± 0,22 в поле зрения. Полученные результаты свидетельствуют о том, что на фоне применения мексидола и мелатонина наблюдается снижение активности ангиогенеза в ткани индуцированных неоплазий.

Влияние мелатонина и мексидола на процессы морфогенеза экспериментального опухолевого рост кожи

По завершению эксперимента рассчитывали выживаемость мышей и средний латентный период развития опухолей. Средний период морфогенеза экспериментальных узлов составил 95 + 8.6 суток в контрольной группе (наименьший период формирования неоплазий составил 81 сутки, максимальный - 151 сутки). При воздействии мелатонина средний латентный период развития опухолей увеличился на 30,5% в сравнении с контрольной группой (р < 0,05) и оказался на уровне 124 ± 5,2 суток. Наименьший и наибольший периоды формирования опухолей составили 82 и 164 дня соответственно. На фоне применения мексидола средний латентный период развития опухолей увеличился по сравнению с группой контроля на 30%, что составило 124 ± 5,3 суток, при этом наименьший временной промежуток морфогенеза опухолевых узлов- 85 суток, наибольший - 170 суток. На фоне

16

совместного использования мексидола и мелатонина данный показатель у мышей увеличился на 41,05% по сравнению с контрольной группой (р < 0,05) и составил 134 ± 5,8 суток. При определении подобных показателей в остальных группах различия были не достоверны. При этом наименьший период формирования новообразований составил 90 суток, наибольший -179 суток.

При введении мелатонина продолжительность жизни экспериментальных животных после появления неоплазий увеличилась на 26,87% по сравнению с группой контроля (67 ± 6,9), составив, 85 ± 3, суток, различия статистически недостоверны. На фоне введения как одного мексидола, так и сочетанния мелатонина и мексидола, выживаемость животных составила 95 ± 4,2 и 102 ± 3,3 суток соответственно, что на 41,79 и 52,3% больше, чем в группе контроля (р < 0,05) (табл.4, рис. 3).

Таблица 4

Раздельное и сочетанное влияние мелатонина и мексидола на латентный период развития опухолей, индуцированных бенз(а)пиреном и выживаемость экспериментальных животных

Показатель 5енз(а)пир ен £еиз(а)пирсн+ мелатонин Бенз(а)пирен+ мексидол Венз(а)пирсн+мелатонин+ мексидол

Количество экспериментальных мышей, шт. 30 30 30 30

Показатели среднего периода морфогенеза опухолевой ткани, сут., М+т 95 ± 8,6* 124 ±5,2* 124 ±5,3* 134 ±5,8*

Выживаемость животных после выявления новообразований, сут.,М+т 67 ±6,91 85 ±3,1 95 ± 4,2* 102 ±3,3*

Примечания. С группой контроля различия достоверны (тест Стыодснта): * — р < 0,05, ** — р < 0,01, *** -р< 0,001.

120 100 80

I 60 |:ft| -10

20

- 9

0 -

6П БП+МЛТ БП+МК БП+МЛТ+МК

Рис. 3. Раздельное и сочетанное влияние мексидола и мелатонина на выживаемость экспериментальных животных после обнаружения опухолевых узлов.

Примечание:С группой контроля различия достоверны (тест Стыодента): * - р < 0,05.

При воздействии бенз(а)пирена в месте аппликации в 80% случаев у мышей контрольной группы развивались опухоли кожи (24 из 30). При введении мелатонина опухолевые узлы кожи развились в 60% случаев (у 18 из 30 мышей), что соответствует снижению данного показателя по сравнению с группой контроля в 1,2 раза; при применении одного мексидола -у 16 из 30 мышей ( в 53% случаев), что показывает снижение в 1,4 раза по сравнению с группой контроля. Кроме того, при сочетанном введении мексидола и мелатонина новообразования формировались в 50% случаев, что отражает снижение в 1,7 раза по сравнению с контрольными показателями.

Средние показатели диаметра опухолевых узлов в контрольной группе составили 3,5 ± 0,2 см. В группе мышей, получавших мелатонин, данный показатель уменьшился на 38% по сравнению с контрольной группой и составил 2,0 ± 0,2 см; при введении мексидола средний размер опухолей уменьшился на 41% по сравнению с контролем и составил 2,1 ± 0,3см. При комбинированном введении мексидола и мелатонина подобные цифры

гГп

-f

снизились до 1,5 ± 0,2 см, что способствует уменьшению на 53% по сравнению с показателями в группе контроля. Различия достоверны (р < 0,001). Результаты представлены на рис. 4.

3,5

о---

БП БП+МЛТ БП+МК БП+МЛТ+МК

Рис. 4. Раздельное и сочетанное влияние мексидола и мелатонина на размер опухолевых узлов у мышей.

Примечание: С группой контроля различия достоверны (тест Стьюдента): *** - р < 0,001.

В группе контроля среднее количество опухолей на одну мышь

составило 3,3 ± 0,4, а при введении мелатонина этот показатель снизился на

29,5% по сравнению с контрольной группой (2,3 ±0,4). Подобные параметры

у мышей на фоне применения мексидола уменьшились на 38% по сравнению

с показателями контрольной группы и составил 2,1 ± 0,3. При сочетанном

введении мексидола и мелатонина среднее количество опухолевых узлов на

одну мышь уменьшилось на 32% (по сравнению с контролем) и составило

2,2 ± 0,4. Все различия достоверны (р < 0,05).

Через пять месяцев от начала экспозиции бенз(а)пиреном у мышей

контрольной группы развивались опухолевидные образования в месте

воздействия бенз(а)пирена. По своей структуре опухолевидные узелки

имеют плотно-эластическую консистенцию, несколько выбухающие над

19

поверхностью сохранившихся кожных покровов. Узлы имели округлую или округло-овальную форму, размеры - 1-2 мм. У 15 мышей контрольной группы под воздействием бенз(а)пирена формировался плоскоклеточный рак. В случаях выявлялся рак высокой степени дифференцировки: в пластах раковой паренхимы клеточный атипизм и полиморфизм были выражены слабее, прослеживалась зональность строения, напоминающая базальный, шиповатый и зернистый слои эпидермиса. В других случаях обнаруживалась картина плоскоклеточного рака без ороговения: выявлялись пласты и тяжи атипичного плоского эпителия, с выраженным инвазивным ростом до глубоких слоев дермы. При патоморфологическом изучении выявлены пласты раковой паренхимы с вертикальной анизоморфностью и наличием «жемчужин» при диагностике мукоэпидермоидного рака высокой степени дифференцировки. При диагностике папилломы микроскопически обнаружены сосочковые выросты многослойного плоского эпителия с сохранением дифференцировки слоев. При этом микроскопическая картина эпидермоидного рака и папиллом кожи у мышей в группе контроля и в группе применения мелатонина и мексидола была схожей.

В условиях экспериментального канцерогенеза кожи уровень малонового диальдегида в сыворотке крови у интактных животных составил 4,87 ± 0,58 ммоль/л (данные представлены в табл. 5).

Таблица 5

Значения малонового диальдегида и активность каталазы в сыворотке крови и ткани неоплазий у экспериментальных мышей в группе контроля, на фоне применения мелатонина и мексидола и в интактном контроле_

№ группы Воздействие Уровень МДА, ммоль/л Показатели активности каталазы, мккат/л

Сыворотка крови Ткань новообразований Сыворотка крови Ткань неоплазий

1 Иитактный контроль 4,87 ±0,58 - 0,32 ± 0,02 -

2 БП 5,64 ± 0,86 9,8 ± 1,01 3,15 ±4,43 2,00 ± 0,45

3 БП + мслатонин 2,12 ±0,51 5,66 ± 1,26 5,27 ± 0,40 5,68 ± 1,69

4 БП + мексидол 4,84 ± 0,57 4,11 ±0,99 6,51 ±4,02 8,34 ± 2,46

5 БП + мелатопим + 3,01 ±0,88 3,97 ± 1,42 7,91 ± 1,42 9,37 ± 2,04

|мексидол

Достоверность различия между группами, р Р|-2 < 0,05 Р,-з < 0,05 Рм < 0,05 Р2-з < 0,01 Р4-з<0,01 Р3.5< 0,001 < 0,05 Р2.3< 0,001 Р2.5< 0,001 Р4.3< 0,001 Рз_5 < 0,05 Рм< 0,001 Р 1_5 < 0,05 Р2_4< 0,001 Р2.5< 0,001 Р2-4< 0,001 Р2-з < 0,01 Р4-5< 0,001 Р4-3 0,001

На фоне применения мелатонина данный показатель в сыворотке крови достоверно снизился на 57%, по сравнению с контрольной группой (р < 0,01). В опухолевой ткани уменьшение МДА на 52% оказалось статистически достоверным (р < 0,01). На фоне применения мексидола значение МДА в сыворотке крови достоверно снизилось на 2,62% (р < 0,1). В опухолевой ткани содержание малонового диальдегида снизилось на 65% (р < 0,1).

В сыворотке крови содержание малонового диальдегида на фоне применения мелатонина снизилось на 48,9% по сравнению с контролем (р < 0,1) и уменьшилось на 39,4% по сравнению с группой интактного контроля, составив, 3,01 ± 0,88 моль/л (р > 0,05). В опухолевой ткани уменьшение МДА на 66,3% было достоверно (р < 0,001). На фоне применения мелатонина данный показатель в сыворотке крови увеличился на 67,3%. В ткани опухоли активность каталазы увеличилась в 2 раза (р < 0,1). Показатель активности каталазы в сыворотке крови увеличился в 2 раза по сравнению с группой контроля, а по сравнению с интактным контролем данный показатель повысился в 1,4 раза (р < 0,001). Уровень активности каталазы в ткани новообразований составил 8,34 ±2,46 мккат/л, что в 3 раза больше (р < 0,001) по сравнению с контрольной группой. При сочетанном применении мексидола и мелатонина активность каталазы в сыворотке крови повысилась в 1,8 раза по сравнению с интактным контролем (р < 0,05), и увеличилась в 3 раза по сравнению с контрольной группой по канцерогену (р < 0,001), а в ткани опухоли данный показатель увеличился в 3,5 раза (р <0,1).

выводы

1. Мелатонин и мексидол оказывают онкостатическое действие в отношении новообразований кожи и мягкотканных опухолей спины и нижних конечностей фиброгистиоцитарного происхождения, индуцируемых БП у мышей, что подтверждается снижением частоты опухолевых узлов на 50 и 40% соответственно, уменьшением диаметра узлов кожи на 53% по сравнению с контролем.

2. В условиях экспериментальных неоплазий кожи и мягких тканей совместное применение мексидола и мелатонина способствует увеличению продолжительности жизни животных после появления опухолевых узлов на 52,5 и 44,4% соответственно.

3. Совместное использование изучаемых препаратов в условиях экспериментального опухолевого роста кожи и мягких тканей сопровождается положительной патоморфологической динамикой, что проявляется уменьшением числа случаев плоскоклеточного рака кожи до 20%, (в контроле - 50%), а также снижением митотического индекса на 48 и 40% соответственно.

4. Сочетанное введение мелатонина и мексидола способствует снижению активности ангиогенеза в тканях индуцируемых неоплазий мезенхимального происхождения, что подтверждается снижением количества С031+ сосудов с 17 +.0,31 до 8 ±0,22 и уменьшением интенсивности окрашивания УЕОР с 3+ до 1+.

5. Совместное применение мексидола и мелатонина предотвращает формирование оксидантного стресса, что достоверно подтверждается уменьшением активности липопероксидации данных процессов в сыворотке крови и в ткани экспериментальных неоплазий.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Результаты, полученные в ходе диссертационного исследования, могут составить экспериментальную базу для последующего изучения ингибирующего, подавляющего эффекта мелатонина и мексидола, разработки научно обоснованных рекомендаций по применению данных препаратов с целью комплексной терапии неоплазий.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Коррекция ряда показателей оксндативного стресса препаратами метаболического типа действия при экспериментальных неоплазиях / П.М. Канаев, H.A. Плотникова, С.П. Кемайкин, Т.В. Харитонова, C.B. Харитонов // Здоровье и образование в XXI веке. Сер.: медицина. - М., 2013. - Т. 15, № \-Л. -С. 148-150.

2. Морфогенез экспериментального опухолевого роста при коррекции препаратами антиоксидантного типа действия / А.П. Кириллова, О.Н. Дерябина, П.М. Канаев, H.A. Плотникова / Здоровье и бразование в XXI веке -М.,2013.-Т.15, № \-4.~ С. 374-375.

3. Сравнительная характеристика биохимических показателей периферической крови при использовании мексидола и эмоксипина на модели перевиваемой карциномы Льюиса и экспериментальном уретановом канцерогенезе / H.A. Плотникова, И.В. Пашкевич, П.М. Канаев, Е.О. Букаева // Российский биотерапевтический журнал. - 2011. - Т. 10, №1. -С. 471.

4. Характеристика патогистологической структуры индуцированных бенз(а)пиреном опухолей мягких тканей у мышей на фоне применения мексидола и мелатонина / H.A. Плотникова, П.М. Канаев, О.Н. Дерябина // Материалы XIV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты (экспериментальная онкология)». -М. 2015. -Т. 14, №1,-С. 88.

5. Исследование миелопротекторных свойств мелаксена при противоопухолевой химиотерапии у мышей с карциномой легкого Льюиса / H.A. Плотникова, A.B. Сипров, И.М. Вашуркина, П.М. Канаев // Научные труды X международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке». -M. 2011.-С. 296.

6 Изучение онкостатического эффекта мелатонина в условиях бенз(а)пиреновой модели канцерогенеза у мышей / П.М. Канаев, H.A. Плотникова, С.П. Кемайкин, О.Н. Дерябина // Научные труды XIV международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке». -М. 2015. -С. 12-16.

7. Оксндативный стресс и его коррекция при экспериментальных неоплазиях / H.A. Плотникова, С.П. Кемайкин, Д.В. Демидов, П.М. Канаев, П.В. Кудрявцев // Материалы VI Российского пленума президиума Российского общества патологоанатомов. - Н. Новгород, 2012. - С. 17-20.

8. Динамика морфогенеза экспериментальных неоплазий при коррекции мелатонином и метформином / H.A. Плотникова, Т.А. Маньчева, Д.В. Демидов, П.М. Канаев, С.П. Кемайкин // Материалы XI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты (экспериментальная онкология)». - М. 2012. -Т.11, №2 - С. 34.

9. Оценка эффективности сочетанного использования комбинированного лечения и антиоксидантной терапии при перевиваемой карциноме легкого Льюиса / Н.А.Плотникова, П.М. Канаев, И.М. Вашуркина, Т.В. Харитонова, С.П. Кемайкин, C.B. Харитонов // Здоровье и образование в XXI веке. Сер.: медицина. - М. 2012. -Т.14,№1. -С. 229-230.

10. Патоморфологическая динамика экспериментальных неоплазий при коррекции мелатонином и мсксндолом: матер. VIII Всеросс. съезда онкологов / H.A. Плотникова, П.М. Канаев, О.Н. Дерябина // Журнал Вопросы онкологии. - 2013.-Т.59, № 3. - С. 74.

11. Патоморфологическая картина первичного узла карциномы Льюиса при коррекции антиоксидантами комбинированного лечения / H.A. Плотникова, И.М. Вашуркина, С.П. Кемайкин, П.М.Канаев, Е.В. Колышкина // Материалы Белорусско-Российской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты». М.2013. -Т.12, № 2. -С. 65.

12. Морфогенез опухолевого роста при коррекции мелато......ом

и метформином / О.Н. Дерябина, П.М. Канаев, H.A. Плотникова // Известия высших учебных заведении: поволжский регион. Сер.: медицинские науки. -2014. - № 2 (30). - С. 5-15.

13. Динамика морфогенеза экспериментальных мезенхимальных опухолей при воздействии мелатонина и метформина / О.Н. Дерябина, H.A. Плотникова, П.М. Канаев, А.П. Кириллова // Здоровье и образование в XXI веке. Сер.: медицина. - М., 2014. - Т. 16, № 3. -С. 50-54.

Канаев Павел Михайлович

Динамика патоморфологическпх изменений

в тканях экспериментальных неоплазин на фоне применения мелатонина и мексидола

14.03.02 -патологическая анатомия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 19.06.15. Объем 1,5 п. л. Тираж 100 экз. Заказ № 742. Типография Издательства Мордовского университета 430005, г. Саранск, ул. Советская, 24