Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Патофизиологические и морфологические аспекты моделирования и терапии острого пиелонефрита



На правах рукописи

ии-з-

ЗИМУШКИНА НИНА АЛЕКСАНДРОВНА

ПАТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МОДЕЛИРОВАНИЯ И ТЕРАПИИ ОСТРОГО ПИЕЛОНЕФРИТА

14.00.16 - патологическая физиология

Автореферат 1 С ОПТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск, 2009

003479895

Работа выполнена на кафедре патологической физиологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Пермская государственная медицинская академия им. академика Е.А. Вагнера Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Росздрава»

Научные руководители:

доктор медицинских наук Самоделкин Евгений Иванович

кандидат медицинских наук Косарева Полина Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук

Долгих Владимир Терентьевич Осиков Михаил Владимирович

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет им. ГШ. Пирогова», г. Москва

Защита диссертации состоится « 2009 г. в и часов на

заседании специализированного Совета Д-208.117.02 Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Росздрава» (г. Челябинск, ул. Воровского, 64).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Росздрава» (г. Челябинск, ул. Воровского, 64).

Автореферат разослан « у » у/сГЛ^С^ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук,

профессор Н.В. Тишевская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Инфекционно-воспалительные заболевания органов мочевыделительной системы - одна из особенно остро стоящих на сегодняшний день проблем практического здравоохранения, поскольку эта патология встречается достаточно часто как у взрослых, так и детей (Foxman, 2002), и в последнее время наблюдается неуклонный рост частоты уроренальных инфекций (Никитина с соавт., 2007).

Терапевтическая тактика при лечении данной патологии предусматривает обязательное назначение пациентам курсов антибактериальной терапии (Коровина с соавт., 2003; Domann et al., 2003). Вместе с тем, наличие нежелательных побочных эффектов у современных антимикробных средств (Стра-чунский, 1994; John D. Nelson, 1997; Кеворков с соавт., 2001) и быстрое формирование резистентности уропатогенных бактерий к антибиотикам определяют постоянный интерес исследователей к поиску новых эффективных и безопасных препаратов. Поэтому наиболее перспективным направлением в данной области является разработка способов лечения с использованием лекарственных средств, включающих естественные компоненты организма (Масы-чева с соавт., 2001).

Прежде всего, это внедрение в схемы лечения пациентов, страдающих пиелонефритом или циститом, иммунотропных средств. Иммуномодулирую-щая терапия является важнейшим звеном патогенетической терапии пиелонефрита, способной предотвратить хронизацию микробно-воспалительного процесса и развитие почечной недостаточности. В настоящее время во многих научных центрах в России и за рубежом проводятся многопрофильные исследования по созданию лечебных препаратов, действующим началом которых являются рекомбинантные цитокины. Наряду с этим вместе с природными факторами, оптимизирующими элиминацию из организма инфекционного агента за счет активации иммунной системы хозяина, начинается внедрение в клиническую практику антибактериальных катионных пептидов нейтрофиль-ных гранулоцитов млекопитающих (Кокряков, 1999). К настоящему времени доказано, что к лейкоцитарным белкам и пептидам проявляют чувствительность многие микроорганизмы (Печеркина с соавт., 1982; Кузнецов и др., 1982; Korobov, 1988), они обладают способностью потенцировать эффекты традиционно применяемых антибактериальных средств и являются многофункциональными иммуномодуляторами (Кокряков, 1999; Титова, 2002), что делает их перспективным объектом фармакологических исследований. Поскольку в настоящее время многими авторами отмечается возрастание этиологической роли грампозитивной кокковой флоры у пациентов с пиелонефритом (Сафи-на, 2002; Урывчиков, 2002; Gupta К., 2003; Ronald А., 2003), представляется целесообразным изучение эффективности применения препаратов, содержащих антибактериальные катионные пептиды живых организмов, при лечении данной патологии, так как антибактериальные пептиды, прежде всего, проявляют свою активность в отношении грамположительных кокков (Кокряков, 1999;

Титова, 2002).

Кафедрой иммунологии РГМУ совместно с предприятием «Иммунохелп», г. Москва, разработан и внедрен в клиническую практику препарат «Суперлимф» - естественный комплекс природных противомикробных пептидов и цитоки-нов. Применение препарата «Суперлимф» является новым перспективным методом терапии, обеспечивающим длительную и качественную ремиссию, уменьшение частоты обострений и улучшение качества жизни пациентов (Ко-вальчук с соавт., 2006; Козырева с соавт., 2007; Локтева, 2007). В литературе отсутствуют данные относительно применения препарата «Суперлимф» в терапии уроренальных инфекций, в связи с чем исследование его эффективности при лечении пиелонефрита в доклинических экспериментах и определило цели и задачи диссертационной работы.

Цель работы: на экспериментальной модели острого пиелонефрита исследовать эффективность применения отечественного препарата «Суперлимф», представляющего собой комплекс природных цитокинов и антибактериальных пептидов животного происхождения.

Задачи исследования:

1. Разработать экспериментальную модель острого пиелонефрита, используя культуры уропатогенных микроорганизмов, изолированные от пациентов.

2. Исследовать эффективность применения препарата «Суперлимф» при лечении экспериментального пиелонефрита.

3. В эксперименте на лабораторных животных изучить морфологические изменения ткани почек при экспериментальном пиелонефрите, охарактеризовать их динамику при проведении экспериментальной терапии.

4. Охарактеризовать морфологические изменения органов иммунной системы и ткани печени экспериментальных животных при моделировании острого пиелонефрита.

Положения, выносимые на защиту:

1. Использование для экспериментального моделирования острого пиелонефрита клинического уропатогенного штамма Staphylococcus saprophytics № 1256, изолированного из мочи пациента с пиелонефритом, позволяет получить воспалительные изменения в ткани почек экспериментальных животных, идентичные наблюдаемым в клинике.

2. При экспериментальном пиелонефрите, вызванном уропатогенным штаммом Staphylococcus saprophytics № 1256, в центральных и периферических органах иммунной системы отмечаются пролиферативные процессы, в ткани печени - умеренно выраженные изменения воспалительного характера.

3. Включение в состав экспериментальной терапии пиелонефрита комплекса природных цитокинов и антибактериальных катионных пептидов («Суперлимфа») обеспечивает адекватное течение иммунных реакций на фоне минимально выраженных явлений воспаления в ткани почек.

Научная новизна

Разработан способ моделирования острого пиелонефрита с использованием клинического уропатогенного штамма Staphylococcus saprophytics № 1256, вызывающего развитие в ткани почек экспериментальных животных патологических изменений, идентичных наблюдаемым в клинике и подтверждающихся результатами гистологических, иммуногистохимических и морфомет-рических исследований.

Впервые показано, что включение в экспериментальную терапию пиелонефрита комплекса природных цитокинов и антибактериальных катионных пептидов («Суперлимф») способствует оптимальной регрессии признаков микробного воспаления в ткани почек. В доклинических экспериментах выявлено, что использование «Суперлимф» оказывает благоприятное влияние на течение иммунных реакций, в частности, стимулирует процессы клеточного иммунитета.

Иммуногистохимическими методами впервые установлено, что применение «Суперлимф» в сочетании с антибактериальной терапией способствует сокращению в эпителии проксимальных извитых канальцев почек числа клеток, зкспрессирующих проапоптотический белок Fas Ligand, что говорит об уменьшении интенсивности гибели клеток канальцев под воздействием про-воспалительных цитокинов. Выявленная интенсивная экспрессия молекул межклеточной адгезии ICAM-1 в ткани почек объясняется такими эффектами «Суперлимф», как активация клеток фагоцитарного ряда, фибробластов и усиление межклеточного взаимодействия в очаге воспаления (Ковальчук, 2006).

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные результаты, свидетельствующие о роли в развитии пиелонефрита процессов апоптоза и миграционной активности клеток иммунной системы в зоне воспаления, позволяют, в целом, расширить представление о патогенезе инфекционно-воспалительных заболеваний органов мочевыдели-тельной системы, а также определить оптимальные точки приложения патогенетической терапии при лечении данной патологии.

Выявленная в экспериментальных исследованиях эффективность применения препарата «Суперлимф», являющегося комплексом природных цитокинов и катионных антибактериальных пептидов, делает перспективным дальнейшее его изучение с целью последующего применения в клинической практике.

Разработанная экспериментальная модель острого пиелонефрита может быть использована для воспроизведения микробно-воспалительного процесса в почках с целью дальнейшего изучения патогенеза пиелонефрита и доклинической апробации новых лекарственных средств.

Апробация диссертационного материала и публикации

Работа выполнена в соответствии с планом НИР ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. академика Е.А. Вагнера Росздра-ва». Результаты исследований доложены и обсуждены на LXVIII Всероссийс-

кой научно-практической конференции «Инновации и технологии - эффективному агропроизводству» (г. Пермь, 2007); XI международной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов, Ур. ГСХА, (г. Екатеринбург,

2007); Итоговой научной сессии ПГМА им. академика Е.А. Вагнера Росздрава (г. Пермь, 2008); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 90-летию сельскохозяйственного образования на Урале, ПГСХА (г. Пермь,

2008).

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из нихЗ-в рецензируемых журналах ВАК РФ, 2 - патенты РФ на изобретения.

Внедрение в практику

Полученные в ходе экспериментальных и клинических исследований результаты внедрены в работу отдела морфологических и патофизиологических исследований ЦНИЛ ГОУ ВПО «ПГМА им. академика Е.А. Вагнера Росздрава», используются в учебном процессе на кафедре нормальной, топографической и клинической анатомии и оперативной хирургии, кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии, кафедре микробиологии и вирусологии и кафедре патологической физиологии ГОУ ВПО «ПГМА им. академика Е.А. Вагнера Росздрава» при изучении вопросов этиологии и патогенеза заболеваний мочевыделитель-ной системы.

Структура и объем работы

Диссертация включает следующие разделы и главы: содержание, введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, четыре главы собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, практические рекомендации, список литературы. Материалы диссертации изложены на 120 печатных страницах, содержат 5 рисунков, 16 таблиц, включают 179 литературных источников, из которых 107 - отечественных и 72 - иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

С целью воспроизведения в эксперименте микробно-воспалительной патологии почек и для проведения экспериментальной терапии использовано 60 животных - беспородных белых крыс (самцов и самок) четырехмесячного возраста, с массой тела 150-200 г, содержащихся в стандартных условиях вивария (свободный доступ к пище и воде и 12-14-часовой световой день).

Все эксперименты выполнены на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории Государственного учреждения высшего профессионального образования «Пермская государственная медицинская академия йм. академика Е.А. Вагнера Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», имеющего разрешение на работу с экспериментальными животными и в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием

экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. N 755) и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18 марта 1986 г. Животные получали типовой рацион вивария в соответствии с нормами, утвержденными приказом Министра здравоохранения СССР от 10 марта 1966 г. № 163 и Приказом Минздрава СССР от 10.10.83 №1179 (пункт 4.1).

Поскольку задачами экспериментального исследования являлись моделирование острого пиелонефрита у животных и поиск путей рационального лечения данной патологии, были сформированы следующие группы (в равной степени самцы и самки для унифицирования исследования).

1. Контрольная группа (интактные животные), находящиеся на стандартном рационе вивария, п=10.

2. Моделирование пиелонефрита путем интраперитонеального инфицирования животных уропатогенным штаммом St. saprophytics № 1256, концентрация культуры бактерий - 10е КОЕ/мл, стандартный рацион вивария, п=10.

3. Моделирование пиелонефрита путем интраперитонеального инфицирования животных уропатогенным штаммом St. saprophytics № 1256, концентрация культуры бактерий - 106 КОЕ/мл, стандартный рацион вивария, п=10.

4. Моделирование пиелонефрита путем интраперитонеального инфицирования животных уропатогенным штаммом Staphylococcus saprophytics № 1256, концентрация культуры бактерий - 108 КОЕ/мл, экспериментальная терапия - цефазолин, стандартный рацион вивария, п=10.

5. Моделирование пиелонефрита путем интраперитонеального инфицирования животных уропатогенным штаммом St. saprophytics № 1256, концентрация культуры бактерий - 10s КОЕ/мл, экспериментальная терапия - суперлимф, стандартный рацион вивария, п=10.

6. Моделирование пиелонефрита путем интраперитонеального инфицирования животных уропатогенным штаммом St. saprophytics № 1256, концентрация культуры бактерий - 10а КОЕ/мл, экспериментальная терапия - соче-танное применение цефазолина и «Суперлимф», стандартный рацион вивария, п=10.

Моделирование экспериментального пиелонефрита осуществляли следующим образом. Животным однократно под легким эфирным наркозом инт-раперитонеально вводили суточную бульонную культуру уропатогенного штамма St. saprophytics № 1256, изолированного из мочи пациента с клинической картиной острого пиелонефрита, подтвержденного лабораторными данными. Культуру используемого для заражения штамма вводили в концентрациях 103 КОЕ/мл и 106 КОЕ/мл, стандартизированных нефелометрическим методом. Оптическую плотность микробной суспензии, соответствующую заданной концентрации, определяли эмпирически (Веслополова, 1995) на фотоэлектрока-лориметре КФК-3 (зеленый светофильтр, длина волны 540 нм, кювета - 1,060 мм). Для каждого значения известной оптической плотности делали четыре

посева по 1 мкл: суспензия в исходной концентрации и 3 ее десятикратных разведения. В результате проведенных исследований установлено, что оптическая плотность бактериальной суспензии варюрЬуНсиз, соответствующая концентрациям 108 КОЕ/мл и 10е КОЕ/мл, составляет 0,026 и 0,012 соответственно.

В качестве средства этиотропной терапии экспериментального пиелонефрита был выбран цефазолин (Ва1капрЬагта, Болгария) - цефалоспориновый антибиотик I поколения широкого спектра действия для парентерального применения, оказывающий бактерицидное действие и активный в отношении грам-положительных и грамотрицательных бактерий (в том числе, в отношении заргорЬуНсиэ). В списке показаний к применению - заболевания верхних и нижних дыхательных путей, мочевыводящих и желчевыводящих путей, органов малого таза, сепсис, перитонит.

Препарат «Суперлимф», представляющий собой комплекс природных антибактериальных пептидов (протегринов) и цитокинов разработан и внедрен в клиническую практику кафедрой иммунологии РГМУ совместно с предприятием «Иммунохелп» (г. Москва). «Суперлимф» является иммуномодулятором с прямым противовирусным и противомикробным действием. Препарат используется для лечения заболеваний инфекционно-воспалительной природы в офтальмологии, гинекологии, хирургии. Данные о применении «Суперлимфа» в лечении острого пиелонефрита в эксперименте и клинической практике в литературе отсутствуют.

Экспериментальную терапию «Суперлимфом» и цефазолином начинали спустя 48 часов после заражения. Препараты вводили интраперитонеально 1 раз в сутки, в течение 8 дней: суперлимф - из расчета 0,1 мг/кг массы тела в сутки в 0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия для инъекций, цефазолин - 50 мг/кг, также в 0,5 мл физиологического раствора.

В ходе эксперимента наблюдали за поведением, аппетитом и внешним видом животных, динамикой массы тела. По окончании исследований животных выводили из эксперимента путем перерезки спинного мозга под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии. В асептических условиях забирали для проведения бактериологического исследования органы: печень, селезенку, почки. Выделенные чистые культуры идентифицировали по стандартным схемам (Приказ МЗ СССР № 535,1985). Идентификацию выделенных чистых культур варгорЬуИсиз по биохимическим признакам проводили при помощи системы одноразового использования для дифференциации микроорганизмов рода стафилококки «ПБДС» (НПО «Диагностические системы», Нижний Новгород). Микробиологические исследования проведены в микробиологической лаборатории ЦНИЛ Пермской государственной медицинской академии им. академика Е.А. Вагнера (зав. ЦНИЛ - д.ф.н., профессор Г.П. Вдови-на, зав. лабораторией - профессор Ю.Н. Маслов).

Одновременно при проведении аутопсии забирали органы (почки, печень, селезенку, тимус, тонкую кишку с пейеровыми бляшками) для проведения пос-

ледующего гистологического исследования. Кусочки тканей, толщиной 5-7 мм, фиксировали в 10%-ном забуференном по Лилли формалине (pH -7,2), гистологические препараты готовили по стандартным методикам с заливкой в гис-тамикс. Срезы, полученные на ротационном микротоме (3—4 мкм), депарафи-нировали по стандартной схеме и подвергали окрашиванию гематоксилином и эозином, пикрофуксином по ван Гизону с целью визуализации коллагеновых волокон. Гистологические срезы почек дополнительно окрашивали нитратом серебра по Футу для лучшей визуализации гломерулярной базальной мембраны; ткань селезенки - также нитратом серебра по Футу с целью визуализации ретикулярных волокон в строме селезенки и метиловым зеленым-пирони-ном для выявления РНК в клетках.

Иммуногистохимические исследования ткани почек проводили с использованием антител и полного диагностического набора компании Diagnostic BioSystems (USA), предназначенного для проведения экспериментальных исследований. Для выявления пролиферативной активности клеток использовали моноклональные антитела к регуляторному протеину Ki-67 (Rabbit Monoclonal Antibody to Human Ki-67, Clone SP6, Isotype IgG). Выраженность воспалительных реакций в ткани почек оценивали по уровню экспрессии адгезивных молекул ICAM-1 (Monoclonal Mouse Antibody to Human CD54 (ICAM-1), Clone 15.2, Isotype lgG1) на эндотелиоцитах сосудов и в эпителии проксимальных извитых канальцев, процессы апоптоза в клетках оценивали по уровню экспрессии про-апоптотического белка Fas ligand (Polyclonal Rabbit Antibody to Fas Ligand) в эпителиоцитах проксимальных извитых канальцев почки. Для исследования экспрессии ICAM-1 в ткани почек использовали криостатные срезы нативного материала, полученные на замораживающем микротоме shandon creatom FE (патологоанатомическое отделение ПККБ, зав. отделением - Н.В. Зотова). Иммуногистохимические исследования проводили в соответствии с инструкциями фирмы-производителя по стандартным протоколам. При проведении им-муногистохимических исследований использовали позитивные контроли, также рекомендованные фирмой-производителем. Гистологические срезы докрашивали гематоксилином Майера, заключали в канадский бальзам и исследовали в проходящем свете микроскопа при увеличении х 400.

Оценка интенсивности пероксидазной метки и определение индекса пролиферации Ki-67 проводились полуколичественным методом. Учитывалось число позитивных результатов на 100 учтенных ядер (при учете 500-1000 клеток) (Корсакова, 2007.). При определении экспрессии Ki-67 ядерная реакция любой интенсивности фиксировалась как позитивная (Раскин, 2007). Уровень пролиферации расценивался как низкий, если <15% клеток имели позитивную реакцию, умеренный, если 15-30% ядер были позитивны на Ki-67, и высокий при позитивной реакции более 30% клеток (Раскин, 2007). Гибель клеток в форме апоптоза оценивали по индексу апоптоза (1АПТ), вычисляемому по формуле: 1АПТ (%) = N (число апоптозных клеток, позитивных к Fas Ligand)/N1 (общее число клеток)х100 (Осадчук с соавт., 2004).

Захват гистологических изображений осуществляли при помощи цифровой камеры для микроскопа САМ V200, Vision (Австрия). Морфометрические исследования выполнены при помощи специализированного программного обеспечения для медицины и биологии BioVision, version 4,0 (Австрия). При проведении морфометрического анализа органов иммунной системы экспериментальных животных мы исследовали ткань тимуса, селезенки и стенки подвздошной кишки животных с пейеровыми бляшками. Анализ морфометричес-ких параметров в селезенке животных подразумевал измерение относительного объема белой пульпы, относительного объема ПАЯМ и светлых центров в лимфатических узелках. При проведении морфометрического анализа ткани тимуса экспериментальных животных мы исследовали соотношение относительных объемов коркового и мозгового вещества в дольках тимуса. При исследовании стенки подвздошной кишки экспериментальных животных мы проводили подсчет количества клеток Панета в дне кишечных крипт, определяя их число в поперечном срезе крипты, и подсчитывали количество поперечно срезанных крипт, содержащих дегранулирующие клетки Панета. Подсчет гистологических объектов в данном случае проводили при увеличении микроскопа.

Патофизиологические и морфологические исследования выполнены в отделе морфологических и патофизиологических исследований Центральной научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО ПГМА им. академика Е.А. Вагнера Росздрава (зав. ЦНИИ - д.ф.н., профессор Г.П. Вдовина, зав. отделом -К.М.Н. П.В. Косарева).

Результаты исследований подвергнуты статистической обработке с применением программы Microsoft Excel и программного пакета Biostat. При проведении статистической обработки результатов экспериментальных исследований вычисляли среднее арифметическое и стандартное отклонение, сравнение между собой двух выборок проводили при помощи непараметрического критерия Манна-Уитни (Гланц, 1999). Для сопоставления количества животных в группах, обладающих исследуемым признаком, вычисляли статистику X2 (Гланц, 1999);

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В эксперименте на белых крысах обоего пола было изучено влияние различных концентраций (106 КОЕ/мл и 10е КОЕ/мл) суточных бульонных культур клинического уропатогенного штамма Staphylococcus saprophytics №1256, выделенного из мочи пациента с острым пиелонефритом, подтвержденным клиническими и лабораторными данными.

При проведении бактериологического исследования аутопсийного материала культура St. saprophytics была изолирована из ткани почек, селезенки и печени животных, которым интраперитонеально вводили уропатогенный штамм St. saprophytics в концентрации Ю8КОЕ/мл, в 100% случаев в титре, превышающем 105 КОЕ/мл. Результаты бактериологического исследования аутопсийного материала, полученного от экспериментальных животных, зара-

женных урокультурой 5/. БаргорЬуНсиБ в концентрации Ю£КОЕ/мл, представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Результаты бактериологического исследования аутопсийного материала, полученного от животных, зараженных урокультурой 8(. варгорЬуНсиз в концентрации 108 и106 КОЕ/мл

Исследуемый материал Заражение Si. Saprophyticus 10е КОЕ/мл Заражение Si. Saprophyticus 106 КОЕ/мл

Процент животных, от которых были получены положительные результаты бактериологического исследования Концентрация выделенной культуры St. saprophyticus, КОЕ/г Процент животных, от которых были получены положительные результаты бактериологического исследования Концентрация выделенной культуры Sf. saprophyticus, КОЕ/г

Почки 100% >10= 60%* 10J-t0'

Печень 100% >10ь 70%* 10а

Селезенка 100% >10* 50%* <10J

•достоверность различий по отношению к группе, зараженной урокультурой St. Saprophyticus в концентрации 10е КОЕ/мл (р<0,05)

У всех животных, зараженных урокультурой St. saprophyticus в концентрации 108 КОЕ/мл, к 14-м суткам в ткани почек отмечались выраженное полнокровие дуговых и междольковых артерий и вен, тромбы в просвете сосудов, в стенках сосудов выявляли воспалительные инфильтраты. В почечных тельцах при импрегнации гистологических срезов азотнокислым серебром находили утолщенные гломерулярные базальные мембраны. В паренхиме почки выявлялись участки зернистой дистрофии эпителия проксимальных извитых канальцев, в межуточной ткани почек и слизистой и подслизистой оболочках почечных лоханок обнаруживалась выраженная воспалительная инфильтрация, представленная лимфоцитами, полиморфноядерными нейтрофилами и макрофагами (рис. 1). Воспалительные изменения в виде выраженной воспалительной инфильтрации отмечались у 60% животных не только в стенке почечной лоханки, но и в подслизистой и адвентициальной оболочках мочеточников (рис. 2).

У экспериментальных животных, зараженных урокультурой Staphylococcus saprophyticus в концентрации 106 КОЕ/мл, к 14-м суткам в межуточной ткани почек и слизистой и подслизистой оболочках почечных лоханок отмечались слабо выраженные воспалительные изменения. Результаты гистологического исследования ткани почек животных обеих экспериментальных групп представлены на рис. 2.

При окраске пикрофуксином по ван Гизону избыточного образования соединительной ткани в интерстициальной ткани почек и стенках лоханок как у животных, зараженных высокой дозой возбудителя (108 КОЕ/мл), так и у живот-

ных, зараженных низкой дозой урокультуры St. saprophyticus (106 КОЕ/мл), нами выявлено не было.

Рис. 1. Выраженная воспалительная инфильтрация межуточной ткани почки крысы, зараженной St. saprophyticus в концентрации 108 КОЕ/мл. Окраска гематоксилином и эозином х 150.

■ Полнокровие дуговых и междольк Сосудов

□ Зернистая дистрофия эпителия канальцев

□ Воспалительная инф-я межуточной ткани почек

О Воспалительная инф-я стенки мочеточника__

Высокая концентрация Низкая концентрация

культуры культуры

Рис. 2. Характер патологических изменений в ткани почек экспериментальных животных, интралеритонеально зараженных урокультурой ЗаргорЬуНсиз в концентрациях 106 КОЕ/мл и 108 КОЕ/мл

При проведении иммуногистохимических исследований ткани почек животных, зараженных урокультурой St. saprophyticus, выявлена выраженная экспрессия проапоптотического белка Fas Ligand, главным образом, в эпителиоцитах проксимальных извитых канальцев, и молекул межклеточной адгезии ICAM-1 в эндотелиоцитах сосудов и эпителиоцитах проксимальных извитых канальцев, что свидетельствует о протекающем воспалительном процессе. Индекс пролиферации, определяемый посредством полуколичественной оценки экспрессии регуляторного протеина K¡-67, во всех экспериментальных группах составил менее 1%, что не противоречит литературным данным (Nadasdy et al., 1994). Установлено, что у животных, зараженных урокультурой St. saprophyticus в концентрации 103 КОЕ/мл, отмечаются более выраженные патологические изменения, чем в группе, зараженной St. saprophyticus в концентрации 105 КОЕ/мл.

Выявлено, что при моделировании острого пиелонефрита в эксперименте в центральных (тимус) и периферических органах иммунной системы (селезенка, пейеровы бляшки тонкой кишки) отмечаются пролиферативные процессы, что сопровождается скоплением клеток лимфоидного ряда в Т- и В-зависи-мых зонах и формированием светлых центров в лимфоидных узелках селезенки и пейеровых бляшек. В ткани печени обнаруживаются умеренно выраженные изменения воспалительного характера. Установлено, что у животных, зараженных уропатогенным штаммом St. saprophyticus в концентрации 10е КОЕ/ мл, отмечались более выраженные патологические изменения, чем в группе, зараженной культурой St. saprophyticus в концентрации 10е КОЕ/мл.

Таблица 2.

Характер патологических изменений в ткани селезенки у животных, зараженных урокультурой St. saprophyticus в концентрации 108 КОЕ/мл и 105

КОЕ/мл

10в КОЕ/мл 10ь КОЕ/мл

Выявленные изменения (п= 10) (п= 10)

Абс. % Абс. %

Отек паренхимы селезенки 6 60 3 30

Отек(набухание)капсулы селезенки 4 40 1 10

Увеличение объема белой пульпы 10 100 6 60

Большое количество лимфоцитов и макрофагов в красной пульпе 10 100 7 70

Появление светлых центров в лимфатических узелках 10 100 6 60

Краевое стояние лейкоцитов в венулах 8 80 4 40

Таким образом, использование уропатогенного штамма Staphylococcus saprophyticus № 1256, изолированного из мочи пациента с острым пилонефри-

том, в концентрации 108 -106 КОЕ/мл вызывает у белых беспородных крыс обоего пола развитие острого пиелонефрита, с более выраженными патогистоло-гическими изменениями в исследуемых органах при применении высокой дозы возбудителя (108 КОЕ/мл), что позволяет рекомендовать введение данной концентрации уропатогенного штамма БаргорЬуНсиз N3 1256 для воспроизведения острого пиелонефрита в эксперименте.

При проведении дальнейших экспериментальных исследований нами было установлено, что включение в экспериментальную терапию пиелонефрита комплекса природных цитокинов и антибактериальных катионных пептидов («Суперлимф») способствует более выраженной регрессии признаков микробного воспаления в ткани почек. Так, гистологическое исследование показало, что воспалительные явления в ткани почек у животных с экспериментальным пиелонефритом, получавших комбинированное лечение в форме сочетанного применения антибактериального химиопрепарата (цефазолин) и иммуномодулирую-щего средства (суперлимф), были выявлены в единичных случаях (10%).

При проведении иммуногистохимических исследований установлено, что экспрессия 1САМ-1 в ткани почек максимально выражена у животных, получавших в качестве экспериментальной терапии препарат «Суперлимф» (рис. 3, рис. 4), биологическими эффектами которого являются активация клеток фагоцитарного ряда, фибробластов, усиление взаимодействия между клеточными элементами и регуляция миграционной активности клеток иммунной системы в зоне воспаления и регенерации (Ковальчук, 2006).

..... .

Ш

Рис. 3.

1

''г\ ■ • - :

'Л-■ д

Ш'

т

ш

Рис.

Рис. 3. Криостатный срез коркового вещества почки животного, зараженного уропатогенным штаммом Э/ заргорЬуИсиз и получавшего антибактериальную

терапию цефазолином х 600. Рис. 4 Криостатный срез коркового вещества почки животного, зараженного уропатогенным штаммом в/. варгорЬуНсиз в концентрации 108 КОЕ/мл и получавшего терапию Суперлимфом х 600.

Также нами показано, что применение антибактериального препарата (це-фазолин), так и использование в качестве монотерапии или в сочетании с антибактериальным средством иммуномодулятора «Суперлимфа», способствует сокращению в эпителии проксимальных извитых канальцев числа клеток, экспрессирующих проапоптотический белок Fas Ligand, что говорит об уменьшении интенсивности гибели клеток канальцев под воздействием провоспали-тельных цитокинов (таблица 3).

Таблица 3.

Индекс апоптоза (1АПТ) в эпителиоцитах проксимальных канальцев ткани почек экспериментальных животных (%)

Экспериментальная группа индекс апоптоза (1АПТ), %

Интактные животные 1,25±0,07

Заражение 10н КОЕ/мл 5,08±0,62*

Заражение 10ь КОЕ/мл 3,11 ±0,47*

Заражение 10е КОЕ/мл, терапия цефазолином 2,81 ±0,09*

Заражение 10а КОЕ/мл, терапия суперлимфом 1,92+0,12

Заражение 10й КОЕ/мл, терапия цефазолином и суперлимфом 1,53±0,08

* - достоверность различий между экспериментальными группами и группой ин-тактных животных (р<0,05)

Таблица 4.

Относительный объем белой пульпы в селезенке экспериментальных

животных (%)

Экспериментальная группа Относительный объем белой пульпы, %

Интактные животные 30,18±2,69

Заражение 10й КОЕ/мл 41,66+9,91*

Заражение 10ь КОЕ/мл 34,88+1,64

Заражение 10а КОЕ/мл, терапия цефазолином 35,94±2,59

Заражение 10й КОЕ/мл, терапия суперлимфом 39,56±3,49*

Заражение 10е КОЕ/мл, терапия цефазолином и суперлимфом 38,48±2,75*

* - достоверность различий между экспериментальными группами и группой ин-тактных животных (р<0,05)

Таблица 5.

Толщина ретикулярных волокон в строме селезенки экспериментальных животных при импрегнации гистологических срезов солями серебра

Экспериментальная группа Толщина ретикулярных волокон, мкм

Интактные животные 0,623±0,248

Заражение 10а КОЕ/мл 0,912±0,381*

Заражение 10й КОЕ/мл 0,852±0,228*

Заражение 10° КОЕ/мл, терапия цефазолином 0,648±0,351

Заражение 10" КОЕ/мл, терапия суперлимфом 0,611+0,218

Заражение 10° КОЕ/мл, терапия цефазолином и суперлимфом 0,622+0,245

*-см. табл. 4.

Таблица 6.

Относительный объем ПАЯМ в белой пульпе селезенки экспериментальных

животных (%)

Экспериментальная группа Удельный объем ПАЯМ, %

Интактные животные 18,72±2,45

Заражение 10й КОЕ/мл 24,83±1,56

Заражение Юь КОЕ/мл 21,37±2,59

Заражение 10 КОЕ/мл, терапия цефазолином 22,36±2,51

Заражение 10в КОЕ/мл, терапия суперлимфом 26,87±1,35

Заражение 10° КОЕ/мл, терапия цефазолином и суперлимфом 25,58+2,38

*-см. табл. 4.

Таблица 7.

Относительный объем коркового вещества в дольках тимуса экспериментальных животных

Экспериментальная группа Удельный объем коркового вещества, %

Интактные животные 65,19±7,71

Заражение заргорЬуНсиз 10й КОЕ/мл 34,05±2,38*

Заражение варгорЬуИси5 10° КОЕ/мл 39,18±3,96*

Экспериментальная терапия цефазолином 47,52±3,55*

Экспериментальная терапия цефазолином и суперлимфом 63,84±6,98

Экспериментальная терапия суперлимфом 68,57±7,53

*- см. табл. 4.

Таблица 8.

Количество дегранулирующих клеток Пакета в криптах подвздошной кишки экспериментальных животных

Экспериментальная группа Количество дегранулирующих клеток Панета

Интактные животные 0,8±0,051

Заражение эаргорЬуНсиэ 10в КОЕ/мл 3,9+0,982*

Заражение БаргорЬуНсиз 10° КОЕ/мл 2,8+0,046*

Экспериментальная терапия цефазолином 1,7±0,023

Экспериментальная терапия цефазолином и суперлимфом 4,11+0,191*

Экспериментальная терапия суперлимфом 5,3±0,342*

* - см. табл. 4.

Таблица 9.

Относительный объем межузелковых зон в лимфатических узелках пейеровых бляшек тонкой кишки экспериментальных животных (%)

Экспериментальная группа Удельный объем межузелковой зоны, %

Интактные животные 25,01 ±2,52

Заражение $арюрЬуИси5 10а КОЕ/мл 47,24+2,49*

Заражение 5?. заргорЬуНсиз 10° КОЕ/мл 43,78±1,98*

Экспериментальная терапия цефазолином 30,68±2,36*

Экспериментальная терапия цефазолином и суперлимфом 49,18±3,88*

Экспериментальная терапия суперлимфом 50,92±0,43*

* - см. табл. 4.

При проведении морфометрического анализа органов иммунной системы экспериментальных животных мы исследовали ткань тимуса, селезенки и стенки подвздошной кишки животных с пейеровыми бляшками. Результаты морфометрических исследований представлены в таблицах 4-9.

Как видно из таблиц, применение «Суперлимфа» в терапии острого пиелонефрита обуславливает активацию клеточного иммунитета, что подтверждается результатами морфометрических исследований органов иммунной системы. Это объясняется тем, что Суперлимф, прежде всего, стимулирует процессы клеточного иммунитета посредством переключения дифференцировки Т-хелперов в сторону ТЫ (Курышева с соавт., 2006).

Исходя из результатов проведенных исследований можно сделать вывод о том, что включение в комплексную терапию острого пиелонефрита нового

отечественного иммуномодулятора с прямым антибактериальным действием - препарата «Суперлимф» способствует оптимальной регрессии признаков воспалительного процесса в ткани почек и оказывает благоприятное влияние на течение иммунных реакций за счет стимулирующего действия на процессы клеточного иммунитета. Полученные результаты открывают перспективы дальнейшего его исследования в ходе клинических испытаний в качестве средства этиопатогенетической терапии инфекций мочевыделительной системы.

ВЫВОДЫ

1. Разработанная экспериментальная модель острого пиелонефрита, сущность которой заключается в однократном интраперитонеальном введении лабораторным крысам клинического штамма Staphylococcus saprophytics № 1256 в концентрациях Ю6КОЕ/мл и 108 КОЕ/мл, позволяет воспроизвести в эксперименте на животных патогистологические изменения в ткани почек, идентичные наблюдаемым в клинике.

2. Согласно результатам патогистологического, иммуногистохимического и морфометрического исследований, при интраперитонеальном введении экспериментальным животным (белым крысам) уропатогенного штамма Staphylococcus saprophytics № 1256 в периферических органах иммунитета отмечаются пролиферативные процессы, сопровождающиеся пролиферацией клеток лимфоидного ряда в Т- и В-зависимых зонах и формированием светлых центров в лимфоидных узелках селезенки и пейеровых бляшек.

3. В экспериментальных исследованиях установлена целесообразность включения в комплексную терапию пиелонефрита комплекса природных антибактериальных пептидов и цитокинов - «Суперлимф»: применение «Суперлимф» способствует уменьшению выраженности патогистологических признаков пиелонефрита у экспериментальных животных.

4. Согласно результатам иммуногистохимического исследования, в ткани почек животных, зараженных уропатогенным штаммом Staphylococcus saprophytics, отмечается выраженная экспрессия проапоптотического белка Fas Ligand и молекул межклеточной адгезии ICAM-1, что свидетельствует о протекающем воспалительном процессе в ткани почек.

5. Экспрессия ICAM-1 в ткани почек максимально выражена у животных, получавших в качестве экспериментальной терапии иммуномодулятор суперлимф, биологическими эффектами которого, согласно литературным данным, являются активация клеток фагоцитарного ряда, усиление взаимодействия между клеточными элементами и регуляция миграционной активности клеток иммунной системы в зоне воспаления и регенерации.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для воспроизведения в эксперименте острого пиелонефрита предлагается однократное внутрибрюшинное введение экспериментальным животным клинического изолята Staphylococcus saprophytics в концентрации 108 КОЕI мл, изолированного из мочи пациента с острым пиелонефритом, подтвержденным клиническими и лабораторными данными.

2. Полученные результаты определяют целесообразность проведения клинических испытаний по изучению эффективности включения в комплексную терапию острого пиелонефрита наряду с традиционно используемыми антибактериальными химиопрепаратами комплекса антибактериальных пептидов и цитокинов «Суперлимф».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зимушкина, Н.А. Гистологические изменения у лабораторных животных при коррекции экспериментального пиелонефрита комплексом природных антибактериальных пептидов и цитокинов/ Н.А. Зимушкина, Е.И. Самодел-кин, Т.В. Кочинова, Н.И. Аверьянова, П.В. Косарева, И.Ф. Елькин, Ф.А. Шилова, И.А. Логинова Н Материалы XI международной научно-практич. конф. молодых ученых и специалистов - Екатеринбург, 2007 г. - С. 24-29.

2. Аверьянова, Н.И. Способ моделирования острого пиелонефрита / Н.И. Аверьянова, В.В. Звездаков, Н.А. Зимушкина, П.В. Косарева, И.А. Логинова, Е.И. Самоделкин, О.С. Суринова, В.А. Черешнев, А.В. Чигалейчик// Патент РФ на изобретение № 2349965 - 2007127373/17; Заявлено 17.07.2007; Опубл. 20.03.09. Бюлл. N 8 II Открытия. Изобретения. - 2009. - N 15.

3. Косарева, П.В. Воспроизведение в эксперименте острого гематогенного пиелонефрита / П.В. Косарева, В.А. Черешнев, Е.И. Самоделкин, Н.А. Зимушкина, И.А. Логинова, Н.И. Аверьянова // Успехи современного естествознания. - М.: «Академия естествознания», 2008. - № 2. - С. 99-101.

4. Зимушкина, Н.А. Изменения гематологических показателей у белых крыс при экспериментальном пиелонефрите и его терапии комплексом природных антибактериальных пептидов и цитокинов / Н.А. Зимушкина, П.В. Косарева, И.А. Логинова, Н.И. Аверьянова // Материалы юбилейной научной сессии ПГМА -Пермь, 2008.-Т. 1.-С. 309-311.

5. Логинова, И.А. Патофизиологические изменения при экспериментальном пиелонефрите и изучение эффективности его терапии протеолитически-ми энзимами / И.А. Логинова, Е.И. Самоделкин, Н.А. Зимушкина, Т.В. Кочинова, П.В. Косарева, И.Ф. Елькин // Сборник науч. трудов LXVIII Всероссийской научно-практической конф. «Инновации и технологии - эффективному агро-производству». - Пермь, 2008. - Ч. 1. - С. 208-213.

6. Аверьянова, Н.И. Способ моделирования острого пиелонефрита на фоне холодового стресса / Н.И. Аверьянова, Н.А. Зимушкина, П.В. Косарева, Т.В. Кочинова, И.А. Логинова, В.А. Черешнев // Патент РФ № 2368016 по заявке

№ 2008100590/14; Заявлено 09.01.2008; Опубл. 20.09.09. Бюлл. N 26//Открытия. Изобретения. - № 26.

7. Аверьянова, Н.И. Способ моделирования острого пиелонефрита на фоне криогенного воздействия / Н.И .Аверьянова, H.A. Зимушкина, П.В. Косарева, И.А. Логинова, В.А. Черешнев // Получено положительное решение от 22.10.2008 г. о результате формальной экспертизы по заявке № 2008125356/ 14. Уведомление о рассмотрении ходатайства о проведении экспертизы по существу от 10.12.08.

8. Черешнев, В.А. Морфологические и гематологические критерии эффективности лечения экспериментального пиелонефрита комплексом природных цитокинов и антибактериальных пептидов / В.А. Черешнев, П.В. Косарева, Н.И. Аверьянова, Ф.А. Шилова, H.A. Зимушкина, И.А. Логинова // Пермский медицинский журнал, том XXV № 2. - Пермь, 2008 г. - С. 5-13.

9. Зимушкина, H.A. Изменение патоморфологических показателей при экспериментальном пиелонефрите и изучение эффективности его терапии комплексом природных антибактериальных пептидов и цитокинов / H.A. Зимушкина, Е.И. Самоделкин, Т.В. Кочинова, П.В. Косарева, Н.И. Аверьянова, Ф.А. Шилова, И.Ф. Елькин, И.А. Логинова II Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 90-летию сельскохозяйственного образования на Урале. - Пермь, 2008. - С. 150-153.

10. Зимушкина, H.A. Патоморфологические изменения внутренних органов и показателей крови белых крыс при экспериментальном пиелонефрите / H.A. Зимушкина, Е.И. Самоделкин, П.В. Косарева и др.// Вятская ГСХА, 2009.-С. 54-61.

11. Косарева, П.В. Экспрессия ICAM-1, проапоптотического белка Fas Ligand и регуляторного протеина Ki-67 в ткани почек экспериментальных животных при моделировании стафилококкового пиелонефрита в эксперименте / П.В. Косарева, А.С.Лиманский, H.A. Зимушкина II Научный журнал «Современные проблемы науки и образования». -2009. - № 6. - С. 48-49.

ДЛЯ ЗАМЕТОК

ДЛЯ ЗАМЕТОК

На правах рукописи

ЗИМУ11ЖИНА НИНА АЛЕКСАНДРОВНА

ПАТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МОДЕЛИРОВАНИЯ И ТЕРАПИИ ОСТРОГО ПИЕЛОНЕФРИТА

14.00.16 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск, 2009

Отпечатано в типографии BNL. Подписано в печать 07.10.09 г. Формат 60x84 Vie. Гарнитура Arial Суг. Бумага офсетная. Печать на ризографе. Объем 1 усл. п.л. Тираж 100 экз.