Противовирусные эффекты комплекса природных цитокинов (препарат "Суперлимф") на модели герпес-вирусной инфекции in vitro

Баркевич, Оксана Анатольевна

Диссертации по медицине → Аллергология и иммулология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Противовирусные эффекты комплекса природных цитокинов (препарат "Суперлимф") на модели герпес-вирусной инфекции in vitro

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Баркевич, Оксана Анатольевна Москва 2005 г.

Ученая степень: кандидата медицинских наук

ВАК РФ: 14.00.36

Автореферат диссертации по медицине на тему Противовирусные эффекты комплекса природных цитокинов (препарат "Суперлимф") на модели герпес-вирусной инфекции in vitro

На правах рукописи

БАРКЕВИЧ ОКСАНААНАТОЛЬЕВНА

ПРОТИВОВИРУСНЫЕ ЭФФЕКТЫ КОМПЛЕКСА ПРИРОДНЫХ ЦИТОКИНОВ (ПРЕПАРАТ СУПЕРЛИМФ) НА МОДЕЛИ ГЕРПЕСВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ IN VITRO

14. 00. 36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва2005

Работа выполнена в Государственном учреждении научно-исследовательском институте вирусных препаратов им. О.Г. Анжапаридзе РАМН и в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский Государственный Медицинский Университет Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, Лавров В.Ф.

Научный консультант:

Доктор медицинских наук, профессор Ковальчук Л.В. Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Стенина М.А. Доктор медицинских наук, профессор Ярилин А.А.

Ведущее учреждение: НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН.

диссертационного Совета Д 208.072.05 в ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава

Защита состоится «_».

.200 г. в.

час. на заседании

Автореферат разослан «_».

200 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета Кандидат медицинских наук, доцент

Кузнецова Т.Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Герпетическая инфекция является одним из наиболее распространенных и опасных вирусных заболеваний человека. Легкость инфицирования, латентное и пожизненное течение, развитие вторичного иммунодефицита, а также других серьезных осложнений, делают актуальной разработку методов эффективной профилактики и лечения заболеваний герпесвирусной этиологии [Баринский И.Ф. и др. (1986), Yasin В. et а1. (2000)].

Механизмы врожденного иммунного ответа при вирусной инфекции характеризуются способностью к быстрому индуцированию, относительно низкой специфичностью и состоят из трех основных фаз. В первой из них вирус подвергается атаке комплемента, природных антител и противомикробных пептидов. Во второй фазе в действие включаются интерфероны 1 типа (а и р), секретируемые инфицированными эпителиальными клетками. Наконец, в третьей фазе борьбу с вирусом продолжают быстро мобилизованные клеточные эффекторы - нейтрофилы, макрофаги и естественные киллеры и секретируемые ими цитокины [Duerst Я et а1. (2003)].

Вторичный иммунодефицит, развивающийся при герпетической инфекции, характеризуется избирательным поражением клеток макрофагально-моноцитарного ряда, дефектом в системе интерферонов и других цитокинов.

В связи с этим лечение герпетической инфекции основано на следующих подходах:

-проведении специфической противовирусной терапии

химиотерапевтическими препаратами, блокирующими размножение вируса (ацикловир, валтрекс и др.);

-осуществлении заместительной терапии препаратами интерферонового ряда и индукторами интерферонов;

-применении иммуностимуляторов, активирующих реакции врожденного и адаптивного иммунитета [Ершов Ф.И. и др. (2001), Петров Р.В. и др. (1999)].

В последние годы ведется активный поиск иммунотропных препаратов с прямым противовирусным действием. В середине 80-х годов прошлого столетия Д.Лерером и В.Н.Кокряковым был открыт новый класс низкомолекулярных катионных пептидов - протегринов, обладающих противомикробной активностью. Эндогенные пептиды играют значительную роль в защите организма при бактериальной и вирусной патологии, подавляют рост грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, грибов и некоторых вирусов. Их по праву называют природными или эндогенными антибиотиками [Кокряков В.Н. (1999), Lehrer R. et al. (2002)]. В настоящее время ведутся работы по созданию новых лекарственных препаратов на основе противомикробных пептидов.

На кафедре иммунологии РГМУ разработан оригинальный препарат Суперлимф - иммуномодулятор с прямым противомикробным действием [Ковальчук Л.В. и др. (1995), Ганковская Л.В. и др. (2005)]. По своему составу Суперлимф - это сбалансированный комплекс с активностью ряда цитокинов: интерлейкина-1/J (ИЯ-lß), интерлейкина-6 (ИЛ-6), фактора некроза опухоли (ФНО), миграцию ингибирующего фактора (МИФ), трансформирующих факторов роста ßl (ТФРР1) и ß2 (T<DPß2) и противомикробных протегрин-подобных пептидов [Ковальчук Л.В. и др. (2003)].

Суперлимф обладает широким спектром влияния на клетки, участвующие в реакциях врожденного иммунитета: макрофаги, нейтрофилы и естественные киллеры. Препарат активирует фагоцитоз, выработку цитокинов и активных форм кислорода моноцитами, индуцирует противоопухолевую активность макрофагов, способствует гибели внутриклеточных паразитов, регулирует миграцию лейкоцитов. Вследствие активации клеток макрофагально-моноцитарного ряда под влиянием Суперлимфа включаются механизмы адаптивного клеточного и гуморального иммунного ответа.

В настоящее время активно изучаются антибактериальные и противовирусные эффекты Суперлимфа. Показано, что препарат, помимо иммуностимулирующего действия, способен непосредственно подавлять рост и

размножение таких микроорганизмов, как St. aureus и Е. coli [Ковальчук Л.В. и др. (2003)].

В культуре клеток эндотелия пупочной вены человека, инфицированных вирусом герпеса простого 1 типа (ВГП-1), была показана противовирусная активность Суперлимфа [Щегловитова О.Н. и др. (1999)]. Продемонстрирована высокая эффективность препарата в комплексном лечении генитального герпеса [Сакун Н.Ю. и др. (2000), Ковальчук Л.В. и др. (2005)]. Вместе с тем, механизмы противогерпетического действия препарата Суперлимф до настоящего времени изучены недостаточно.

Цель работы: изучение механизмов противовирусной активности комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов (препарат Суперлимф) на модели герпесвирусной инфекции in vitro.

Для достижения указанной цели были поставленны следующие задачи:

1)Разработать экспериментальную модель оценки противогерпетического действия комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов (препарат Суперлимф).

2)Оценить протективное действие Суперлимфа на неинфицированные клетки Vero.

3)Исследовать морфологические и молекулярно-биологические механизмы противовирусной активности препарата Суперлимф в экспериментальной системе клетки Vero - вирус герпеса простого (ВГП).

4)Изучить прямое действие препарата Суперлимф на вирионы ВГП-1.

5)Исследовать действие препарата на выработку цитокинов и ИЛ-12 (факторов врожденного иммунитета) в культуре стимулированных мононуклеарных клеток периферической крови больных генитальным герпесом и здоровых доноров.

Научная новизна:

Изучены механизмы противовирусного действия комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов (препарат Суперлимф) на модели герпесвирусной инфекции.

Установлено, что Суперлимф повышает устойчивость клеток Vero к заражению вирусом герпеса простого 1 и 2 типов. Протективное действие препарата прямо пропорционально его концентрации в культуре и времени взаимодействия с клетками Vero.

Впервые показано, что Суперлимф подавляет цитопатическое действие ВГП-1 и ВГП-2 в культуре клеток Vero, а противовирусная активность препарата обусловлена низкомолекулярной фракцией (1,0 - 4,0 kD), содержащей катионные противомикробные пептиды - протегрины.

Установлено, что опосредованное через клетку Vero противовирусное действие Суперлимфа связано с нарушением синтеза вирусной ДНК. Также препарат блокирует дальнейшее распространение инфекции с помощью увеличения экспрессии вирусной тимидинкиназы, за счет чего происходит нарушение проникновения вновь продуцируемых вирионов ВГП в клетку-мишень.

Впервые продемонстрировано прямое противогерпетическое действие комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов (Суперлимф), которое проявлялось в образовании вирионов, лишенных оболочки.

Препарат Суперлимф регулирует выработку ФНОа и ИЛ-12 в культуре мононуклеарных клеток больных генитальным герпесом и здоровых доноров.

Полученные результаты расширяют представления о новых механизмах противовирусного врожденного иммунитета, в частности, об участии противомикробных пептидов в прямом действии на вирионы герпеса простого. Это может служить основой для дальнейших медико-биологических исследований в области изучения механизмов противовирусного действия препарата Суперлимф.

Практическая значимость

Разработана экспериментальная модель, позволяющая оценить действие противовирусных препаратов 1) на неинфицированные клетки-мишени, 2) на репродукция вируса в клетке, 3) на вирус непосредственно.

Полученные данные о противовирусных эффектах препарата Суперлимф открывают новые возможности его использования в профилактике и комплексном лечении герпетической инфекции. Включение препарата в лечение герпетической инфекции позволило сократить продолжительность и частоту рецидивов у больных генитальным герпесом.

Внедрение результатов работы в клиническую практику

Результаты работы внедрены в схемы лечения больных генитальным герпесом на базах Курского государственного медицинского университета и Орловской областной клинической больницы.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, отражающих ее основное содержание.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 3-х глав: «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», заключения, выводов, списка литературы и приложения. Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц и 36 рисунков. Список литературы включает в себя Щ источников, из которых ^.отечественных ШЙ^иностранных.

Апробация диссертационного материала состоялась на расширенном Ученом совете ГУ НИИ вирусных препаратов им. О.Г. Анджапаридзе РАМН 6 апреля 2005 года.

Материалы диссертации были доложены и обсуждены на XI Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 19-23 апреля 2004г.), на Объединенном иммунологическом форуме (Екатеринбург, 31мая-4 июня 2004г.), на конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2730 сентября 2004г.), на Республиканской научной конференции «Иммунология репродукции» (Иваново, 11-14 апреля 2005г.), на XII Национальном Конгрессе «Человек и Лекарство» (Москва, 18-22 апреля 2005г.), на 9-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 18-22 апреля 2005г.).

Положения, выносимые на защиту:

1. Комплекс природных цитокинов и противомикробных пептидов (препарат Суперлимф) обладает протективным действием на неинфицированные клетки культуры Vero. Обработка клеток Vero препаратом защищает их от последующего заражения вирусом герпеса

2. Препарат Суперлимф угнетает цитопатическое действие герпеса простого в культуре Vero за счет снижения синтеза вирусной ДНК, следствием чего является продукция дефектных вирионов.

3. Препарат Суперлимф обладает прямым противовирусным действием, вызывая разрушение оболочки вирионов герпеса простого.

4. Противовирусный эффект препарата Суперлимф связан с низкомолекулярной фракцией (1,0-4,0 kD) катионных противомикробных пептидов - протегринов, входящей в состав препарата.

5. В культуре мононуклеарных клеток больных генитальным герпесом под действием препарата происходит снижение уровня выработки ИЛ-12 и увеличение уровня ФНОа.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В работе была использована перевиваемая культура клеток Vero, полученная из почки африканской зеленой мартышки [N. Rincho (1963)]. В НИИ вирусных препаратов РАМН культура была передана в 2001 году из Института им. Пастера (Санкт-Петербург). Линия чувствительна к вирусу герпеса простого и некоторым другим вирусам (семейств парамиксо-, рео- и т. д.).

Для инфицирования клеток Vero использовали вирусы герпеса простого 1 типа, штамм VR-3, и 2 типа, штамм MS, полученные из Национальной вирусной коллекции (Великобритания).

Определены различные условия обработки клеток препаратом, в частности, время контакта препарата Суперлимф (серия 001) с клетками Vero, его оптимальные концентрации, заражающие дозы вирусов, а также различные комбинации внесения в культуру препарата и вирусов.

Для оценки противовирусного действия комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов нами были разработаны 3 схемы проведения опыта.

Схема 1 - для оценки протективного действия препарата на клетки Vero проводили предварительная обработка клеток Vero препаратом с последующим их инфицированием вирусом герпеса.

Схема 2 - для изучения действия Суперлимфа на инфицированные клетки Vero проводили предварительное заражение клеток вирусом герпеса с последующим добавлением в культуру препарата.

Схема 3 - для исследования прямого действия препарата Суперлимф на ВГП проводили обработку вируссодержащей жидкости препаратом. В качестве контролей были использованы: -контроль клеток Vero (клетки + среда культивирования); -контроль препарата Суперлимф (клетки +100 мкг/мл препарата); -контроль вируса (клетки + ВГП в дозах 0,1-0,000001 ТЦД^кл).

Титр вируса при всех схемах проведения опытов определяли на 6-е сутки культивирования по методу Рида и Менча [Королюк М. А. и др. (2002)].

Проведено электронно-микроскопическое исследование зараженных ВГП-1 клеток Vero в присутствие препарата Суперлимф. Клетки Vero в течение 3-х ч обрабатывали Суперлимфом в концентрации 100 мкг/мл, далее заражали 1,0 ТЦЦ50/КЛ ВГП-1 и затем, через 20 ч после инфицирования, готовили пробы для их последующего исследования в электронном микроскопе. (Работа выполнена совместно с к.б.н. В.Д. Лотте, НИИ вирусных препаратов им. О.Г. Анджапаридзе РАМН).

Оценка молекулярных механизмов противогерпетического действия

препарата проводилась в двух направлениях, изучалось влияние комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов (препарат Суперлимф) на: 1) синтез вирусной ДНК и 2) экспрессию ключевых вирусных белков (ICP0 и тимидинкиназы).

Динамику синтеза вирусной ДНК изучали в инфицированных клетках через 7, 12, 18 и 24 час. после инфицирования [Херрингтон С. и др. (1999)]. На выделенной из инфицированных клеток ДНК была поставлена ПЦР [Федоров Н.А. (1996)] с праймерами на консервативный участок гена вирусной тимидинкиназы. Праймеры были подобраны с помощью компьютерной программы VectorNTI 8,0, сиквенс гена вирусной тимидинкиназы был взят из международной базы данных GeneBank.

Экспрессию вирусных белков (ICP0 и вирусной тимидинкиназы) определяли по уровню мРНК. Через 2,4,7 и 24 ч после инфицирования из клеток выделяли общую (клеточную и вирусную) РНК. Реакцию обратной транскрипции проводили с добавлением гексамеров. В результате на всем пуле мРНК синтезировалась кДНК. Контроль прохождения обратной транскрипции осуществляли с помощью актиновой системы.

Определение экспрессии ICP0 проводили в специально подобранных условиях с помощью праймеров, комплементарных мРНК ICP0 ВГП-1 согласно сиквенсу из Международной базы данных GeneBank. Для исследования

экспрессии вирусной тимидинкиназы, нами использовалась система, отработанная для определения вирусной ДНК (т.к. праймеры были подобраны на участок гена 111,23 общий для ДНК и мРНК тимидинкиназы ВГП-1).

Препаративное разделение субстанции препарата Суперлимф по молекулярным массам на колонке с сефадексом 0-501зпе проводилось совместно со с.н.с. лаборатории молекулярной иммунологии НИИ физико-химической медицины С.Н. Москвиной. В вирусологических экспериментах использовали высокомолекулярную цитокин-содержащую (12,0 - 25,0 kD) и низкомолекулярную протегрин-содержащую (1,0 - 4,0 kD) фракции препапата.

Для изучения прямого действия препарата Суперлимф на вирус герпеса проводилось электронно-микроскопическое исследование вируссодержащей жидкости, инкубированной в течение 2-х часов с препаратом Суперлимф.

Для исследования действия комплекса природных цитокинов на факторы врожденного иммунитета проводили оценку продукции цитокинов ИЛ-12 и Мононуклеарные клетки, выделенные из периферической крови больных генитальным герпесом (п=12) и здоровых доноров (п=10) с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколл-пака (р = 1,077г/см3), культивировали в концентрации 1x10е кл/мл, в течение 48 час. в присутствии стимуляторов (ЛПС, антигена ВГП-2 и Суперлимфа). После чего отбирали надосадочную жидкость для определения содержания ИЛ-12 и ФНОа с помощью коммерческих наборов ИФА (С^етшипе).

Статистический анализ проводили с помощью компьютерной статистической программы Вю8Ш. Для сравнения групп данных использовали параметрический критерий Стьюдента (1).

Результаты собственных исследований и их обсуждение

В данной работе нами изучались механизмы противовирусного действия препарата Суперлимф на модели герпесвирусной инфекции. Для этого была разработана система, позволяющая оценить протективное действие препарата

Суперлимф на незаряженные клетки, действие препарата на инфицированные клетки и прямое противовирусное действие.

Исследование действия комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов на незараженную культуру клеток Vero.

При культивировании клеток Vero в культуральной среде не определялась продукция и (Рис. 1). Полученные данные согласуются с

результатами Emeny J.M. с соавторами о генетическом дефекте в выработке интерферонов клетками Vero [Emeny J.M. et al. (1979)]. В то же время, в культуре этих клеток был выявлен высокий уровень ИЛ-12 и ТФР(3, цитокина, поддерживающего рост и пролиферацию фибробластоподобных клеток. Цитокиновый профиль клеток Vero, по-видимому, обеспечивает условия необходимые для полноценной репродукции вирусов в культуре этой клеточной линии.

Рис. 1 Продукция цитокинов интактными и зараженными ВГП клетками Vero на фоне воздействия препарата Суперлимф. По оси абсцисс - цитокины.

По оси ординат- концентрация цитокинов в культуральной среде (пкг/мл). | | - спонтанная выработка цитокинов клетками Vero

- выработка цитокинов клетками Vero после их обработки препаратом Суперлимф (100 мкг/мл) ИИ - выработка цитокинов зараженными ВГП-1 клетками Vero * - значение достоверно отличается от контроля

Было установлено, что препарат Суперлимф в дозах 50 и 100 мкг/мл не оказывает цитотоксического действия на клетки Vero и подавляет ЦПД вируса герпеса. Учитывая, что для лечения больных Суперлимф применяется в дозах от 25 до 100 мкг и на основании полученных нами результатов in vitro, его можно отнести к группе препаратов с низкой цитотоксичностью.

Для изучения протективного действия Суперлимфа на клетки Vero проводили предварительную обработку клеток препаратом. Суперлимф повышал устойчивость клеток к заражению различными дозами вируса герпеса простого 1 и 2 типов. Экспозиция клеток с препаратом Суперлимф в течение 24-х час. индуцировала значительную устойчивость клеток к последующему заражению вирусом, приводя к снижению титра вируса на 2 ^ТЦДя/СМмл (Рис. 2).

Рис 2. Зависимость величины инфекционного титра ВГП-1 и ВГП-2 от времени предварительной обработки клеток Vero препаратом Суперлимф. По оси абсцисс - вирусы; По оси ординат - титр вируса контроль вируса

| | инкубация клеток с препаратом в течение 1 ч; Ц инкубация клеток с препаратом в течение 3-х ч; Ц инкубация клеток с препаратом в течение 24-х ч;

* значение достоверно отличается от контроля (р^0,05)

Известно, что ВГП может использовать для проникновения в клетку рецептор для ФНОа, TLR, в частности TLR-3, и некоторые другие молекулы [Lehrer R. Et al. (2002)]. Цитокиновые и пептидные молекулы препарата, вероятно, взаимодействуют с этими рецепторными структурами, блокируя, тем самым, проникновение ВГП в клетку, что, в свою очередь, уменьшает его цитопатическое действие вируса.

При изучении действия препарата на инфицированные клетки Vero,

было выявлено, что Суперлимф снижал титр ВГП-1 и ВГП-2 в среднем на 1 lg, то есть в 10 раз. Для выяснения механизмов снижения ЦПД вируса герпеса простого 1 типа в культуре клеток Vero под влиянием Суперлимфа было проведено электронно-микроскопическое исследование.

Обработка клеток препаратом Суперлимф приводила к продукции клетками культуры Vero смешанной вирионной популяции, в которой не менее 90% составляли дефектные вирусные частицы, представляющие собой плотные образования различной величины и формы, в которых отсутствовали такие структурные компоненты вирионов, как нуклеоид, перинуклеоидная область и поверхностная оболочка. Многие частицы находились в состоянии деградации. Этот процесс, по нашему мнению, был связан с нарушением белковых синтезов и задержкой репликации вирусной ДНК.

Для подтверждения данного предположения возникла необходимость в изучении молекулярных механизмов противогерпетического действия препарата Суперлимф. При исследовании динамики синтеза ДНК ВГП-1 было показано, что под воздействием препарата Суперлимф синтез вирусной ДНК в инфицированных клетках Vero определялся на 6 ч позже, чем в контроле. Следовательно, можно сделать вывод, что формирование дефектных (не содержащих ДНК) вирионов при действии препарата связано с нарушением синтеза вирусной ДНК.

Вирусные белки, ICPO (infected cell protein) и тимидинкиназа, играют ключевую роль в синтетических процессах вируса герпеса простого. ICP0 связывается с белком р53 [Boutell С. Et al. (2003)], тем самым препятствует апоптозу в инфицированной клетке. Помимо этого ICP0 блокирует IRF3 и IRF7

(IFN regulated factor), тем самым, приводя к подавлению экспрессии интерферон-стимулированных генов [Lin R. Et al. (2004), Mossman K. et al. (2000)]. Вышеуказанные механизмы характеризуют 1СР0 как один из основных белков, «используемых» ВГП-1 для «ускользания» вируса от иммунных механизмов. Второй также чрезвычайно важный белок - вирусная тимидинкиназа (ТК) отвечает за экспрессию у-генов. ТК негативно регулирует экспрессию gH -гликопротеина вирусной оболочки, который принимает активное участие в проникновении вируса в клетку [Chen S. et al. (2004), Cook J. Et al. (1996)].

Изменения в экспрессии ICPO ВГП-1 не выявлены. Однако, было обнаружено достоверное увеличение экспрессии ТК в присутствие Суперлимфа (Рис. 3). Следствием этого явилась задержка экспрессии гликопротеина вирусной оболочки gH, ответственного за проникновение вируса в клетку.

Рис. 3 Электрофорез продуктов ПЦР кДНК тимидинкиназы. 1- Маркер LadderlOO (Fermentas); 2- ВГП-1 (ОД ТЦД50,кл); 3- ВГП-1 (0,01 ТЦЦ5о/Кл); 4- ВГП-1 (0,001 ТЦ^кл^; 5- ВГП-1 (0,П"ЦЦ5а/кл) +Суперлимф (10 мкг); 6- ВГП-1 (0,01 ТЦДм/Кл) +Суперлимф (10 мкг); 7- ВГП-1 (0,001 ТЦД5о/Кл) +Суперлимф (10 мкг); 8- контроль (не инфицированные клетки).

Помимо регуляции экспрессии gH, тимидинкиназа способствует активации ацикловира - химиопрепарата, широко используемого в лечении генитального герпеса [Михайленко А.А. и др. (2004)] Следовательно, индуцируемое

Суперлимфом повышение уровня ТК в клетке, ведет к более выраженному противогерпетическому действию ацикловира и его аналогов. Проведенные клинические испытания подтвердили значительную эффективность лечения генитального герпеса ацикловиром с препаратом Суперлимф относительно базисного метода лечения [Ганковская Л.В. и др. (2005)].

Противогерпетическое действие фракций препарата Суперлимф. Фракция препарата Суперлимф, содержащая цитокины, практически не влияла на цитопатическое действие ВГП-1 и ВГП-2. Низкомолекулярная фракция препарата, содержащая катионные протегрин-подобные пептиды с м.м. 1,0 — 4,0 kD активно ингибировала репродукцию вируса в культуре клеток Vero (Рис.4).

Рис. 4 Влияние низкомолекулярной фракции противомикробных пептидов на цитопатическое действие ВГП-1.

По оси абсцисс - концентрации низкомолекулярной фракции (мкг/мл). По оси ординат - титр вируса

* - значение достоверно отличается от контроля (р^0,05)

В результате масс-спектрометрии в низкомолекулярной фракции были обнаружены пептиды с молекулярной массой 1946 и 2155 Ба, относящиеся к протегринам Рв-1 и Рв-2. Протегриновая фракция дозозависимо ингибировала репродукцию ВГП-1 (Рис. 4). В концентрации 100 мкг/мл она снижала титр вируса на 1,5 1§ТЦД5о/0,1мл, а в концентрации 200 мкг/мл - на 2,0 1дТЦЦ5О/0,1мл, т.е. в 100 раз. Кроме того, наблюдали отсроченный цитопатический эффект, 16

который возникал в опыте на 24-36 ч позже, чем в контроле. Таким образом, можно предположить, что противовирусная активность препарата обусловлена протегрин-подобными молекулами, которые индуцировали выработку ФНОа клетками Vero. Известно, что ФНОа оказывает цитотоксическое действие на инфицированные клетки и обладает протективным действием на незараженные клетки Vero [Баринский И.Ф. (2004)]

Так как в состав Суперлимфа помимо цитокинов входит и фракция противомикробных пептидов, возник вопрос о возможности прямого действия Суперлимфа на вирус герпеса. С этой целью вируссодержащий материал обрабатывали препаратом, а затем инфицировали клетки Vero. Наблюдали снижение титра вируса в опыте по сравнению с контролем, в среднем на 0,8-1,0 ^ТЦД5о/0,1мл. ЦПД вируса в опытной культуре клеток проявлялось на 24-36 ч позже, и было менее выражено, чем в контроле. Соотношение полноценных вирионов к дефектным вирусным частицам (нуклеокапсидам) в вируссодержащем материале смещалось в сторону нуклеокапсидов (Рис. 5). Вероятно, действие препарата приводило к нарушению целостности оболочки вируса. Есть основания полагать, что противомикробные пептиды непосредственно участвуют в изменении структуры вируса [Howell M. (2004)].

Рис. 5 Изменение соотношения вирионов к нуклеокапсидам под воздействием препарата Суперлимф.

* - значение достоверно отличается от контроля (р^0,05)

Сравнительный анализ противогерпетического действия препарата Суперлимф и рекомбинантного ИФНа в культуре Vero показал, что оба препарата успешно ингибируют ЦПД ВГП-1. Однако механизмы их противовирусной активности различны. действует опосредованно,

блокируя репродукцию вируса в клетке за счет активации ферментов - 2'5'-олиго (А)-синтетазы и протеинкиназы, следствием чего является нарушение синтеза вирусных белков [Вотяков В.К. (1992)]. Суперлимф же, наряду с протективным действием на клетки за счет угнетения синтеза вирусной ДНК и усиления экспрессии тимидинкиназы, оказывает прямой вирус-нейтрализующий эффект, который проявляется в изменении структуры вирусной оболочки, вплоть до ее полного разрушения. Этот эффект, как уже было отмечено, связан с влиянием на вирионную популяцию низкомолекулярной протегрин-подобной фракции противовмикробных пептидов.

Препарат Суперлимф оказывает иммуномодулирующий эффект на продукцию цитокинов (ФНОа и ИЛ-12), участвующих во врожденном противовирусном иммунитете.

Ранее было показано, что Суперлимф обладает широким спектром активности по отношению к клеткам участвующим в реакциях врожденного иммунитета - макрофагам, нейтрофилам, естественным клеткам-киллерам. Цитокины, являясь важнейшим средством межклеточной коммуникации, выполняют и другие не менее важные функции, включая непосредственное участие в защите организма от патогенов бактериальной и вирусной природы. Нами было исследовано действие препарата Суперлимф, а также антигенов вируса герпеса на выработку цитокинов ФНОа и ИЛ-12 в культуре мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров и больных генитальным герпесом. Выбор данных цитокинов был не случаен. наряду

с и продуцируется уже в первые часы и даже минуты после

инфицирования, обеспечивая реализацию врожденных механизмов противовирусной защиты. ИЛ-12, напротив, вырабатывается позже, в процессе развития вирус-специфического иммунного ответа и выявляется в значительных 18

количествах преимущественно при рецидивирующей форме инфекции. ИЛ-12 индуцирует выработку ИФНу естественными клетками-киллерами и цитотоксическими Т-лимфоцитами, играет ключевую роль в направленной дифференцировке ThO-лимфоцитов в Thl-клетки [Ярилин А.А. (1999)].

Мононуклеары периферической крови доноров и больных генитальным герпесом спонтанно продуцировали не высокий, фоновый, уровень который составлял не более 20,0 пкг/мл. После стимуляции ЛПС выработка ФНОа клетками доноров и больных значительно возрастала. Стимуляция мононуклеарных клеток больных в стадии ремиссии антигенами ВГП-2 in vitro в значительной степени увеличивала выработку ФНОа (до 467,0 ±36 пкг/мл). Это можно объяснить фактом участия в активации клеток TLR-9, который взаимодействуя с неметилированной вирусной ДНК, осуществляют передачу сигналов, ведущих к экспрессии и секреции ФНОа и ИЛ-8. При рецидивирующей форме вирусной инфекции в стадии обострения было обнаружено резкое снижение способности мононуклеаров крови больных продуцировать

Герпетическая инфекция приводит к резкому, в 5-6 раз, увеличению циркулирующего в сыворотке ИЛ-12. Одновременно с этим достоверно возрастает продукция ИЛ-12 в культуре клеток крови больных. Процесс увеличения продукции ИЛ-12 в равной степени был выражен у всех больных генитальным герпесом, независимо от стадии заболевания. Суперлимфа вызывал существенное снижение выработки ИЛ-12 мононуклеарными клетками больных генитальным герпесом.

Таким образом, препарат оказывает ярко выраженный иммуномодулирующий эффект: увеличивает сниженную продукцию ФНОа и уменьшает повышенную выработку ИЛ-12 МНК.

использование Суперлимфа с целью активации механизмов врожденного противовирусного иммунитета [Ковальчук Л.В. (2005)].

ВЫВОДЫ

1. На модели герпесвирусной инфекции in vitro разработана система комплексной оценки действия препарата Суперлимф на неинфицированные клетки-мишени, на репродукцию вируса в клетке, на вирус герпеса простого непосредственно.

2. Комплекс природных цитокинов и противомикробных пептидов (препарат Суперлимф) повышает устойчивость клеток Vero к инфицированию вирусом герпеса простого 1 и 2 типов, увеличивая выработку клетками.

3. Препарат Суперлимф угнетает цитопатическое действие герпеса простого в культуре Vero за счет снижения синтеза вирусной ДНК и увеличения экспрессии вирусной тимидинкиназы, следствием чего является продукция дефектных вирионов.

4. Препарат Суперлимф обладает прямым противовирусным действием, вызывая разрушение оболочки вирионов герпеса простого и снижение его инфекционного титра.

5. Противовирусный эффект препарата Суперлимф связан с низкомолекулярной фракцией (1,0-4,0 kD) катионных противомикробных пептидов - протегринов, входящей в его состав.

6. Препарат Суперлимф оказывает иммуномодулирующий эффект на продукцию цитокинов (ФНОа и ИЛ-12), участвующих во врожденном противовирусном иммунитете. В культуре мононуклеарных клеток больных генитальным герпесом Суперлимф увеличивает сниженную продукцию ФНОа и уменьшает повышенный уровень ИЛ-12 по сравнению со здоровыми донорами.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Разработанная экспериментальная модель может быть использована для оценки противовирусного действия различных препаратов в системе герпесвирусной инфекции in vitro.

Полученные данные о протективном действии препарата Суперлимф на модели герпесвирусной инфекции позволили обосновать и применить препарат в качестве профилактического средства в лечении генитального герпеса.

Препарат Суперлимф может быть использован в комплексном лечении генитального герпеса с ацикловиром и его аналогами, т.к. показано, что Суперлимф приводит к увеличению экспрессии вирусной тимидинкиназы -фермента, который увеличивает противовирусное действие ацикловира в инфицированной клетке.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Лавров В.Ф., Баркевич ОА, Лотте В.Д., Противовирусное действие препарата Суперлимф и его фракции, содержащей противомикробные пептиды // Тезисы докл. XI Нац. Конгресса «Человек и лекарство XI», М., 2004, с. 445

2. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Лавров В.Ф., Баркевич ОА Лотте В.Д., Противогерпетическое действие комплекса природных цитокинов (Суперлимф): от механизма в клинику // Тезисы Объединенного иммунологического форума, Екатеринбург, 2004, с. 42

3. Ковальчук Л.В., Баркевич ОА, Ганковская Л.В., Лавров В.Ф. Лотте В.Д., Противогерпетический эффект комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов // «Медицинская иммунология», 2004, т. 6, №3-5, с. 234

4. Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., Лавров В.Ф., Баркевич ОА, Лотте В.Д., Долгина Е.Н., Некоторые механизмы противогерпетического действия иммуномодулирующего препарата «Суперлимф» // «Биопрепараты», 2004, №4(16), с. 18-22

5. Баркевич ОА, Ковальчук Л.В., Лавров В.Ф., Ганковская Л.В., Эбралидзе Л.К., Лотте В.Д., Изучение механизмов противогерпетического действия препарата Суперлимф // «Актуальные вопросы эпидемиологии и инфекционных болезней», Сборник научных трудов, (выпуск 7), М, 2005, с. 237-241

6. Ковальчук Л.В., Лавров В.Ф., Ганковская Л.В., Баркевич О.А, Эбралидзе Л.К., Подавление цитопатического действия вируса герпеса простого 1 типа комплексом природных цитокинов (препаратом Суперлимф) in vitro // ЖМЭИ, 2005, №1, с.57-60

7. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Лавров В.Ф., Баркевич О.А, Интерферон-независимые противовирусные эффекты препарата Суперлимф // Тезисы докл. Республиканской научной конференции «Иммунология репродукции», Иваново, 2005, с.241

8. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Юдина С.М., Лавров В.Ф., Баркевич ОА и др., Суперлимф - новый иммуномодулятор с прямым противовирусным действием. Опыт клинического применения в комплексном лечении герпетической инфекции // Russian Journal of Immunology, 2005, v.9, sup. 2, p.37-42

9. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Лавров В.Ф., Баркевич ОА, Лотте В.Д., Долгина Е.Н., Суперлимф - новый иммуномодулятор с прямым и опосредованным противогерпетическим действием // Тезисы докл. Национального Конгресса «Человек и Лекарство», М, 2005, с. 671

10. Баркевич О.А., Лавров В.Ф., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Лотте В.Д., Исследование механизмов противогерпетического действия комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов in vitro // Тезисы докл. 9-ой международной пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века», 2005, с. 133

Тираж 1GG экз

07 МАЙ 2005

Оглавление диссертации Баркевич, Оксана Анатольевна :: 2005 :: Москва

СПИСОК

СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Часть1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1.1. Классификация вирусов герпеса. Общая характеристика вируса герпеса простого и его репродукция в клетке.

1.1.1. Особенности строения вирионов ВГП.

1.1.2. Репродукция вируса герпеса простого в клетке.

Глава 1.2. Вронеденный иммунитет при герпетической инфекции.

1.2.1.Механизмы противогерпетического врожденного иммунного ответа.

1.2.2. Противомикробные пептиды.

Глава 1.3. Генитальный герпес: клиника и лечение.

1.3.1. Возникновение, развитие и течение герпетической инфекции.

1.3.2. Противогерпетические препараты.

1.3.3. Суперлимф - иммуномодулирующий препарат с антимикробным и противовирусным действием.

Часть II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Перевиваемая линия клеток Vero.

2.2. Вирусы герпеса простого 1 и 2 типов.

2.3. Характеристика препарата Суперлимф и его фракций.

2.4. Метод электронной микроскопии.

2.5. Выделение из клеток Vero общей ДНК.

2.6. Выделение из клеток Vero общей РНК.

2.7. Реакция обратной транскрипции.

2.8. Полимеразная цепная реакция.

2.9. Выделение мононуклеарных клеток из периферической крови человека:.

2.10. Определение содержания цитокинов в культурах мононуклеарных клеток методом иммуноферментного анализа.

2.11. Статистическая обработка результатов.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1.Разработка экспериментальной модели для оценки противогерпетического действия препарата Су пер лимф.

3.1.1. Оценка действия препарата Суперлимф на клетки Vero.

3.1.2. Влияние препарата Суперлимф на цитопатическое действие вируса герпеса простого в культуре клеток Vero.

3.2. Механизмы противогерпетического действия препарата Суперлимф в культуре клеток Vero.

3.2.1. Электронно-микроскопические исследования действия препарата Суперлимф на репродукцию ВГП-1 в культуре клеток Vero.

3.2.2. Изменение репликации вирусной ДНК в клетках Vero, обработанных препаратом Суперлимф.

3.2.3. Изучение изменения уровня экспрессии вирусных белков (ICP0 и тимидинкиназы) при действии препарата Суперлимф.

3.2.4. Оценка влияния отдельных фракций препарата на цитопатическое действие ВГП-1 и ВГП-2.

3.2.5. Сравнительная характеристика противовирусного действия рекомбинантного ИФНа и препарата Суперлимф.

3.3. Исследование прямого действия препарата Суперлимф на вирионы ВГП-1.

3.4. Изучение влияния препарата Суперлимф на выработку ИЛ-12 и ФНОа мононуклеарными клетками периферической крови больных генитальным герпесом.

Введение диссертации по теме "Аллергология и иммулология", Баркевич, Оксана Анатольевна, автореферат

Актуальность проблемы

Механизмы врожденного иммунного ответа при большинстве вирусных инфекций характеризуются способностью к быстрому индуцированию, относительно низкой специфичностью и состоят из трех основных фаз. В первой из них вирус подвергается атаке комплемента, природных антител и противомикробных пептидов. Во второй фазе в действие включаются интерфероны 1 типа (а и (3), секретируемые инфицированными эпителиальными клетками. Наконец, в третьей фазе борьбу с вирусом продолжают быстро мобилизованные клеточные эффекторы - нейтрофилы, макрофаги и естественные киллеры и секретируемые ими цитокины (77).

В связи с этим лечение герпетической инфекции основано на следующих подходах: проведении специфического противовирусного лечения химиотерапевтическими препаратами, блокирующими репликацию вируса (ацикловир, валтрекс и др.);

- осуществлении заместительной терапии препаратами интерферонового ряда и индукторами интерферонов;

- применении иммуностимуляторов, активирующих реакции врожденного и адаптивного иммунитета (12, 35).

В последние годы ведется активный поиск иммунотропных препаратов с прямым противовирусным действием. В середине 80-х годов прошлого столетия Д.Лерером и В.Н.Кокряковым был открыт новый класс низкомолекулярных катионных пептидов, обладающих противомикробной активностью. Так выяснилось, что эндогенные пептиды играют значительную роль в защите организма при бактериальной и вирусной патологии, подавляют рост грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, грибов и некоторых вирусов. Их по праву называют природными или эндогенными антибиотиками (22, 116). В настоящее время ведутся работы по созданию новых лекарственных препаратов на основе противомикробных пептидов.

На кафедре иммунологии РГМУ разработан оригинальный препарат Суперлимф - иммуномодулятор с прямым противомикробным действием. По своему составу Суперлимф - это сбалансированный комплекс природных цитокинов с активностями интерлейкина-1(3 (ИЛ-1(3), интерлейкина-6 (ИЛ-6), фактора некроза опухоли а (ФНОа), миграцию ингибирующего фактора (МИФ), трансформирующих факторов роста (31 (ТФР|31) и |32 (ТФР|32) и противомикробных протегрин-подобных пептидов (20, 21).

Суперлимф обладает широким спектром влияния на клетки, участвующие в реакциях врожденного иммунитета: макрофаги, нейтрофилы и естественные киллеры. Препарат активирует фагоцитоз, выработку ИЛ-1(3, ФНОа, ИФНа и ИФНР моноцитами, индуцирует противоопухолевую активность макрофагов, способствует гибели внутриклеточных паразитов, регулирует миграцию лейкоцитов. Вследствие активации клеток макрофагально-моноцитарного ряда под влиянием Суперлимфа включаются механизмы адаптивного клеточного и гуморального иммунного ответа (18).

В настоящее время активно изучаются антибактериальные и противовирусные эффекты Суперлимфа. Установлено, что препарат, помимо иммуностимулирующего действия, способен непосредственно подавлять рост и размножение таких микроорганизмов, как St. aureus и Е. coli (20).

В опытах с культурой клеток эндотелия пупочной вены человека, инфицированной ВГП-1, была показана противовирусная активность Суперлимфа (46). Продемонстрирована высокая эффективность препарата в комплексном лечении различных видов герпетической инфекции, включая генитальный герпес, офтальмогерпес и др. (19, 36). Вместе с тем, механизмы противогерпетического действия препарата Суперлимф до настоящего времени изучены недостаточно.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1) Разработать экспериментальную модель оценки противогерпетического действия комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов (препарат Суперлимф).

2) Оценить протективное действие Суперлимфа на неинфицированные клетки Vero.

3) Исследовать морфологические и молекулярно-биологические механизмы противовирусной активности препарата Суперлимф в экспериментальной системе клетки Vero - вирус герпеса простого (ВГП).

4) Изучить прямое действие препарата Суперлимф на вирионы ВГП-1.

5) Исследовать действие препарата на выработку цитокинов ФНОа и ИЛ-12 (факторов врожденного иммунитета) в культуре стимулированных мононуклеарных клеток периферической крови больных генитальным герпесом и здоровых доноров.

Научная новизна:

Впервые показано, что Суперлимф подавляет цитопатическое действие ВГП-1 и ВГП-2 в культуре клеток Vero. Противовирусная активность препарата обусловлена низкомолекулярной фракцией Суперлимфа (1,0 - 4,0 lcD), содержащей катионные противомикробные пептиды - протегрины.

Установлено, что опосредованное через клетку Vero противовирусное действие Суперлимфа связано с нарушением синтеза вирусной ДНК и увеличением экспрессии вирусной тимидинкиназы, за счет чего происходит образование дефектных вирионов герпеса простого.

Практическая значимость

Разработана экспериментальная модель, позволяющая оценить действие противовирусных препаратов 1) на неинфицированные клетки-мишени, 2) на репродукцию вируса в клетке, 3) непосредственно на вирус.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение диссертационного исследования на тему "Противовирусные эффекты комплекса природных цитокинов (препарат "Суперлимф") на модели герпес-вирусной инфекции in vitro"

ВЫВОДЫ:

1. На модели герпесвируеной инфекции in vitro разработана система комплексной оценки действия препарата Суперлимф на неинфицированные клетки-мишени, на репродукцию вируса в клетке, на вирус герпеса непосредственно.

3. Препарат Суперлимф угнетает цитопатическое действие герпеса простого в культуре клеток Vero за счет снижения синтеза вирусной ДНК и усиления экспрессии вирусной тимидинкиназы, следствием чего является продукция дефектных вирионов.

4. Комплекс природных цитокинов и противомикробных пептидов (препарат Суперлимф) обладает прямым противовирусным действием, вызывая разрушение вирусной оболочки вирионов герпеса простого и снижение его инфекционного титра.

5. Противовирусный эффект препарата Суперлимф связан с низкомолекулярной фракцией (1,0 - 4,0 kD) катионных противомикробных пептидов - протегринов, входящих в его состав.

6. Препарат Суперлимф оказывает иммуномодулирующий эффект на продукцию цитокинов (ФНОа и ИЛ-12), участвующих во врожденном противовирусном иммунитете. В культуре мононуклеарных клеток больных генитальным герпесом Суперлимф повышает сниженную продукцию ФНОа и уменьшая повышенный уровень ИЛ-12 по сравнению со здоровыми донорами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В настоящее время герпетическая инфекция является одной из наиболее распространенных вирусных болезней человека. Вторичный иммунодефицит, развивающийся при этом заболевании, характеризуется избирательным поражением клеток макрофагально-моноцитарного ряда, дефектом в системе интерферонов и других цитокинов. В связи с этим в комплексной терапии герпетической инфекции, наряду с противовирусными препаратами, применяются иммуномодуляторы - ронколейкин, беталейкин, полиоксидоний, ликопид и др. (12). Постоянно ведется поиск новых лекарственных средств, которые, обладая противовирусной активностью, одновременно могли бы стимулировать иммунный ответ к вирусу герпеса.

В середине 80-х годов прошлого столетия Д.Лерером и В.Н.Кокряковым был открыт новый класс катионных низкомолекулярных пептидов, обладающих противомикробной активностью. Авторы показали, что эти пептиды, являются важным компонентом врожденного иммунитета, играют существенную роль в защите организма от патогенов, подавляя рост микроорганизмов, грибов и вирусов. Данный класс пептидов многие исследователи относят к природным или эндогенным антибиотикам (22, 116). В настоящее время ведутся работы по созданию на основе противомикробных пептидов новых лекарственных препаратов.

Оригинальный иммуномодулятор Суперлимф (ФСП 42-0185-0573-00. Р№ 00516/01-20001) представляет собой комплекс природных цитокинов и протегрин-подобных противомикробных пептидов, который получают из культур лейкоцитов периферической крови свиней.

Установлено, что препарат Суперлимф, наряду с активировацией механизмов врожденного иммунитета, обладает прямым противомикробным действием. Продемонстрирована его эффективность при лечении больных острыми и хроническими воспалительными заболеваниями бактериальной и вирусной этиологии (20, 21). Тем не менее, механизмы противовирусного действия препарата, в том числе по отношению к вирусу герпеса простого, до настоящего времени были практически не известны.

В данной работе нами изучались клеточные и молекулярные механизмы противовирусного действия препарата Суперлимф на модели герпесвирусной инфекции.

Первоочередной задачей исследования явилась разработка экспериментальной системы, позволяющей оценить протективное действие препарата Суперлимф на незараженные клетки, действие препарата на инфицированные клетки и прямое противовирусное действие.

С этой целью в работе использовали перевиваемую культуру клеток Vero, которая широко применяется исследователями для оценки ЦПД вируса герпеса простого и других вирусов (126, 137, 140).

Для изучения механизма действия комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов на культуру клеток Vero был исследован спектр цитокинов, секретируемых инфицированной и неинфицированной культурой спонтанно, и под воздействием препарата Суперлимф.

Известно, что клеточная линия Vero имеет генетический дефект в выработке интерферонов (81). Как показали наши исследования, клетки Vero не продуцировали цитокинов ИФНу и ФНОа, угнетающих репродукцию вируса (Рис. 12). В то же время, в культуре этих клеток был выявлен высокий уровень ИЛ-12 и ТФРР - цитокина, поддерживающего рост и пролиферацию фибробластоподобных клеток. Цитокиновый профиль клеток Vero, по-видимому, обеспечивает условия необходимые для полноценной репродукции вирусов в культуре этой клеточной линии.

Спектр цитокинов, секретируемых спонтанно, практически не отличался от спектра цитокинов, продуцируемых инфицированными ВГП-1 клетками. Препарат Суперлимф приводил к небольшому снижению уровней ИЛ-12 и ТФРр.

Вероятно, отсутствие цитокинов, обладающих противовирусной активностью, может способствовать полноценной репродукции вирусов в клетках и служить объяснением широкого использования перевиваемых клеток Vero в качестве одной из наиболее чувствительных клеточных линий, применяемых при изучении противогерпетического действия различных препаратов.

В наших опытах, для заражения клеток Vero использовали ВГП-1 (штамм VR-3) - возбудитель лабиального герпеса, и ВГП-2 (штамм MS) - один из основных этиологических факторов герпеса гениталий.

Были определены оптимальные условия (схемы) взаимодействия клеток с Суперлимфом, в частности, время контакта, концентрация препарата, заражающие дозы вируса, последовательность внесения препарата и вируса в культуру.

Для изучения протективного противовирусного действия Суперлимфа проводили предварительную (до заражения вирусом) обработку клеток Vero препаратом. В результате было установлено, что Суперлимф повышает устойчивость клеток к заражению различными дозами вируса герпеса простого 1 и 2 типов. Степень противовирусной активности препарата при этом зависела от его концентрации в культуральной среде, а также от времени взаимодействия клеток с препаратом. Экспозиция с Суперлимфом в течение одних суток индуцировала значительную устойчивость клеток к последующему заражению вирусом, 3-х часовая инкубация вызывала менее выраженный противовирусный эффект.

Не исключено, что молекулы входящих в состав препарата белков могут конкурировать за «вирусспецифические» рецепторы на клетках-мишенях, участвующие в прикреплении и проникновении вируса в клетку. Известно, что ВГП может использовать в качестве прикрепительных структур на клетке рецептор для ФНОа, TLR, в частности TLR-3, и некоторые другие молекулы (107). Цитокиновые и пептидные молекулы препарата, вероятно, взаимодействуют с этими рецепторными структурами, блокируя, тем самым, проникновение вируса в клетку, что, в свою очередь, выражается в уменьшении его цитопатического эффекта.

В свою очередь, входящий в состав Суперлимфа ФНОа, также способен вызывать вируснейтрализующий эффект. Так, было показано, что обработка клеток экзогенным ФНОа в течение одних суток оказалась вполне достаточной для их защиты от цитопатического действия вируса простого герпеса 2 типа (2). Известно, что ФНОа, как и ИФНр, блокирует ранние фазы репродукции вируса герпеса простого и формирование структурных вирусных белков. Этим можно объяснить снижение титра вирусного потомства, наблюдаемое в случае предварительной, до заражения вирусом, обработки клеток препаратом Суперлимф. Как показано в наших экспериментах, культивирование клеток Vero с препаратом в течение одних суток приводило к уменьшению продукции вирусного потомства на 2,0 ^ТЦД50/0,1мл, т.е. в 100 раз (Табл. 3).

При изучении действия препарата на инфицированные клетки Vero, было выявлено, что Суперлимф снижал титр ВГП-1 и ВГП-2 в среднем на 1 ^ТЦД5о/0,1мл, то есть в 10 раз. Для выяснения механизмов снижения ЦПД вируса герпеса простого 1 типа в культуре клеток Vero под влиянием Суперлимфа было проведено электронно-микроскопическое исследование.

Для выяснения механизмов снижения ЦПД вируса герпеса простого 1 типа под влиянием Суперлимфа было проведено электронно-микроскопическое исследование. Установлено, что обработка клеток Суперлимфом приводила к продукции клетками смешанной вирионной популяции, в которой не менее 90% составляли дефектные вирусные частицы, представляющие собой плотные образования различной величины и формы, в которых отсутствовали такие структурные компоненты вирионов, как нуклеоид, перинуклеоидная область и поверхностная оболочка. Многие частицы находились в состоянии деградации (Рис. 21). Этот процесс, по нашему мнению, был связан с нарушением белковых синтезов и задержкой репликации вируса. Для подтверждения данного предположения возникла необходимость в изучении механизмов образования дефектных вирионов на молекулярном уровне и была разработана адекватная система детекции вирусной ДНК. При исследовании динамики синтеза ДНК ВГП-1 было показано, что под воздействием препарата синтез вирусной ДНК в инфицированных клетках Vero определялся на 6 ч позже, чем в контроле. Следовательно, можно сделать вывод, что формирование дефектных (не содержащих ДНК) вирионов происходит вследствие нарушения синтетических процессов в клетках, в том числе в результате нарушения синтеза вирусной ДНК, возникающего, в свою очередь, под влиянием Суперлимфа.

Вирусные белки, ICPO и тимидинкиназа, как известно, играют ключевую роль в синтетических процессах. Так, ICPO связывается с белком р53 (58), тем самым, препятствуя инфицированной вирусом клетке «уйти» в апоптоз. Недавно описана роль белка ICPO в блокировке IRF3 и IRF7, которая приводит к подавлению экспрессии интерферон-стимулированных генов (118, 136). Вышеуказанные механизмы характеризуют белок ICPO как один из основных белков, «используемых» ВГП-1 для «ускользания» вируса от иммунных механизмов. Второй также чрезвычайно важный белок - вирусная тимидинкиназа (ТК) отвечает за экспрессию у-генов. ТК негативно регулирует экспрессию gH - гликопротеина вирусной оболочки, который способствует эндоцитозу вирусной частицы (67, 70, 147).

Нам не удалось выявить изменений в экспрессии ICP0 ВГП-1, которые могли бы возникнуть в результате воздействия Суперлимфа. Однако, было обнаружено достоверное, индуцированное препаратом, увеличение экспрессии ТК. Можно полагать, что следствием этого явилась задержка экспрессии гликопротеина вирусной оболочки gH, и, таким образом, нарушился процесс инфицирования вновь синтезированным вирусом клеток-мишеней. Это, возможно, является еще одним из защитных механизмов влияния препарата, ограничивающим поражение вирусом окружающих зараженную клетку, но еще не инфицированных клеточных элементов.

Помимо регуляции экспрессии gH, тимидинкиназа способствует реализации противогерпетических механизмов ацикловира - химиопрепарата, широко используемого в лечении генитального герпеса (33) Следовательно, индуцируемое Суперлимфом повышение уровня ТК' в клетке, ведет к более выраженному вируснейтрализующему эффекту ацикловира и, вероятно, его аналогов. Проведенные клинические испытания включали группу больных, для лечения которых использовали ацикловир в сочетании с Суперлимфом. В этой группе число рецидивов генитального герпеса сокращалось в 2,5 раза по сравнению с контрольной группой пациентов, которых лечили только ацикловиром. В частности, достоверно уменьшалась продолжительность рецидива заболевания и интенсивность его клинических проявлений (16).

Для выявления компоненты (фракции) препарата Суперлимф, обладающей наиболее высокой противовирусной активностью, комплекс природных цитокинов и противомикробных пептидов методом гель-хроматографии был разделен на цитокин-содержащую (12000 - 25000 D) и протегрин-содержащую (1000 - 4000 D) фракции (Рис. 27).

Фракция препарата Суперлимф, содержащая цитокины, практически не влияла на цитопатическое действие ВГП-1 и ВГП-2 (Рис. 28). Выделенная в процессе гель-фильтрации фракция низкомолекулярных пептидов с м.м. 10004000 Da, напротив, активно ингибировала репродукцию вируса (Рис. 29). В связи с тем, что препарат Суперлимф получают из стимулированных культур лейкоцитов периферической крови свиней, которые являются источником катионных противомикробных пептидов, т.н. протегринов, можно предположить, что его противовирусная активность обусловлена этими протегрин-подобными молекулами. Для подтверждения данного предположения, полученная нами низкомолекулярная фракция пептидов была охарактеризована методом масс-спектрометрии. В результате в ней были обнаружены пептиды с молекулярной массой 1946 и 2155 Da, относящиеся к протегринам PG-1 и PG-2. Протегриновая фракция дозозависимо ингибировала репродукцию ВГП-1. В концентрации 100 мкг/мл она снижала титр вируса на 1,5 1§ТЦД5о/0,1мл, а в концентрации 200 мкг/мл - на 2,0 ^ТЦД5о/0,1мл, т.е. в 100 раз. Кроме того, наблюдали отсроченный цитопатический эффект, который возникал в опыте на 24-36 ч позже, чем в контроле.

В последние годы появились работы, описывающие прямое, не опосредуемое клеточными механизмами, действие пептидов на вирус. Eagl М et al. (78) продемонстрировали противогерпетический (анти-ВГП-1) эффект, вызываемый противомикробными лизин-обогащенными синтетическими пептидами. Авторы указывают на прямое действие пептидов на вирионы (102', 173).

Так как в состав Суперлимфа помимо цитокинов входит и фракция противомикробных пептидов, возник вопрос о возможности прямого действия Суперлимфа на вирус герпеса. Проверяя это предположение, вируссодержащий материал обрабатывали препаратом, а затем, обработанный таким образом вирус, использовали для инфицирования клеток Vero. Наблюдали снижение титра вируса в опыте по сравнению с контролем, в среднем на 0,8-1,0 ^ТЦД5о/0,1мл. ЦПД вируса в опытной культуре клеток проявлялось на 24-36 ч позже, и было менее выражено, чем в контроле. Соотношение полноценных вирионов к дефектным вирусным частицам (нуклеокапсидам) в вируссодержащем материале смещалось в сторону нуклеокапсидов. Вероятно, действие препарата приводило к нарушению целостности оболочки вируса. Есть основания полагать, что противомикробные пептиды непосредственно участвуют в изменении структуры вируса (102).

Таким образом, можно заключить, что механизмы влияния Суперлимфа на вирус герпеса носят многонаправленный характер: во-первых, препарат осуществляет защиту клеток от цитопатического действия вирусов герпеса, стимулируя в них синтез ФНОа, во-вторых, инициирует молекулярные механизмы подавления репродукции вируса, угнетает в зараженных клетках репликацию вирусной ДИК и стимулирует экспрессию вирусной тимидинкиназы. в-третьих, действует непосредственно на отдельные вирусные частицы, нарушая целостность вирусной оболочки.

Следует отметить, что применение препарата с профилактической целью (за одни сутки до инфицирования) более эффективно, чем при его использовании после заражения культуры вирусом.

Сравнительный анализ противогерпетического действия препарата Суперлимф и рекомбинантного ИФНа в культуре Vero показал, что оба препарата ингибируют ЦПД ВГП-1. Однако механизмы их противовирусной активности различны. рИФНа действует опосредованно, блокируя репродукцию вируса в клетке за счет активации ферментов - 2'5'-олиго (А)-синтетазы и протеинкиназы, следствием чего является нарушение синтеза вирусных белков (6). Суперлимф же, наряду с протективным действием на клетки Vero, угнетает синтез вирусной ДЕК и оказывает прямой противогерпетический эффект, который проявляется в изменении структуры вирусной оболочки, вплоть до ее полного разрушения. Этот эффект, как уже было отмечено, связан с влиянием на вирионную популяцию низкомолекулярной протегрин-подобной фракции противомикробных пептидов.

Ранее было показано, что Суперлимф обладает широким спектром активности по отношению к клеткам участвующим в реакциях врожденного иммунитета - макрофагам, нейтрофилам, естественным клеткам-киллерам. Препарат активирует фагоцитоз, выработку ряда цитокинов моноцитами, индуцирует противоопухолевую активность макрофагов, вызывает гибель внутриклеточных паразитов, регулирует процесс миграции лейкоцитов. Индуцированная Суперлимфом активация системы клеток макрофагально-моноцитарного ряда готовит «почву» для реализации, опосредуемых лимфоцитами, механизмов адаптивного иммунного ответа (77).

Цитокины, являясь важнейшим средством межклеточной коммуникации, выполняют и другие не менее важные функции, включая непосредственное участие в защите организма от патогенов бактериальной и вирусной природы. Нами было исследовано действие препарата Суперлимф, а также антигенов вируса герпеса на выработку цитокинов ФНОа и ИЛ-12 в культуре мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров И' больных генитальным герпесом. Выбор данных цитокинов был не случаен. ФНОа, наряду с ИФНа и ИФН(3, продуцируется уже в первые часы и даже минуты после инфицирования, обеспечивая реализацию врожденных механизмов противовирусной защиты. ИЛ-12, напротив, вырабатывается позже, в процессе развития вирус специфического иммунного ответа и выявляется в значительных количествах преимущественно при рецидивирующей форме инфекции. ИЛ-12 индуцирует выработку ИФНу естественными киллерами и цитотоксическими Т-лимфоцитами, играет ключевую роль в направленной дифференцировке ThO-лимфоцитов в Thl-клетки (33).

Мононуклеарные клетки периферической крови доноров и больных генитальным герпесом спонтанно продуцировали невысокий, фоновый, уровень ФНОа. После стимуляции ЛПС выработка ФНОа клетками доноров и больных значительно возрастала. Стимуляция мононуклеарных клеток больных в стадии ремиссии антигенами ВГП-2 in vitro в значительной степени увеличивала выработку ФНОа (до 467,0 пкг/мл). Такой подъем можно объяснить фактом участия в активации клеток TLR-3, который, взаимодействуя с вирусными антигенами, осуществляют передачу сигналов, ведущих к экспрессии и секреции ФНОа, ИЛ-6 и ИЛ-8 (17, 47). При рецидивирующей форме вирусной инфекции в стадии обострения было обнаружено резкое снижение способности мононуклеаров крови больных продуцировать ФНОа.

Обработка мононуклеарных клеток больных, как в стадии ремиссии, так и в стадии обострения Суперлимфом значительно, в несколько раз, увеличивала продукцию ФНОа.

Необходимо отметить, что мононуклеары здоровых доноров спонтанно продуцировали высокий уровень ИЛ-12 в сравнении с ФНОа. В сыворотке крови у этих лиц, напротив, определялись низкие концентрации ИЛ-12.

Герпетическая инфекция приводит к резкому, в 5-6 раз, увеличению циркулирующего в сыворотке ИЛ-12. Одновременно с этим достоверно возрастает продукция ИЛ-12 в культуре клеток крови больных (3). Процесс увеличения продукции ИЛ-12 в равной степени был выражен у всех больных генитальным герпесом, независимо от стадии заболевания. Статистически значимых различий у пациентов с обострением болезни и в состоянии ремиссии установлено не было. Применение для лечения таких больных Суперлимфа приводило к существенному снижению концентрации ИЛ-12.

Таким образом: препарат оказывает ярко выраженный иммуномодулирующий эффект, увеличивает сниженный вследствие заболевания уровень продукции ФНОа МНК и снижает повышенную выработку клетками ИЛ-12, тем самым включая механизмы врожденного противовирусного иммунитета.

На основании полученных нами данных были разработаны эффективные схемы лечения генитального герпеса, включающие наряду с применением химиотерапевтических препаратов, блокирующих репликацию вируса, использование Суперлимфа с целью активации механизмов врожденной противовирусной резистентности (16, 36).

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2005 года, Баркевич, Оксана Анатольевна

1. Биргер М.О., Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования// «Медицина», 1982

2. Баринский И.Ф., Каспаров А.А., Лазаренко А.А. и др., Терапевтические убитые вакцины как средство иммунокоррекции при хронических вирусных инфекциях// 2003, Иммунология, Т. 24, №6, с. 356-359.

3. Баринский И.Ф., Шубладзе А.К., Каспаров А.А. и др., Герпес: этиология, диагностика, лечение// Москва «Медицина», 1986.

4. Борисенко К.К., Генитальный герпес, Кн. Неизвестная эпидемия: герпес// Смоленск, 1997, с. 75-83.

5. Вотяков В.К., Генерализованная герпетическая инфекция: факты и концепция//Минск «Наука:техника», 1992

6. Ганковская Л.В., Иммуноцитокины: регуляция функции макрофагов, локальная иммунокоррекция// Автореф. док. дис., М., 1993.

7. Гланц Стентон, Медико-биологическая статистика, «Практика», Москва, 1999

8. Егорова В.Н., Попович A.M., Ронколейкин в комплексном лечении инфекционных заболеваний// СПб «Альтернативная полиграфия»

9. Ершов Ф.И., Система интерферонов в норме и при патологии// М., 1996, 97с.

10. Ершов Ф.И., Коваленко А.Л., Романцов М.Г. и др., Герпетическая инфекция: вопросы патогенеза, методические подходы к терапии// М., 1997, с. 4-87.

11. Ершов Ф.И., Оспельникова Т.П., Современный арсенал антигерпетических лекарственных средств// Инфекции и антимикробная терапия, 2001, т.З, №4,

12. Зарубаев В.В., Сухинин В.П., Слита А.В., Влияние циклоферона на морфогенез и репродукцию вируса простого герпеса 1 типа в культуре клеток Vero// НИИ гриппа РАМН, Санкт-Петербург.

13. Исакова В.А., Циклоферон в клинической практике// Санкт-Петербург, «Интермедика», 2002

14. Кицак В.Я., Успехи молекулярной биологии герпесвирусов и перспективы решения прикладных задач диагностики, терапии, эпиделиологии и профилактики герпесвирусных инфекционных болезней// М., 1997, Вып. 2, с.294-298.

15. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Хорева M.B. и др., Система цитокинов, современные методы иммунного анализа// М., 2001

16. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Иммуноцитокины и локальная иммунокоррекция// Иммунология, 1995, №1, стр. 4-7.

17. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Юдина С.М. и др., Суперлимф в комплексном лечении заболеваний урогенитального тракта// М., 2003, с. 157

18. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Мороз А.Ф., Аведова Т.А., Левченко

19. B.А., Иммуномодулятор с противомикробной активностью// Вестник РГМУ, 2003, №4/30/, с.28-33

20. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Мороз А.Ф., Аведова Т.А., Москвина

21. C.Н., Противомикробные пептиды иммунной системы: клинические аспекты// Аллергология и иммунология, 2003, том 4 №2, стр. 20-26

22. Кокряков В.Н., Биология антибиотиков животного происхождения// Монография, Наука, С-П, 1999, с. 29-32

23. Коломиец А.Г., Вотяков В.К., Бикбулатов P.M., Генерализованная герпетическая инфекция: факты и концепция// М., 1992, с. 103

24. Королюк М. А., Сбойчакова В. Б. (ред.), Медицинская вирусология// Санкт-Петербург ЭЛБИ-СПб, 2002, стр. 63-68.

25. Кулагин В.И., Никитина Е.Б., Климова P.P. и др., Опыт лечения больных рецидивирующим герпесом с использованием бета-лейкина, эпигена и куриозина// Сб. научных работ «Актуальные проблемы дерматологии и венерологии», М., 2000, с. 107

26. Лавров В.Ф., Кузин С.Н. Вирус герпеса, ассоциированный с саркомой Капоши: патогенетические и эпидемиологические аспекты// Эпидемиология и вакцинопрофилактика, 2004, №1, с. 28-32

27. Лавров В.Ф., Кузин С.Н. Вирус герпеса человека 6-го типа и ассоциированные с ним заболевания детей и взрослых// Эпидемиология и вакцинопрофилактика, 2003, №6, с. 7-10

28. Лацис Р.В., Культивирование эукариотических клеток// 2000, М., 24с.

29. Малиновская В.В. и др., Виферон// Москва, 2004

30. Маниатис Т. и др., Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование.//М., «Мир», 1984

31. Мезенцева М.В., Щербенко В.Э., Наровлянский А.Н. и др., Особенности продукции интерферонов и цитокинов при генитальном герпесе// Вопросы Вирусологии, 2003, 49 (6), с.33-36.

32. Мирошник О.А., Редькин Ю.В., Иммуномодуляторы в России// Справочник, Омск, 2004, 342с.

33. Михайленко А. А., Базанов Г. А., Покровский В.И. и др., Профилактическая иммунология// Москва, 2004

34. Назаров П.Г., Врожденный иммунитет и защита от инфекции// Russian Journal of Immunology, 2005, v. 9, sup. 2, p. 51-54

35. Петров P.B., Хаитов P.M., Некрасов A.B., Полиоксидоний -иммуномодулятор последнего поколения, итоги трехлетнего клинического применения// Аллергия, астма и клиническая иммунология, 1999, № 3, с. 3-6

36. Сакун Н.Ю., Манухин И.Б., Ковальчук JI.B., Эффективность комплекса природных цитокинов в лечении генитального герпеса// Аллергология и иммунология, 2000, т.1, №2, с.97

37. Самгин М.А., Халдин А.А, Простой герпес. Дерматологические аспекты// М. «МЕДпресс-информ», 2002

38. Семенов Б.Ф., Каулен Д.Р., Баландин И.Г., Клеточные и молекулярные основы противовирусного иммунитета//М., изд. «Медицина», 1982, 238с.

39. Сингер М, Берг П., Гены и геномы// М., изд «Мир», 1998, 2т.

40. Сухих Г.Т., Ванько Л.В., Кулаков В.И., Иммунитет и генитальный герпес// Н.Новгород-Москва, 1997.

41. Федоров Н.А., Суханов Ю.С., Асади Мобахан А.Х. и др., Полимеразная цепная реакция (ПЦР) // Москва, 1996

42. Фрейдлин И. С., Цитокины и межклеточные контакты в противоинфекционной защите организма// Соросовский образовательный журнал, 1996, №7, 19-25.

43. Филдс Б, Найпа Д, Вирусология// 1989, М «Мир», Зт.

44. Херрингтон С., Макги Дж., Молекулярная клиническая диагностика. Методы// М. изд. «Мир», 1999

45. Щегловитова О.Н., Максянина Е.В., Спектр цитокинов, продуцируемых лейкоцитами крови при инфекции вирусом простого герпеса типа 1// Вопросы вирусологии, 2004, 49(4), с. 39-43.

46. Щегловитова О.Н., Романов Р.А., Максянина Е.В., Регуляция цитокинами репродукции ВПГ-1 в эндотелии сосудов in vitro и в организме больных// Аллергология и иммунология, 2000, т.1, №2, с. 131

47. Ярилин А.А. Основы иммунологии// М., «Медицина», 1999

48. Agerberth В, Lee JY, Bergman Т et al., Amino acid sequence of PR-39// Eur J Biochem, 1991, 202 (3), p. 849-854.

49. Albiol Matanic VC, Castilla V, Antiviral activity of antimicrobial cationic peptides against virus and herpes simplex virus// Int J Antimicrob Agmts, 2004, Apr, 23 (4), p. 382-389.

50. Al-Khatib K, Campbell IL, Carr DJ, Resistance to ocular herpes simplex virus type 1 infection in IL-12 transgenic mice// J Neuroimmunol., 2002, Nov, 132 (1-2), p.41-48.

51. Amitabh V. Nimonkar and Paul E. Boehmer, On the mechanism of strand assimilation by the herpes simplex virus type-1 single-strand DNA-binding protein (ICP8)//Nucleic Acids Research, 2003, v. 31, N. 18, p. 5275-5281

52. Ashkar AA, Yao XD, Gill N Toll-like receptor (TLR)-3, but not TLR4, agonist protects against genital herpes infection in the absence of inflammation seen with CpG DNA// J Infect Dis. 2004, Nov 15; 190( 10), p. 1841 -1849

53. Benencia, F., M.C. Courreges, G. Gamba, et al. Effect of aminoguanidine, a nitric oxide synthase inhibitor, on ocular infection with herpes simplex virus in Balb/c mice// Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 2001, v. 42, p. 1277-1284.

54. Biragyn A, Ruffmi PA, Leifer CA et al., Toll-like receptol 4-dependent activation of dendritic cells by beta-defensin 2// Science, 2002, Nov 1, 298 (5595), p. 997-998.

55. Biswas N. and Weller S., The UL5 and UL52 Subunits of the Herpes Simplex Virus Type 1 Helicase-Primase Subcomplex Exhibit a Complex Interdependence for DNA Binding// JBC, 2001, v. 276, N. 20, p. 17610-17619

56. Boman H., Antibacterial peptides: basic facts and emerging concepts// Journal of Internal Medicine, 2003, v. 254, p. 197-215

57. Boutell C. and Everett R., The Herpes Simplex Virus Type 1 (HSV-1) Regulatory Protein ICP0 Interacts with and Ubiquitinates p53// J. of Biol. Chemistry, 2003, v. 278, N. 38, p. 36596-36602

58. Boutell, C., S. Sadis, and R.D. Everett. Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein ICP0 and is isolated RING finger domain act as ubiquitin E3 ligases in vitro// J. Virol., 2002., v. 76, p. 841-850.

59. Brown EW, Burdash NM, Manos JP et al., MIF-like activity in non-stimulated and virus infected cell cultures// Ann Clin Lab Sci., 1978, Sep-Oct, 8(5), p. 419424.

60. Brown T.A., Gene cloning and DNA analysis, «Blackwell Publishing», 2001

61. Brown S M and MacLean A R, Methods in Molecular Medicine, Vol 10 Herpes Simplex Virus Protocols// Humana Press Inc , Totowa, NJ

62. Cantin EM, Hinton DR, Chen J et al., Gamma interferon expression during acute and latent nervous infection by herpes simplex virus type 1// J Virol., 1995, Aug, 69 (8), p. 4898-4905.

63. Chatteijee S., Burns P., Whitley R., Kern Е/, Effect of (S)-l-(3-hydroxy-2-phosphonylmethoxy)propyl. cytosine on the replication and morphogenesis of herpes simplex virus type 1// Antiviral Res., 1992, V. 19, N3, p.181-192

64. Chee AV, Roizman B, Herpes simplex virus 1 gene products occlude the interferon signaling pathway at multiple sites// J of Virol., 2004, April, p. 41854196.

65. Chen, S.H., J.E. Oalces, and R.N. Lausch. Synergistic anti-herpes effect of TNF-alpha and IFN-gamma in human corneal epithelial cells compared with that in corneal fibroblasts// Antiviral Res., 1994, v. 25, p. 201-213.

66. Chen S., Pearson A., Coen D., et al., Failure of Thymidine Kinase-Negative Herpes Simplex Virus To Reactivate from Latency following Efficient Establishment//J.of Virology, 2004, v. 78, N 1, p. 520-523

67. Cheryl AJ, Knipe D, Herpes simplex virus vaccines// Concise Reviews of Pediatric Infections Diseases, 2003, Nov., p. 1003-1006.

68. Chilukuri S, Rosen T, Management of acyclovir-resistant herpes simplex virus// Dermatol Clin., 2003, Apr., 21 (2), p. 311-320.

69. Cook J., Wobbe K., Donald M., Regulation of Neighboring Gene Expression by the Herpes Simplex Virus Type 1 Thymidine Kinase Gene// J.of Virology, 1996, v. 218, p. 193-203

70. Cooper D, Pride MW, Guo M Interleukin-12 redirects murine immune responses to soluble or aluminum phosphate adsorbed HSV-2 glycoprotein D towards Thl and CD4+ CTL responses// Vaccine, 2004, Nov 25, 23(2), p. 23646

71. Constantin N. and Dodson M., Two-hybrid analysis of the interaction between the UL52 and UL8 subunits of the herpes simplex virus type 1 helicase-primase// J. of General Virology, 1999, v. 80, p. 2411-2415

72. Dargan D., Aitken J., Subak-Sharpe J., The effect of triterpenoid compounds on uninfected and herpes simplex virus-infected cells in culture// J. Gen. Virol., 1988, V. 69, p. 439-444.

73. Davido DJ, Zagorski WF, Lane WS et al., Phosphorylation site mutations affect herpes simplex virus type 1 ICP0 function// J Virol., 2005, Jan, 79 (2), p. 12321243.

74. Deshpande, S.P., U. Kumaraguru, and B.T. Rouse. Dual role of В cells in mediating innate and acquired immunity to herpes simplex virus infections// Cell. Immunol., 2000, v. 202, p. 79-87.

75. Ding L, Yang L, Weiss TM Interaction of antimicrobial peptides with lipopolysaccharides// Biochemistry, 2003, Oct 28, 42(42), p. 12251-9

76. Duerst R., Innate Immunity to Herpes Simplex Virus Type 111 Viral immunology, 2003, v. 16, № 4, 2003, p. 475-490

77. Egal M, Conrad M, MacDonald DL, Antiviral effects of synthetic membrane-active peptides on herpes simplex virus, type 1// Int J Antimicrob Agents, 1999, Sep, 13(1), p. 57-60

78. Edward K., Wagner, Herpes Virus Research

79. Eidson, К., T. Purohit, and N.A. DeLuca, Inhibition of phosphorylation and nuclear retention of IRF-3 by HSV-1 ICPO// Presented at the 28th International Herpesvirus Workshop, University of Wisconsin, Madison, 2003

80. Emeny J.M., Morgan M.J., Regulation of the interferon system: evidence that Vero cells have a genetic defect in interferon production// J. Gen. Virol., 1979, v. 43(1), p. 247-252

81. Emery V.C. Human herpesvirus 6 and 7 in solid organ transplant recipients// Clin. Infect. Dis, 2001, v. 32, p. 1357-1360

82. Eom Chi-Yong and Lehman I. Robert, Replication-initiator protein (UL9) of the herpes simplex virus 1 binds NFB42 and is degraded via the ubiquitin-proteasome pathway// PNAS, 2003, v. 100, N. 17, p. 9803-9807

83. Everett RD, Herpes simplex virus type 1 regulatory protein ICPO does not protect cyclins D1 and D3 from degradation during infection// J Virol., 2004, Sep, 78 (18), p. 9599-9604.

84. Finberg, R.W., E.A. Kirk-Jones, J. Zhu, et al. TLR2 is required for cytokine induction by HSV-1// Presented at the 28th International Herpesvirus Workshop, University of Wisconsin, Madison, 2003.

85. Friedman, H.M., L. Wang, N.O. Fishman, et al. Immune evasion properties of herpes simplex virus type 1 glycoprotein gCII J. Virol, 1996, 70, p. 4253-4260.

86. Gallo R., Huttner M., Antimicrobial peptides: an emerging concept in cutaneous biology// J. Of Investigative Dermatology, 1998, v. Ill, N5, p.739-743

87. Gauter I, Coppey J, Durieux C, Early apoptosis-related changes triggered by HSV-1 in individual neuronlike cells// Experimental Cell Research, 2003, 289, p. 174-183.

88. Ghiasi, H., S. Cai, G.C. Perng, et al. The role of natural killer cells in protection of mice against death and corneal scarring following ocular HSV-1 infection// Antiviral Res, 2000, 45, p. 33-45.

89. Gidalevitz D., Ishitsuka Y, Muresan A., et al., Interaction of antimicrobial peptide protegrin with biomembranes// PNAS, 2003, v. 100, №. 11, p. 63026307

90. Goldsby R.A., Kindt T.J., Osborne B.A., Kuby J., Immunology (5th edition)// W.H. Freeman & Company; 2002

91. Granzow H, Klupp BG, Fuchs W et al., Egress of alphaherpesviruses: comparative ultrastructural study// J of Virol., 2001, Apr., p. 3675-3684.

92. Gu, H. and B. Roizman. The degradation of promyelocytic leukemia and SplOO proteins by herpes simplex virus 1 is mediated by the ubiquitin-conjugating enzyme UbcH5a// PNAS, 2003, 100, p. 8963-8968.

93. Hagglund, R. and B. Roizman. Characterization of the novel E3 ubiquitin ligase encoded in exon 3 of herpes simplex virus-1-infected cell protein 0// PNAS, 2002, 99, p. 7889-7894.

94. Hancock RE, Patrzykat A, Clinical development of cationic antimicrobial peptides: from natural to novel antibiotics// Curr Drug Targets Infect Disord., 2002, Mar, 2(1), p.79-83.

95. Harandi AM The potential of immunostimulatory CpG DNA for inducing immunity against genital herpes: opportunities and challenges// J Clin Virol., 2004, Jul, 30(3), p. 207-10

96. Harris, S.L., I. Frank, A. Yee, et al. Glycoprotein С of herpes simplex virus type 1 prevents complementmediated cell lysis and virus neutralization// J. Infect. Dis, 1990, 162, p. 331-337.

97. Harwing SL„ Kokryakov VN, Swiderek KM et al., Prophenin-1, exceptionally proline-rich antimicrobial peptide from porcine leukocytes// FEBS Letter's, 1995,362, p. 65-69.

98. Hayashi F, Means TK, Luster AD, Toll-like receptors stimulate human neutrophil function// Blood, 2003, 1 Oct, v. 102, No. 7, p. 2660-2668.

99. Hristova, К., M.E. Selsted and S.H. White, Critical role of lipid composition in membrane permeabilization by rabbit neutrophil defensins// J. Biol. Chem, 1997, 272, p. 24224-24233.

100. Howell M., Jones J., Kisich K., et al., Selective Killing of Vaccinia Virus by LL-37: Implications for Eczema Vaccinatuml// J. of Immunology, 2004, p. 1763-1767

101. Jing X, Cerveny M, Yang К, He B, Replication of herpes simplex virus 1 depends on the gamma, functions that facilitate virus response to interferon and different stages of productive infection// J Virol., 2004, Jul, 78 (14), p. 76537667.

102. Julkunen et al., Introduction Cytokine receptors, signaling pathways and viruses// Cytokine and Growth Factor Reviews, 2001, 12, p. 129-131.

103. Kawai T and Akira S, Toll-like receptor downstream signaling// Arthritis Research and Therapy, 2004, v. 7, no. 1, p. 12-17.

104. Khaiboullina SF, Netslci DM, Krumpe P, Jeor SC, Effects of tumor necrosis factor alpha on sin nombre virus infection in vitro// J of Virol. 2000, Dec., p. 11966-11971.

105. Knipe D.M., Fundamental virology// 2001, Lippincott W&W, p. 1123-1185

106. Kobelt D, Lechmann M, Steinkasserer A, The interaction between dendritic cells and herpes simplex virus-l// Curr Top Microbiol Immunol, 2003, 276, p. 145-161.

107. Koff, W.C. and A.V. Fann. Human tumor necrosis factor-alpha kills herpesvirus-infected but not normal cells// Lymphokine Res, 1986, 5, p. 215— 221.

108. Kokryakov VN, Harwing SL, Panyutich EA et al., Protegrines: leukocyte antimicrobial peptides that combine features of corticostatic defensins and tachyplesins// FEBS, 1993, v. 327, n. 2, p. 231-236.

109. Krug A, Luker GD, Barchet W et al., Herpes simplex virus type 1 activates murine natural interferon-producing cells through Toll-like receptor 9// Blood,2003, 8, p. 2674-2687

110. Kurt-Jones EA, Belko J, Yu С The role of toll-like receptors in herpes simplex infection in neonates// J Infect Dis, 2005, Mar, 1, 191(5), p. 746-748

111. Kurt-Jones EA, Chan M, Zhou S et al, Herpes simplex virus type 1 interaction with Toll-like receptor 2 contributes to lethal encephalitis// PNAS,2004, Feb 3, 101 (5), p. 1315-1320.

112. Leary JJ, Wittrock R, Sarisky RT et al., Susceptibilities of Herpes simplex virus to Penciclovir and Acyclovir in eight cell lines// Antimicr. Agents and Chemotherapy, 2002, Mar, p. 762-768.

113. Lee CL, Lee SH, Rozee ICR et al., 8-Azaguanin resistant African green monkey kidney cell mutants (Vero 153): isolation and characterization, In Vitro// 1983, May, 19(5), p. 416-420.

114. Lehrer R., T. Ganz Т., Cathelicidins: a family of endogenous antimicrobial peptides// Current Opinion in Hematology, 2002, v. 9, p. 18-22

115. Li XD, Kukkonen S, Vapalahti О et al., Tula hantavirus infection of Vero E6 cells induces apoptosis involving caspase 8 activation// J Gen. Virology, 2004, Nov, 85, p. 3261-3268

116. Lin R., Noyce R., Collins S., et al., The herpes simplex virus ICPO RING finger domain inhibits IRF3- and IRF7-mediated activation of interferon-stimulated genes// J.of Virology, 2004, v. 78, N 4, p. 1675-1684

117. Lubinski, J.M., M. Jiang, L. Hook, et al. Herpes simplex virus type 1 evades the effects of antibody and complement in vivo// J. Virol., 2002, 76, p. 92329241.

118. Lubinski, J., L. Wang, D. Mastellos, et al. In vivo role of complement-interacting domains of herpes simplex virus type 1 glycoprotein gC// J. Exp. Med., 1999, 190, p. 1637-1646.

119. Lubinski, J.M., L. Wang, A.M. Soulika, et al. Herpes simplex vims type 1 glycoprotein gC mediates immune evasion in vivo// J. Virol. 1998. 72:82578263.

120. Lund J, Sato A, Akira S et al., Toll-like receptor 9 mediated recognition of herpes simplex virus-2 by plasmacytoid dendritic cells// J of Experim. Medicine, 2003, v. 198, No. 3, Aug 4, p. 513-520.

121. Malmgaard L, Melchjorsen J, Bowie AG Viral activation of macrophages through TLR-dependent and -independent pathways// J Immunol., 2004, Dec 1, 173(11), p. 6890-6898

122. Malmgaard L. and Paludan S., Interferon (IFN)-a/b, interleukin (IL)-12 and IL-18 coordinately induce production of IFN-c during infection with herpes simplex virus type 111 Journal of General Virology, 2003, v. 84, p. 2497-2500

123. Manson M. Manual I From. Methods u-t Molecular Biology, Vol 10. Immunochemical Protocols// 01992 The Humana Press, Inc , Totowa, NJ

124. Martino L., Marfe G., Stefano C., et al., Interference of Bovine Herpesvirus 1 (BHV-1) in Sorbitol-Induced Apoptosis// Journal of Cellular Biochemistry, 2003, 89, p. 373-380

125. McNally JM, Andersen HA, Chervenak R et al., Phenotypic characteristic's associated with the acquisition of HSV-specific CD8 T-lymphocyte-mediated cytolytic function in vitro// J Immunol., 2004, Dec 1, 173 (11), p. 6890-6898.

126. Medunitsin NV, Avdeeva JI, Acilzina SE et al., Presence of cytokines in biological preparations// Biologicals, 2002, 30, p. 1-6.

127. Melroe GT, DeLucaNA, Knipe DM, Herpes simplex virus type 1 has multiple mechanisms for blocking virus-induced interferon production// J Virol., 2004, Aug, 78(16), p. 8411-8420.

128. Methe H, Kim JO, Kofler S, Nabauer M, Weis M Statins Decrease Toll-Like Receptor 4 Expression and Downstream Signaling in Human CD 14+ Monocytes// Arterioscler Thromb Vase Biol., 2005, Apr 28

129. Mettenleiter Т., Herpesvirus Assembly and Egress// J. of Virology, 2002, v. 76, N. 4, p. 1537-1547

130. Mirgorodskaya OA, Shevchenko AA, Abdalla КО et al., Primary structure of three cationic peptides from porcine neutrophils// FEBS Lett, 1993, 330 (3), p.339-342.

131. Mogensen SC, Macrophage migration inhibition as a correlate of cell-mediated immunity to herpes simplex virus type 2 in mice// 1982, 162 (1), p. 28-38.

132. Mogensen Т.Н., Soren R. P., Molecular pathways in virus-induced cytokine production// Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2001, v.65, no.l, p.131-150

133. Morrison LA. The Toll of herpes simplex virus infection// Trends Microbiol., 2004, Aug, 12(8), p. 353-356

134. Mossman K., Saffran H., and Smiley J., Herpes Simplex Virus ICP0 Mutants Are Hypersensitive to Interferon// J. of Virology, 2000, v. 74, N. 4, p. 20522056

135. Morrison E.E., Stevenson A.J., Wang Y.F., et. al, Defferences in the intracellular localization and fate of herpes simplex virus tegument proteins early in the infection of Vero cells// J. of General Virology, 1998, v. 79, p. 2517-2528

136. Narita, M., Y. Ando, S. Soushi, et al. The Bglll-N fragment of herpes simplex virus type 2 contains a region responsible for resistance to antiviral effects of interferon// J. Gen. Virol, 1998, 79, p. 565-572

137. Nimonkar AV, Boehmer PE, Reconstitution of recombination-dependent DNA synthes in herpes simplex virus 1// PNAS, 2003, Sept 2, v. 100, no. 18, p. 10201-10206.

138. Nippon Rincho, 1963, 21, 1209

139. Perez-Romero P, Perez A, Capul A, Montgomery R, Fuller AO Herpes simple virus entry mediator associates in infected cells in a complex with viral protein gD and at least gH.// J Virol, 2005, Apr, 79(7), p. 4540-4544.

140. Periathamby AR, Dentino AR, Current status of defensins and their role i innate and adaptive immunity// FEMS Microbiology Letters, 2002, v. 206, p. S 18.

141. Perregaux DG, Bhavsar K, Contillo L et al. Antimicrobial peptides initiate IL IP posttranslational processing: a novel role beyond innate immunity// J с immunology, 2002, p. 3024-3032.

142. Reynolds A, Liang L. and Baines J, Conformational Changes in the Nuclear Lamina Induced by Herpes Simplex Virus Type 1 Require Genes UL31 and UL34// J. of Virology, 2004, v. 78, no. 11, p. 5564-5575

143. Ogasawara M., Suzutani Т., Yoshida I. et al., Herpes Simplex Virus Capsid: Location of UL25 Product in the Capsid and Demonstration that It Binds DNA// J. of Virology, 2001, v. 75, no. 3, p. 1427-1436

144. Oppenheim JJ, Biragyn A, Kwak LW, Yang D, Roles of antimicrobial peptides such as defensins in innate and adaptive immunity// Ann Rheum Dis, 2003, 62, p. 17-21.

145. Ostrander M., Vogel S. and Silversten S., Phenotypic Switching in Cells Transformed with the Herpes Simplex Virus Thymidine Kinase Gene// Mol. And Cell. Biol., 1982, v. 2, N. 6, p. 708-714

146. Oullette AJ and Bevis CL, Paneth cell defensins and innate immunity of the small bowel// Inflammatory Bowel Diseases, 2001, v. 7, No. 1, Febr., p. 43-50.

147. Quin~ones-Mateua M., Ledermanb M., Fengc Z., et al., Human epithelial p-defensins 2 and 3 inhibit HIV-1 replication// AIDS, 2003, v. 17, p. 39-48-79

148. Qureshil S. and Medzhitov R., Toll-like receptors and their role in experimental models of microbial infection// Genes and Immunity, 2003, v. 4, p. 87-94

149. Schang L., Phillips J. and Schaffer P., Requirement for Cellular Cyclin-Dependent Kinases in Herpes Simplex Virus Replication and Transcription// J. of Virology, 1998, v. 72, N. 7, p. 5626-5637

150. Schulz O, Diebold SS, Chen M Toll-like receptor 3 promotes cross-priming to virus-infected cells// Nature., 2005, Feb 24, 433(7028), p. 887-92

151. Sit, M.F., D.J. Tenney, J.L. Rothstein, et al. Effect of macrophage activation on resistance of mouse peritoneal macrophages to infection with herpes simplex virus types 1 and 2// J. Gen. Virol., 1988, 69, p. 1999-2010.

152. Sorensen O.E., Follin P, Johnsen A, et al., Human cathelicidin, hCAP-18, is processed to the antimicrobial peptide LL-37 by extracellular cleavage with proteinase 3//Blood, 2001, v.97, no. 12, p. 3951-3957

153. Spear P. and Longnecker R., Herpesvirus Entry: an Update// J. of Virology, 2003, v. 77, N. 19, p. 10179-10185

154. Spear P., Herpes simplex virus: receptors and ligands for cell entry// Cellular Microbiology, 2004, №6(5), p. 401-410

155. Steinstraesser L., Klein R., Aminlari A., et al., Protegrin-1 enhances bacterial killing in thermally injured skin// Crit Care Med, 2001, v. 29, N. 7, p. 14311437

156. Steinstraesser L., Tippler B, Mertens J et al., Inhibition of early steps in the lentiviral replication cycle by cathelicidin host defense peptides// Retrovirology, 2005, 2:2.

157. Su, Y.H., J.E. Oakes, and R.N. Lausch. Mapping the genetic region coding for herpes simplex virus resistance to mouse interferon alpha/beta// J. Gen. Virol., 1993, 74, p. 2325-2332.

158. Taddeo B, Esclatine A, Roizman B, Post-transcriptional processing of cellular RNAs in herpes simplex virus-infected cells// Biochemical Society Transactions, 2004, v. 32, part 5, p. 697-701.

159. Tauszig S, Jouanguy E, Hoffman JA, Imler J, Toll-related receptors and the control of antimicrobial peptide expression in Drosophilall PNAS, 2000, Sept. 12, v. 97, no. 19, p. 10520-10525.

160. Thomas D, Blakqori G, Wagner V et al., Inhibition of RNA polymerase II phosphorylation by a viral interferon antagonist// J Biol. Chem., 2004, Jul 23, 279 (30), p. 31471-31477.

161. Thompson R. L., Shieh M. and Sawtell N. M., Analysis of Herpes Simplex Virus ICP0 Promoter Function in Sensory Neurons during Acute Infection, Establishment of Latency, and Reactivation In Vivo// J. of Virology, 2003, v. 77, N. 22, p. 12319-12330

162. Tjabringa G., Aarbiou J., Ninaber D., et al., The Antimicrobial Peptide LL-37 Activates Innate Immunity at the Airway Epithelial Surface by Transactivation of the Epidermal Growth Factor Receptorl// The J. of Immunology, p. 66906697

163. Waggoner-Fountain L., Grossman L., Herpes Simplex Virus// Pediatrics in Review, 2004, v. 25, N. 3, p. 86-93

164. Wang J., Lu X., Chen D, et al., Herpes simplex virus thymidine kinase and ganciclovir suicide gene therapy for human pancreatic cancer// World Journal of Gastroenterology, 2004; N. 10(3), p. 400-403

165. Wang W., Owen S., Rudolph D., et al., Activity of a- and 9-Defensins against primary isolates of HIV-l, 2003// J. of immunology, p.515-520

166. Wildner O., Hoffmann D., Jogler C., Comparison of HSV-1 thymidine lcinase-dependent and -independent inhibition of replication-competent adenoviral vectors by a panel of drugs// Cancer Gene Therapy, 2003, v. 10, p.791-802

167. Xing Z and Wang J, Consideration of cytokines as therapeutics agents or targets// Current Pharmac. Design, 2000, 6, p. 599-611.

168. Yang D., Biragyn A, Kwak LW et al., Mammalian defensins in immunity: more than just microbicidal// Trends in immunology, 2002, v. 23, No. 6, June, p. 291-296.

169. Yang D., Chertov O., Rosenberg H.F. et. al, Mobilisation of varios types of leukocytes by human granulocyte-derived antimicrobial proteins// J. Leucos. Biol., 2000, N63

170. Yarovinsky F, Zhang D, Andersen JF, TLR11 Activation of Dendritic Cells by a Protozoan Profilin-Like Protein// Science. 2005 Apr 28

171. Yasin В., Pang M., Turner J., et al., Evalution of inactivation of infectious HSV by host-defense peptides// Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2000, v. 19, p. 187-194

172. Yasushi Kawaguchi, Michiko Tanaka, Alcihiko Yokoymama, et al., Herpes simplex virus 1 a regulatory protein ICP0 functionally interacts with cellular transcription factor BMAL1// PNAS, 2001, v. 98, N. 4, p. 1877-1882

173. Yokota S, Yokosawa N, Kubota T et al., Herpes simplex virus type 1 suppresses the interferon signaling pathway by inhibiting phosphorilation of STATs and janus kinases during an early infection stage// Virology, 2001, Jul 20, 286(1), p. 119-124.

174. Zanetti M., Gennaro R., Romeo D., Cathelicidins: a novel protein family with a common proregion and a variable C-terminal antimicrobial domain// FEBS Letters, 1995, v. 374, p. 1-5

175. Zanetti M., Gennaro R., Skeriavaj В et al., Cathelicidin peptides as candidates for a novel class of antimicrobials// Curr Pharm Des., 2002, 8(9), p. 779-793.

176. Zanetti M., Storici P., Tossi A., et al., Antibacterial Peptide Derived from Pig Myeloid Cells// JBC, 1994, v. 269, N. 11, p. 7855-7858.

177. Zasloff M., Antimicrobial peptides of multicellular organism// Nature, 2002, v.415, p.389-395

Автореферат диссертации по медицине на тему Противовирусные эффекты комплекса природных цитокинов (препарат "Суперлимф") на модели герпес-вирусной инфекции in vitro

Оглавление диссертации Баркевич, Оксана Анатольевна :: 2005 :: Москва

Введение диссертации по теме "Аллергология и иммулология", Баркевич, Оксана Анатольевна, автореферат

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2005 года, Баркевич, Оксана Анатольевна

Похожие научные работы

Каталог диссертаций