Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Экспериментальное обоснование новых способов патогенетической коррекции пиелонефрита у детей

На правах рукописи

КОСАРЕВА ПОЛИНА ВЛАДИМИРОВНА

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ НОВЫХ СПОСОБОВ ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ ПИЕЛОНЕФРИТА У ДЕТЕЙ

14.03.03 - патологическая физиология 14.01.08 - педиатрия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

ЧЕЛЯБИНСК, 2010

003493120

Работа выполнена в Центральной научно-исследовательской лаборатории Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Пермская государственная медицинская академия имени академика Е.А. Вагнера Росздрава»

Научные консультанты: академик РАН и РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Валерий Александрович Черешнсв доктор медицинских нау к, профессор Наталья Ивановна Аверьянова

Официальные онпоненты: доктор медицинских наук, профессор

Борис Германович Юшков

доктор медицинских наук Михаил Владимирович Осиков

доктор медицинских нау к, профессор Леонид Александрович Дулькин

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет им. Н.И. Пирогова», г. Москва

Защита диссертации состоится « ^у>Л{'1/1ахС<А- 2010 г. в /О часов на заседании специализированного Совета Д-208.1/7.02 Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Росздрава» (г. Челябинск, ул. Воровского, 64).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Росздрава» (г. Челябинск, ул. Воровског о, 64).

Автореферат разослан « У » 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук,

профессор Н.В. Тишевская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Заболеваемость пиелонефритом на сегодняшний день не имеет тенденции к снижению (Коровина с соавт., 2003; Никитина с соавт., 2007; Orellana et al., 2002), а хронизация инфекционного процесса в ткани почек, его рецидивирование и прогрессирование с формированием нефросклероза и развитием хронической почечной недостаточности, приводящих к инваггидизации больного (Domann et al., 2003), ставят эту проблему в ряд особо важных.

Подобная ситуация обусловлена многими факторами, среди которых ведущими являются рост антибиотикорезистентности условно-патогенной микрофлоры (Manges et al., 2001) и снижение иммунологической резистентности у детей (Румянцев с соавт., 2000). Назначение антибактериальных химиопрепаратов, которым принадлежит ведущая роль в терапии пиелонефрита, зачастую оказывается недостаточным для ликвидации инфекционно-воспалительного процесса, что и определяет растущий интерес исследователей к поиску новых эффективных и безопасных средств патогенетической терапии инфекционно-воспалительных заболеваний почек.

Несмотря на достаточную полноту данных, касающихся этиологии и патогенеза пиелонефрита, в данной области также имеется ряд открытых вопросов. К их числу относится вопрос о роли эндогенной бактериемии в развитии инфекционно-воспалительного процесса в почках. По мнению ряда авторов, в патогенезе пиелонефрита определяющее значение имеет восходящая уроинфекция, а гематогенное инфицирование встречается редко, обычно на фоне системных инфекций и сопровождается острым двусторонним гнойным (метастатическим) пиелонефритом (Тареева, 2000; Симченко с соавт., 2000; Лукьянов, 2006; Schlader, 2001). Тем не менее, и отечественными, и зарубежными авторами высказывается точка зрения, заключающаяся в том, что эндогенная бактериемия энтерального происхождения способствует развитию инфекционного процесса в удаленных от первичного очага инфекции органах и, в частности, в почках (Вялкова, 1989; Бондаренко, 2004; Гриценко с соавт., 2008; Mandell et al., 2000; Рарр et al., 2003).

Поскольку чаще всего источником эндогенной бактериемии служит толстая кишка как наиболее массивно заселенный биотоп в организме (Зурочка, 1984; Долгушин, Эберт, Лившиц, 1989), основным этиологическим фактором пиелонефрита при эндогенном инфицировании ткани почек является микрофлора желудочно-кишечного тракта (Mandell et al., 2000; Alverdy et al., 2003). Поэтому поиск средств, препятствующих реализации процесса транслокации бактерий через стенку кишечника в системный кровоток, также представляется весьма актуальным. Согласно литературным данным, оптимальным в этом

отношении может стать дополнительное включение в рацион пациентов продуктов, содержащих пищевые волокна, являющиеся источником короткоцепочечных жирных кислот, под действием которых происходит селективная стимуляция роста и активности индигенной микрофлоры и одновременно подавление роста патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и укрепление стенки кишечника, а, следовательно, и стабилизация гематоинтестинального барьера (Roberfroid et al., 2002; Priebe et al., 2002).

Обозначенные проблемы определили цели и задачи диссертационной работы.

ЦЕЛЬ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ: разработать экспериментальную модель острого пиелонефрита и апробировать на доклиническом материале и в клинике новые методы его патогенетической коррекции с учетом выявленных современных особенностей течения микробно-воспалительных заболеваний почек в детском возрасте.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Разработать экспериментальную модель пиелонефрита, позволяющую воспроизводить инфекционно-воспалительный процесс в почках, подобный наблюдаемому в клинике, и не сопровождающуюся нанесением животному операционной травмы.

2. На разработанной экспериментальной модели пиелонефрита исследовать эффективность диеты с высоким содержанием метаболизированных пищевых волокон в плане нормализации качественного и количественного состава кишечной микрофлоры и стабилизации гематоинтестинального барьера.

3. Оценить в эксперименте эффективность препаратов Вобэнзим и Суперлимф в комплексной терапии острого пиелонефрита.

4. Изучить современные особенности течения пиелонефрита в детском возрасте и охарактеризовать роль эндогенной кишечной бактериемии в его развитии.

5. Провести оценку клинической эффективности биологически активной добавки к пище «Ультрасорб» как компонента функционального питания и препарата Вобэнзим как средства патогенетической терапии при пиелонефрите у детей.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ. Разработаны два новых варианта моделирования острого пиелонефрита у экспериментальных животных, включая наиболее приближенную к реальным клиническим условиям модель пиелонефрита, развивающегося вследствие эндогенного инфицирования на фоне острого холодового стресса. От пациентов с пиелонефритом, подтвержденным клиническими и лабораторными данными, выделены и охарактеризованы штаммы микроорганизмов (Escherichia coli № 2899 и Staphylococcus saprophytics № 1256), вызывающие развитие острого пиелонефрита у животных при различных способах заражения.

Иммуногистохимическими исследованиями установлено, что у животных с экспериментальным пиелонефритом отмечается выраженная экспрессия молекул межклеточной адгезии 1САМ-1 эндотелиальными клетками и эпителиоцитами проксимальных извитых канальцев. У животных, подвергнутых ректальному введению урокультуры кишечной палочки и последующему острому стрессу, в толстой кишке отмечается активация процессов апоптоза и уменьшение индекса пролиферации.

Впервые выявлено, что включение пребиотического продукта «Ультрасорб» в рацион экспериментальных животных обеспечивает нормализацию популяционной численности и видового состава микрофлоры, образующей биотоп толстой кишки. При моделировании острого пиелонефрита, развившегося в результате феномена бактериальной транслокации кишечной микрофлоры на фоне острого холодового стресса, включение «Ультрасорба» в диету экспериментальных животных способствует устранению кишечного дисбактериоза и препятствует транслокации условно-патогенной кишечной микрофлоры во внутреннюю среду организма, таким образом обеспечивая профилактику инфекционных осложнений в условиях острого стресса, что подтверждается результатами гематологических, бактериологических, гистологических и иммуногистохимических исследований.

Впервые установлено, что включение в экспериментальную терапию пиелонефрита комплекса природных цитокинов и антибактериальных катионных пептидов (препарат Суперлимф) так же, как и комплекса протеолитических энзимов (препарат Вобэнзим), способствует нормализации лабораторных показателей и ликвидации признаков микробного воспаления в ткани почек экспериментальных животных.

Установлены современные тенденции течения пиелонефрита у детей. На клиническом и патологоанатомическом материале показана роль эндогенной бактериемии, развивающейся вследствие транслокации условно-патогенной кишечной микрофлоры в системный кровоток, в развитии пиелонефрита в детском возрасте.

Впервые установлено, что использование «Ультрасорба» в качестве компонента функционального питания у пациентов с пиелонефритом способствует более быстрой нормализации клинических и лабораторных показателей. Выявлено, что применение ферментного препарата Вобэнзим в составе комплексной терапии пиелонефрита у детей способствует эффективному клиническому улучшению и нормализации лабораторных показателей.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Результаты экспериментальных и клинических исследований, свидетельствующие о роли эндогенной бактериемии в развитии пиелонефрита, позволяют расширить представление о

механизмах патогенеза инфекционно-воспалительных заболеваний органов мочевыделительной системы, а также определить оптимальные точки приложения патогенетической терапии при лечении данной патологии.

Установленный в эксперименте эффект «Ультрасорба» в профилактике развития пиелонефрита на фоне эндогенного инфицирования является аргументом в защиту значимости эндогенной бактериемии, обусловленной стрессом, в формировании инфекционно-воспалительных заболеваний почек. Разработанный в эксперименте способ профилактики пиелонефрита может использоваться в клинической практике как у пациентов с хроническим пиелонефритом - в плане предупреждения обострений, так и у пациентов, страдающих дисбактериозом кишечника, с целью профилактики микробно-воспалительного поражения почек. Положительное влияние диеты, обогащенной пищевыми волокнами и короткоцепочечными жирными кислотами, на клинические и лабораторные показатели при остром пиелонефрите получило подтверждение в клинических исследованиях.

Выявленная в эксперименте эффективность препарата Суперлимф делает перспективным дальнейшее его изучение с целью последующего применения в клинической, в том числе, педиатрической практике. Результаты проведенных доклинических и клинических исследований эффективности применения ферментного препарата Вобэнзим при лечении пиелонефрита дают основание к широкому применению его в детской нефрологии.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Разработанная модель острого пиелонефрита, воспроизводящая развитие инфекционно-воспалительного процесса в ткани почек вследствие реализации феномена бактериальной транслокации на фоне острого стресса, является оптимальным способом воспроизведения острого пиелонефрита в эксперименте.

2. Включение метаболизированных пищевых волокон в рацион животных, подвергшихся ректальному заражению урокультурой Escherichia coli, способствует нормализации популяционной численности и активности облигатной микрофлоры кишечника, стабилизации гематоинтестинального биологического барьера и профилактике эндогенного пиелонефрита.

3. Включение в экспериментальную терапию пиелонефрита препарата Суперлимф ускоряет регрессию воспалительных изменений в ткани почек и способствует восстановлению нормальной структуры тканей в органах иммунитета.

б

4. Применение препарата Вобэнзим при лечении экспериментального пиелонефрита уменьшает выраженность воспалительных изменений в ткани почек и стимулирует клеточную пролиферацию в Т-зависимых зонах органов иммунитета.

5. В детском возрасте в возникновении и прогрессировании пиелонефрита существенную роль играет эндогенная бактериемия, развивающаяся вследствие транслокации условно-патогенной кишечной микрофлоры в системный кровоток; в связи с чем патогенетически обоснованным является использование в качестве компонента функционального питания метаболизированных пищевых волокон с целью нормализации кишечного микробиоценоза и предотвращения нарушения целостности гематоинтестинального барьера.

6. Включение ферментного препарата Вобэнзим в комплексную терапию пиелонефрита у детей оказывает положительное влияние на клинические и лабораторные показатели.

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ. Полученные в ходе экспериментальных и клинических исследований результаты внедрены в работу отдела морфологических и патофизиологических исследований ЦНИЛ, используются в учебном процессе на кафедре пропедевтики детских болезней и факультетской педиатрии, кафедре патологической физиологии, кафедре гистологии, эмбриологии и цитологии, кафедре микробиологии и вирусологии, кафедре нормальной, топографической и клинической анатомии ГОУ ВПО «ПГМА им. академика Е.А. Вагнера Росздрава», внедрены в работу городского нефрологического отделения и поликлиник №1, №2, №3 ГДКБ им. П.И. Пичугина г. Перми.

СВЯЗЬ РАБОТЫ С НАУЧНЫМИ ПРОГРАММАМИ. Работа выполнена в соответствие с планом НИР ГОУ ВПО «ПГМА им. академика Е.А. Вагнера Росздрава».

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИ. Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на II Всероссийской научно-практической конференции «Здоровье и образование», Пермь, 2004 г.; IV Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых и студентов по медицине», Тула, 2005 г.; VI Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды», Пермь-Казань-Пермь, Россия, 2005 г.; II Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал», Пермь-Казань-Пермь, Россия, 2005 г.; Научно-практической конференции «Научно-практические итоги региональных конкурсов РФФИ-Урал в Пермском крае 2004-2006 годов», Пермь,

2007 г.; научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы медицины», Пермь, 2007 г.; Весенней сессии Российской Академии Естествознания, Москва, 2007 г.; VII Международной конференции «Загрязнение окружающей среды, адаптация, иммунитет», Пермь-Нижний Новгород-Пермь, 2008 г.; II Межрегиональной гастроэнтерологической научно-практической конференции «Неинфекционные заболевания кишечника: от научных достижений к стандартам терапии», Нижний Новгород, 2008 г.; III Научно-практической конференции гастроэнтерологов ПФО «Диагностика и лечение заболеваний органов пищеварения: от научных достижений к стандартам терапии». Нижний Новгород, 2009 г.; Заседании Пермского нефрологического общества, Пермь, 2009 г.; Итоговых научных сессиях ПГМА им. академика Е.А. Вагнера Росздрава, Пермь, 2005 г., 2006 г., 2009 г.

По теме диссертации опубликована 51 печатная работа, из них 9 работ, опубликованных в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ, 4 патента РФ на изобретение.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация включает следующие разделы и главы: содержание, введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, пять глав собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, практические рекомендации, список литературы. Материалы диссертации изложены на 445 печатных страницах, содержат 104 таблиц, 130 рисунков, 2 клинических примера, включают 324 литературных источника, из которых 151 - отечественных и 173 -иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальный раздел работы. Эксперименты проведены на 190 животных -нелинейных белых крысах, самцах и самках, четырехмесячного возраста массой тела 150200 г. Животные содержались в стандартных условиях экспериментально-биологической клиники - вивария (свободный доступ к пище и воде и 12-14-часовой световой день), получали типовой рацион питания в соответствии с нормами, утвержденными приказом МЗ СССР от 10 марта 1966 г. № 163 и Приказом МЗ СССР от 10.10.83 № 1179 (п. 4.1). Все эксперименты выполнены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 г. N 755) и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18 марта 1986 г. на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории Государственного учреждения высшего профессионального образования «Пермская государственная медицинская

академия имени академика Е.А. Вагнера Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», имеющего разрешение на работу с экспериментальными животными.

Для заражения животных использованы выделенные от пациентов урокультуры бактерий: лактозонегативная Escherichia coli (штамм № 2899) и Staphylococcus saprophytics (штамм № 1256). Культуры микроорганизмов изолированы из мочи детей, входящих в клиническую выборку и имеющих диагноз «острый пиелонефрит», в концентрации не менее 105 КОЕ/мл. Идентификацию чистых культур проводили при помощи систем одноразового использования для дифференциации микроорганизмов -«ЭНТЕРОтест 24» (PLIVA-Lachema Diagnostica s.r.o., г. Москва) для идентификации Е. coli, «ПБДС» (НПО «Диагностические системы», Нижний Новгород) - для идентификации St. saprophytics.

Экспериментальная терапия включала следующие препараты.

Антибиотики группы цефалоспоринов, имеющие широкий спектр антимикробного действия: Цефазолин (из расчета 50 мг/кг в 500 мкл физиологического раствора) и Клафоран (цефотаксим) - из расчета 25 мг/кг в 500 мкл физ. раствора. К данным антибактериальным препаратам установлена чувствительность урокультур St. saprophytics и £. coli в экспериментах in vitro.

Суперлимф (Superlimf) - комплекс природных антибактериальных пептидов (протегринов) и цитокинов - разработан и внедрен в клиническую практику кафедрой иммунологии Государственного образовательного учреждения высшего

профессионального образования «Российский государственный медицинский университет» им. Н.И. Пирогова совместно с предприятием «Иммунохелп» (г. Москва), является иммуномодулятором с прямым противовирусным и противомикробным действием. Суперлимф в эксперименте применяли из расчета 0,1 мг/кг в 500 мкл физиологического раствора.

Антибиотики и Суперлимф животным вводили интраперитонеально, 1 раз в сутки.

Вобэнзим (Wobenzyme) - ферментный препарат («МУКОС-Фарма», Германия), обладает иммуномодулирующим, противовоспалительным, противоотечным, фибринолитическим и антиагрегационным действием. Вобэнзим животным вводили перорально 1 раз в сутки в дозе 0,1 таблетки (2,4 мг трипсина, 0,1 мг химотрипсина, 1,0 мг амилазы, 1,0 мг липазы, 4,5 мг бромелаина, 6,0 мг папаина, 10,0 мг панкреатина, 5,0 мг рутозида) в 400 мкл физиологического раствора.

Введение препаратов в эксперименте начинали спустя 48 часов после заражения, продолжительность терапии составила 8 дней.

В качестве компонента функционального питания использовали биологически активную добавку (БАД) «Ультрасорб» (ЗАО «Ягодное», г. Киров, д. Югрино) в количестве 10% суточного объема пищи (3 г/сутки). «Ультрасорб» представляет собой таблетированный комплекс «Рекицена-РД» с фруктоолигосахаридами. Его основными компонентами являются нерастворимые и растворимые пищевые волокна пшеничных отрубей, метаболизированные винными дрожжами Saccharomices vini, и короткоцепочечные жирные кислоты. Продукт используется в качестве пребиотического средства; при воздействии неблагоприятных экологических и производственных факторов; как компонент функционального питания при заболеваниях желудочно-кишечного тракта, нарушениях обмена веществ, алкогольной интоксикации, аллергической патологии; в комплексной терапии вторичной иммунной недостаточности.

Проведено 2 серии экспериментов.

1 серия: моделирование острого пиелонефрита путем интраперитонеального введении микробной суспензии. Лабораторным животным интраперитонеально однократно вводили суточную бульонную урокультуру лактозонегативной Е. coli или St. saprophyticus в определенной концентрации, определяемой нефелометрическим методом, в количестве 400 мкл. Оптическую плотность микробной суспензии, соответствующую заданной концентрации, устанавливали эмпирически на фотоэлектрокалориметре КФК-3 (зеленый светофильтр, длина волны 540 нм, кювета - 1,060 мм) (Веслополова, 1995).

Были сформированы 10 экспериментальных групп по 10 животных в каждой.

I. Ингактные животные, находящиеся в стандартных условиях вивария.

II. Введение St. saprophyticus (108 КОЕ/мл), терапию не получали.

III. Введение St. saprophyticus (106 КОЕ/мл), терапию не получали.

IV. Введение St. saprophyticus (108 КОЕ/мл), экспериментальная терапия -Цефазолин.

V. Введение St. saprophyticus (108 КОЕ/мл), экспериментальная терапия -Суперлимф.

VI. Введение St. saprophyticus (10s КОЕ/мл), экспериментальная терапия -Цефазолин и Суперлимф.

VII. Введение Е. coli (109 КОЕ/мл), терапию не получали.

VIII. Введение Е. coli (10* КОЕ/мл), терапию не получали.

IX. Введение Е. coli (109 КОЕ/мл), экспериментальная терапия - Цефазолин.

X. Введение Е. coli (109 КОЕ/мл), экспериментальная терапия - Цефазолин и Вобэнзим.

ю

Терапию начинали через 48 ч от заражения, проводили в течение 8 дней, на 14 сутки от заражения животных выводили из эксперимента.

2 серия экспериментов: моделирование острого пиелонефрита путем ректального введения микробной суспензии с последующим острым стрессовым воздействием. Лабораторным животным ректально однократно вводили суточную бульонную урокулыуру лактозонегативной Escherichia coli № 2899 в количестве 400 мкл. В последующие за заражением сутки животных подвергали острому холодовому стрессу при следующих условиях: t° = 0-(+2)° С, экспозиция - 2 ч.

Были сформированы 9 экспериментальных групп по 10 животных в каждой.

I. Интактные животные, получавшие в течение всего периода наблюдения только типовой рацион вивария.

II. Интактные животные, получавшие в дополнение к рациону вивария «Ультрасорб».

Ш. Введение Е. coli (109 КОЕ/мл), острый стресс.

IV. Введение Е. coli (106 КОЕ/мл), острый стресс.

V. Предварительный прием «Ультрасорба» в течение 14 дней, затем введение Е. coli (109 КОЕ/мл), острый стресс, последующий прием «Ультрасорба» в течение 14 дней.

VI. Предварительный прием «Ультрасорба» 14 дней, введение Е. coli (10s КОЕ/мл), острый стресс, последующий прием «Ультрасорба» в течение 14 дней.

VII. Предварительный прием «Ультрасорба» 14 дней, введение Е. coli (109 КОЕ/мл), острый стресс, последующий прием «Ультрасорба» 14 дней, терапия клафораном через 48 ч от заражения в течение 8 дней.

VIII. Введение Е. coli (109 КОЕ/мл), острый стресс, «Ультрасорб» 14 дней, терапия клафораном через 48 ч от заражения в течение 8 дней.

IX. Введение Е. coli (Ю5 КОЕ/мл), острый стресс, терапия клафораном через 48 ч от заражения в течение 8 дней.

Через 14 дней после заражения животных выводили из эксперимента.

Ежедневное наблюдение за животными в условиях 2 серий эксперимента включало регистрацию поведения, внешнего вида, физиологических функций. До начала и по окончании исследования у животных регистрировали показатели периферической крови рутинными лабораторными методиками. Определяли количество эритроцитов (109 клеток в 1 мл), лейкоцитов (106 клеток в 1 мл), концентрацию гемоглобина (г/л). Из нативной капли крови готовили мазок, фиксировали в смеси Никифорова и подвергали окрашиванию по Романовскому-Гимзе. Окрашенные мазки микроскопировали под

иммерсией (Micros, Austria, x 1000), проводили подсчет лейкоцитарной формулы, определяя относительное содержание клеток в мазке и абсолютные значения (абс. колич. = абс. колич. лейкоцитов х относит. / 100).

У интактных животных, получавших «Ультрасорб» в дополнение к типовому рациону вивария, проводили бактериологическое исследование содержимого толстой кишки. С этой целью первичный посев разведения фекалий осуществляли на дифференциально-диагностические среды с последующей характеристикой выделенных бактерий по стандартным методикам. Количество микроорганизмов выражали в десятичных логарифмах (lg) колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 г сырой массы фекалий.

Животных выводили из эксперимента путем перерезки спинного мозга под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии. Сразу после наступления биологической смерти животного в асептических условиях для проведения бактериологического исследования забирали органы: почки, печень, селезенку, у животных с ректальным заражением - и брыжеечные лимфатические узлы. Бактериологические исследования проводили по стандартным методикам. Выделенные чистые культуры идентифицировали по стандартным схемам микроскопией мазка, окрашенного по Граму, и изучением культуральных и биохимических свойств (Приказ МЗ СССР № 535, 1985). Одновременно для гистологического исследования забирали почки, печень, тимус, селезенку, подвздошную кишку с пейеровыми бляшками; у животных с ректальным заражением -дополнительно толстую кишку. Кусочки тканей, толщиной 5-7 мм, фиксировали в 10%-ном забуференном по Лилли формалине (рН-7,2), гистологические препараты готовили по стандартным методикам с заливкой в гистамикс. Срезы, полученные на ротационном микротоме (толщиной 3-4 мкм), депарафинировали и подвергали окрашиванию гематоксилином и эозином, пикрофуксином по ван Гизону с целью визуализации коллагеновых волокон. Гистологические препараты ткани почек дополнительно окрашивали нитратом серебра по Футу с целью визуализации гломерулярной базальной мембраны. Гистологические препараты ткани селезенки и срезы пейеровых бляшек подвздошной кишки окрашивали нитратом серебра по Футу для выявления ретикулярных волокон и метиловым зеленым-пиронином для выявления РНК в клетках.

Иммуногистохимические исследования гистологических образцов проводили используя антитела и полный диагностический набор компании Diagnostic BioSystems (USA), предназначенный для проведения экспериментальных исследований. Для выявления пролиферативной активности клеток использовали моноклонапьные антитела к регуляторному протеину Ki-67 (Clone SP6, Isotype IgG), процессы апоптоза оценивали по

уровню экспрессии Fas ligand (Polyclonal Rabbit Antibody to Fas Ligand); выраженность воспалительных реакций в тканях - по выраженности экспрессии адгезивных молекул ICAM-1 (Clone 15.2, Isotype IgGl). При исследовании экспрессии ICAM-1 в ткани почек использовали криостатные срезы нативного материала, полученные на замораживающем микротоме Shandon creatom FE. Иммуногистохимические исследования проводили по стандартным протоколам, использовали позитивные контроли согласно рекомендациям фирмы-производителя. Срезы докрашивали гематоксилином Майера, заключали в канадский бальзам и исследовали в проходящем свете микроскопа при увеличении х 600.

Оценка интенсивности пероксидазной метки и определение индекса пролиферации проводились полуколичественным методом: учитывалось число позитивных результатов на 100 учтенных ядер (при подсчете 500-1000 клеток) (Корсакова, 2007). При определении экспрессии Ki-67 ядерная реакция любой интенсивности фиксировалась как позитивная; уровень пролиферации расценивался как низкий, если <15% клеток имели позитивную реакцию, умеренный, если 15-30% ядер были позитивны на Ki-67, и высокий при позитивной реакции более 30% клеток (Раскин, 2007). Гибель клеток в форме апоптоза в эпителиоцитах толстой кишки определяли по индексу апоптоза (1АПТ) по формуле: 1АПТ (%) = N (число апоптозных клеток, позитивных к Fas Ligand)/Nl (общее число клеток)х100 (Осадчук с соавт., 2004).

Морфометрические исследования выполнены при помощи специализированного программного обеспечения для медицины и биологии BioVision, version 4,0 (Австрия). Захват изображений осуществляли при помощи цифровой камеры для микроскопа САМ V200, Vision (Австрия). При проведении гистометрических исследований ткани почек учитывали следующие параметры: толщину гломерулярной базальной мембраны, толщину базальной мембраны эпителия проксимальных извитых канальцев, измеряемые при увеличении х 1500 и импрегнации гистологических срезов нитратом серебра по Футу, площадь мочевого пространства на срезах, проходящих по максимальному диаметру почечного тельца, площадь поперечного сечения капилляров клубочков. Кроме того, определяли степень выраженности воспалительной инфильтрации в ткани почек. В селезенке учитывали относительный объем белой пульпы, относительный объем периаритериальных лимфоидных муфт (ПАЛМ) и светлых центров в лимфатических узелках. В ткани тимуса определяли относительный объем коркового вещества в дольках. В тонкой кишке учитывали количество клеток Панета в дне кишечных крипт и количество поперечно срезанных крипт, содержащих дегранулирующие клетки Панета. Морфометрические исследования проводили при увеличении микроскопа х 600 не менее, чем в 10 полях зрения микроскопа в каждом гистологическом препарате. При изучении

пейеровых бляшек определяли относительный объем светлых центров в лимфатических узелках.

Исследование аутопсийиого материала. В работе проанализировано 22 случая смерти детей в возрасте от 1,5 до 5,5 месяцев, умерших от острых кишечных инфекций, вызванных условно-патогенной кишечной микрофлорой. Вскрытия проведены на базе патологоанатомического отделения Пермской краевой детской клинической больницы в 2004-2008 гг. Бактериологическому исследованию подвергали образцы тканей легких, селезенки, стенки толстой кишки. Проводили гистологическое исследование образцов стенки толстой кишки и ткани почки. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином и пикрофуксином по ван Гизону.

Клинический раздел работы. В период с 2005 по 2009 гг. под нашим наблюдением в нефрологическом отделении городской детской клинической больницы им. П.И. Пичугина г. Перми находилось 144 ребенка с острым пиелонефритом и обострением хронического пиелонефрита. Возраст пациентов - от 1 года до 15 лет. Распределение в выборке больных по полу: 32 мальчика (22,2%) и 112 девочек (77,8%). В рамках работы проведено контролируемое (с применением стандартной терапии) рандомизированное открытое исследование по изучению эффективности включения в комплексную терапию пациентов с пиелонефритом препарата Вобэнзим и БАД «Ультрасорб». Стандартная (базисная) терапия включала назначение антибактериальных препаратов 14-дневным курсом; у пациентов с нарушением кишечного микробиоценоза в качестве средств стандартной терапии дополнительно использовали пробиотические средства (Бактисубтил®, Marion Merrell S.A., Линнекс®, LEK d.d.). Рандомизация проводилась методом конвертов. Критерии включения пациентов в исследование: наличие типичной для пиелонефрита клинической симптоматики и лабораторных данных, включая высев из мочи микроорганизмов в концентрации не ниже 105 КОЕ/мл. Критерии исключения пациентов из исследования: наличие грубых аномалий развития органов мочевыделительной системы.

Оценка результатов лечения проводилась на основе клинически ревалентных критериев эффективности и с объективизацией клинических данных при помощи лабораторных методов исследования. При проведении клинического обследования обращали внимание на данные анамнеза заболевания, учитывали выраженность симптомов интоксикации, в том числе длительность лихорадочного периода, болевого и дизурического синдромов. Лабораторное обследование включало проведение анализов крови: общеклинического и биохимического; анализа мочи: общеклинического, пробы Зимницкого, исследование суточного ритма произвольных мочеиспусканий, суточной

экскреции солей, бактериологическое исследование мочи. Забор мочи для проведения бактериологического исследования и интерпретация полученных результатов проводились в соответствии с приказом МЗ СССР № 535 от 22 апреля 1985 г. Пациентам, предъявлявшим жалобы на боли в животе и диспепсические расстройства, проводили также исследование кала на дисбактериоз. Исследование микробного пейзажа толстой кишки осуществляли согласно общепринятым методикам (Николаева с соавт., 2000; Леванова с соавт., 2001). Дополнительно в сыворотке крови 36 пациентов определяли уровень провоспалительных цитокинов: Интерлейкина б (IL-6), Интерлейкина 8 (IL-8) и фактора некроза опухоли альфа (ФНО-а) серологическими методами.

Инструментальное обследование включало проведение ультрасонографического исследования органов мочевыделительной системы, микционной цистографии и экскреторной урографии.

Методы статистической обработки материала. Статистический анализ выполнен при помощи программного пакета Biostat и приложения Microsoft ® Excel полнофункционального офисного пакета Microsoft Office 2007. При проведении клинических исследований, характеризуя выборки, определяли выборочные средние величины, ошибку среднего и выборочное стандартное отклонение, а также процент больных, обладающих изучаемым признаком, от общего числа пациентов в группе. Сравнение выборочных средних между собой осуществляли при помощи критерия Стьюдента; результаты повторных измерений оценивали при помощи парного критерия Стьюдента (Гланц, 1999). Наличие связи между признаками определяли при помощи коэффициента ранговой корреляции Спирмена (rs). Для оценки существенности различий между распределением качественных признаков в изучаемых выборках использовали критерий (Айвазян, 1985, Тюрин с соавт, 1995).

При проведении статистической обработки результатов экспериментальных исследований также вычисляли выборочное среднее, стандартную ошибку и стандартное отклонение, сравнение между собой двух выборок проводили при помощи критерия критерия Манна-Уитни. Для оценки различий между несколькими случайными выборками использовали метод Крускала-Уоллиса. Анализируя результаты повторных измерений, пользовались критерием Мак-Нимара. Для оценки существенности различий между распределением качественных признаков в изучаемых выборках использовали критерий у^1 (Айвазян, 1985, Тюрин с соавт, 1995).

Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в экспериментальных и клинических исследованиях принимали равным р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Результаты экспериментальных исследований

С целью экспериментального обоснования роли стрессогенной бактериемии в патогенезе острого пиелонефрита и доклинической апробации новых методов его патогенетической коррекции разработано два способа моделирования острого пиелонефрита.

1 серия экспериментов: моделирование острого пиелонефрита путем интраперитонеалыюго введения микробной суспензии. У животных с острым пиелонефритом, воспроизведенным путем внутрибрюшинного введения клинических изолятов лактозонегативной Е. coli № 2899 и St. saprophytics № 1256, к 14-м суткам эксперимента отмечалось статистически значимое по сравнению с исходным уровнем повышение количества лейкоцитов периферической крови, причем, наиболее выраженные изменения отмечались в группах, которым вводили урокультуру Е. coli. В группах, зараженных урокультурой St. saprophytics, достоверные изменения были выявлены только при использовании для заражения концентрации бактериальной взвеси 108 КОЕ/мл. В периферической крови животных, зараженных урокультурой Escherichia coli, к концу эксперимента отмечалось статистически значимое увеличение относительного и абсолютного количества сегментоядерных и палочкоядерных пейтрофилов и соответственно уменьшение количества лимфоцитов. У животных, зараженных урокультурой Staphylococcus saprophytics, статистически значимое увеличение количества сегментоядерных и палочкоядерных нейтрофилов отмечалось лишь при использовании культуры в высокой концентрации (108 КОЕ/мл).

При проведении бактериологического исследования установлено, что образцы биоматериала, полученные от интактных животных, были стерильны. Из ткани почек, селезенки и печени животных, которым уропатогенные штаммы вводили в высоких концентрациях (109 и 108 КОЕ/мл), в 100% случаев были изолированы культуры St. saprophytics и Е. coli, по свойствам идентичные использованным для заражения штаммам, в концентрациях, превышающих 105 КОЕ/мл. При использовании концентрации 106 КОЕ/мл положительные результаты микробиологического исследования были получены в меньшем проценте случаев (табл. 1).

Гистологическое исследование органов экспериментальных животных выявило наличие микробного воспаления в ткани почек, выражающееся в полнокровии дуговых, междольковых сосудов и капилляров, воспалительной инфильтрации межуточной ткани почки, стенки лоханки и мочеточника без формирования абсцессов, наличии дистрофических изменений в эпителиоцитах проксимальных извитых канальцев нефрона,

появлении белковых цилиндров в их просветах. Более выраженные изменения получены в экспериментальных группах, зараженных урокультурами бактерий в высоких концентрациях (109 КОЕ/мл и 108 КОЕ/мл). Патогистологические изменения документированы результатами морфометрических исследований (табл. 2).

Таблица 1

Результаты бактериологического исследования органов экспериментальных животных

Исследуемый материал Заражение 5аргоркуйсш 106 КОЕ/мл, п=10 Заражение Е. соИ 10® КОЕ/мл, п=10

Процент животных, от которых были получены высевы Концентрация выделенной культуры 51. ¡аргорЬуНсиз, КОЕ/г Процент животных, от которых были получены высевы Концентрация выделенной культуры Е. соН, КОЕ/г

Почки 60%* шМо4* 50%* <103*

Печень 70% 1& 70%

Селезенка 50%* <Ю3* 50%* <103*

*р<0,05 по сравнению с соответствующей экспериментальной группой, зараженной высокой

концентрацией культуры

Метод статистического анализа - критерий

Таблица 2

Результаты морфометрических исследований ткани почек экспериментальных животных

Показатель Интактные животные, п=10 Заражение 5/. заргорЪуйсиз 108 КОЕ/мл, п=10 Заражение Е. сой 10' КОЕ/мл, п=10

Толщина ГБМ, Мкм (М±ш) 10,37±0,864 22,52±2,212* 19,01±1,641*

Толщина БМ проксимальных извитых канальцев, Мкм (М±т) 34,68±7,038 51,79±6,32* 47,5±3,501*

Площадь мочевого пространства в почечном тельце, мкмг (М+СГ)) 1582,9±386,4 1122±235,5* 1090,034±394,4*

Площадь поперечного сечения капилляров в почечном тельце, мкмг(М±СЕ>) 16,24±2,85 48,96±9,242* 49,71±10,05*

Относительная площадь сечения в препарате, занимаемая воспалительной инфильтрацией, % от площади среза (М±т) 0 32,94+1,14* 26,27±4,71

*р-^),05 по сравнению с интактными животными

Метод статистического анализа - критерий Крускала-Уоллиса

Гистологическое исследование ткани тимуса выявило отек и разрежение коркового вещества, нечеткость границ между корковым и мозговым веществом, набухание и десквамацию эндотелиоцитов в сосудах коркового вещества. В периферических органах иммунной системы (селезенка, пейеровы бляшки тонкой кишки) выявлялись

пролиферативные процессы в Т- и В-зависимых зонах. В слизистой оболочке подвздошной кишки обнаружено большое количество дегранулирующих клеток Панета. В ткани печени в дольках (вокруг центральных вен) и в междольковой соединительной ткани наблюдалась умеренно выраженная воспалительная инфильтрация. Результаты исследования подтверждены данными морфометрических исследований (табл. 3).

Таблица 3

Результаты морфометрических исследований органов иммунной системы экспериментальных животных___

Показатель Интактные животные, п=Ю, М+ш Заражение St. saprophytics 10s КОЕ/мл, n=10, M±m Заражение E. coli 10 КОЕ/мл, n=10, M±m

Относительный объем коркового вещества в дольках тимуса, % 65,19+7,71 34,05+2,38* 36,22±2,71*

Относительный объем белой пульпы в селезенке, % 30,18±2,69 41,6б±4,91* 42,71 ±4,82*

Относительный объем ПАЯМ в селезенке, % 12,72±2,45 33,33+2,98* 31,51±3,94*

Относительный объем светлых центров в белой пульпе, % 8,9±1,25 3,99±0,52* 5,18+2,68*

Количество крипт с дегранулирующими клетками Панета в гистологических срезах подвздошной кишки, п 0,8+0,051 3,9±0,982* 3,5±0,763*

*р<0,05 по сравнению с иитактными животными

Метод статистического анализа - критерий Крускала-Уоллиса

2 серия экспериментов: моделирование острого пиелонефрита путем ректального введения микробной суспензии с последующим острым стрессовым воздействием. Следующим этапом экспериментального раздела работы было воспроизведение у лабораторных крыс острого пиелонефрита, индуцированного транслокацией условно-патогенных бактерий из просвета кишечника в системный кровоток. В качестве объекта транслокации был выбран клинический штамм лактозонегативной Escherichia coli X» 2899 в концентрациях 106 и 10® КОЕ/мл. Спустя 24 часа после ректального введения культуры животных подвергали острому холодовому стрессу (t°=0+2°C, экспозиция - 2 часа).

В периферической крови интактных животных количество лейкоцитов к окончанию эксперимента не отличалось от исходных показателей. У животных опытных групп к концу эксперимента отмечалось статистически значимое увеличение количества лейкоцитов периферической крови по сравнению с исходным уровнем, в большей степени в группе, которой вводили микробную суспензию Escherichia coli в концентрации 105 КОЕ/мл.

Результаты бактериологического исследования образцов органов экспериментальных животных представлены в табл. 4.

Таблица 4

Результаты бактериологического исследования органов экспериментальных животных, зараженных per rectum урокультурой Е. coli_

Исследуемый материал Интактные животные, рацион вивария, п=10, % животных в 1руппе Животные, подвергнутые ректальному введению Е coli (10' КОЕ/мл) с последующим острым стрессом, п=10, % животных в группе Животные, подвергнутые ректальному введению Е. coli (104 КОЕ/мл) с последующим острым стрессом, п=10, % животных в группе

Брыжеечные лимфоузлы Роста нет 100% 109 КОЕ/мл 60%* Ю2-10' КОЕ/мл

Ткань печени Роста нет 100% 107-109 КОЕ/мл 60%* 103 КОЕ/мл

Ткань селезенки Роста нет 100% 107-109 КОЕ/мл 40%* сЮ1 КОЕ/мл

Ткань почки Роста нет 100% 109 КОЕ/мл 40%* 103 КОЕ/мл

*р<0,05 по сравнению с группой, которой вводили микробную суспензию в концентрации 10 КОЕ/мл

Метод статистического анализа - критерий

Таблица 5

Патогистологические изменения в ткани почек экспериментальных животных, зараженных per rectum урокультурой Е coli, % животных в группе __

Выявленные патологические изменения Животные, которым вводили культуру Е. coli в концентрации 109 КОЕ/мл (I), п=10, % Животные, которым вводили культуру Е. coli в концентрация 10s КОЕ/мл (II), п=10, %

Полнокровие сосудов почек 100 60*

Краевое стояние лейкоцитов в венулах 60 30*

Наличие участков зернистой дистрофии проксимальных извитых канальцев 90 70

Воспалительная инфильтрация межуточной ткани почки и стенки лоханки 100 60*

Периваскулярно расположенные воспалительные инфильтраты 80 30*

Воспалительная инфильтрация стенки мочеточника 60 20*

* р<0,05 по сравнению с I

Метод статистического анализа - критерий

Гистологическое исследование аутопсийного материала выявило в ткани почек изменения микробно-воспалительного характера, типичные для острого пиелонефрита, более выраженные у животных, которым вводили урокультуру Я соИ в концентрации 109 КОЕ/мл (табл. 5). В центральных и периферических органах иммунной системы животных выявлены пролиферативные процессы, сопровождающиеся увеличением количества клеток лимфоидного ряда в Т- и В-зависимых зонах и формированием светлых центров в лимфоидных узелках селезенки и пейеровых бляшек. В ткани печени наблюдались умеренно выраженные изменения воспалительного характера, преимущественно в группе животных, зараженных культурой Е. сой в концентрации 10' КОЕ/мл (табл. 6).

Таблица 6

Патогистологические изменения в органах иммунной системы и ткани печени экспериментальных животных, зараженных per rectum урокультурой Е. coli, % животных

в группе

Выявленные патологические изменения, % животных Животные, которым вводили культуру Е. coli в концентрации 109 КОЕ/мл (I, n=10k% Животные, которым вводили культуру Е. coli в концентрации 106 КОЕ/мл (11, п=10), %

Тимус

Отек коркового вещества тимуса 80 40*

Набухание и десквамация эндотелиоцитов в корковом веществе 90 50*

Краевое стояние лейкоцитов в венулах с высоким эндотелием 60 40*

Селезенка

Отек ткани селезенки 80 50*

Набухание эндотелия капилляров красной пульпы и маргинальной зоны 90 30*

Наличие светлых центров в лимфатических узелках селезенки 100 50*

Краевое стояние лейкоцитов в венулах 70 70

Утолщение ретикулярных волокон в строме селезенки 50 50

Подвздошная кишка

Воспалительная инфильтрация слизистой оболочки подвздошной кишки 90 70*

Набухание и десквамация эндотелия сосудов собственной пластинки слизистой оболочки 50 30*

Выявление дегранулирующих клеток Пакета в дне крипт 90 50*

Выявление пролиферативных процессов в лимфатических узелках пейеровых бляшек 100 90

Печень

Полнокровие центральных вен 80 30*

Воспалительная инфильтрация паренхимы печени 90 40*

Вакуольная дистрофия гепатоцитов 100 40*

Полнокровие синусоидных капилляров 70 20*

Воспалительная инфильтрация междольковой соединительной ткани 60 30*

* р<0,05 по сравнению с I

Метод статистического анализа - критерий ^

Таким образом, для моделирования в условиях эксперимента острого пиелонефрита, вызванного как интраперитонеальным введением урокультур условно-патогенных бактерий, так и ректальным их введением с последующим острым стрессом, целесообразно использовать культуры этих микроорганизмов в высоких концентрациях -108 КОЕ/мл для стафилококка и 109 КОЕ/мл при заражении животных культурой кишечной палочки.

На животных с экспериментальным пиелонефритом, вызванным ректальным введением урокультуры Е. coli и острым стрессом, исследована эффективность диеты с высоким содержанием метаболизированных пищевых волокон в составе пребиотического продукта «Ультрасорб». Бактериологическое исследование содержимого толстой кишки

интактных животных выявило, что высокое содержание в рационе пищевых волокон при добавлении к корму «Ультрасорба» в течение 14 суток обеспечивает оптимальные показатели (количественные и качественные) кишечного микробиоценоза (табл. 7).

Таблица 7

Количественная характеристика микроорганизмов, вегетирующих в биотопе толстой кишки интактных животных, получавших в дополнение к рациону вивария «Ультрасорб»

(lg КОЕ на 1 г сырой массы фекалий), n=10

Микроорганизм Содержание бактерий в кале животных, КОЕ/г, ^

Исходные данные Спустя 14 дней от начала

(М±т) эксперимента (М ± т)

Bifidobacteria 6,4 ±1,8 6,8 ±1,1

Lactobacillus 7,2 ± 1,7 8,2 ±0,5

Enterobacteriacea 5,6 ±0,5 5,0 ±1,0

Enterobacteriacea 5,6 ±0,5 0*

(лактозонегагивные)

Enterococcus spp 8,0 8,0

Staphylococcus spp 5,8 ±0,8 5,2 ±0,5

Candida spp 1,8 ± 1,1 0*

Saccharomyces spp 2,4 ± 1,5 0*

Bacillus spp 2,4 ±1,5 2,0 ± 1,2

* р<0,05 по отношению к исходным показателям Метод статистического анализа - критерий Манна-Уитни

При сопоставлении результатов эксперимента по моделированию пиелонефрита на фоне стрессогенной бактериемии установлено, что у животных опытных групп, находящихся на стандартном рационе вивария, к концу эксперимента отмечалось увеличение количества лейкоцитов периферической крови (р<0,05), абсолютного и относительного количества лимфоцитов (р<0,05) и уменьшение количества сегментоядерных нейтрофилов (р<0,05). Подобные изменения отсутствовали у животных, подвергнутых заражению и стрессу и получавших «Ультрасорб» - как в группах, получавших антибиотик, так и в группах без антибактериальной терапии. Вместе с тем, у животных, получавших антибактериальную терапию на фоне стандартного рациона вивария, отмечалось увеличение относительного и абсолютного количества лимфоцитов и моноцитов и уменьшение количества сегментоядерных нейтрофилов, что свидетельствовало о сохраняющихся в данном случае изменениях периферической крови на стрессовое воздействие. Прием «Ультрасорба» также способствовал достоверному уменьшению процента положительных результатов бактериологического исследования и достоверному уменьшению концентрации выделяемых из аутопсийного материала культур Е. соЫ (табл. 8). Оптимальный результат достигнут в группах, получавших одновременно антибактериальную терапию и «Ультрасорб» (группы VII, VIII, табл. 8).

К концу эксперимента у животных с пиелонефритом, получавших в дополнение к стандартному рациону вивария «Ультрасорб», признаки воспаления в ткани почек и печени, а также описанные ранее изменения органов иммунной системы были в

значительной степени менее выражены в сравнении с животными, получавшими типовом рацион вивария, и встречались у меньшего процента животных.

У животных, подвергнутых заражению и стрессу, гистологическое исследование надпочечников с использованием морфометрических методов выявило гипертрофию коркового слоя за счет увеличения размеров пучковой зоны (р<0,05). У животных, получавших «Ультрасорб», размеры пучковой зоны не имели существенных отличий от параметров интактных животных (рис. 1).

0.(30

0.40

0,30

0.20

0.10

0.00

Ширина пучковой зоны коркового вещества 1адпочечников жччи-рнлнчиа.и.ныч животных, мм

Ж 0.22

§К

0,41

0,30

ш

Ннтакт животные Опы1..ставд рацион Опыт, сшнд рацион н

"Улырпсоро"

Метод статистического анализа - критерий Крускала-Уоллиса Представлены выборочные средние и стандартные отклонения

Рис. 1. Ширина пучковой зоны коркового вещества надпочечников экспериментальных животных

Таблица 8

Результаты бактериологического исследования органов экспериментальных животных

VII группа VIII группа IX группа

1 группа II группа III группа IV группа V группа VI группа (£. coli 10', (£. coli 109, (£. coli 109,

Исследуемый (интактные (интактные (£. coli 109, (£. coli 106, (£. coli 109, (£. coli 106, рацион + БАД рацион + БАД стандартный

материал животные, животные, стандартный стандартный рацион + БАД рацион + БАД «Ультрасорб» «Ультрасорб» рацион +

стандартный рацион + БАД рацион), рацион), п=10, «Ультрасорб»), «Ультрасорб»), пролонгир. короткий курс клафоран),

рацион), «Ультрасорб»), п=10, % % животных в л=10, % л=10, % курс + + клафоран), п=10, %

п=10, % п=10, % животных в группе, животных в животных в клафоран), п=10, % животных в

животных в животных в группе. концентрация группе. группе, п=10, % животных в группе,

группе. группе, концентрация выделенной концентрация концентрация животных в группе. концентрация

концентрация концентрация выделенной культуры выделенной выделенной группе. концентрация выделенной

выделенной выделенной культуры Е. coli культуры культуры концентрация выделенной культуры

культуры культуры К coli Е. coli Е. coli выделенной культуры £. coli

£. coli Е. coli культуры Е. coli

Е. coli

Брыжеечные Роста нет Роста нет 100% 60%* 60%* 20%** 10% 10% 10%

лимфоузлы 109 КОЕ/мл 102-Ю3 102-103 <103 КОЕ/мл 103 КОЕ/мл 104 КОЕ/мл 106 КОЕ/мл

КОЕ/мл КОЕ/мл

Ткань печени Роста нет Роста нет 100% 60%* Роста нет Роста нет Роста нет Роста нет Роста нет

107-109 10' КОЕ/мл

КОЕ/мл

Ткань Роста нет Роста нет 100% 40%* Роста нет Роста нет Роста нет Роста нет 10%

селезенки 107-10' <103 КОЕ/мл ю'-ю4

КОЕ/мл КОЕ/мл

Ткань почки Роста нет Роста нет 100% 40%* 60%* 20%** Роста нет Роста нет 10%

109 КОЕ/мл 103 КОЕ/мл 102-103 <103 КОЕ/мл <103 КОЕ/мл

КОЕ/мл

*р<0,05 по сравнению с III группой

**p<fl,05 по сравнению с IV группой Метод статистического анализа - критерий

Иммуногистохимические исследования стенки толстой кишки показали, что включение в рацион «Ультрасорба» способствует нормализации процессов апоптоза и клеточной пролиферации в эпителии толстой кишки (табл. 9, рис. 2, 3).

Таблица 9

Индекс апоптоза (1АПТ) и индекс клеточной пролиферации (ИП) в эпителии толстой

Экспериментальная группа Индекс апоптоза (1АПТ), % Индекс пролиферации (ИП), %

I** (М ± т) 5,52±0,38 32,34±1,16

II (М ± т) 4,87±0,46 29,54±2,46

III (М ± т) 19,86±2,58* 12,53+1,89*

IV (М±т) 14,52±1,7б* 19,55+2,38*

V (М ± т) 9,53+0,28* 33,46+1,51

VI СМ ± т) 5,78±0,б7 31,34±1,15

VII (М±т) 4,42±0,81 28,46±2,51

VIII (М ± т) 5,56±0,92 34,42±1,83

IX (М ± т) 11,86±0,54* 29,15±2,55

*р<0,05 по сравнению с группой 1

** нумерация, состав и численность экспериментальных групп соответствует данным табл. В Метод статистического анализа — критерий Крускала-Уоллиса

Рис. 2. Небольшое количество пролиферирующих клеток (экспрессия регуляторного протеина Ki-67) в эпителии толстой кишки крыс, подвергшихся ректальному заражению урокультурой Escherichia coli и последующему острому холодовому стрессу х 600

Рис. 3. Умеренно выраженная экспрессия Кл-67 в эпителии толстой кишки крыс, получавших пребиотический продукт «Ультрасорб» и в качестве экспериментальной терапии Клафоран х 600

Исследование в ткани почек полуколичественным методом экспрессии адгезивных молекул, относящихся к ICAM-1, показало, что у интактных животных молекулы межклеточной адгезии ICAM-1 экспрессируются единичными эндотелиальными клетками перитубулярных капилляров и отдельными эпителиоцитами проксимальных извитых канальцев (рис. 4). Максимально выраженная экспрессия ICAM-1 в ткани почек выявлена у животных с пиелонефритом, вызванным введением Е. coli в концентрации 109 КОЕ/мл и

не получавших терапии (рис. 5). При использовании антибактериальной терапии экспрессия 1САМ-1 выражена в значительно меньшей степени, так же как и гистологические признаки воспаления. При включении в рацион животных «Ультрасорба» выраженность экспрессии 1САМ-1 соответствует результатам, полученным в группах интактных животных.

Рис. 4. Криостатный срез коркового вещества почки интактного животного (крысы).

Экспрессия 1САМ-1 в эндотелии перитубулярных капилляров и эпителиоцитах проксимальных извитых канальцев х 600.

Рис. 5. Криостатный срез коркового вещества почки животного, зараженного per rectum урокультурой Escherichia coli в концентрации 109 КОЕ/мл с последующим острым стрессом. Выраженная экспрессия ICAM-1 в эндотелии перитубулярных капилляров, капилляров клубочков и эпителиоцитах проксимальных извитых канальцев х 600

Полученные результаты можно объяснить физиологическими эффектами короткоцепочечных жирных кислот, содержащихся в «Ультрасорбе» - такими как обеспечение колонизационной резистентности, энергообеспечение эпителия толстой кишки, участие в регуляции процессов пролиферации и дифференцировки кишечного эпителия, процессов апоптоза (Нага е1 а!., 2000; МНошс е1 а!., 2000; АшЗоЬ е1 а]., 2003), а также, по-видимому, иммунотропными, противовоспалительными,

противоаллергическими эффектами, реализующимися на уровне целого организма (Кузнецов и соавт., 2005; Ыш е! а1., 1997; 8сЪе1у е1 а!., 2002).

Исследование эффективности включения препаратов Вобэнзим и Суперлимф в комплексную терапию острого пиелонефрита проводили на модели с интраперитонеальным заражением (1 серии экспериментальных исследований).

Согласно результатам бактериологического исследования, при проведении терапии только Цефазолином у 60% животных сохранялась бактериемия, обусловившая развитие

микробного воспаления в ткани почек (табл. 11). В экспериментальной группе, зараженной урокультурой Е. coli и получавшей, помимо инъекций Цефазолина, Вобэнзим перорально, высев Е. coli, идентичной по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам штамму, использованному для заражения, был получен лишь от 10% животных в концентрации 102 КОЕ/г, что достоверно отличалось от результатов, полученных у животных, находившихся только на антибактериальной терапии (табл. 10).

Таблица 10

Результаты бактериологического исследования органов экспериментальных животных, зараженных урокультурой Е. coli Ks 2899 в концентрации 109 КОЕ/мл и

получавших терапию

Исследуемый материал Терапия Цефазолином (I), п=10 Комбинированная терапия (Цефазолин + Вобэнзим) (II), п=10

Процент животных, от которых были получены высевы, % Концентрация выделенной культуры Е. coli, КОЕ/г Процент животных, от которых были получены высевы, % Концентрация выделенной культуры Е. coli, КОЕ/г

Почки 60 <105 10* <102 КОЕ/г*

Печень 50 <10J 10* <10' КОЕ/г*

Селезенка 40 <10J 10* <10' КОЕ/г*

* р<0,05 по сравнению с I

Метод статистического анализа - критерий ^

Гистологическое исследование также продемонстрировало преимущества комбинированной терапии перед мототерапией Цефазолином. У животных, получавших Вобэнзим, достоверно реже отмечались гистологические признаки воспаления в ткани почек - такие как инфильтрация интерстициальной ткани и стенки лоханки полиморфноядерными нейтрофилами, краевое стояние лейкоцитов в венулах, периваскулярные воспалительные инфильтраты, дистрофические изменения эпителиоцитов проксимальных извитых канальцев (табл. 11). Морфометрическими исследованиями установлено, что у животных, дополнительно к антибиотику получавших Вобэнзим, отмечалась более выраженная положительная динамика со стороны показателей, характеризующих выраженность воспалительных изменений в межуточной ткани почки (толщина базальной мембраны проксимальных извитых канальцев, относительная площадь воспалительных инфильтратов) и динамику сосудистых нарушений (площадь поперечного сечения капилляров в клубочках) (табл. 12).

При проведении морфометрического исследования органов иммунитета установлено, что в группе, получавшей Вобэнзим, удельный объем коркового вещества в дольках тимуса соответствовал показателям интактных животных, отмечалось увеличение объема белой пульпы в селезенке, в основном, за счет увеличения объема ПАЛМ, в пейеровых бляшках увеличивался относительный объем межузелковых зон, являющихся, так же, как и ПАЛМ, тимусзависимыми зонами (табл. 13). По-видимому, выявленные

закономерности объясняются тем, что протеолитические энзимы способны не только повышать цитотоксический эффект моноцитов-макрофагов и естественных киллерных клеток, но и увеличивать количество Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов (Leskovar, 1990; Kim et al„ 1991; Desser et al., 1993).

Таблица 11

Характер патогистологических изменений в ткани почек экспериментальных животных, получавших терапию (% животных в группе)__

Выявленные патологические изменения Терапия Цефазолином (п=10), % Комбинированная терапия (Цефазолин + Вобэнзим) (п=Ш), %

Полнокровие сосудов почек 40 30

Краевое стояние лейкоцитов в венулах 30 0»

Наличие участков зернистой дистрофии проксимальных извитых канальцев 50 20*

Воспалительная инфильтрация межуточной ткани почки и стенки лоханки 60 10*

Периваскулярно расположенные воспалительные инфильтраты 20 0*

Воспалительная инфильтрация стенки мочеточника 0 0

* р<0,05 по сравнению с группой, получавшей Цефазолин

Метод статистического анализа - критерий ^

Таблица 12

Результаты морфометрического исследования ткани почек экспериментальных животных __

Показатель Интактные животные, п=10 Заражение Е. coli, п=10 Терапия Цефазолином, п=10 Терапия Цефазолином и Вобэнзимом, п=Ю

Толщина ГБМ, Мкм (М ± т) 10,37±0,864 19,01±1,641* 14,52±1,212 12,85 ±0,754

Толщина базальной мембраны проксимальных извитых канальцев, Мкм (М ± ш) 34,68±7,038 47,5±3,501* 38,79±6,32 35,51±4,087

Площадь мочевого пространства в почечном тельце, мкм2 (М ± СО) 1 582,9±386,4 1090,034±394,4* 1443±483,9 1522±235,5

Площадь поперечного сечения капилляров в почечном тельце, мкм2 (М ± СЭ) 16,24±2,85 49,71±10,05* 23,66±2,902 21,96±1,242

Площадь сечения в препарате, занимаемая воспалительной инфильтрацией % (М±ш) 0 2б,27±4,7* 8,942±1,144** 3,504±0,667**

*р<0,05 по сравнению с интактными животными; **р<0,05 по сравнению с группой, подвергнутой

заражению и не получавшей терапии

Метод статистического анализа - критерий Крускала-Уоллиса

Таблица 13

Морфометрическое исследование органов иммунной системы экспериментальных животных

Показатель Интактные животные, п-10, (М±т) Заражение Е. соН, п=10, (М±т) Терапия Цефазолином, п=10, (М±т) Терапия Цефазолином и Вобэнзимом, п=10, (М + т)

Удельный объем белой пульпы в селезенке, % 30,18±2,69 42,71±4,82* 37,51±1,83* 47,71+4,82*

Удельный объем ПАЛМ, % 12,72±2,45 31,51+3,94* 30,51г3,94* 40,14+3,86*

Удельный объем коркового вещества в дольках тимуса, % 65,19±7,71 36,22±2,71 36,32+1,47 49,84±2,38

Количество крипт в срезах подвздошной кишки, содержащих дегранулирующие клетки Панета, п 0,8±0,051 3,5±0,763* 1,6±0,043 2,37±0,181*

Удельный объем межузелковых зон в пейеровых бляшках, % 25,01±2,52 31,22±1,46* 29,27±2,34* 33,08±1,59*

*р<0,05 по сравнению с интактными животными

Метод статистического анализа - критерий Крускала-Уоллиса

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о целесообразности включения в комплексную терапию пиелонефрита препарата Вобэнзим.

В работе исследована эффективность применения препарата Суперлимф в комплексной терапии пиелонефрита. Установлено, что минимальное количество животных с экспериментальным пиелонефритом, из органов которых была выделена культура 5г. мргоркупсиь, выявлено в группе, получавшей комбинированную терапию (табл. 14).

Таблица 14

Бактериологическое исследование аутопсийного материала, полученного от животных, зараженных урокультурой 5г. харгоркучких №1256 в концентрации 108 КОЕ/мл

и получавших экспериментальную терапию

Исследуемый материал Терапия Цефазолином, п=10 Терапия Суперлимфом, п=10 Комбинированная терапия (Цефазолин + Суперлимф), п=10

Процент животных, от которых были получены высевы, % Концентрация выделенной культуры 5/. .торгорйупсш, КОЕ/г Процент животных, от которых были получены высевы, % Концентрация выделенной культуры 5/. заргоркуйсия, КОЕ/г Процент животных, от которых были получены высевы, % Концентрация выделенной культуры 5/. КОЕ/г

Почки 20 юМо1 40 <105 10* ** <103

Печень 20 <103 20 <103 10*** <103

Селезенка 20 <103 40 <103 0* »* <103

* р<0,05 по сравнению с результатами в группе, получавшей Цефазолин ** р<0,05 по сравнению с результатами в группе, получавшей Суперлимф Метод статистического анализа - критерий У2

Таблица 15

Результаты гистологического исследования ткани почек экспериментальных животных

Выявленные патологические изменения Терапия Цефазолином (п=10), % животных в группе Терапия Суперлимфом (п=10), % животных в группе Комбинированная терапия (Цефазолин + Суперлимф) (п=10), % животных в группе

Полнокровие сосудов почек 50 40 20* **

Краевое стояние лейкоцитов в венулах 30 30 20

Наличие участков зернистой дистрофии проксимальных извитых канальцев 40 30 20*

Воспалительная инфильтрация межуточной ткани почки и стенки лоханки 30 50 20**

Периваскулярно расположенные воспалительные инфильтраты 20 30 0 * **

Воспалительная инфильтрация стенки мочеточника 20 20 0* **

* р<0,05 по сравнению с результатами в группе, получавшей Цефазолин ** р<0,05 по сравнению с результатами в группе, получавшей Суперлимф Метод статистического анализа - критерий ^

Таблица 16

Результаты морфометрических исследований органов иммунной системы

экспериментальных животных

Показатель Интакгные животные, п=10, (М±т) Заражение 5/. •шргорЛуи'«« 108 КОЕ/мл, п=10, (М±т) Заражение Яг. ¡аргор/гуИсш 106 КОЕ/мл, п=10, (М±т) Заражение 108 КОЕ/мл, терапия Цефазолином, п=10, (М ± ш) Заражение 10* КОЕ/мл, терапия Суперлимфом, п=10, (М±т) Заражение 10" КОЕ/мл, терапия Цефазолином и Суперлимфом, п=10, (М ± ш)

Относительный объем белой пульпы в селезенке, % 30,18±2,69 41,66±4,91* 34,88±1,64** 35,94±2,59 39,5б±3,49* 38,48±2,75* ***

Удельный объем светлых центров в лимфоидных узелках белой пульпы селезенки, % 8,9+1,25 3,99±0,52* 7,22±0,18 10,67+1,21* 17,66±2,78* 14,23+1,44*

Удельный объем коркового вещества в дольках тимуса, % 65,19±7,71 34,05±2,38* 39,18±3,96* ** 47,52±3,55* 63,84±6,98 68,57±7,53 ***

Количество крипт подвздошной кишки, содержащих дегранулирующие клетки Панета, п 0,8±0,051 3,9±0,982* 2,8±0,04б* 1,7±0,023 4,11+0,191* 5,3±0,342* ***

Удельный объем светлых центов в лимфатических узелках пейеровых бляшек, % 20,01±2,52 15,24+2,39* 18,92±1,55* 33,62+0,59* 39,22±1,57* 42,37±1,25* ***

*р<0,05 по сравнению с интактными животными

** р<0,05 по сравнению с группой, зараженной Si. Saprophytics в концентрации Ю8 КОЕ/мл

*** р<0,05 по сравнению с группами, получавшими монотерапию

Метод статистического анализа - критерий Крускала-Уоллиса

Гистологические признаки воспаления в ткани почек и стенке лоханки (сосудистые расстройства, воспалительная инфильтрация, дистрофические изменения эпителиоцитов канальцев) также с достоверно меньшей частотой обнаруживались в этой экспериментальной группе (табл. 15). Кроме того, отмечалась нормализация объема коркового вещества в тимусе, увеличивался относительный объем светлых центров в лимфоидных узелках белой пульпы селезенки и удельный объем светлых центров в лимфоидных узелках пейеровых бляшек подвздошной кишки; в криптах подвздошной кишки увеличивалось количество дегранулирующих клеток Панета (табл. 16). Полученные результаты объясняются тем, что Суперлимф обладает широким спектром иммуномодулирующих эффектов и активирует механизмы как клеточного, так и гуморального иммунитета (Ковальчук, 2006).

Таким образом, результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о целесообразности включения в комплексную терапию пиелонефрита препарата Суперлимф, поскольку он не только обеспечивает оптимизацию иммунного ответа, но и способствует уменьшению воспалительных изменений в ткани почек.

Результаты клинических исследований

Полученные в эксперименте данные, подтверждающие роль стрессогенной бактериемии в развитии острого пиелонефрита и возможность ее предотвращения, способствовали получению клинических доказательств феномена бактериальной транслокации.

С целью клинического подтверждения возможности транслокации микроорганизмов из просвета толстой кишки в ткань почек проанализировано 22 случая смерти детей в возрасте от 1,5 до 5,5 месяцев от острых кишечных инфекций, вызванных условно-патогенными бактериями, в 2004-2008 гг. в г. Перми и Пермском крае. Во всех случаях клиническая картина манифестировала симптомами острой кишечной инфекции. Проведенное бактериологическое исследование внутренних органов (толстой и тонкой кишки, легких и селезенки) выявило у 31,82% умерших полимикробную бактериемию, вызванную условно-патогенными микроорганизмами, преобладающими из которых были бактерии родов Staphylococcus и Klebsiella. У 15 детей (68,18%) из всех биотопов была выделена монокультура; при этом структура микроорганизмов выглядела следующим образом (рис. 6).

20,00%

13,33%

33,33%

26,67%

6,67%

□ Escherichia coli

□ Proteus spp

и Enterococcus spp

□ Klebsiella spp

Я Acinetobacter spp

Рис. 6. Спектр идентичных культур бактерий, выделенных в монокультуре из всех биотопов детей, умерших от острого энтероколита, п=15.

При проведении гистологического исследования стенок тонкой и толстой кишки умерших детей отмечалось полнокровие сосудов слизистой и подслизистой оболочек и выраженная десквамация эпителиальных пластов с поверхности слизистой оболочки (табл. 17). Эрозивные и небольшие язвенные дефекты выявлены в слизистой оболочке тонкой (63,63%) и толстой кишки (31,81%); воспалительные изменения слизистой оболочки - в тонкой (86,36%) и в толстой кишке (81,81%). В ткани почек отмечались признаки воспаления в интерстициальной ткани почек и стенках чашечек и лоханки (табл. 18, рис. 7). Об инфекционной природе воспаления свидетельствовало обнаружение микроорганизмов при микроскопии препаратов. То есть, в почках детей, умерших при клинической картине острой кишечной инфекции, вызванной условно-патогенными микроорганизмами, при проведении гистологического исследования были выявлены признаки острого пиелонефрита.

Таблица 17

Результаты гистологического исследования стенки толстой и тонкой кишки детей, умерших от острого энтероколита, вызванного условно-патогенной микрофлорой, п=22

Выявленные гистологические изменения В тонкой кишке, % больных с выявленными изменениями В толстой кишке, % больных с выявленными изменениями

Полнокровие сосудов подслизистой оболочки 90,91 90,91

Десквамация эпителиоцитов с поверхности слизистой оболочки 77,27 90,91

Эрозивные и язвенные дефекты слизистой оболочки 63,63 31,81

Воспалительная инфильтрация собственной пластинки слизистой оболочки 86,36 81,81

Метод статистического анализа - критерий

Таблица 18

Результаты гистологического исследования ткани почек детей, умерших от острого энтероколита, вызванного условно-патогенной микрофлорой, п=22__

Выявленные гистологические изменения % больных с выявленными изменениями

Полнокровие и отек интерстициальной ткани почки 95,45

Отек и разволокнение капсулы почки 90,91

Дистрофические изменения эпителиоцитов проксимальных извитых канальцев 45,45

Воспалительные изменения в слизистой оболочке почечных чашечек и лоханки 77,27

Изменения в подслизистой оболочке чашечек и лоханки (полнокровие сосудов, отек, воспалительная инфильтрация) 63,63

Выявление микроорганизмов при микроскопии гистологических препаратов 31,81

Метод статистического анализа - критерий ^

Рис. 7. Острый серозно-десквамативный пиелит у ребенка, умершего от острого инфекционного энтероколита, вызванного гемолизирующей Escherichia coli. Инфильтрация подслизистой оболочки почечной лоханки лимфоцитами, и полиморфноядерньгми лейкоцитами. Окраска гематоксилином и эозином х 150

При проведении клинических исследований углубленное клинико-лабораторное обследование 144 детей с острым и обострением хронического пиелонефрита наряду с классической клинической картиной, наблюдаемой у большинства детей, позволило выделить группу больных, у которых, помимо типичных клинических и лабораторных проявлений пиелонефрита, отмечались дисфункция кишечника, болезненность при пальпации по ходу толстой кишки, а также наличие в анамнезе кишечного дисбактериоза. Выделение данного контингента больных из общей выборки позволило изучить в клинических условиях процессы бактериальной транслокации кишечной микрофлоры и эффективность применения пищевой добавки «Ультрасорб» в комплексной терапии пиелонефрита.

Таким образом, наблюдаемые пациенты были разделены на 2 клинические группы.

I группу составили 84 ребенка с пиелонефритом, не имевших диспепсических расстройств и болезненности при пальпации по ходу толстой кишки (при проведении объективного обследования). Средний возраст детей в группе: 5,7 ± 1,3 л.

II группу составили 60 детей с пиелонефритом, имевших диспепсические расстройства и боли в животе; в их анамнезе имелись указания на наличие кишечного дисбактериоза, ранее подтвержденного результатами лабораторных исследований. Эту группу составили преимущественно дети раннего и дошкольного возраста: средний возраст обследованных пациентов - 2,9 ± 0,4 г.

При проведении бактериологических исследований анализ диагностически значимых высевов микроорганизмов из мочи детей с пиелонефритом показал преобладание в структуре уропатогенов бактерий рода Escherichia (44,8%). С несколько меньшей частой встречались представители грампозитивной микрофлоры - Staphylococcus spp (17,7%), Streptococcus spp (9,5%), Enterococcus spp (9,8%). Значительно реже причиной пиелонефрита были грамотрицательные условно-патогенные бактерии - Klebsiella spp (8,4%) и Proteus spp (2,6%), а также неферментирующие грамотрицательные бактерии -Pseudomonas aeruginosa (2,0%) и Acinetobacter spp (5,2%), являющиеся возбудителями госпитальных инфекций (рис. 8). Полученные результаты согласуются с данными отечественных (Сафина с соавт., 2003, Коровина с соавг., 2003; Козлова, 2007) и зарубежных авторов (Ronald, 2003).

45.00% 40,00% 35.00% 30.00% 25.00% 20.00% 15.00% 10.00% 5.00% 0.00%

Рис. 8. Таксономическая принадлежность микроорганизмов, выделенных из мочи пациентов с пиелонефритом в концентрации, превышающей 10' КОЕ/мл

Исследование кала на дисбактериоз в наших исследованиях было проведено только детям II группы. Выявлено уменьшение количества в просвете толстой кишки

представителей индигенной микрофлоры - бифидобактерий (91,67%) и лактобацилл (78,33%). На этом фоне определялось изменение состава популяции кишечной палочки: уменьшение содержания полноценной Е. coli (70,0%), рост количества штаммов Е. coli с гемолитическими свойствами (75,0%) и появление лактозонегативной Е. coli (53,33%). Отмечалось уменьшение содержания энтерококков (58,33%), увеличение содержания дрожжеподобных грибов рода Candida (33,33%), появление в высоких концентрациях условно-патогенных микроорганизмов (табл. 19).

Среди условно-патогенных бактерий преобладали представители рода Staphylococcus (St. aureus, St. saprophyticus, St. haemolyticus, St. epidermidis) и представители грамнегативной кишечной микрофлоры - бактерии родов Klebsiella (Klebsiella pneumonia, Klebsiella oxytoca), Proteus (Proteus mirabilis, Proteus myxofaciens), Enterococcus (Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium), Enterobacter (Enterobacter faecalis), Citrobacter (Citrobacter freundï). В отдельных случаях выделены представители неферментирующих грамотрицательных анаэробных бактерий - родов Acinetobacter и Pseudomonas. При этом от некоторых пациентов данные микроорганизмы были изолированы в ассоциациях.

Таблица 19

Процент больных II группы, имеющих изменения качественного и количественного состава биотопа толстой кишки (п=60)_

Характер выявленных патологических изменений п=60

Абс. %

Уменьшение количества бифидобактерий 55 91,67

Уменьшение количества лаисгобактерий 47 78,33

Снижение содержания полноценной Е.соН 42 70,0

Увеличение содержания штаммов Е.соИ с гемолитическими свойствами 45 75,0

Появление лактозонегативной Е.со11 32 53,33

Наличие условно-патогенных энтеробаетерий 59 98,33

Изменение содержания энтерококков 35 58,33

Повышение содержания дрожжеподобных грибов 20 33,33

Метод статистического анализа - критерий ^

От 20 детей II группы (33,33%) в процессе бактериологического исследования мочи и фекалий, проведенного до начала этиотропной и патогенетической терапии, удалось выделить 20 пар идентичных культур условно-патогенных бактерий. Идентичность выделенных чистых уро- и копрокультур устанавливали на основании культуральных, тинкториальных, морфологических и биохимических свойств, а также на основании тождественности антибиотикограмм и фаголизабельности культур. Этот факт косвенно

свидетельствует о несостоятельности гематоинтестинального барьера и возможности проникновения патогенов из просвета толстой кишки в системный кровоток и ткань почек. В структуре идентичных копро- и урокультур преобладали Klebsiella spp (40%) и Escherichia coli с измененными свойствами - гемолитическая (15%) и лактозонегативная (20%), далее следовали бактерии родов Staphylococcus (15%) и Proteus (10%).

Как в экспериментальном разделе нами бьио показано, включение в рацион животных с пиелонефритом пребиотического продукта «Ультрасорб» предупреждает транслокацию условно-патогенной микрофлоры из кишечника во внутреннюю среду организма, тем самым, препятствуя развитию пиелонефрита при остром стрессе. В связи с этим представляется актуальным исследование эффективности включения «Ультрасорба» в терапию детей с пиелонефритом.

В зависимости от лечения слепым методом II группа была разделена на две подгруппы: IIa (группа сравнения) - 30 детей, получавших стандартную (базисную) терапию, а для коррекции кишечного дисбактериоза — пробиотические препараты (бактисубтил, линнекс), IIb (основная группа) - 30 детей, получавших стандартную терапию в комплексе с пребиотическим продуктом «Ультрасорб». Группы сопоставимы по возрасту, полу, основным клинико-лабораторным показателям до начала терапии (р>0,05).

Стандартная (базисная) терапия включала назначение антибактериальных препаратов 14-дневным курсом: антибиотиков группы цефалоспоринов - Цефотаксима, Медоцефа (цефоперазон), Супракса (цефиксим) или полусинтетических пенициллинов -Аугментина (амоксициллин + клавулановая кислота). «Ультрасорб» применяли в дополнение к лечебной диете из расчета 0,045 г/кг массы тела (исходя из дозировки, рекомендуемой взрослым пациентам) в течение 14 суток пребывания пациентов в стационаре.

Клинические исследования эффективности использования различных схем лечения (упоминаемых здесь и далее) проведены в соответствие с Хельсинской декларацией Всемирной медицинской ассоциации (рекомендациями для врачей по проведению биомедицинских исследований на людях), пересмотренной на 48-й Генеральной Ассамблее, Сомерсет Уэст, ЮАР, октябрь 1996 г.

Выявлено, что через 3 дня от начала лечения количество детей с болями в животе достоверно снизилось в обеих группах (pj^i-2>0,05). Анализ динамики нормализации стула показал, что к 3-м суткам нарушенный характер стула выявлялся у 10,0% больных в группе сравнения (p^o-i>0,05) против одного ребенка в основной группе (3,33%; р^о-

2<0,05; p^i-2<0,05). Что касается регрессии проявлений интоксикационного синдрома,

быстрее всего у детей обеих групп исчезали лихорадка и беспокойство (у детей раннего возраста) или жалобы на головную боль (у дошкольников и школьников), без достоверных различий между группами (p^i.2>0,05). Аппетит заметно улучшился к 3-м

суткам у 83,33% детей группы сравнения (IIa) и у 96,67% детей основной группы (IIb) (р^|.2<0,05). При оценке дизурического синдрома беспокойство при мочеиспускании у

детей раннего возраста и жалобы на болезненные мочеиспускания у дошкольников и детей школьного возраста сохранялись у 10% больных группы сравнения (P^o i<0,05) и

не выявлялись у детей основной группы (р^о-2<0,05; р^11_2<0,05). С одинаковыми

темпами в обеих клинических группах происходила регрессия изменения прозрачности и запаха мочи (р^2 i-2>0,05), что объясняется, по-видимому, тем, что данный симптом

всецело определяется степенью бактериальной обсемененности мочи и исчезает при назначении пациенту адекватно подобранной этиотропной терапии.

Через б дней после поступления в стационар у всех больных как основной группы, так и группы сравнения были купированы боли в животе и нормализовался стул (pjjf i-2>0,05). Дизурический синдром в форме уреженного мочеиспускания сохранялся лишь у пациентов группы сравнения (p^i.2<0,05). При оценке симптомов интоксикации статистически значимые различия между группами были выявлены в отношении динамики исчезновения таких симптомов, как бледность кожи и слизистых и сниженный аппетит (p^u^.OS).

На 9-е сутки пребывания в стационаре у наблюдаемых пациентов полностью купирован болевой, дизурический синдромы, нормализовалась температура тела. В основной группе и группе сравнения сохранялись лишь такие симптомы хронической интоксикации, как бледность кожных покровов (6,67% и 3,33% соответственно) и периорбитальные «тени» (13,33% и 6,67% соответственно) без достоверных различий между группами (p^i-2>0,05).

Спустя 5-7 дней от начала лечения лейкоцитурия сохранялась у 66,67% детей группы сравнения и у 46,67% детей основной группы (р^2 i.2<0,05). Спустя 14 дней наблюдения

лейкоцитурия была выявлена у 26,67% пациентов группы сравнения и 16,67% больных основной группы (pjjf i-2>0,05). Протеинурия по данным общеклинического анализа мочи через 7 дней после поступления в стационар выявлена в единичных случаях у пациентов

обеих групп (р^1-2>0,05) и только у одного ребенка из группы сравнения спустя 14 дней терапии.

К 5-7 суткам общее количество лейкоцитов периферической крови и лейкоцитарная формула нормализовались по сравнению с исходным уровнем у значительного количества детей в обеих группах с достоверно большими темпами в основной группе (76,67%), чем в группе сравнения (63,33%) (р^о-1<0,05; р^о-2<0,05; р^21.2<0,05). Уровень СОЭ достоверно снизился как в основной группе (у 53,33% больных), так и в группе сравнения (43,33%) (р^о-1<0,05; Р^ог<0,05; р^21.2>0,05). Через 14 дней от начала лечения в основной группе и группе сравнения наблюдалась отчетливая тенденция к нормализации таких показателей, как количество лейкоцитов (93,33% и 83,33% соответственно), относительное количество палочкоядерных нейтрофилов (96,67% и 93,33% соответственно) и СОЭ (86,67% и 80% соответственно) без достоверных различий между группами (р ^ 1_2>0,05).

Таблица 20

Динамика качественного и количественного состава биотопа толстой кишки пациентов при проведении терапии__

Характер выявленных патологических изменений Группа сравнения (IIa), п=30, количество больных с выявленным признаком Основная группа (IIb), п=30, количество больных с выявленным признаком

Исходные показатели Результаты через 14сут. Исходные показатели Результаты через 14 сут.

Абс. % Абс. % Абс. % Абс. %

Уменьшение кол-ва бифидобактерий 29 96,67 16 53,33* 26 86,67 4 13,33* **

Уменьшение кол-ва лактобактерий 22 73,33 14 46,67 * 25 83,33 3 10,0* **

Снижение содержания полноценной E.coli 23 76,67 10 33,33* 19 63,33 5 16,67*

Выявл-ие Е. coli с гемолитическими свойствами 21 70,0 И 36,67* 24 80,0 4 13,33* **

Появление лактозонегативной E.coli 18 60,0 9 30,0* 14 46,67 2 6,67* **

Наличие условно-патогенных энтеробактерий 30 100,0 18 60,0* 29 96,67 4 13,33* **

Изменение содержания энтерококков 16 53,33 7 23,33* 19 63,33 3 10,0* **

Повышение содержания дрожжеподобных грибов 8 26,67 5 16,67* 12 40,0 1 з зз* **

* р<0,05 по сравнению с исходным уровнем

** р<0,05 по сравнению с группой Па; метод статистического анализа - критерий ^

Группа сравнения (IIa) - антибактериальная терапия в сочетании с приемом пробиотических средств (бактисубтила и линнекса)

Основная группа (IIb) - антибактериальная терапия в сочетании с приемом пребиотического средства (БАД «Ультрасорб»)

В основной группе, пациенты которой получали «Ультрасорб», более быстрая нормализация мочевого осадка и показателей периферической крови, по-видимому, была связана не только с противовоспалительными эффектами КЦЖК, но также с нормализацией кишечного микробиоценоза, о чем свидетельствовали результаты повторного исследования кала на дисбактериоз - через 14 дней от начала проведения терапии в стационаре (табл. 20).

Таким образом, клиническими исследованиями установлена эффективность использования пищевой добавки «Ультрасорб» у детей с пиелонефритом.

Следующим этапом клинического раздела работы стало исследование эффективности препарата Вобэнзим. В зависимости от выбора схемы лечения слепым методом было сформировано 21руппы:

1а - 48 детей, получавших лечение по традиционной схеме (стандартная терапия), 1Ь - 36 детей, получавших в дополнение к стандартной терапии полиферментный препарат Вобэнзим. Группы были идентичны по возрасту, полу, активности воспалительного процесса (р>0,05). В обеих группах (основной и сравнения) преобладали дети дошкольного и школьного возраста. Вобэнзим назначался из расчета 1 таблетка на 6 кг массы тела.

Выявлено, что через 3 дня от начала лечения количество детей, которых продолжали беспокоить боли в животе и в поясничной области, в обеих группах имело тенденцию к снижению (р^(м>0,05; р^о-г>0,05; р^ 1.2>0,05). Положительный симптом Пастернацкого сохранялся у 10,41% больных группы сравнения (р^.1>0,05) и лишь у 5,55% в основной группе (р^о-2<0.05; р^2 ]-2>0,05). Что касается регрессии проявлений интоксикационного синдрома, быстрее всего у пациентов обеих групп исчезали такие симптомы, как лихорадка и головная боль (р^<м<0,05; р^о-г<0,05; Р^1-2>0,05). Жалобы на отсутствие аппетита к 3-м суткам предъявляли 12,5% детей группы сравнения и только 5,55% детей основной группы (р^1-г<0,05; р^о-2<0,05). Болезненное мочеиспускание сохранялось у 10,4% больных группы сравнения (р^о-1<0,05)и у 5,55% Изменение прозрачности и запаха мочи также происходило быстрее у детей основной группы (р^21_2<0,05). Выявленные закономерности, по-видимому, могут быть объяснены

способностью Вобэнзима потенцировать действие антибиотиков.

Через 6 дней после поступления в стационар проявления болевого синдрома были купированы у всех больных как основной группы, так и группы сравнения. Проявления дизурического синдрома (болезненность при мочеиспускании, изменение прозрачности и запаха мочи, поллакиурия, урежение мочеиспусканий) к этому времени выявлялись в

единичных случаях только у пациентов группы сравнения (р^о1<0,05; р^о-2<0,05; Р^ч-

2>0,05). К 6-м суткам терапии у пациентов обеих групп наблюдалась отчетливая регрессия проявлений интоксикационного синдрома с большими темпами у детей основной группы (р^0-1<0,05; р^0-2<0,05; р^ч.2<0,05).

На 9-е сутки пребывания в стационаре у наблюдаемых пациентов полностью купирован болевой, дизурический синдромы, нормализовалась температура тела. В основной группе и группе сравнения у отдельных пациентов сохранялись лишь такие симптомы хронической интоксикации, как бледность кожных покровов (р^1-2>0,05) и

периорбитальные «тени» (р^¡1.2<0,05).

Таким образом, анализ клинических симптомов заболевания через 3, 6 и 9 дней от начала лечения показал, что дополнение стандартной терапии пиелонефрита ферментным препаратом Вобэнзим способствует более быстрому и эффективному купированию основных симптомов заболевания

Спустя 5-7 дней от начала лечения лейкоцитурия сохранялась у 52,08% детей группы сравнения (р^о-1<0,05) и лишь у 33,33% больных основной группы (р^о-2<0,05; 2<0,05). Через 14 дней наблюдения лейкоцитурия сохранялась у 25,0% больных группы сравнения и 11,11% детей основной группы (р^г0-1<0,05; Р^о 2<0,05; Р/^1-2<0,05).

Протеинурия по данным общеклинического анализа мочи через 7 дней после поступления в стационар выявлена в единичных случаях (4,17%) у пациентов группы сравнения, но без статистически значимых различий между группами (р^л0-1<0,05; р^о-2<0,05; 2>0,05) и только у одного пациента из группы сравнения (2,08%) спустя 14 дней терапии.

К 5-7 суткам пребывания в стационаре количество лейкоцитов периферической крови нормализовалось у значительного количества больных обеих групп (р^о-1<0,05; Р%2о-г<0,05). Статистически значимые различия были получены только при оценке палочкоядерного сдвига в периферической крови (Р/^21-2<0,05). Уровень СОЭ достоверно снижался как в основной группе, так и в группе сравнения (р^о-1<0,05; р^о-2<0,05; р^!.2>0,05).

Через 14 дней от начала лечения в обеих группах у большинства детей отмечалась нормализация количества лейкоцитов периферической крови (91,67% и 83,33% соответственно), относительного количества палочкоядерных нейтрофилов (97,22% и 91,67%) СОЭ (94,45% и 85,42%). При этом по всем анализируемым показателям отмечались достоверные различия между группами (р^1.2<0,05).

Таким образом, у детей основной группы, получавших в дополнение к стандартной терапии ферментный препарат Вобэнзим, отмечалась достоверно более выраженная нормализация клинических и лабораторных показателей.

Помимо изучения влияния Вобэнзима на динамику основных клинико-лабораторных показателей при пиелонефрите, исследовано его влияние на уровень сывороточных провоспалительных цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-8 и ФНО-а). С этой целью нами серологически обследовано 15 детей из основной группы (1Ь) и 21 человек из группы сравнения (1а). Сформированные выборки были сопоставимы по возрасту, полу, остроте воспалительного процесса (р>0,05). Этот контингент больных мы наблюдали в течение 30 дней (14 дней во время пребывания в стационаре и в последующем - на этапе долечивания в амбулаторных условиях).

Установлено, что нормализация уровня ИЛ-8 в сыворотке крови детей основной группы происходила достоверно быстрее, нежели у пациентов группы сравнения (табл. 21), что демонстрирует противовоспалительный эффект препарата, приводящий к более быстрому клиническому улучшению и нормализации лабораторных показателей.

Таблица 21

Уровень ИЛ-8 в сыворотке крови детей с обострением хронического пиелонефрита

Время исследования 1 группа (получавшие Вобэнзим) п=15 4, уровень ИЛ-8, (М±т) 2 группа (традиционная терапия) п=21 5, уровень ИЛ-8, (М±ш) Критический уровень значимости при проверке гипотезы, р

При поступлении 1 144,26±46,52 147,19±50,85 р4/р5>0,1(р=0,861)

10 день 2 102,45±21,23 105,0±20,93 р4/р5>0,1 (р=0,722)

1 месяц' 61,03±19,34 75,63±24,38 р4/р5<0,05

Р р1/р2<0,05 р2/рЗ<0,001 р1/рЗ<0,001 р1/р2<0,001 р2/р5<0,001 р3/р'<0.001

Нормальные показатели - 27,46±8,81 пг/мл

Метод статистического анализа - критерий Стьюдента

Таблица 22

Уровень ИЛ-6 в сыворотке крови детей с обострением хронического пиелонефрита (пг/мл)____

Время исследования 1 группа (получавшие Вобэнзим) п=15 4, уровень ИЛ-б, (М±т) 2 группа (традиционная терапия) П--21 5, уровень ИЛ-6, (М±ш) Критический уровень значимости при проверке гипотезы, р

При поступлении ' 26,44±7,32 25,31±6,79 р4/р5>0,1(р=0,637)

10 день2 53,45±12,65 64,0±14,79 р4/р5<0,05(р=0,032)

1 месяц3 41,23±1б,34 52,53±23,98 р4/р5>0,1 (р=0,12)

Р р1/р2<0,001 р2/рЗ<0,05 р1/рЗ<0,05 р1/р2<0,05 р2/рЗ<0,05 р1/рЗ<0,05

Нормальные показатели - 3,28±1,3 пг/мл

Метод статистического анализа - критерий Стьюдента

Уровень ИЛ-6 в сыворотке крови детей с пиелонефритом достигал максимальных значений к 10-м суткам, после чего начинал снижаться наиболее интенсивно также у пациентов основной группы, получавших Вобэнзим (табл. 22). Полученные данные могут быть объяснены тем, что ИЛ-8 продуцируется в острую фазу воспаления, главным образом, отвечая за миграцию лейкоцитов и реализацию их фагоцитарной активности в очаге воспаления, в то время как ИЛ-6 принимает участие в формировании гуморального иммунного ответа.

Выявлено, что уровень ФНО-а в сыворотке крови детей обеих групп на всех этапах исследования оставался неизменным, что может быть объяснено тем, что между ФНО-а и ИЛ-6 существуют антагонистические взаимодействия: ИЛ-6 ингибирует продукцию ФНО-а лейкоцитами крови.

Суммируя результаты экспериментальных и клинических исследований, можно утверждать, что в процессе выполнения диссертационной работы разработаны новые способы моделирования пиелонефрита, раскрыт один из возможных механизмов инфицирования ткани почек у детей путем реализации феномена стрессогенной бактериальной транслокации, предложены и экспериментально и клинически обоснованы пути оптимизации комплексной терапии пиелонефрита у детей.

выводы

1. Разработанная экспериментальная модель острого пиелонефрита, заключающаяся в однократном интраперитонеальном введении нелинейным белым крысам урокультур условно-патогенных бактерий - лактозонегативной Escherichia coli (штамм № 2899) в концентрации 109 КОЕ/мл или Staphylococcus saprophytics (штамм № 1256) в концентрации 108 КОЕ/мл, выделенных из мочи детей с острым пиелонефритом, позволяет воспроизвести микробно-воспалительный процесс в ткани почек, сопровождающийся реактивными изменениями в органах иммунитета.

2. Разработанная экспериментальная модель острого пиелонефрита на основе ректального введения нелинейным белым крысам урокультуры лактозонегативной Escherichia coli (штамм № 2899) в концентрации 109 КОЕ/мл и последующего острого холодового стресса позволяет воспроизвести в эксперименте феномен бактериальной транслокации кишечной микрофлоры в системный кровоток, сопровождающийся формированием микробно-воспалительного процесса в ткани почек и реактивными изменениями в органах иммунной системы.

3. Включение в рацион животных биологически активной пищевой добавки «Ультрасорб» обеспечивает нормализацию количественных и качественных

характеристик кишечного микробиоценоза; при заражении экспериментальных животных урокультурой Escherichia coli нормализует клеточную пролиферацию и апоптоз в эпителии толстой кишки, способствует ограничению микробно-воспалительного процесса в ткани почек.

4. Применение в терапии экспериментального пиелонефрита препарата Вобэнзим способствует регрессии морфологических признаков пиелонефрита и стимулирует клеточную пролиферацию в Т-зависимых зонах органов иммунной системы.

5. Дополнение комплексной терапии экспериментального пиелонефрита отечественным иммуномодулятором Суперлимф уменьшает выраженность воспалительных изменений в ткани почек и способствует восстановлению нормальной структуры тканей в органах иммунитета.

6. В этиологической структуре возбудителей пиелонефрита у детей превалируют следующие микроорганизмы: Escherichia coli (44,8%), Staphylococcus spp (17,7%), Streptococcus spp (9,5%), Enterococcus spp (9,8%), Klebsiella spp (8,4%).

7. Важным механизмом в развитии пиелонефрита у детей раннего возраста является нарушение гематоинтестинального барьера и транслокация кишечной микрофлоры через системный кровоток в почки; при этом в структуре возбудителей ведущее место занимают бактерии родов Klebsiella (40%), Escherichia (35%), Staphylococcus (15%) и Proteus (10%).

8. Включение в диету детей с пиелонефритом биологически активной добавки к пище «Ультрасорб» приводит к более быстрому купированию клинических проявлений заболевания, нормализации лабораторных показателей, включая нормализацию качественного и количественного состава кишечной микрофлоры.

9. Дополнение базисной терапии пиелонефрита ферментным препаратом Вобэнзим способствует более быстрому купированию клинических симптомов и лабораторных показателей пиелонефрита у детей, в том числе, к статистически значимому снижению Интерлейкина 6 в сыворотке крови пациентов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Разработанные экспериментальные модели острого пиелонефрита могут использоваться для воспроизведения микробно-воспалительного процесса в ткани почек с целью изучения патогенеза пиелонефрита и доклинической апробации новых средств этиотропной и патогенетической терапии.

2. Биологически активная добавка к пище «Ультрасорб» может быть использована в рационе нелинейных белых крыс для профилактики дисбиотических нарушений как во время эксперимента, так и во время содержания животных в

экспериментально-биологических клиниках (вивариях); схема применения: 3 г в сутки на животное в смеси с кормом, курс - 1-3 месяца.

3. Полученные в процессе проведения экспериментальных и клинических исследований результаты позволяют рекомендовать широкое применение биологически активной добавки «Ультрасорб» в педиатрической практике - как для коррекции дисбиотических нарушений, так и у пациентов с пиелонефритом для профилактики дисбактериоза кишечника при приеме антибиотиков и в целях предупреждения рецидивирования пиелонефрита. Рекомендуемая схема применения «Ультрасорба»: дети раннего возраста (1-3 года) - 1 таблетка х 3 раза в день во время приема пищи, дети дошкольного возраста (4-6 лет) - 2 таблетки х 3 раза в день во время приема пищи, дети школьного возраста (7-16 лет) - 3 таблетки х 3 раза в день во время приема пищи; курс - 1-3 месяца.

4. Ферментный препарат Вобэнзим может применяться в комплексном лечении пиелонефрита у детей в острую фазу заболевания и на амбулаторном этапе «долечивания».

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ НОВЫХ СПОСОБОВ ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ ПИЕЛОНЕФРИТА У ДЕТЕЙ

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кузнецов В.Ф., Косарева П.В., Негодяева H Л., Обернебесова Т.П.

Ферментированные пищевые волокна (Рекицен-РД) в реабилитации пациентов с патологией иммунной системы / Кузнецов В.Ф., Косарева П.В., Негодяева H.JI., Обернебесова Т.П. // Аллергология и иммунология.- 2009.- №2 апрель.- Т.10. - С. 267.

2. Косарева П.В., Кузнецов В.Ф. Аверьянова Н.И. Условно-патогенная флора кишечника как источник эндогенного инфицирования при пиелонефрите у детей грудного возраста / Косарева П.В., Кузнецов В.Ф. //Аверьянова Н.И. Казанский медицинский журнал 2009. - № 1. - Т. ХС. - С. 110-111.

3. Косарева П.В., Кузнецов В.Ф., Маслов Ю.Н., Кулемин JI.M. Клинико-патогенетические корреляции нарушения кишечного биоценоза и микробно-воспалителыюго процесса в органах мочевой системы / Косарева П.В., Кузнецов В.Ф., Маслов Ю.Н., Кулемин JI.M. // Медицинский альманах (рецензируемый научно-практический журнал). - 2008. - № 2. - С. 86-88.

4. Косарева П.В., Кузнецов В.Ф., Кулемин Л.М.Эксперименталыюе обоснование применения БАД «Ультрасорб» для профилактики эндогенной бактериемии в детском возрасте / Косарева П.В., Кузнецов В.Ф., Кулемин Л.М. // Вестник РГМУ. - 2008. - № 4 (Т. 63). - С. 195.

5. Черешнев В.А., Косарева П.В., Аверьянова Н.И., Зимушкина H.A., Самоделкин Е.И., Логинова И.А. Морфологические и гематологические критерии эффективности лечения экспериментального пиелонефрита комплексом природных цитокинов и антибактериальных пептидов / Черешнев В.А., Косарева П.В., Аверьянова Н.И., Зимушкина H.A., Самоделкин Е.И., Логинова И.А. // Пермский медицинский журнал, 2008. - № 2.-С. 5-13.

6. Косарева П.В., Аверьянова. Н.И. Проблемы и перспективы коррекции нарушенного кишечного симбиоза в детском возрасте / Косарева П.В., Аверьянова Н.И. // Российский педиатрический журнал. - 2006. - № 2. - С. 1618.

7. Волкова Л.В., Казьяиин A.B., Косарева П.В., Пестерева С.А., Гуляева Н.И., Ожерельева Е.Е., Березина Е.А., Мелехин C.B., Аверьянова Н.И. Антибактериальное и иммуномодулирующее действия пептидного комплекса, ассоциированного с процессом интерфероногенеза, в доклинических экспериментах / Волкова Л.В., Казьяиин A.B., Косарева П.В., Пестерева С.А.,

Гуляева Н.И., Ожерельева Е.Е., Березина Е.А., Мелехин C.B., Аверьянова Н.И. // Пермский медицинский журнал. - 2004. - Т. 21. - №4. - С. 116-123.

8. Волкова JI.B., Косарева П.В., Аверьянова Н.И. Антибактериальные свойства катионных пептидов / Волкова JI.B., Косарева П.В., Аверьянова Н.И. // Пермский медицинский журнал. - 2004. - №2. - С. 139-143.

9. Косарева П.В., Аверьянова Н.И., Зарницына Н.Ю. К вопросу о резистентности уропатогенов семейства Enterobacteriacea к антибактериальным химиопрепаратам / Косарева П.В., Аверьянова Н.И., Зарницына Н.Ю. // Пермский мед. журнал. - 2003. №2. - С. 98-100.

10. Зимушкина H.A., Самоделкин Е.И., Кочинова Т.В., Косарева П.В., Аверьянова Н.И., Шилова Ф.А., Елькин И.Ф., Логинова И.А. Изменение патоморфологических показателей при экспериментальном пиелонефрите и изучение эффективности его терапии комплексом природных антибактериальных пептидов и цитокинов / Зимушкина H.A., Самоделкин Е.И., Кочинова Т.В., Косарева П.В., Аверьянова Н.И., Шилова Ф.А., Елькин И.Ф., Логинова И.А. // Инновационный потенциал аграрной науки - основа развития АПК: Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 90-летию сельскохозяйственного образования на Урале. - Пермь, 2008. - Часть 1. - С. 150-153.

11. Косарева П.В., Елькин И.Ф., Логинова И.А., Самоделкин Е.И., Зимушкина H.A., Кочинова Т.В. Патофизиологические изменения при экспериментальном пиелонефрите и изучение эффективности его терапии протеолитическими энзимами / Косарева П.В., Елькин И.Ф., Логинова И.А., Самоделкин Е.И., Зимушкина H.A., Кочинова Т.В. // Пермский аграрный вестник, Часть 1: Сборник научных трудов LXVIII Всероссийской научно-практической конференции «Инновации и технологии - эффективному агропроизводству» - Пермь, 2008. - С. 208-213.

12. Зимушкина Н.А, Логинова И.А., Косарева П.В., Аверьянова Н.И., Самоделкин Е.И. Изменения гематологических показателей у белых крыс при экспериментальном пиелонефрите и его терапии комплексом природных антибактериальных пептидов и цитокинов / Зимушкина Н.А, Логинова H.A., Косарева П.В., Аверьянова Н.И., Самоделкин Е.И. // Материалы Юбилейной научной сессии ПГМА 2008 г., Т.1. - С. 309-311.

13. Елькин И.Ф., Косарева П.В., Логинова И.А., Самоделкин Е.И., Зимушкина H.A., Кочинова Т.В. Патофизиологические изменения при экспериментальном пиелонефрите и изучение эффективности его терапии протеолитическими

энзимами / Елькин И.Ф., Косарева П.В., Логинова И.А., Самоделкин Е.И., Зимушкина H.A., Кочинова Т.В. // Пермский аграрный вестник. - Пермь, 2008, Часть I, С. 208-213.

14. Косарева П.В., Пушкарева О.М. Перспективные подходы к этиопатогенетической коррекции острого пиелонефрита / Косарева П.В., Пушкарева О.М. // Вятский медицинский вестник, специальный выпуск «Материалы юбилейной X итоговой открытой межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Молодежь и медицинская наука в XXI веке», посвященная 20-летию Кировской ГМА. - № 1. - 2007. - Киров. - С. 71 -72.

15. Косарева П.В., Аверьянова Н.И., Шилова Ф.А. Новые пути этиопатогенетической коррекции острого пиелонефрита / Косарева П.В., Аверьянова Н.И., Шилова Ф.А. // Материалы дистанционной научно-практической конференции «Внедрение инновационных технологий в хирургическую практику (фундаментальные и прикладные аспекты)», посвященная 110-летию со дня рождения профессора Александра Петровича Соколова, - Пермь, май 2007г.-С. 132-134.

16. Аверьянова Н.И., Косарева П.В., Козлова В.В. Исследование антибактериальных и иммуномодулирующих свойств низкомолекулярного катионного пептидного комплекса из лейкоцитов человека на уропатогенные и энтеропатогенные штаммы микроорганизмов и на экспериментальных моделях уроренальных и кишечных инфекций / Аверьянова Н.И., Косарева П.В., Козлова В.В. // Результаты научных исследований, полученные за 2004 г. Аннотационные отчеты. Сборник статей. Пермь, Екатеринбург, 2005. - С. 176-178.

17. Аверьянова Н.И., Косарева П.В., Козлова В.В. Исследование антибактериальных и иммуномодулирующих свойств низкомолекулярного катионного пептидного комплекса из лейкоцитов человека на уропатогенные и энтеропатогенные штаммы микроорганизмов и на экспериментальных моделях уроренальных и кишечных инфекций / Аверьянова Н.И., Косарева П.В., Козлова В.В. // Результаты научных исследований, полученные за 2005 г.: аннотационные отчеты; сборник статей. Пермь, Екатеринбург, 2005. - С. 156-159.

18. Аверьянова Н.И., Косарева П.В., Шилова Ф.А., Коломеец Н.Ю. Нарушенный кишечный симбиоз как фактор риска развития пиелонефрита у детей раннего возраста / Аверьянова Н.И., Косарева П.В., Шилова Ф.А., Коломеец Н.Ю.

// Материалы Юбилейной научной сессии 2006 года, Пермь Т. II «Клинические науки», С. 165-166.

19. Аверьянова Н.И., Косарева П.В., Власова Т.Н., Зарницына Н.Ю. Некоторые аспекты этиопатогенеза инфекций мочевой системы в детском возрасте / Аверьянова Н.И., Косарева П.В., Власова Т.Н., Зарницына Н.Ю. // Материалы научной сессии 2005 г. - Пермь-Ижевск, 2005. - С. 64 - 66.

20. Аверьянова Н.И., Косарева П.В., Зарницына Н.Ю., Козлова В.В. Современный взгляд на проблему этиологии инфекций мочевой системы в детском возрасте / Аверьянова Н.И., Косарева П.В., Зарницына Н.Ю., Козлова В.В. // Состояние окружающей среды и здоровье детей: матер, конференции, посвященной 25-летию кафедры детских инфекций и 70-летию профессора И.Г. Гришкина. - Ижевск, 2005. - С. 17 - 19.

21. Кузнецов В.Ф., Косарева П.В., Аверьянова Н.И. Влияние ферментированных пищевых волокон на процессы пролиферации и апоптоза в эпителии толстой кишки при остром стрессе / Кузнецов В.Ф., Косарева П.В., Аверьянова Н.И. // Сб. материалов Российской конференции, посвященной 80-летию со дня рождения Р.И. Лившица «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» - Челябинск, 2009. - С. 232-234.

22. Косарева П.В., Аверьянова Н.И., Авдеева Н.С., Козлова В.В. Инфекционно-воспалительные заболевания органов мочевой системы у детей, развившиеся на фоне дестабилизации кишечного симбиоза / Косарева П.В., Аверьянова Н.И., Авдеева Н.С., Козлова В.В. // Российская научная конференция «Педиатрия: из XIX в XXI век», посвященная 140-летию кафедры детских болезней Военно-медицинской академии, 120-летию со дня рождения Михаила Степановича Маслова, Санкт-Петербург, 30 июня - 1 июля, 2005. - С. 102.

23. Косарева П.В. Перспективный метод этиопатогенетической коррекции нарушенного кишечного симбиоза / Косарева П.В. // IV Всероссийская университетская научно-практическая конференция молодых ученых и студентов по медицине. - Тула, 2005. - С. 66 - 67.

24. Косарева П.В., Черешнев В.А., Зимушкина H.A., Логинова И.А., Самоделкин Е.И., Аверьянова Н.И. Воспроизведение в эксперименте острого гематогенного пиелонефрита / Косарева П.В., Черешнев В.А., Зимушкина H.A., Логинова И.А., Самоделкин Е.И., Аверьянова Н.И. // Успехи современного естествознания, - 2008. -№ 2. -С. 99-101.

25. Аверьянова Н.И., Косарева П.В., Черешнев В.А., Самоделкин Е.И., Кумаланина И.В. Применение препарата суперлимф в терапии экспериментального пиелонефрита / Аверьянова Н.И., Косарева П.В., Черешнев В.А., Самоделкин Е.И., Кумаланина И.В. // Успехи современного естествознания. - 2007. - № 7. - С. 40-41.

26. Аверьянова Н.И., Козлова В.В., Косарева П.В., Кичигина Л.А., Кумаланина И.В. Провоспалительные цитокины у детей с хроническим пиелонефритом / Аверьянова Н.И., Козлова В.В., Косарева П.В., Кичигина Л.А., Кумаланина И.В. // Актуальные проблемы педиатрии и детской неврологии - Материалы Российской конференции с международным участием, посвященной 85-летию Пермской педиатрической школы «III Пичугинские чтения», т. И, С. 13-16.

27. Косарева П.В., Аверьянова Н.И., Коробов В.П. Новые перспективы антибактериальной терапии микробно-воспалительных заболеваний органов мочевой системы в детском возрасте / Косарева П.В., Аверьянова Н.И., Коробов В.П. // Актуальные проблемы педиатрии и детской неврологии - Материалы Российской конференции с международным участием, посвященной 85-летию Пермской педиатрической школы «III Пичугинские чтения», т. II, С. 3-6.

28. Аверьянова Н.И., Косарева П.В. Экспериментальная терапия острого пиелонефрита с использованием отечественного иммуномодулятора, обладающего прямым антибактериальным действием / Аверьянова Н.И., Косарева П.В. // Успехи современного естествознания. - 2006. - № 6. - С. 62.

29. Коломеец Н.Ю., Аверьянова Н.И., Косарева П.В. Морфометрические показатели почек здоровых беспородных белых крыс / Коломеец Н.Ю., Аверьянова Н.И., Косарева П.В. // Материалы IV (XIII) Международной научной конференции «Онкология - XXI век» - Хошимин, 2009. - С. 116-119.

30. Зимушкина H.A., Самоделкин Е.И., Косарева П.В., Аверьянова Н.И., Логинова И.А. Современные научные тенденции в животноводстве / Зимушкина H.A., Самоделкин Е.И., Косарева П.В., Аверьянова Н.И., Логинова И.А. // Сборник статей Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения П.Г. Петского - Киров, 2009. - С. 113-115.

31. Косарева П.В. Исследование характера патогенной микрофлоры при дисбактериозах кишечника у детей / Косарева П.В. // III Российский конгресс «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии»: Сб. материалов. -Москва. - 2004. - С. 60.

32. Косарева П.В., Аверьянова Н.И., Козлова В.В. Нарушение качественного состава кишечной микрофлоры как фактор риска развития пиелонефрита у детей /

Косарева П.В., Аверьянова Н.И., Козлова В.В. // II Всероссийская научно-практическая конференция «Здоровье и образование»: Сб. материалов. - Пермь, 2004.-С. 135.

33. Волкова Л.В., Косарева П.В, Аверьянова Н.И. Чувствительность урокультур бактерий к катионному пептидному комплексу, ассоциированному с процессом интерфероногенеза / Волкова Л.В., Косарева П.В, Аверьянова Н.И. // Международная Российско-Американская научно-практическая конференция «Актуальные проблемы охраны материнства и детства»: Сб. материалов. - Тула, 2004. -С. 97-99.

34. Косарева П.В., Аверьянова Н.И. Микробиологические особенности уроренальных инфекций у детей / Косарева П.В., Аверьянова Н.И. // Материалы научной сессии Пермской государственной и Ижевской государственной медицинских академий 2004 года: Сб. материалов. - Пермь-Ижевск, 2004. - С. 129131.

35. Косарева П.В. Клинико-лабораторные особенности уроренальных инфекций детского возраста / Косарева П.В. // Материалы международной научно-практической конференции. - Пермь: ГОУ ВПО «ПГМА Минздрава России», 2004. -С. 301.

36. Косарева П.В. Исследование антибактериального действия низкомолекулярного пептидного комплекса из лейкоцитов человека в отношении уропатогенных микроорганизмов, выделенных из мочи детей с уроренальными инфекциями / Косарева П.В. // IX Конгресс педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии»: Сб. материалов. - Москва, 2004. - С. 529.

37. Аверьянова Н.И., Косарева П.В., Кичигина Л.А. Микрофлора мочи как фактор, определяющий характер течения уроренальной инфекции / Аверьянова Н.И., Косарева П.В., Кичигина Л.А. // IX Конгресс педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии»: Сб. материалов. - Москва, 2004. - С. 7.

38. Аверьянова Н.И., Зимушкина H.A., Косарева П.В., Кочинова Т.В., Логинова И.А., Самоделкин Е.И., Черешнев В.А. Способ моделирования острого пиелонефрита на фоне холодового стресса / Аверьянова Н.И., Зимушкина H.A., Косарева П.В., Кочинова Т.В., Логинова И.А., Самоделкин Е.И., Черешнев В.А. // Патент РФ на изобретение № 2368016, заявка № 2008100590; приоритет изобретения от 09 января 2008 г., зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ 20 сентября 2009 г.

39. Аверьянова Н.И., Звездаков В.В., Зимушкина H.A., Косарева П.В., Логинова И.А., Самоделкин Е.И., Черешнев В.А., Чигалейчик A.B. Способ моделирования острого пиелонефрита / Аверьянова Н.И., Звездаков В.В., Зимушкина H.A., Косарева П.В., Логинова И.А., Самоделкин Е.И., Черешнев В.А., Чигалейчик A.B. II Патент РФ на изобретение № 2349965, заявка № 2007127373; приоритет изобретения от 17 июля 2007 г., зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ 20 марта 2009 г.

40. Косарева П.В., Кулемин Л.М., Кузнецов В.Ф., Черешнев В.А., Аверьянова Н.И., Маслов Ю.Н., Одинцова О.В. Способ профилактики дисбактериоза кишечника в эксперименте / Косарева П.В., Кулемин Л.М., Кузнецов В.Ф., Черешнев В.А., Аверьянова Н.И., Маслов Ю.Н., Одинцова O.B. II Патент РФ на изобретение № 2363477, заявка № 2008106681; приоритет изобретения от 20 февраля 2008 г., зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ10 августа 2009 г.

41. Косарева П.В., Кулемин Л.М., Кузнецов В.Ф., Черешнев В.А., Аверьянова Н.И. Способ профилактики пиелонефрита в эксперименте / Косарева П.В., Кулемин Л.М., Кузнецов В.Ф., Черешнев В.А., Аверьянова Н.И. II Патент РФ на изобретение № 2354388, заявка № 2007146536; приоритет изобретения от 12 декабря 2007 г., зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ 10 мая 2009 г.

42. Косарева П.В., Черешнев В.А., Кулемин Л.М., Кузнецов В.Ф., Маслов Ю.Н., Аверьянова Н.И. Исследование эффективности применения БАД Ультрасорб для коррекции кишечного биоценоза белых крыс, получающих стандартный рацион вивария / Косарева П.В., Черешнев В.А., Кулемин Л.М., Кузнецов В.Ф., Маслов Ю.Н., Аверьянова Н.И. // VII Международная конференция «Загрязнение окружающей среды, адаптация, иммунитет», Пермь-Нижний Новгород-Пермь, 2008.- Тезисы докладов. - С. 75.

43. Зимушкина H.A., Самоделкин Е.И., Кочинова Т.В., Аверьянова Н.И., Косарева П.В., Елькин И.Ф., Логинова И.А. Гистологические изменения у лабораторных животных при коррекции экспериментального пиелонефрита комплексом природных антибактериальных пептидов и цитокинов / Зимушкина H.A., Самоделкин Е.И., Кочинова Т.В., Аверьянова Н.И., Косарева П.В., Елькин И.Ф., Логинова И.А. // Материалы IX Международной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Вклад молодых ученых в

реализацию приоритетного национального проекта «Развитие агропромышленного комплекса», Троицк, 2007. - С. 24-29.

44. Аверьянова Н.И., Косарева П.В., Власова Т.Н. Инфекционно-воспалительные заболевания органов мочевой системы у детей, развившиеся на фоне дестабилизации кишечного симбиоза / Аверьянова Н.И., Косарева П.В., Власова Т.Н. // Международная научно-практическая конференция «Здоровье и образование. Медико-социальные и экономические проблемы» - Италия, Рим, 2005. -С. 5-10.

45. Аверьянова Н.И., Косарева П.В., Власова Т.Н., Коломеец Н.Ю., Курносов Ю.В., Сулейманова О.М. Роль эндогенной микрофлоры энтерального происхождения в формировании пиелонефрита / Аверьянова Н.И., Косарева П.В., Власова Т.Н., Коломеец Н.Ю., Курносов Ю.В., Сулейманова О.М. // Международная научно-практическая конференция «Здоровье и образование. Медико-социальные и экономические проблемы» - Италия, Рим, 2005. - С. 3-4.

46. Аверьянова Н.И., Косарева П.В., Волкова Л.В., Коломеец Н.Ю. Влияние низкомолекулярного пептидного комплекса лейкоцитарного происхождения на систему иммуногенеза в доклинических экспериментах / Аверьянова Н.И., Косарева П.В., Волкова Л.В., Коломеец Н.Ю. // Международная научно-практическая конференция «Здоровье и образование. Медико-социальные и экономические проблемы» - Италия, Рим, 2005. - С. 116-117.

47. Лемкина Л.М., Полюдова Т.В., Косарева П.В., Авдеева Н.С., Коробов В.П. Изучение чувствительности коагулазо-негативных стафилококков, выделенных от урологических больных, к низкомолекулярному катионному пептиду варненрину / Лемкина Л.М., Полюдова Т.В., Косарева П.В., Авдеева Н.С., Коробов В.П. // Материалы II Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал» - Пермь-Казань-Пермь, 2005.-С. 57-58.

48. Аверьянова Н.И., Косарева П.В., Козлова В.В., Новоселова И.П., Митягина О.М., Дробкова В.А. К вопросу о роли эндогенной микрофлоры в формировании воспалительного процесса в органах мочевой системы / Аверьянова Н.И., Косарева П.В., Козлова В.В., Новоселова И.П., Митягина О.М., Дробкова В.А. // VI Международная конференция «Проблемы загрязнения окружающей среды» -Пермь - Казань - Пермь, 2005. - С. 97.

49. Аверьянова Н.И., Косарева П.В., Волкова Л.В., Авдеева Н.С., Митягина О.М., Коряковцева Л.С. Чувствительность культур условно-патогенных

микроорганизмов, выделенных от детей с нарушенным кишечным симбиозом, к комплексу низкомолекулярных пептидов, продуцируемых лейкоцитами человека / Аверьянова Н.И., Косарева П.В., Волкова JI.B., Авдеева Н.С., Митягина О.М., Коряковцева Л.С. // XII Национальный Конгресс «Человек и лекарство»: тезисы докладов. - Москва, 2005. - С. 630.

50. Косарева П.В., Аверьянова Н.И., Волкова JI.B., Козлова В.В., Зарницына Н.Ю. Нарушенный кишечный симбиоз как фактор риска развития пиелонефрита в детском возрасте / Косарева П.В., Аверьянова Н.И., Волкова Л.В., Козлова В.В., Зарницына Н.Ю. // XII Национальный Конгресс «Человек и лекарство» XII Национальный Конгресс «Человек и лекарство»: тезисы докладов. - Москва, 2005. -С. 46.

51. Аверьянова Н.И., Косарева П.В., Волкова Л.В., Денисова A.B. Антибиотикорезистентность уропатогенной микрофлоры, выделенной от больных с инфекциями мочевой системы / Аверьянова Н.И., Косарева П.В., Волкова Л.В., Денисова A.B. // XI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: Тез. докл. - Москва, 2004. - С. 430.

Список сокращений, использованных в автореферате

БАД - биологически активная добавка

БМ - базальная мембрана

ГБМ - гломерулярная базальная мембрана

ИЛ-6 - интерлейкин-6

ИЛ-8 - интерлейкин-8

ИП - индекс пролиферации

КОЕ - колониеобразующие единицы

КЦЖК - короткоцепочечные жирные кислоты

ПАЛМ - Периартериальная лимфоидная муфта

ФНО-а - фактор некроза опухоли-апьфа

1АПТ - индекс апоптоза

ICAM-1 - иммуноглобулин-подобные адгезивные молекулы Ki-67 - регуляторный протеин Ki-67

Подписано в печать 25.01.2010. Тираж 200 экз. Усл. печ. л. 2. Формат 60x90/16. Набор компьютерный. Заказ № 209/2010.

Отпечатано в типографии ИД "Пресстайм" Адрес: 614025, г. Пермь, ул. Героев Хасана, 105

Актуальность проблемы. Инфекционно-воспалительные заболевания почек и мочевых путей — одна из особенно остро стоящих на сегодняшний день проблем практического здравоохранения, поскольку эта нозологическая группа достаточно часто встречается как у взрослых, так и у детей, и в структуре заболеваний органов мочевой системы детского возраста уроренальные инфекции составляют 70-80% [Foxman В., 2002; Мс Bride S.C., 2003].

В Российской Федерации распространенность инфекций мочевой системы (ИМС) у детей в среднем составляет 18-22 на 1000 детской популяции; среди доношенных новорожденных частота ИМС достигает 1 %, недоношенных - 4-25%; новорожденные, родившиеся с экстремально низкой массой (<1000 г), имеют высокий риск развития ИМС в течение всего первого года жизни [Горяйнова А.Н. и др., 2007]. В последние годы отмечается значительное (на 24% за 5 лет) увеличение заболеваемости мочевыделительной системы у детей; при этом удельный вес инфекции мочевыделительной системы вырос в 1,7 раза [Никитина H.A. и др., 2007].

Помимо того, что инфекционно-воспалительные заболевания органов мочевой системы являются часто встречающейся патологией детского возраста, хронизация инфекционного процесса, рецидивирование и прогрессирование с формированием нефросклероза и развитием хронической почечной недостаточности, приводящих к инвалидизации больного и требующих экстраординарных медицинских вмешательств (программный гемодиализ, трансплантация почки) [Вялкова A.A., 1989, Папаян A.B. и др., 1997], делает эту проблему особенно актуальной. Кроме того, по данным ВОЗ, в числе умерших от «инфекции почек» значительную долю составляют больные хроническим пиелонефритом [Сенцова и др., 1994].

Существование подобной ситуации обусловлено многими факторами, среди которых ведущими являются рост антибиотикорезистентности микрофлоры, вызывающей уроренальные инфекции у человека [Manges A.R. е1 а1., 2001], снижение иммунологической резистентности макроорганизма [Румянцев А.Ш. и др., 2000; Мопйш в. еХ. а1., 2007], а также, по-видимому, частая встречаемость врожденных аномалий развития органов мочевой системы. Назначение антибактериальных химиопрепаратов, которым до настоящего времени отводилась ведущая роль в терапии инфекционно-воспалительных заболеваний почек и мочевых путей, во многих случаях оказывается недостаточным для ликвидации инфекционно-воспалительного процесса. Существующая порочная практика назначения антибактериальных химиопрепаратов в тех случаях, когда к этому нет прямых и обоснованных клинических показаний, приводит к устойчивой колонизации макроорганизма полирезистентными штаммами и к развитию вторичных иммунодефицитных состояний, усугубляющих, в свою очередь, течение основного заболевания. Благодаря подобным взаимоотношениям микро- и макроорганизма инфекционно-воспалительные заболевания почек приобретают затяжное, хроническое течение, тенденции к частым обострениям, трудно поддаются лечению, что усугубляет существующую ситуацию в целом, а также ухудшает качество жизни и утяжеляет прогноз для каждого пациента.

Несмотря на достаточную полноту данных, касающихся этиологии и патогенеза пиелонефрита, в данной области имеется ряд открытых вопросов. К их числу относится, прежде всего, вопрос о роли эндогенной бактериемии в развитии и течении инфекционно-воспалительного процесса в органах мочевыделительной системы. По мнению ряда авторов, в патогенезе пиелонефрита определяющее значение имеет восходящая уроинфекция, гематогенное инфицирование встречается редко, обычно на фоне системных инфекций и сопровождается острым двусторонним гнойным (метастатическим) пиелонефритом, протекающим с высокой лихорадкой, лейкоцитозом, повышением СОЭ, явлениями общей интоксикации; под лимфатическим путем инфицирования подразумевается поступление микробов из кишечника в почку по лимфатическим сосудам [Лукьянов А.В. и др., 2004; Rubin R.H., 1996]. По мнению И.Е. Тареевой, на долю гематогенного пути инфицирования почки приходится не более 3% случаев [Тареева И.Е., 2000]. Тем не менее, рядом отечественных и зарубежных авторов [Schwarts Н. et al., 1969; Archambaud М. et al., 1988; Вялкова A.A., 1989; Mandell J. et al., 2000; Papp L. et al., 2003; Бондаренко B.M. и др., 2004; Гриценко B.A. и др., 2008] высказывается противоположная точка зрения, заключающаяся в том, что эндогенная бактериемия энтерального происхождения способствует у определенного контингента больных развитию инфекционного процесса в органах мочевой системы.

Безусловно, рост числа больных уроренальными инфекциями, утяжеление течения данной патологии, обусловленное постоянно увеличивающимся количеством антибиотикорезистентных уропатогенных штаммов и снижением иммунологической резистентности макроорганизма, определяют растущий интерес исследователей к поиску новых эффективных и безопасных средств патогенетической терапии инфекционно-воспалительных заболеваний почек и мочевых путей.

Существует несколько основных направлений, по которым в настоящее время развивается клиническая фармакология в нефрологии и урологии.

Прежде всего, это внедрение в схемы лечения пациентов, страдающих пиелонефритом или циститом, иммунотропных средств. В последнее время неоднократно предпринимались попытки лечения пиелонефрита левамизолом, Т-активином и другими иммунотропными средствами [Москалец О.В. и др., 2002; Пак И.Г. и др., 2004]. Тем не менее, во многих случаях эффективность их оставалась спорной, а выявленные побочные действия носили преобладающий характер.

Согласно современным представлениям о качестве лекарств, наиболее предпочтительными средствами лечения являются препараты, включающие естественные компоненты организма, поэтому разработка способов получения таких веществ и использование их в качестве субстанций лекарственных средств является обоснованным подходом к созданию новых лечебных препаратов [Масычева В.И. и др., 2001]. В связи с этим в настоящее время начинается внедрение в клиническую практику антибактериальных катионных пептидов нейтрофильных гранулоцитов млекопитающих. Лейкоцитарные белки и пептиды не обладают таким разнообразным спектром побочных действий, как традиционно применяемые антибиотики [Кокряков В.Н., 1999], к ним проявляют чувствительность многие микроорганизмы, не развивается антибиотикоустойчивость штаммов [Hancock R.E., 1997]; будучи факторами проницаемости, они усиливают действие традиционно используемых антибиотиков [Титова A.B., 2002] и являются иммуномодуляторами [Conner К. et al., 2002; Scott M.G. et al., 2002]. Все это делает антибактериальные катионные пептиды перспективным объектом фармакологических исследований.

Кафедрой иммунологии РГМУ совместно с предприятием «Иммунохелп», г. Москва, разработан и внедрен в клиническую практику препарат Суперлимф - естественный комплекс природных ' противомикробных пептидов и цитокинов. Суперлимф является иммуномодулятором с прямым противовирусным и противомикробным действием. Применение препарата Суперлимф является новым перспективным методом терапии, обеспечивающим длительную и качественную ремиссию, уменьшение частоты обострений и улучшение качества жизни пациентов. В литературе отсутствуют данные относительно применения препарата Суперлимф в терапии уроренальных инфекций, что позволило нам включить исследование его эффективности при лечении инфекционно-воспалительных заболеваний органов мочевой системы в цели и задачи диссертационной работы.

В сложившейся ситуации становится патогенетически обоснованным и назначение пациентам с инфекционно-воспалительными заболеваниями органов мочевой системы энзимных препаратов, поскольку энзимы обладают способностью ограничивать распространение воспалительного отека, улучшая при этом микроциркуляцию и противодействуя дальнейшему распространению патологического процесса [ВагБот Б. е1 а1., 1983; РпеЬе et а1., 2002], обладают иммуномодулирующим действием, потенцируют эффект антибактериальных средств [Вагеот 8. е1 а1., 1983; Ремезов А.П. и др., 2003].

Ферментный препарат Вобэнзим (МУКОС-Фарма, Германия) уже несколько лет успешно применяется для лечения и профилактики обострений инфекций мочевыделительной системы, при этом данные о влиянии Вобэнзима на патоморфоз пиелонефрита получены в большинстве случаев на клиническом материале - результатах биохимических тестов, УЗИ-диагностики и пр. Это определяет актуальность проведения исследования эффективности применения Вобэнзима при лечении пиелонефрита в условиях эксперимента с определением морфологических и микробиологических параметров.

Учитывая, что инфекции мочевой системы возникают у пациентов с нарушениями иммунитета, и причиной их является условно-патогенная микрофлора, в качестве одного из вариантов развития инфекционно-воспалительного процесса можно рассматривать эндогенное инфицирование. Транслокация микроорганизмов может произойти из любого биотопа, но чаще источником эндогенной бактериемии служит толстая кишка, как наиболее массивно заселенная полость [Мапёе111. е! а1., 2000; А1уег<1у 1.С. е1 а1., 2003]. В связи с этим основным эндогенным источником инфицирования органов мочевой системы является микрофлора желудочно-кишечного тракта. Поэтому поиск средств, препятствующих процессу транслокации микрофлоры через стенку кишечника, также представляется весьма актуальным.

Согласно литературным данным, наиболее оптимальным в этом отношении может стать дополнительное включение в рацион детей раннего возраста и кормящих матерей продуктов, содержащих пищевые волокна, являющиеся источником короткоцепочечных жирных кислот, под действием которых происходит селективная стимуляция роста и активности полезной микрофлоры, особенно бифидо — и лактобактерий, и одновременно подавление роста патогенных и условно-патогенных бактерий и укрепление стенки кишечника, а, следовательно, и стабилизация гемато-интестинального барьера [Gibson G.R. et al., 1995; Roberfroid M.B. et al., 2002; Priebe M. et al., 2002].

Отечественным предприятием ЗАО «Ягодное», г. Киров, д. Югрино, разработана и выпускается биологически активная добавка (БАД) «Ультрасорб». «Ультрасорб» представляет собой комплекс «Рекицена-РД» с фруктоолигосахаридами. Продукт используется в качестве профилактического средства практически здоровыми людьми, при воздействии неблагоприятных экологических и производственных факторов, при повышенном риске формирования дисбактериоза, онкологических заболеваний, сахарного диабета, иммунной недостаточности. Также применяется отдельно или как компонент функционального питания при заболеваниях желудочно-кишечного тракта (стоматиты, дисбактериоз, острые кишечные инфекции, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, гастриты, холециститы, гепатиты, энтериты, колиты), при нарушениях обмена веществ (атеросклероз, ожирение, сахарный диабет, гипергликемия), при алкогольной интоксикации и алкогольной патологии, при воспалительной патологии кожи микробного и аллергического происхождения, в комплексной терапии вторичной иммунной недостаточности. Основным компонентом «Ультрасорба» являются нерастворимые и растворимые пищевые волокна пшеничных отрубей, метаболизированные винными дрожжами Saccharomices vini, и короткоцепочечные жирные кислоты, наличие которых способствует нормализации кишечной микрофлоры.

Положительный эффект БАД «Ультрасорб» в отношении ликвидации симптомов острой кишечной инфекции доказан при сальмонеллезной инфекции у детей [Золотарев Ю.В. и др., 1999]. В связи с этим представляется актуальным и обоснованным изучение эффективности применения БАД «Ультрасорб» в качестве компонента функционального питания у детей с пиелонефритом.

Цель работы: разработать экспериментальную модель острого пиелонефрита и апробировать на доклиническом материале и в клинике новые методы его патогенетической коррекции с учетом выявленных современных особенностей течения микробно-воспалительных заболеваний почек в детском возрасте.

Задачи исследования:

1. Разработать экспериментальную модель пиелонефрита, позволяющую воспроизводить инфекционно-воспалительный процесс в почках, подобный наблюдаемому в клинике, и не сопровождающуюся нанесением животному операционной травмы.

2. На разработанной экспериментальной модели пиелонефрита исследовать эффективность диеты с высоким содержанием метаболизированных пищевых волокон в плане нормализации качественного и количественного состава кишечной микрофлоры и стабилизации гематоинтестинального барьера.

3. Оценить в эксперименте эффективность препаратов Вобэнзим и Суперлимф в комплексной терапии острого пиелонефрита.

4. Изучить современные особенности течения пиелонефрита в детском возрасте и охарактеризовать роль эндогенной кишечной бактериемии в его развитии.

5. Провести оценку клинической эффективности биологически активной добавки к пище «Ультрасорб» как компонента функционального питания и препарата Вобэнзим как средства патогенетической терапии при пиелонефрите у детей.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработанная модель острого пиелонефрита, воспроизводящая развитие инфекционно-воспалительного процесса в ткани почек вследствие реализации феномена бактериальной транслокации на фоне острого стресса, является оптимальным способом моделирования острого пиелонефрита в эксперименте.

2. Включение метаболизированных пищевых волокон в рацион животных, подвергшихся ректальному заражению урокультурой Escherichia coli, способствует нормализации популяционной численности облигатной микрофлоры кишечника, стабилизации гематоинтестинального биологического барьера и профилактике эндогенного пиелонефрита.

3. Включение в экспериментальную терапию пиелонефрита препарата Суперлимф ускоряет регрессию воспалительных изменений в ткани почек и способствует восстановлению нормальной структуры тканей в органах иммунной системы.

4. Применение препарата Вобэнзим при лечении экспериментального пиелонефрита уменьшает выраженность воспалительных изменений в ткани почек и стимулирует клеточную пролиферацию в Т-зависимых зонах органов иммунной системы.

5. В детском возрасте в возникновении и прогрессировании пиелонефрита существенную роль играет эндогенная бактериемия, развивающаяся вследствие транслокации условно-патогенной кишечной микрофлоры в системный кровоток; в связи с чем патогенетически обоснованным является использование в качестве компонента функционального питания метаболизированных пищевых волокон с целью нормализации кишечного микробиоценоза и предотвращения нарушения целостности гематоинтестинального барьера.

6. Включение ферментного препарата Вобэнзим в комплексную терапию пиелонефрита у детей оказывает положительное влияние на клинические и лабораторные показатели.

Научная новизна. Разработаны два новых варианта моделирования острого пиелонефрита у экспериментальных животных, включая наиболее приближенную к реальным клиническим условиям модель пиелонефрита, развивающегося вследствие эндогенного инфицирования на фоне острого холодового стресса. От пациентов с пиелонефритом, подтвержденным клиническими и лабораторными данными, выделены и охарактеризованы штаммы микроорганизмов (Escherichia coli № 2899 и Staphylococcus saprophyticus № 1256), вызывающие развитие острого пиелонефрита у животных при различных способах заражения.

Иммуногистохимическими исследованиями установлено, что у животных с экспериментальным пиелонефритом отмечается выраженная экспрессия молекул межклеточной адгезии ICAM-1 эндотелиальными клетками и эпителиоцитами проксимальных извитых канальцев. У животных, подвергнутых ректальному введению урокультуры кишечной палочки и последующему острому стрессу, в толстой кишке отмечается активация процессов апоптоза и уменьшение индекса пролиферации.

Впервые выявлено, что включение пребиотического продукта • «Ультрасорб» в рацион экспериментальных животных обеспечивает нормализацию популяционной численности и видового состава микрофлоры, образующей биотоп толстой кишки. При моделировании острого пиелонефрита, развившегося в результате феномена бактериальной транслокации кишечной микрофлоры на фоне острого холодового стресса, включение «Ультрасорба» в диету экспериментальных животных способствует устранению кишечного дисбактериоза и препятствует транслокации условно-патогенной кишечной микрофлоры во внутреннюю среду организма, таким образом обеспечивая профилактику инфекционных осложнений в условиях острого стресса, что подтверждается результатами гематологических, бактериологических, гистологических и иммуногистохимических исследований.

Впервые установлено, что включение в экспериментальную терапию пиелонефрита комплекса природных цитокинов и антибактериальных катионных пептидов (препарат Суперлимф) так же, как и комплекса протеолитических энзимов (препарат Вобэнзим), способствует нормализации лабораторных показателей и ликвидации признаков микробного воспаления в ткани почек экспериментальных животных.

Установлены современные тенденции течения пиелонефрита у детей. На клиническом и патологоанатомическом материале показана роль эндогенной бактериемии, развивающейся вследствие транслокации условно-патогенной кишечной микрофлоры в системный кровоток, в развитии пиелонефрита в детском возрасте.

Впервые установлено, что использование «Ультрасорба» в качестве компонента функционального питания у пациентов с пиелонефритом способствует более быстрой нормализации клинических и лабораторных показателей. Выявлено, что применение ферментного препарата Вобэнзим в составе комплексной терапии пиелонефрита у детей способствует эффективному клиническому улучшению и нормализации лабораторных показателей.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты экспериментальных и клинических исследований, свидетельствующие о роли эндогенной бактериемии в развитии пиелонефрита, позволяют расширить представление о механизмах патогенеза инфекционно-воспалительных заболеваний органов мочевыделительной системы, а также определить оптимальные точки приложения патогенетической терапии при лечении данной патологии.

Установленный в эксперименте эффект «Ультрасорба» в профилактике развития пиелонефрита на фоне эндогенного инфицирования является аргументом в защиту значимости эндогенной бактериемии, обусловленной стрессом, в формировании инфекционно-воспалительных заболеваний почек. Разработанный в эксперименте способ профилактики пиелонефрита может использоваться в клинической практике как у пациентов с хроническим пиелонефритом - в плане предупреждения обострений, так и у пациентов, страдающих дисбактериозом кишечника, с целью профилактики микробно-воспалительного поражения почек. Положительное влияние диеты, обогащенной пищевыми волокнами и короткоцепочечными жирными кислотами, на клинические и лабораторные показатели при остром пиелонефрите получило подтверждение в клинических исследованиях.

Выявленная в эксперименте эффективность препарата Суперлимф делает перспективным дальнейшее его изучение с целью последующего применения в клинической, в том числе, педиатрической практике. Результаты проведенных доклинических и клинических исследований эффективности применения ферментного препарата Вобэнзим при лечении пиелонефрита дают основание к широкому применению его в детской нефрологии.

Связь работы с научными программами. Работа выполнена в соответствие с планом НИР ГОУ ВПО «ПГМА им. академика Е.А. Вагнера Росздрава».

Апробация работы и публикации. Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на II Всероссийской научно-практической конференции «Здоровье и образование», Пермь, 2004 г.; IV Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых и студентов по медицине», Тула, 2005 г.; VI Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды», Пермь-Казань-Пермь, Россия, 2005 г.; II Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал», Пермь-Казань-Пермь, Россия, 2005 г.; Научно-практической конференции «Научно-практические итоги региональных конкурсов РФФИ-Урал в Пермском крае 2004-2006 годов», Пермь, 2007 г.; научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы медицины», Пермь, 2007 г.; Весенней сессии Российской Академии Естествознания, Москва, 2007 г.; VII

Международной конференции «Загрязнение окружающей среды, адаптация, иммунитет», Пермь-Нижний Новгород-Пермь, 2008 г.; II Межрегиональной гастроэнтерологической научно-практической конференции

Неинфекционные заболевания кишечника: от научных достижений к стандартам терапии», Нижний Новгород, 2008 г.; III Научно-практической конференции гастроэнтерологов ПФО «Диагностика и лечение заболеваний органов пищеварения: от научных достижений к стандартам терапии», Нижний Новгород, 2009 г.; Заседании Пермского нефрологического общества, Пермь, 2009 г.; Итоговых научных сессиях ПГМА им. академика Е.А. Вагнера Росздрава, Пермь, 2005 г., 2006 г., 2009 г.

По теме диссертации опубликована 51 печатная работа, из них 9 работ, опубликованных в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ, 4 патента РФ на изобретение.

Внедрение в практику. Полученные в ходе экспериментальных и клинических исследований результаты внедрены в работу отдела морфологических и патофизиологических исследований ЦНИЛ, используются в учебном процессе на кафедре пропедевтики детских болезней и факультетской педиатрии, кафедре патологической физиологии, кафедре гистологии, эмбриологии и цитологии, кафедре микробиологии и вирусологии, кафедре нормальной, топографической и клинической анатомии ГОУ ВПО «ПГМА им. академика Е.А. Вагнера Росздрава», внедрены в работу городского нефрологического отделения и поликлиник №1, №2, №3 ГДКБ им. П.И. Пичугина г. Перми.

Объем и структура диссертации. Диссертация включает следующие разделы и главы: содержание, введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, пять глав собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, практические рекомендации, список литературы. Материалы диссертации изложены на 445 печатных страницах, содержат 109 таблиц, 130 рисунков, 2 клинических примера, включают 324 литературных источника, из которых 151 - отечественных и 173 — иностранных авторов.

ВЫВОДЫ:

1. Разработанная экспериментальная модель острого пиелонефрита, заключающаяся в однократном интраперитонеальном введении нелинейным белым крысам урокультур условно-патогенных бактерий -лактозонегативной Escherichia coli (штамм № 2899) в концентрации 109 КОЕ/мл или Staphylococcus saprophyticus (штамм № 1256) в о концентрации 10 КОЕ/мл, выделенных из мочи детей с острым пиелонефритом, позволяет воспроизвести микробно-воспалительный процесс в ткани почек, сопровождающийся реактивными изменениями в органах иммунной системы.

2. Разработанная экспериментальная модель острого пиелонефрита на основе ректального введения нелинейным белым крысам урокультуры лактозонегативной Escherichia coli (штамм № 2899) в концентрации 109 КОЕ/мл и последующего острого холодового стресса позволяет воспроизвести в эксперименте феномен бактериальной транслокации кишечной микрофлоры в системный кровоток, сопровождающийся формированием микробно-воспалительного процесса в ткани почек и реактивными изменениями в органах иммунной системы.

3. Включение в рацион животных биологически активной пищевой добавки «Ультрасорб» способствует нормализации количественных и качественных показателей кишечного микробиоценоза; при ректальном введении урокультуры Escherichia coli и остром стрессе обеспечивает нормализацию процессов пролиферации и апоптоза в эпителии толстой кишки и профилактику стрессогенной бактериемии и гематогенного пиелонефрита.

4. Применение в терапии экспериментального пиелонефрита препарата Вобэнзим способствует регрессии морфологических признаков пиелонефрита и стимулирует клеточную пролиферацию в Т-зависимых зонах органов иммунной системы.

5. Дополнение комплексной терапии экспериментального пиелонефрита отечественным иммуномодулятором Суперлимф уменьшает выраженность воспалительных изменений в ткани почек и способствует восстановлению нормальной структуры тканей в органах иммунной системы.

6. В этиологической структуре возбудителей пиелонефрита у детей превалируют следующие микроорганизмы: Escherichia coli (44,8%), Staphylococcus spp (17,7%), Streptococcus spp (9,5%), Enterococcus spp (9,8%), Klebsiella spp (8,4%).

7. Важным механизмом в развитии пиелонефрита у детей раннего возраста является нарушение гематоинтестинального барьера и транслокация кишечной микрофлоры через системный кровоток в почки; при этом в структуре возбудителей ведущее место занимают бактерии родов Klebsiella (40%), Escherichia (35%), Staphylococcus (15%) и Proteus (10%).

8. Включение в диету детей с пиелонефритом биологически активной добавки к пище «Ультрасорб» приводит к более быстрому купированию клинических проявлений заболевания, нормализации лабораторных показателей, включая нормализацию качественного и количественного состава кишечной микрофлоры.

9. Дополнение базисной терапии пиелонефрита ферментным препаратом Вобэнзим способствует более быстрому купированию клинических симптомов и лабораторных показателей пиелонефрита у детей, в том числе, к статистически значимому снижению Интерлейкина 8 в сыворотке крови пациентов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Разработанные экспериментальные модели острого пиелонефрита могут использоваться для воспроизведения микробно-воспалительного процесса в ткани почек с целью изучения патогенеза пиелонефрита и доклинической апробации новых средств этиотропной и патогенетической терапии.

2. Биологически активная добавка к пище «Ультрасорб» может быть использована в рационе нелинейных белых крыс для профилактики дисбиотических нарушений как во время эксперимента, так и во время содержания животных в экспериментально-биологических клиниках (вивариях); схема применения: 3 г в сутки на животное в смеси с кормом, курс - 1-3 месяца.

3. Полученные в процессе проведения экспериментальных и клинических исследований результаты позволяют рекомендовать широкое применение биологически активной добавки «Ультрасорб» в педиатрической практике - как для коррекции дисбиотических нарушений, так и у пациентов с пиелонефритом для профилактики дисбактериоза кишечника при приеме антибиотиков и в целях предупреждения рецидивирования пиелонефрита. Рекомендуемая схема применения «Ультрасорба»: дети раннего возраста (1-3 года) - 1 таблетка х 3 раза в день во время приема пищи, дети дошкольного возраста (4-6 лет) — 2 таблетки х 3 раза в день во время приема пищи, дети школьного возраста (7-16 лет) - 3 таблетки х 3 раза в день во время приема пищи; курс — 1-3 месяца.

4. Ферментный препарат Вобэнзим может применяться в комплексном лечении пиелонефрита у детей в острую фазу заболевания и на амбулаторном этапе «долечивания».