Автореферат и диссертация по медицине (14.00.07) на тему:Оценка цитогенетического эффекта факторов окружающей среды в клетках органов дыхательной системы экспериментальных животных и человека

На правах рукописи

Коваленко Мария Александровна

ОЦЕНКА ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА ФАКТОРОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ В КЛЕТКАХ ОРГАНОВ ДЫХАТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА

14.00.07. - Гигиена 03.00.15.-Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте экологии человека и гигиены окружающей среды им.А.Н Сысина РАМН

Научные руководители:

доктор биологических наук доктор биологических наук

Сычева Людмила Петровна Беляева Наталия Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук

Михайлова Руфина Иринарховна

доктор биологических наук, профессор Курило Любовь Федоровна

Ведущая организация: ГОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет Министерства здравоохранения и социального развития РФ

Защита диссертации состоится 18 мая 2005 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 001.009.01 в ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им.А.Н.Сысина РАМН по адресу: 119992, г.Москва, ул. Погодинская, д. 10/15, строение 1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им.А.Н.Сысина РАМН

Автореферат разослан » апреля 2005 года Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук

Беляева Наталия Николаевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. В настоящее время возрастает техногенное загрязнение окружающей среды. В атмосферный воздух ежегодно выбрасываются миллионы тонн пыли, оксида углерода и диоксида серы, сотни тысяч тонн оксидов азота, десятки тысяч тонн других химических веществ Поступление большого количества вредных веществ в организм человека через органы дыхания приводит к повышению распространенности легочной патологии и, особенно, онкологической заболеваемости (Онищенко Г Г., Новиков С М, Рахманин Ю.А с соавт, 2002; Пинигин М А , 2004; Величковский Б Т , 2003; Чучалин А.Г 1998) Опухоли трахеи, бронхов, легкого в последние годы стабильно занимают первое место в общей структуре онкопатологии (41,3 на 100000 населения) Возрастает необходимость оценки влияния канцерогенных факторов на систему органов дыхания Проблема профилактики канцерогенного действия факторов окружающей среды является одной из важнейших в мировом сообществе. Первичная профилактика онкологической заболеваемости предусматривает выявление факторов, обладающим канцерогенным действием, и их устранение или ограничение распространения в окружающей среде В настоящее время существует система исследования канцерогенной активности различных факторов окружающей среды, представляющая собой двухгодичные эксперименты на двух видах лабораторных животных. Однако эти исследования являются длительными, дорогостоящими и проводятся лишь для небольшой части веществ

Разработаны краткосрочные тесты, позволяющие прогнозировать канцерогенные свойства химических веществ на основе определения их мутагенных свойств (Руководство ВОЗ, 1989). Однако эти тесты не позволяют определять мутагенное действие факторов на клетки органов дыхательной системы млекопитающих и человека. Этот аспект проблемы является особенно важным, поскольку доказана органная специфичность действия мутагенов,

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ , БИБЛИОТЕКА I

проявляющаяся в качественных и количественных различиях повреждения генетического аппарата клеток разных органов (Сычева, 2002)

В связи с этим актуальной проблемой является оценка цитогенетических и цитотоксических эффектов различных факторов (Журков В С , 1986; Курило Л Ф , Хилькевич JIB, 1989, Беляева НН, 1997), особенно в клетках органов дыхательной системы Разработанная Л.П.Сычевой (2002) система оценки цитогенетического эффекта in vivo микроядерным методом в клетках различных органов экспериментальных животных на суспензионных препаратах позволяет проводить оценку мутагенного действия факторов, в том числе и в легких Этот методический подход может быть использован для оценки мутагенного действия факторов окружающей среды на клетки органов дыхательной системы млекопитающих и человека" эпителиальные клетки бронхов, легких, слизистой носа Для этого необходима дальнейшая разработка и усовершенствование соответствующих методик, в первую очередь неинвазивных (Рахманин Ю.А., Михайлова Р.И, Зайцева Н В. с соавт., 2001), их апробация при исследовании различных клеточных популяций дыхательной системы при действии различных факторов, а также определение дозо-временных закономерностей возникновения цитогенетического эффекта.

Таким образом, нерешенные вопросы этой актуальной проблемы позволили сформулировать цель исследования: оценить цитогенетический эффект факторов окружающей среды в клетках органов дыхательной системы Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1 Разработать методики оценки цитогенетического действия факторов окружающей среды на клетки органов дыхательной системы экспериментальных животных и человека.

яы <»* »iii.i.

«t» У* *í

2 Изучить цитогенетическое действие отдельных химических соединений, их смесей и у-излучения на клетки легкого млекопитающих при ингаляционном или пероральном воздействии.

3. Изучить дозовые и временные параметры изменения уровня цитогенетического эффекта в клетках легкого млекопитающих

4 Сравнить уровни цитогенетических эффектов в разных клеточных популяциях органов дыхательной системы

5 Оценить спектр и частоту цитогенетических и цитотоксических кариологических показателей эпителиальных клеток в слизистой носа и легких человека.

Научная новизна. Впервые

- разработан метод комплексной оценки цитогенетических и цитотоксических

показателей клеток органов дыхательной системы экспериментальных животных и человека;

- определены частоты клеток с микроядрами, ядерными протрузиями, с центральной ядерной перетяжкой, двуядериых клеток в легких контрольных животных;

- проведена количественная оценка и определены дозовые и временные параметры цитогенетического и цитотоксического действия на клетки легких мышей и/или крыс диоксида азота, диоксидина, диоксазида, симвастатина, продуктов дезактивации химических отходов (совтола, люизита, иприта) при ингаляционном и пероральном воздействии;

- проведена комплексная оценка и установлены фоновые уровни цитогенетических (клеток с микроядрами и протрузиями) и цитотоксических показателей (клеток с вакуолизацией ядра, кариорексисом, двуядерных и клеток с перетяжкой ядра) в эпителии слизистой носа 224 жителей г. Москвы, а также частоты этих показателей в макрофагах бронхоальвеолярного лаважа и

бронхиальном эпителии брат-биопсии больных бронхолегочными заболеваниями

Практическая значимость. Материалы исследований использованы при разработке:

- методических рекомендаций «Оценка мутагенной активности факторов окружающей среды в клетках разных органов млекопитающих микроядерным методом», утвержденных Председателем Межведомственного научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РФ академиком РАМН Ю.А Рахманиным (Москва, 2001);

- методических рекомендаций «Оценка цитологического и цитогенетического статуса слизистых оболочек полости носа и рта у человека», утвержденных Председателем Межведомственного научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РФ академиком РАМН Ю А Рахманиным (Москва, 2005);

- изобретения «Способ дифференциальной диагностики туберкулеза и злокачественных поражений легких» (заявка №2004113078, приоритет от 28.04.2004);

- изобретения «Способ неинвазивной диагностики цитогенетического и цитотоксического действия различных факторов на организм человека» (заявка №2005108225, приоритет от 24 03 2005);

Результаты экспериментальных исследований по изучению мутагенной

активности использованы при обосновании гигиенических нормативов

- симвасгашна - ПДК утверждена Минздравом РФ ("Дополнение №1 к ГН 2 1 6 1338-03 г. - ГН 2 1.6 1765-03 г),

- диоксида азота - разовая ПДК рекомендована к утверждению Комиссией по санэннднормированию МЗиСР РФ (протокол от 28 12 04 г) (Справка о внедрении №2 от 25 01 05 г),

- смеси триэтаноламинных солей сульфированных полихлорированных бифенилов и сульфированного трихлорбензола при перорапьном поступлении в организм лабораторных животных ОДУ в воде водных объектов утверждена Минздравом РФ (ГН 2 1 5 1316-03).

Результаты по оценке мутагенной активности смесей РМ1 (продуктов нейтрализации люизита) и РМ2 (продуктов нейтрализации иприта) использованы при комплексной оценке степени эффективности обезвреживания и утилизации этих отходов и при обосновании гигиенических рекомендаций по технологии их переработки (Справка о внедрении от 02 02 05 г.).

Идивидуальные выписки, отражающие цитогенетические и цитотоксические показатели эпителия слизистой носа 205 обследуемых, служащих офиса, переданы в медсанчасть для практического использования с целью улучшения состояния здоровья обследованных

Работа выполнена в лаборатории генетического мониторинга в рамках двух плановых тем ГУ НИИЭЧиГОС им А.Н.Сысина РАМН (№ госрегистрации 01200303902; «Гигиенические основы управления качеством внутренней среды современных общественных зданий») В работе использованы материалы совместных исследований по оценке цитогенетической активности различных факторов с сотрудниками лабораторий' комплексного эколого-гигиенического нормирования, гигиены атмосферного воздуха, гигиены почвы, экологии и гигиены жилой среды, цитогистологии ГУ НИИЭЧиГОС им А Н.Сысина РАМН, Института общей генетики РАН, ВНИХФИ, ГУЛ МосНПО Радон.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на П1 международной научно-практической конференции «Проблемы онкогенетики: научные и прикладные аспекты» (Киев, 2002); научной конференции «Теоретические основы и практические решения проблем санитарной охраны атмосферного воздуха» и конференции молодых ученых «Развитие научного

творчества молодежи - объект постоянного внимания В.А Рязанова», посвященных 100-летию со дня рождения академика В А Рязанова (Москва, 2003); 2-м съезде токсикологов России (Москва, 2003); 3-м съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 3 - в центральной печати.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы Текст изложен на 124 страницах машинописи и 16 (приложение), иллюстрирован 29 таблицами и 7 рисунками. Указатель литературы содержит 134 источников, из них 48 отечественных и 86 иностранных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту

• Методические основы оценки мутагенного действия факторов окружающей среды на клетки органов дыхательной системы экспериментальных животных и человека.

• Качественные и количественные параметры цитогенетического и цитотоксического действия химических веществ (диоксида азота, диоксидина, диоксазида, симвастатина), продуктов дезактивации химических отходов (совтола, люизита, иприта) при ингаляционном и перорапьном воздействии, низких доз у-излучения.

• Дозовые и временные закономерности изменения уровня цитогенетического и цитотоксического эффекта в клетках легкого экспериментальных животных.

• Сравнение уровней цитогенетических эффектов в разных клеточных популяциях органов дыхательной системы.

Материал, методы и объем исследований. В работе исследовали химические вещества (диоксид азота, диоксидин, диоксазид, симвастатин), смеси (продукты дезактивации люизита, иприта, совтола) и у-излучение (табл. 1). Экспериментальные исследования выполнены на 184 животных (мышах и крысах) при анализе не менее 1000 клеток каждого органа Обследовано 259 человек (табл 2). Выборка представлена 113 мужчинами и 146 женщинами в возрасте 23-68 лет В работе использовали микроядерный тест на клетках костного мозга и органов дыхательной системы.

Статистическую обработку результатов проводили параметрическими и непараметрическими методами с использованием пакета статистических программ STATISTICA for Windows.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Методические основы оценки мутагенного действия факторов окружающей среды на клетки органов дыхательной системы экспериментальных животных и человека. Для регламентирования химических веществ и их смесей с учетом мутагенного действия необходима разработка и усовершенствование методик оценки генетического повреждения клеток легких экспериментальных животных. Цитогенетический эффект (микроядра или хромосомные аберрации) нельзя оценивать на гистологических препаратах (срезах), поэтому целесообразно использование суспензионных препаратов За основу брали метод приготовления суспензионных препаратов с помощью КОН, при котором необходима фиксация в формалине в течение 2-4 недель. Для получения более быстрого ответа о наличии цитогенетического эффекта исследуемого фактора разработали методику приготовления препаратов ех tempore путем механического измельчения легких с применением пипетирования в эмбриональной телячьей сыворотке, что позволяет ускорить скрининговые исследования.

Таблица 1

Объем, методы и схемы экспериментов

Факторы Воздействие Объект Анализируемые показатели Число клеток

Диоксидин 10, 100 и 300 мг/кг (1/60,1/6 и 1/2 ЛД50) в течение 5 и 16 дней, Мыши С57В1/6 (41) Доля пневмоцигов 1,11 типа и макрофагов с микроядрами, ядерными протрузиями, двуядерных 41000

Смесь продуктов дезактивации люизита 1,56, 7,8, 39 мг/кг (1/250, 1/50, 1/10 ЛДи) в течение 8 дней СВАх С57В1/6(21) Доля клеток легкого с микроядрами, ядерными протрузиями, двуядерных и с центральной ядерной перетяжкой 21000

Продукты дезактивации иприта 3,6, 18, 92 мг/кг (1/1250, 1/250,1/50 ЛД50) в течение 6 дней СВАх С57В1/6(15) 15000

Диоксид азота 10 мг/м3 в течение 2 и 5 суток, 20 мг/м3 в течение 2 суток и 45 мг/м3 в течение 4 часов (1/16,1/8, 1/4ЛД50) Белые крысы (31) Доля пневмоцигов 1,11 типа и макрофагов с микроядрами, адерными протрузиями, двуядерных и с центральной ядерной перетяжкой 31000

Диоксазид 25 мг/кг (1/24 ЛД50) в течение 3 месяцев Белые крысы (10) 10000

Симвастатин 0,19, 0,839 мг/м3 в течение 4 суток Ьелыс крысы (15) 15000

ПХДС-Т (продукты дезактивации совтола) 0,005, 0,05, 0,5 мг/кг (1/1000, 1/100, 1/10 ЛД,„) в течение 3 месяцев Белые крысы (24) 24000

у-излучение Низкоинтенсивное с мощностью дозы 0,175 сГр/сут в течение 363 дней (накопленная доза 0,635Гр) Мыши СВА (22) Доля клеток легкого с микроядрами 44000

Таблица 2

Обследуемые Тип клеток Исследуемые показатели Число клеток

1 19 жителей г Москва 2 205 служащих офиса г.Москва Назальный эпителий -Микроядра, - ядерные протрузии, - двуядерные клетки, - клетки с перетяжкой ядра, - вакуолизация ядра, -кариорексис, - трехядерные (на препаратах браш-бнопсии), - межъядерные хромосомные мосты (на препаратах лаважа) 19000 205000

35 человек больных саркаидозом, альвеолитами и др бронхолегочными заболеваниями 1 Макрофаги (бронхоальвеолярный даваж, 33 человека), 2 Бронхиальный эпителий (браш-биопсия, 16 человек) 33000 16000

Показана специфичность токсического (Беляева H.H., 1997), генотоксического (Kleinsasser N.H et all.,2000) и цитогенетического (Сычева Л.П , 2002) воздействия различных химических факторов на разные типы клеток органов дыхательной системы. Для оценки цитогенетического эффекта факторов в различных типах клеток легкого на суспензионных препаратах нами разработаны морфологические дифференцировочные критерии четырех типов клеток (пневмоциты первого типа, пневмоциты второго типа или секреторные, макрофаги и бронхиальные эпителиоциты), основанные на учете диагностических признаков- формы и размеров клетки; формы и размеров ядра, его расположения в клетке, окраски и структуры хроматина; окраски и структуры цитоплазмы.

В существующих немногочисленных исследованиях по оценке цитогенетического эффекта факторов в клетках бронхоальвеолярного лаважа животных и назальном эпителии человека оценивается, в основном, частота клеток с микроядрами и, иногда, частота двуядерных клеток (в лаваже). В нашем исследовании предлагается учитывать дополнительный цитогенетический показатель «доля клеток с ядерными протрузиями» - шаровидными ядерными структурами за пределами основного ядра в цитоплазме, которые четко отделены от ядра и соединяются с ним перемычкой. Считают, что образование протрузий происходит за счет разрывов хромосомных или хроматидных мостов, отставания хромосом или удаления из клетки амплифицированного генетического материала (Sandvic H.K et al, 2003; Кузоватов С H с соавт., 2000; Shimuzu N. et al., 1998; Miele M et al, 1989). Предлагается учитывать кариологические показатели, указывающие на цитотоксическое действие исследуемого фактора: долю клеток с вакуолизацией ядра, кариорексисом (показатели дегенерации ядра), двуядерные клетки, клетки с центральной перетяжкой ядра (показатели пролиферации клеток) и трехядерные клетки (показатель аномальных митозов).

Качественные и количественные параметры мутагенного действия химических веществ и у-излучения. Впервые покачан мутагенный эффект диоксидина по увеличению доли клеток с микроядрами в легких мышей при действии дозы 300 мг/кг на двух сроках эксперимента (рис 2) В костном мозге в этом же эксперименте отмечен более высокий уровень цитогенетического эффекта, связанный, по-видимому, со свободно-радикальным механизмом действия препарата Выявлено дозо-зависимое увеличение доли двуядерных клеток при действии исследуемых доз на 16 день эксперимента, которое может свидетельствовать о компенсаторной пролиферативной реакции

Установленный цитогенетический эффект диоксидина сравнивали в различных типах клеток легкого пневмоцитах I, II типа и альвеолярных макрофагах. При сравнении наблюдаемых и ожидаемых частот клеток с микроядрами установлен одинаковый уровень эффекта в различных клеточных популяциях.

5 день 5 день 16 день В10 мг/кг ■ 100 мг/кг □ 300 мг/кг

Рис 2 Доля клеток с микроядрами в легких и костном мозге мышей С57В1/6 при действии диоксидина.

При исследовании смеси продуктов дезактивации люизита

цитогенетический эффект выявлен по увеличению частоты клеток с микроядрами в костном мозге и клеток с протрузиями в легких Эффект наблюдался при действии самой низкой из исследуемых доз, соответствующей 1/250 ЛД50 (рис 3) При изучении смеси продуктов дезактивации иприта цитогенетический эффект в легких выявлен при действии доз, соответствующих 1/250 и 1/1250 (рис 4) В исследовании смесей отмечено увеличение доли двуядерных клеток на самых низких исследуемых дозах и отсутствие этого эффекта на высоких Показано соответствие установленных экспериментально органов-мишеней (легких) мутагенного действия смесей продуктов дезактивации люизита и иприта и канцерогенного эффекта (по данным литературы) исходных соединений Выявлено соответствие минимально-

Контроль

ЕЗ Легкое, протрузии П Костный мозг, микроядра

Рис 3.

Цитогенетический эффект продуктов дезактивации люизита в легких и костном мозге мышей.

2.5 •

ъ

5

ш

Контроль

I

Рис 4 Цитогенетический эффект продуктов дезактивации иприта в легких

мышеи.

действующей дозы (МДД) смеси продуктов дезактивации иприта, полученной в нашем исследовании, и МДД канцерогенного действия соединений иприта (IARC Monographs, 19876).

В экспериментах с диоксидином, продуктами дезактивации люизита и иприта определены временные параметры цитогенетического эффекта в легких. Повышение частоты клеток с микроядрами наблюдалось с 5 дня воздействия. При исследовании диоксидина одинаковый уровень доли клеток с микроядрами отмечен на 5 и 16 день воздействия. Наши данные подтверждаются результатами других исследователей по изменению цитогенетического эффекта в макрофагах бронхоальвеолярного лаважа у животных (Taya A. et all., 1994; Talbot R J. et all, 1989). Выявление стойких цитогенетических повреждений в клетках легкого на отдаленном сроке воздействия указывает на возможность возникновения канцерогенных эффектов в этом органе.

Диоксид азота (10,20 и 45 мг/м3) в эксперименте на крысах не индуцировал микроядра и протрузии, но вызывал повышение частоты двуядерных клеток в легком после 120-часового воздействия в дозе, соответствующей 1/16 ЛД50 (рис 5), что, возможно, указывает на увеличение пролиферативной активности в легких.

контроль 10мг/м3 40 10 мг/м3120 20мг/м3 48 45 мг/мЗ 4часа часов часов часов

Рис 5 Доля двуядерных клеток в легком крыс при действии диоксида азота.

Установлено отсутствие цитогенетического и цитотоксического эффекта в легких крыс лекарственных препаратов диоксазида, симвастатина при подостром ингаляционном воздействии и продуктов дезактивации совтола (ПХДС-Т) при пероральном трехмесячном введении в дозах от 1/1000 до 1/20 ЛДзо.

При облучении мышей в хроническом эксперименте на уровне трехкратного превышения природного радиактивного фона (0,635 Гр) отмечалось статистически незначимое повышение частоты клеток с микроядрами на 60 % (рис 1) В совместном исследовании с сотрудниами ГУЛ МосНПО Радон и Института общей генетики РАН отмечено такое же превышение в опыте над контролем частоты цитогенетических повреждений клеток костного мозга, разрывов ДНК в лимфоцитах селезенки и аномалий головок спермиев В целом, цитогенетический эффект низкоинтенсивного у-излучения в легких не выявлен

контроль опыт

Рис. 1. Цитогенетический эффект у-излучения в легких мышей СВА в дозе 0,635Гр.

Оценка цитогенетических и цитотоксических показателей в клетках органов дыхательной системы человека. Для оценки цитогенетического и цитотоксического эффекта в клетках назального эпителия человека разработана неинвазивная методика приготовления, окраски и анализа препаратов.

Проведено исследование цитогенетических и цитотоксических кариологических маркеров в назальном эпителии 205 человек, служащих офиса Определены средние частоты и пределы варьирования исследуемых показателей назального эпителия человека (табл. 3). К группе риска отнесены обследуемые, у которых доля клеток с одним из кариологических показателей выходит за пределы За В целом, по всем показателям выделено 44 индивидуума (21%), из них 17 (8% от всех обследуемых) - по цитогенетическим

В связи с ростом легочной патологии и высокой распространенностью онкологических заболеваний органов дыхательной системы разработка методик оценки цитогенетических и цитотоксических показателей в клетках бронхов и легких имеет большое практическое значение.

Таблица 3

Средние частоты (Хср±тп) и 99% доверительный интервал (ХсР+За) кариологических показателей в назальном эпителии 205 обследуемых

Показатель Хср±т, %о ХСр+Зо

доля клеток с микроядрами 0,35±0,03 1,83

доля клеток с протрузиями 1,51±0,08 5,65

вакуолизация ядра 58,41 ±1,63 132,63

кариорексис 2,27±0,15 10,51

доля двуядерных клеток 2,29±0,11 7,69

доля клеток с ядерной перетяжкой 2,84±0,12 8,48

Поскольку возможность изучения частот этих показателей в клетках бронхов и легкого человека возможна только при проведении диагностических процедур, нами в совместном исследовании с сотрудниками ГУ НИИ туберкулеза были исследованы материалы бронхоальвеолярного лаважа и браш-биопсии больных различными бронхолегочными заболеваниями Разработана методика приготовления, окраски и анализа препаратов этих клеток, которая использована в изобретении «Способ дифференциальной диагностики туберкулеза и злокачественных поражений легких». Определены уровни цитогенетических и цитотоксических показателей в клетках легких и бронхов у больных саркаидозом, альвеолитами и другими бронхолегочными заболеваниями. При саркоидозе доля макрофагов с микроядрами составила 0,58±0,16%о, с ядерными протрузиями 0,98±0,21%о; при альвеолитах -0,75+0,43%« и 1,00±0,50%о соответственно В бронхиальном эпителии больных саркаидозом доля клеток с цитогенетическими показателями составляла 0,42±0,17%о (микроядра) и 1,63+0,34%» (протрузии) В группе больных с другими диагнозами (бронхиальная астма, альвеолярный протеиноз, хронический бронхит и пневмония, киста и пневмония) клетки с

микроядрами и протру зиями при анализе 1000 клеток бронхоальвеолярного лаважа не выявлены

Сравнение цитогенетических и цитотоксических показателей в клетках органов дыхательной системы экспериментальных животных и человека. Уровни цитогенетических показателей (доля клеток с микроядрами и

Таблица 4

Средние значения показателей, полученных в наших исследованиях и у других авторов в клетках органов дыхательной системы животных и человека_

Исследуемые объекты Средние значения показателей в наших исследованиях, %о Средние значения показателей по данным литературы, %о

Клетки с микро ядрами Клетки с протру зиями Двуядер ные клетки Клетки С перетяж кой ядра Микроядра Дву ядерные

Мыши СВА (контрольные животные) 1,40± 0,43" - - - 1,06 (Talbot R_ J et all, 1989) 3,0° (Talbot R.J etall., 1989)

Мыши (СВА" С57В1/б)Р1 (контрольные животные) 1,00± 0,45* 0,83± 0,31* 3,00± 0,86* 19,07± 3,92* 1,0±0,64* (Сычева Л П., 2001) -

Белые крысы (контрольные животные) 0,43± 0,14* 1,3 5± 1,28* 12,26± 1,28a 10,06± 1,21* 0,5±0,36 (Taya A el all., 1994) 1,5±0,46 (Das RK et all ,1994) 11,83±4,17" (Izzotti A et all, 19%) 13,3±0,26 (Taya A. et all, 1994)

Назальный эпителий человека 0,35±0,03 1,51 ±0,08 2,29±0,11 2,84±0,12 0,25±0,22 (Ballann С etal, 1992) 1,2±0,68 (Ymg С J et al, 1997) -

Бронхиальный эпителий браш-биопсии человека 0,42+0,17 1,63±0,34 1,91±0,37 3,25±0,48 - -

Макрофаги бронхоальвеоляр ного лаважа человека 1 саркаидоз 2 альвеолит 3 др. бронхолег 0,58±0,16 0,75±0,43 0 0,98±0,21 1,0±0,5 0 24,64±1,04 29,012,65 30,15±2,99 34,38±1,22 25,0±2,47 14,46±2,09 3,88±1,84 (условно здоровые) (Agosüm F et all, 1992) -

а - средние значения показателя в пневмоцитах I, II типа и макрофагах суммарно; - средние значения показателя в макрофагах

ядерными протрузиями) близки в различных типах клеток органов дыхательной системы крыс и человека и немного выше в клетках легких мышей (табл 4) Значения показателей «доля двуядерных клеток» и «доля клеток с перетяжкой» ядра приблизительно одинаковы в легких крыс и в макрофагах бронхоальвеолярного лаважа человека Средние значения доли двуядерных клеток и клеток с перетяжкой ядра выше в клетках бронхо-алъвеолярного лаважа, чем в назальном и бронхиальном эпителии человека По-видимому, это обусловлено специфическими отличиями клеток, относящихся к разным тканям У человека отмечаются приблизительно одинаковые средние значения исследуемых показателей в назальном эпителии и бронхиальном эпителии, полученном методом браш-биопсии (табл 4)

Таким образом, разработаны и апробированы методические основы комплексного анализа цитогенетического и цитотоксического эффекта в клетках органов дыхательной системы экспериментальных животных и человека, что позволяет применять их при токсиколого-гигиенической оценке различных факторов окружающей среды

ВЫВОДЫ

1 Для регламентирования химических веществ разработаны методические основы оценки цитогенетического и цитотоксического эффектов микроядерным методом с учетом дополнительных кариологических показателей в клетках органов дыхательной системы экспериментальных животных и человека: приготовление суспензионных препаратов, дифференциация на них клеток легкого, анализ показателей в назальном эпителии, бронхах и легких

2 Определены частоты цитогенетических и цитотоксических показателей в клетках легких контрольных животных; в назальном эпителии человека; в

альвеолярных макрофагах бронхоальвеолярного лаважа и клетках бронхиального эпителия больных различными бронхолегочными заболеваниями (саркоидозом, альвеолитами и др).

3 Установлены цитогенетический и цитотоксический эффекты ряда факторов в легких экспериментальных животных:

- диоксидин (300 мг/кг) повышал частоту клеток с микроядрами в легких мышей на 5 и 16 день воздействия и частоту двуядерных клеток на 16 день эксперимента;

- смесь продуктов дезактивации люизита вызывала увеличение частоты клеток с микроядрами в костном мозге; клеток с протрузиями и двуядерных клеток в легких мышей при действии минимальной исследуемой дозы 1,56 мг/кг;

- смесь продуктов дезактивации иприта в минимальной исследуемой дозе 3,6 мг/кг увеличивала частоту клеток легких с ядерными протрузиями и двуядерных клеток при отсутствии эффекта в костном мозге;

- диоксид азота не индуцировал микроядра и протрузии при изученных дозовых и временных параметрах ингаляции, но вызывал повышение частоты двуядерных клеток на 5 сутки воздействия.

4 Установлено отсутствие цитогенетического и цитотоксического эффекта лекарственных препаратов диоксазида и симвастатина при подостром ингаляционном воздействии; продуктов дезактивации совтола (ПХДС-Т) при пероральном трехмесячном введении в легких крыс; низких доз у-излучения на уровне трехкратного повышения природного радиоактивного фона в 12-месячном эксперименте.

5. Определены дозовые и временные параметры цитогенетического и цитотоксического эффекта химических соединений в клетках легкого мышей: минимально-действующая доза варьировала в широких пределах, от

1/1250 и 1/250 ЛД50 в случае продуктов дезактивации люизита и иприта до 1/2 ЛД50 - для диоксидина; цитогенетический эффект в легких мышей при действии ксенобиотиков выявлен на 5 и 16 сутки воздействия

6 Установлена одинаковая чувствительность разных типов клеток легкого (пневмоцитов I, П и макрофагов) к цитогенетическому действию диоксидина.

7 Показано соответствие установленных экспериментально органов-мишеней (легких) и минимально действующих доз мутагенного действия смесей продуктов дезактивации люизита и иприта и канцерогенного эффекта (по данным литературы) исходных соединений

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Сычева J1 П , Коваленко М А . Шереметьева С М , Дурнев А Д , Журков В С Изучение мутагенного действия диоксидина полиорганным микроядерным методом. //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины-2004.-Т 138 -№8.-С.188-90.

Сыпин В.Д., Осипов А.Н., Елаков A.JL, Померанцева М.Д., Заичкина С И., Розанова О.М., Рамайя Л.К., Клоков Д Ю , Пучков П.В , Ахмадиева А.Х , Мязин А Е , Сычева Л П , Кияткина (Коваленко) М А Оценка генетических эффектов хронического воздействия низкоинтенсивного у-излучения цитогенетическими методами и методом ДНК-комет. //Радиационная биология и радиоэкология.-2003 -N.2 -С 156-60

Сычева Л.П , Журков В С., Кияткина (Коваленко) М А. Померанцева М.Д., Рамайя Л.К. Применение микроядерного теста на клетках легких для оценки генотоксического действия химических веществ и радиации //Пульмонология -2001 -Приложение.-С.ЗЗО.

Коваленко М.А. Оценка мутагенного действия физических и химических факторов на клетки легких мышей //В сб' Теоретические основы и практические решения проблем санитарной охраны атмосферного воздуха М.-2003.-С 328-330.

Беляева Н Н , Сычева Л П, Шамарин A.A., Коваленко М А. Структурно-функциональный и цитогенетический анализ дыхательной системы при воздействии атмосферных загрязнений. //В сб: Теоретические основы и практические решения проблем санитарной охраны атмосферного воздуха. М -2003 .-С. 110-113.

Сычева Л П., Коваленко М А. Шереметьева С.М., Мельников A.M., Дурнев А.Д., Журков В.С Оценка мутагенной активности диоксидина полиорганным микроядерным методом. //2й съезд токсикологов России. Тезисы докладов. М-2003.-С.252.

Кияткина ПСоваленко) М.А. Сычева Л.П, Журков B.C., Померанцева М.Д., Рамайя Л.К. Оценка генотоксического действия гамма-излучения на клетки легкого и кишечника мышей разных линий микроядерным методом //Онкология (Украина).-2002.Т.4.-Приложение.-С.23.

Елаков А.Л., Осипов А.Н., Померанцева М.Д., Заичкина С.И., Сычева Л П., Пучков П.В , Розанова О.М., Рамайя Л.К , Ахмадиева А.Х , Мязин А.Е., Кияткина (Коваленко) М А, Сыпин В.Д. Сравнительная оценка генетических эффектов хронического воздействия низкоинтенсивного гамма-излучения цитогенетическими методами и методом ДНК-комет. /ЯII международный симпозиум «Механизмы действия сверхмалых доз» М.-2002.-С.78. Коваленко М.А.. Сычева ЛП, Журков B.C. Оценка мутагенных эффектов факторов окружающей среды в клетках легких экспериментальных животных. //Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития. III съезд ВОГиС. М.-2004.-Т. П.-С.462.

Стацук Т А., Коваленко М А Ядерные аномалии в клетках бронхиального эпителия в дифференциальной диагностике туберкулеза легких. //В сб: Актуальные вопросы туберкулеза и других гранулематозных заболеваний. РАМН, ЦНИИТ, М.-2005.-С.67-69.

Сычева Л.П., Юрченко В В, Журков B.C., Ревазова Ю.А., Кияткина (Коваленко) М.А. Оценка мутагенной активности факторов окружающей среды в клетках разных органов млекопитающих микроядерным методом Методические рекомендации. М.-2001.-22 с.

Беляева H.H., Сычева Л.П., Журков B.C., Шамарин A.A., Гасимова З.М., Коваленко М А . Чуприна О В , Шереметьва С.М, Присекина А В , Можаева Т Е , Александрова В.П., Горелова Ж.Ю, Александровский С.Б. Оценка цитологического и цитогенетического статуса слизистых оболочек полости носа и рта у человека. Методические рекомендации. М -2005.

Заказ N» 4b Подписано в печать 12.04.05 Тираж 100 экз Усл. п.л. 0,84

ООО "Цифровичок", тел. 741-18-71,505-28-72 WUna.cfr.TU

в70

РНБ Русский фонд

2006-4 5824

В настоящее время возрастает техногенное загрязнение окружающей среды. В атмосферный воздух ежегодно выбрасываются миллионы тонн пыли, оксида углерода и диоксида серы, сотни тысяч тонн оксидов азота, десятки тысяч тонн других химических веществ. Поступление большого количества вредных веществ в организм человека через органы дыхания приводит к повышению распространенности легочной патологии, и особенно онкологической заболеваемости (Онищенко Г.Г., Новиков С.М., Рахманин Ю.А. с соавт., 2002; Пинигин М.А., 2004; Величковский Б.Т., 2003; Чучалин А.Г. 1998). Опухоли трахеи, бронхов, легкого в последние годы стабильно занимают первое место в общей структуре онкопатологии (41,3 на 100000 населения) (Социально значимые заболевания населения России в 2003 г., 2004; Государственный доклад, 2002). Возрастает необходимость оценки влияния канцерогенных факторов на систему органов дыхания. Проблема профилактики канцерогенного действия факторов окружающей среды является одной из важнейших в мировом сообществе. Первичная профилактика онкологической заболеваемости предусматривает выявление факторов, обладающим канцерогенным действием и их устранением или ограничением распространения в окружающей среде.

В настоящее время существует система исследования канцерогенной активности различных факторов окружающей среды, представляющая собой двухгодичные эксперименты на двух видах лабораторных животных. Однако эти исследования являются длительными, дорогостоящими и проводятся лишь для небольшой части веществ. По определению экспертов ВОЗ «канцерогеном (химическим, физическим или вирусным) называют агент, способный вызвать или ускорять развитие новообразования, независимо от механизма (или механизмов) его действия или от специфичности эффекта. Канцероген - это агент, который в силу своих физических или химических свойств может вызывать необратимые изменения или повреждение в тех частях генетического аппарата, которые осуществляют гомеостатический контроль над соматическими клетками». Вне зависимости от того, на какие организмы действуют канцерогенные факторы, объединяющей их чертой является мутагенный эффект (индукция генных, хромосомных, геномных мутаций). Своевременное и корректное выявление мутагенов для запрета или ограничения их использования является важнейшей задачей гигиены окружающей среды. (Сычева Л.П., Журков B.C., Рахманин Ю.А., 2003).

Разработаны краткосрочные тесты, позволяющие прогнозировать канцерогенные свойства химических веществ на основе определения их мутагенных свойств (Руководство ВОЗ, 1989; Руководство, 2000). Однако эти тесты не позволяют определять мутагенное действие факторов на клетки органов дыхательной системы млекопитающих и человека. Этот аспект проблемы является особенно важным, поскольку доказана органная специфичность действия мутагенов, проявляющаяся в качественных и количественных различиях повреждения генетического аппарата клеток разных органов (Сычева, 2002).

В связи с этим актуальной проблемой является оценка цитогенетических и цитотоксических эффектов различных факторов (Журков B.C., 1986; Курило Л.Ф., Хилькевич J1.B., 1989; Беляева Н.Н., 1997), особенно в клетках органов дыхательной системы. В настоящее время распространен тест по оценке цитогенетической активности факторов на культуре фибробластов легких китайского хомяка. Разрабатываются системы in vitro на эпителиальных клетках легких для оценки мутагенных свойств. Однако, такие исследования не учитывают истинные взаимодействия структур целого организма на молекулярном, клеточном, тканевом и органном уровнях, метаболические особенности целого организма. Среди методов оценки мутагенности в легких in vivo проводятся исследования с помощью метода Comet, позволяющего определять повреждения ДНК, однако при этом не рассматривается дальнейшая судьба таких повреждений. Проводятся единичные исследования по оценке цитогенетической активности факторов в бронхоальвеолярном лаваже экспериментальных животных, при этом не оцениваются мутагенные эффекты в эпителиоцитах - клетках-мишенях канцерогенеза.

Разработанная Л.П.Сычевой (2002) система оценки цитогенетического эффекта in vivo микроядерным методом в клетках различных органов экспериментальных животных на суспензионных препаратах, позволяет проводить оценку мутагенного действия факторов, в том числе и в легких. Этот методический подход может быть использован для разработки методов оценки мутагенного действия факторов окружающей среды на клетки органов дыхательной системы млекопитающих и человека: эпителиальные клетки бронхов, легких, слизистой носа. Для этого необходима дальнейшая разработка и усовершенствование соответствующих методик, в первую очередь неинвазивных (Рахманин Ю.А., Михайлова Р.И., Зайцева Н.В. с соавт., 2001), их апробация при исследовании различных клеточных популяций дыхательной системы при действии различных факторов, а также определение дозо-временных закономерностей возникновения цитогенетического эффекта.

Таким образом, нерешенные вопросы этой актуальной проблемы позволили сформулировать цель исследования: оценить цитогенетический эффект факторов окружающей среды в клетках органов дыхательной системы. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Разработать методики оценки цитогенетического действия факторов окружающей среды на клетки органов дыхательной системы экспериментальных животных и человека.

2. Изучить цитогенетическое действие отдельных химических соединений, их смесей и у-излучения на клетки легкого млекопитающих при ингаляционном или пероральном воздействии.

3. Изучить дозовые и временные параметры изменения уровня цитогенетического эффекта в клетках легкого млекопитающих.

4. Сравнить уровни цитогенетических эффектов в разных клеточных популяциях органов дыхательной системы.

5. Оценить спектр и частоту цитотоксических кариологических показателей эпителиальных клеток в слизистой носа и легких человека.

Научная новизна. Впервые:

- разработан метод комплексной оценки цитогенетических и цитотоксических показателей клеток органов дыхательной системы экспериментальных животных и человека;

- определены частоты клеток с микроядрами, ядерными протрузиями, с центральной ядерной перетяжкой, двуядерных клеток в легких контрольных животных;

- проведена количественная оценка и определены дозовые и временные параметры цитогенетического и цитотоксического действия на клетки легких мышей и/или крыс диоксида азота, диоксидина, диоксазида, симвастатина, продуктов дезактивации химических отходов (совтола, люизита, иприта) при ингаляционном и пероральном воздействии;

- проведена комплексная оценка и установлены фоновые уровни цитогенетических (клеток с микроядрами и протрузиями) и цитотоксических показателей (клеток с вакуолизацией ядра, кариорексисом, двуядерных и клеток с перетяжкой ядра) в эпителии слизистой носа 224 жителей г. Москвы, а также частоты этих показателей в макрофагах бронхоальвеолярного лаважа и бронхиальном эпителии браш-биопсии больных бронхолегочными заболеваниями.

Практическая значимость. Материалы исследований использованы при разработке:

- методических рекомендаций: «Оценка мутагенной активности факторов окружающей среды в клетках разных органов млекопитающих микроядерным методом», утвержденных Председателем Межведомственного научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РФ академиком РАМН Ю.А.Рахманиным (Москва, 2001);

- методических рекомендаций «Оценка цитологического и цитогенетического статуса слизистых оболочек полости носа и рта у человека», утвержденных Председателем Межведомственного научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РФ академиком РАМН Ю.А.Рахманиным (Москва, 2005);

- изобретения «Способ дифференциальной диагностики туберкулеза и злокачественных поражений легких» (заявка №2004113078, приоритет от 28.04.2004);

- изобретения «Способ неинвазивной диагностики цитогенетического и цитотоксического действия различных факторов на организм человека» (заявка №2005108225, приоритет от 24.03.2005);

Результаты экспериментальных исследований по изучению мутагенной активности использованы при обосновании гигиенических нормативов:

- симвастатина - ПДК утверждена Минздравом РФ (Дополнение №1 к ГН 2.1.6.1338-03 г.-ГН 2.1.6.1765-03 г.);

- диоксида азота - разовая ПДК рекомендована к утверждению Комиссией по санэпиднормированию МЗиСР РФ (протокол от 28.12.04 г.) (Справка о внедрении №2 от|13.01.05 г.);

- смеси триэтаполаминных солей сульфированных полихлорировапных бифенилов и сульфированного трихлорбензола при иероральном поступлении в организм лабораторных животных. ОДУ в воде водных объектов утверждена Минздравом РФ (ГН 2.1.5.1316-03).

Результаты по оценке мутагенной активности смесей РМ1 (продуктов нейтрализации люизита) и РМ2 (продуктов нейтрализации иприта) использованы при комплексной оценке степени эффективности обезвреживания и утилизации этих отходов и при обосновании гигиенических рекомендаций по технологии их переработки (Справка о внедрении от 06.12.04 г.).

Индивидуальные выписки, отражающие цитогенетические и цитотоксические показатели эпителия слизистой носа 205 обследуемых, служащих офиса, переданы в медсанчасть для практического использования с целью улучшения состояния здоровья обследованных.

Работа выполнена в лаборатории генетического мониторинга в рамках двух плановых тем ГУ НИИЭЧиГОС им.А.Н.Сысина РАМН (№ госрегистрации 01200303902 2003-2005 гг.; «Гигиенические основы управления качеством внутренней среды современных общественных зданий» 2005-2007).

В работе использованы материалы совместных исследований по оценке цитогенетической активности различных факторов с сотрудниками лабораторий: комплексного эколого-гигиенического нормирования, гигиены атмосферного воздуха, гигиены почвы, экологии и гигиены жилой среды, цитогистологии ГУ НИИЭЧиГОС им.А.Н.Сысина РАМН, Института общей генетики РАН, ВНИХФИ, ГУП МосНПО Радон.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на III международной научно-практической конференции «Проблемы онкогенетики: научные и прикладные аспекты» (Киев, 2002); научной конференции «Теоретические основы и практические решения проблем санитарной охраны атмосферного воздуха» и конференции молодых ученых «Развитие научного творчества молодежи - объект постоянного внимания В.А.Рязанова», посвященных 100-летию со дня рождения академика В.А.Рязанова (Москва, 2003); 2-м съезде токсикологов России (Москва, 2003); 3-м съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 3 - в центральной печати.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Текст изложен на 124 страницах машинописи, иллюстрирован 29 таблицами и 10 таблицами (приложение) и 7 рисунками. Указатель литературы содержит 134 источника, из них 48 отечественных и 86 . иностранных авторов.

ВЫВОДЫ

1. Для регламентирования химических веществ разработаны методические основы оценки цитогенетического и цитотоксического эффектов микроядерным методом с учетом дополнительных кариологических показателей в клетках органов дыхательной системы экспериментальных животных и человека: приготовление суспензионных препаратов, дифференциация на них клеток легкого, анализ показателей в назальном эпителии, бронхах и легких.

2. Определены частоты цитогенетических и цитотоксических показателей в клетках легких контрольных животных; в назальном эпителии человека; в альвеолярных макрофагах бронхоальвеолярного лаважа и клетках бронхиального эпителия больных различными бронхолегочными заболеваниями (саркоидозом, альвеолитами и др.).

3. Установлены цитогенетический и цитотоксический эффекты ряда факторов в легких экспериментальных животных:

- диоксидин (300 мг/кг) повышал частоту клеток с микроядрами в легких мышей на 5 и 16 день воздействия и частоту двуядерных клеток на 16 день эксперимента;

- смесь продуктов дезактивации люизита вызывала увеличение частоты клеток с микроядрами в костном мозге; клеток с протрузиями и двуядерных клеток в легких мышей при действии минимальной исследуемой дозы 1,56 мг/кг;

- смесь продуктов дезактивации иприта в минимальной исследуемой дозе 3,6 мг/кг увеличивала частоту клеток легких с ядерными протрузиями и двуядерных клеток при отсутствии эффекта в костном мозге;

- диоксид азота не индуцировал микроядра и протрузии при изученных дозовых и временных параметрах ингаляции, но вызывал повышение частоты двуядерных клеток на 5 сутки воздействия.

4. Установлено отсутствие цитогенетического и цитотоксического эффекта лекарственных препаратов диоксазида и симвастатина при подостром ингаляционном воздействии; продуктов дезактивации совтола (ПХДС-Т) при пероральном трехмесячном введении в легких крыс; низких доз у-излучения на уровне трехкратного повышения природного радиоактивного фона в 12-месячном эксперименте.

5. Определены дозовые и временные параметры цитогенетического и цитотоксического эффекта химических соединений в клетках легкого мышей: минимально-действующая доза варьировала в широких пределах: от 1/1250 и 1/250 ЛД5о в случае продуктов дезактивации люизита и иприта до 1/2 ЛД50 - для диоксидина; цитогенетический эффект в легких мышей при действии ксенобиотиков выявлен на 5 и 16 сутки воздействия.

6. Установлена одинаковая чувствительность разных типов клеток легкого (пневмоцитов I, II и макрофагов) к цитогенетическому действию диоксидина.

7. Показано соответствие установленных экспериментально органов-мишеней (легких) и минимально действующих доз мутагенного действия смесей продуктов дезактивации люизита и иприта и канцерогенного эффекта (по данным литературы) исходных соединений.