Автореферат и диссертация по медицине (14.02.01) на тему:Разработка системы морфометрического анализа для скрининга эффектов нестабильности генома в гигиенических исследованиях

На правах рукописиу

005051439

МОШКОВ НИКОЛАЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ

РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ МОРФОМЕТРИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ДЛЯ СКРИНИНГА ЭФФЕКТОВ НЕСТАБИЛЬНОСТИ ГЕНОМА В ГИГИЕНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ (НА ПРИМЕРЕ НАНОМАТЕРИАЛОВ)

14.02.01 - Гигиена

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

4 АПР 2013

Москва 2013

005051439

Работа выполнена в лаборатории генетического мониторинга Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сысина» Министерства здравоохранения Российской Федерации

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук

Ингель Фаина Исааковна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории эколого-гигиенической оценки и прогнозирования токсичности веществ ФГБУ "НИИ ЭЧиГОС им. А.Н.Сысина" Минздрава России

Желдакова Зоя Ильинична

доктор биологических наук, профессор кафедры

Абилев Серикбай Каримович

генетики биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Кафедра гигиены ГБОУ ВПО РНИМУ имени Н.И. Пирогова Минздрава России

Защита состоится 18 апреля 2013 года в 12:30 на заседании Диссертационного совета Д.208.133.01 при ФГБУ "НИИ ЭЧиГОС им. А.Н.Сысина" Минздрава России по адресу: ГСП 119992, Москва, ул. Погодинская, д. 10, стр.1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ "НИИ ЭЧиГОС им. А.Н.Сысина" Министерства здравоохранения РФ и на сайте www.svsin.ni

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного Совета

доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

-Актуальность проблемы. В настоящее время сферы применения наноматериалов (НМ) асширяются очень быстрыми темпами, но растет и количество публикаций, доказывающих, гто паночастицы (НЧ) обладают более высокой токсичностью, чем микроформы тех же веществ Maynard A.D. et al, 2006; Elder A., et al, 2007). Кроме того, у НЧ и НМ обнаружена способность ндуцировать эффекты нестабильности генома (комплекс изменений, происходящих при ансформации стабильного генома нормальной клетки в нестабильный, характерный для еток опухоли (Smith M. et al, 2003). Так, например, показана индукция повреждений ДНК при оздействии НЧ Ti02 на культуру фибробластов человека (Rahman Q., 2002), НЧ АЬ03 и 'ПО; -га эпителиальные клетки мыши (Barillet S., 2010; Weisheng L., 2008), НЧ Fe304, Ti02 и Al - на (летки печени крыс (Hussain S. M., 2005). Обнаружены цитотоксические эффекты действия НЧ ~e2Oj на нейроны крыс (Pisanic I.I., 2007), НЧ аморфного кварца - на макрофаги крыс (Waters .M., 2009), НЧ гидроксидов некоторых металлов - на опухолевые эпителиальные клетки языка тловека А549 (Choi S.J., 2009) и пр. Однако биологическая активность НМ определяется не только их химическим составом, но структурой вещества, размером и формой частиц, собенностями покрытия и пр. (Онищенко Г.И., Рахманин Ю.А. и др, 2007), что требует оценки езопасности каждого НМ.

ля ммогопараметровой оценки эффектов нестабильности генома in vitro наиболее адаптирован шкроядерный тест на клетках крови человека, культивируемых в условиях цитокинетического лока (Fenech M., 1985; Yager J. W. et al, 1988; Pascoe S. A. et al, 1990; Fenech M. et al, 2003), оскольку расширенный протокол цитогенетического анализа в этом тесте (Ингель Ф.И., 2006) озволяет определить практически весь комплекс показателей нестабильности генома генетические повреждения, анеуплоидию, изменения пролиферации клеток и частоты поптоза) в одной постановке и на одном цитогенетическом препарате. Однако один из сновных прогностических показателей риска развития опухоли - анеуплоидия (Тимошевский В.А., Назаренко С.А., 2006), возникающая в результате асимметричного распределения генетического материала между ядрами дочерних клеток, в классическом варианте этого теста не определяется, а расширенный протокол позволяет ее оценить только в клетках, прошедших в словиях цитокинетического блока более одного цикла деления. В прочих современных исследованиях оценка неспецифической анеуплоидии проводится, в основном, путем fish-окрашивання, что связано с использованием дорогих реактивов, приборов и программного обеспечения. Кроме того, все современные исследования эффектов нестабильности генома довольно продолжительны (Santos S.J., 1997; Yurov Y. В., 2007; Пикалова Л.В., 2007; Comet assay interest group, 2011), а число, новых веществ, нуждающихся в оценке безопасности, постоянно растет. Например, количество наноматериалов, в принципе, может увеличиваться до бесконечности, а экстраполяция биологических эффектов одних наноматериалов на другие невозможна (Luther W., 2004;- Tran С. L., 2005; The Royal Society & The Royal Academy of Engineering, 2004; Онищенко Г.И., Рахманин Ю.А. и др, 2007). Поэтому существует острая необходимость разработки экспериментального подхода для скрининга эффектов, указывающих на возможность индукции нестабильности генома клетки вообще и асимметрии распределения генетического материала при делении клетки - в частности. Известно, что размеры ядер клеток с различным содержанием ДНК могут значимо различаться, причем наибольшие различия наблюдаются между гипо- и гипердиплоидными ядрами (Cavalier-Smith Т., 2005; Pellman D., 2007; Agerholm I.E., 2008; Webster M., 2009). Т.е. можно

предположить, что сравнение размеров двух дочерних ядер, произошедших от одного материнского, может выявить неравновесное распределение ДНК между ними. Кроме того, изменение размеров клеточных ядер наблюдается при изменении структуры и степени компактизации хроматина (Не Yin-Cheng, 2003; Wolfe P., 2004), а также - пролиферативной активности клеток (Collins Р. С., 1999; Derenzini ¡VI., 2000; Roca-Cusachs P., 2008). На этом основании можно предположить, что изменение размеров клеточных ядер по сравнению с контролем может свидетельствовать об индукции как эффектов нестабильности генома, и, следовательно, повышении риска опухолевой трансформации клеток, так и об изменении структуры и степени компактизации хроматина. Давно использующийся в цитологии морфометрический анализ, предметом которого является измерение размеров клетки и ее компонентов, до сих пор применяется только для одноядерных клеток, что не позволяет сопоставлять размеры ядер, произошедших из одной материнской клетки и, тем самым, определять степень асимметрии распределения генетического материала. В то же время, блок цитотомии, используемый в микроядерном тесте in vitro, создает условия для образования двуядерных клеток и, следовательно, позволяет сравнивать размеры ядер, образовавшихся в результате деления одного материнского ядра, причем только того, которое разделилось после введения изучаемого вещества.

Цель исследования: на примере эффектов, индуцированных наноматериалами на лимфоцитах крови человека, культивируемых в условиях блока цитотомии, разработать метод морфометрического анализа площадей клеточных ядер в двуядерных клетках, пригодный для скрининга нестабильности генома.

Задачи исследования

1. Создать математическое описание и методическую базу для анализа симметрии площадей ядер в двуядерных клетках, образовавшихся при культивировании клеток крови человека в условиях цитокинетического блока.

2. Проанализировать изменения симметрии площадей ядер двуядерных клеток в культурах лимфоцитов крови человека, экспонированных стандартным мутагеном, а также нано- и микроформами ряда материалов, предполагаемых к применению в различных областях техники, в частности, при водоподготовке.

3. Провести сравнительный анализ цитогенетических эффектов, индуцированных теми же веществами, с использованием расширенного протокола микроядерного теста, и сравнить полученные результаты с данными морфометрического анализа.

4. На основании полученных данных обосновать алгоритм и критерии использования морфометрического анализа площадей ядер в двуядерных клетках для экспресс-прогноза эффектов нестабильности генома на клетках крови человека, культивированных в условиях блока цитотомии.

Научная новизна

1. Предложен новый подход к морфометрическому анализу, основанный на сравнении площадей ядер в двуядерных клетках, образовавшихся из одной материнской при культивировании лимфоцитов крови человека в условиях цитокинетического блока; созданы его математическое обоснование и методическая база.

2. Разработана система морфометрических показателей, которые могут быть использованы для

скрининга эффектов нестабильности генома человека, индуцированных действием НМ, применимая также для анализа эффектов химических соединений и других видов воздействий.

3. Впервые показано, что при экспозиции лимфоцитов крови человека в условиях цитокинетического блока НЧ магнетита в оболочке из силиката, микро- и НЧ диоксида титана, нановолокнами (НВ) и микродисперсией (УД) гидроксида алюминия, а также Ы-метил-Ы-нитро-М-нитрозогуанидином, дшощим истинный раствор, и микрочастицами латекса, наблюдаются:

a. дозозависимое повышение частоты клеток с микроядрами (МЯ) и нуклеоплазмениыми мостами (НИМ), причем для НМ - преимущественно среди клеток, прошедших 2й митотический цикл за время культивирования, а также повышение частоты апоптоза и укорочении клеточного цикла у значительного числа клеток, способных к делению;

b. в клетках, прошедших 2й митотический цикл - дозозависимое повышение доли асимметричных 3-ядерных клеток;

c. дозозависимые изменения площадей ядер и степени их симметрии в двуядерпых клетках, прошедших 1 митотический цикл.

4. Выявлены повторяющиеся высокоуровневые корреляции между морфометрическими индексами, определенными по соотношению и сумме площадей ядер в двуядерпых клетках, и рядом цитогенетических показателей, характеризующих нестабильность генома в клетках, прошедших второй митоз, что доказывает релевантность разработанного подхода для выявления и прогноза эффектов нестабильности генома, включая анеуплоидию.

5. Показано, что увеличение степени асимметрии площадей ядер в двуядерпых клетках ассоциировано с повышением частоты генетических повреждений в клетках, прошедших второй митоз, а увеличение суммарной площади ядер - с ускорением пролиферации клеток в культуре.

Практическая значимость . .

1. Для решения задач генетико-токсикологического скрининга разработан простой и быстрый способ отбора соединений, нуждающихся в углубленном изучении эффектов нестабильности генома, что позволяет в несколько раз сократить продолжительность рабочего времени па анализ по сравнению с цитогенетическим исследованием.

2. Создана минимальная система морфометрических индексов, которые могут быть использованы для скрининга эффектов нестабильности генома человека, индуцированных действием генотоксикантов, включая НМ.

3. Разработанный математический аппарат и созданная методика анализа делают метод пригодным для автоматизации.

4. Получен патент РФ №2467329 «Способ экспресс-оценки степени потенциальной генотоксической активности веществ и факторов среды по наличию анеуплодии в лимфоцитах периферической крови человека, образовавшихся в результате культивирования в условиях цитокииетического блока», Патентообладатель: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательскнй институт экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. Приоритет изобретения: 03 марта 2011г., Зарегистрировано в Гос.реестре (публикация) 20 ноября 2012г. Срок действия - до 03 марта 2031г.

5. Получена справка о внедрении результатов в научно практическую деятельность по изучению канцерогенной активности, подписанная заместителем председателя комисси

по канцерогенным факторам при Роспотребнадзоре РФ профессором Пылевым Л.Н.

6. Личный вклад автора заключается в участии в работе на всех этапах ее проведения: выборе цели и постановке задач, планировании экспериментов и их проведении, разработке математического описания и методики морфометрического анализа площадей ядер в двуядерных клетках, проведении цитогенетического анализа в микроядерном тесте с использованием расширенного протокола и морфометрического анализа эффектов стандартного мутагена МННГ и микрочастиц латекса, а также НЧ магнетита в оболочке из силиката, микро- и НЧ диоксида титана, НВ и УД гидроксида алюминия, разработке подходов к статистическому анализ и - по разработанной методике - статистической обработке комплекса морфометрических индексов и данных цитогенетического анализа эффектов нестабильности генома, обосновании выбора критериев и разработке алгоритма морфометрического анализа площадей ядер в двуядерных клетках. Часть исследований проведена совместно с сотрудниками лаборатории генетического мониторинга ФГБУ «НИИ ЭЧ и ГОС им. А.Н. Сысина» Минздрава России. Положения выносимые на защиту:

1. Математический аппарат метода морфометрического анализа площадей ядер в двуядерных клетках, который базируется на близости формы ядра ФГА-стимулированного лимфоцита к эллипсоиду (5 < 9%) и наличии прямой слабостепенной зависимости между площадью и объемом ядра.

2. Стандартный мутаген МННГ, а также НВ и УД гидроксида алюминия, микрочастицы латекса, НЧ и микрочастицы диоксида титана и НЧ магнетита в оболочке из силиката индуцируют в лимфоцитах крови человека, культивируемых в условиях блока цитокинеза, повышение уровней нестабильности генома, причем различия в индукции генотоксических эффектов иано- и микродисперсных материалов наблюдаются преимущественно в клетках, прошедших 2 и более митотических цикла. Некоторые различия в эффектах одних и тех же материалов на клетках разных доноров обусловлены, преимущественно, разницей в индивидуальных особенностях пролиферативной активности клеток каждого донора в культуре.

3. Для всех изученных соединений обнаружены повторяющиеся значимые корреляции:

a. между частотами генетических повреждений в клетках, прошедших второй митоз, и отношением площадей ядер в двуядерных клетках:

b. между показателями пролнферативной активности лимфоцитов в культуре и суммарной площадью ядер в двуядерных клетках.

4. Алгоритм морфометрического анализа в двуядерных клетках, основанный на оценке изменений средних значений соотношения (51/82) и суммы (81+82) площадей ядер, эффективен для скрининга эффектов нестабильности генома.

Работа выполнена в лаборатории генетического мониторинга ФГБУ НИИ ЭЧиГОС им А.Н.Сысина МЗ РФ в рамках следующих Государственных тем: «Исследование закономерностей регулируемой структурно-энергетической саморганизации

фазоассоциированной воды для формирования питьевых вод с направленным биологическим действием», «Разработка и внедрение в практику профилактической токсикологии методов испытаний химических веществ по их влиянию на здоровье человека, гармонизированные с рекомендациями ОЭСР», «Эпидемиологическое обоснование модели оценки вклада факторов среды обитания в формирование экологически зависимых заболевании и их причинной обусловленности».

Апробация диссертации проведена 06 июля 2012 г на совместном заседании межотдельческой комиссии по апробации докторских и кандидатских диссертаций ФГБУ «НИИ ЭЧ и ГОС им. А.Н. Сысина» Минздравсоцразвития России (протокол №12 от 12.07.2012). Материалы диссертации доложены на: 1 Международном форуме по нанотехнологиям «Rusnanotech 08» (Москва, 3-5 декабря 2008); V съезде Вавнловского общества генетиков и селекционеров, (Москва, 21-27 июня 2009); VI Съезда Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 14-18 мая 2010); III Международном конкурсе научных работ молодых ученых в области нанотехнологий «Rusnanotech 2010» (Москва, 1-3 ноября 2010); пленуме Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды «Актуализированные проблемы здоровья человека и среды обитания и пути их решения» (14-15 декабря 2011); IV Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 22-25 сентября 2011), IV Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье. Молодые ученые за устойчивое развитие страны в глобальном мире» (Москва, 27-28 сентября 2012), а также Conference of International Society for Environmental Epidemiology (1SEE 2009), "Environmental, Food and Global Health" (Ирландия, Дублин, 25-29 августа 2009) и 42 Annual Meeting of European Environmental Mutagenic Society (EEMS) (Польша, Варшава, 16-21 сентября 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 4 - в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, описания результатов собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Текст изложен на 113 страницах машинописи, включая приложения, иллюстрирован 56 таблицами и 34 рисунками. Указатель литературы содержит 106 источников.

МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ И ОБЪЕМ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе изучали эффекты:

• НЧ магнетита, покрытого силикатом (Fe304/Si02, размером 10+/-10 нм, концентрации 515 мкг/мл), изготовленные по методике TEOS (синтез проведен вед. н.с. лаборатории генной терапии вирусных инфекций ГУ НИИ Вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН к.б.н. Г.Г.Кривцовым).

• НЧ диоксида титана: природный аиатаз размером 33,16±16,0 нм, концентрации 1,6-500 мкг/л (Германия).

• микрочастиц диоксида титана: природный анатаз размером 160,0±59,4 нм (США), концентрации 1,6-500 мкг/л;

• HB гидроксида алюминия: марка IPC (АЮОН - 55 % масс., А1(ОН)з - 33 % масс., оксид алюминия А1203 - 5% масс.,' металлический алюминий AI не более 5 % масс., адсорбированная вода HjO до 2% масс., другие примеси до 0.55% масс; ООО «Передовые порошковые технологии » РФ), концентрации 1,5-1000 мкг/л;

• МД формы гидроксида алюминия, размер частиц > 1000 нм (ООО «АО Реахим», РФ) концентрации 1,5-1000 мкг/л;

• К-метпл-ЬМштро-М-нитрозогуашвдина (МННГ), (Aldrich, США), концентрации 0,8-6,0 мкг/мл;

• частиц латекса для фагоцитоза размером 1.5 мкм; (Диа-М, РФ), концентрации 2,5-20,0 мкг/мл.

Выбор доз осуществляли в соответствии с данными литературы (МННГ, латекс) и токсикологическими данными (НМ). Эксперименты проводили in vitro на цельной венозной крови практически здоровых некурящих молодых мужчин, культивированной в условиях цитокинетического блока (Fenech M., 2000; Fenech M., 2003). Каждое из исследованных веществ вводили в культуру в 4-6 концентрациях на 24 часу, а цитохалазин В - на 44 часу от начала культивирования. Еще через 28 часов лимфоциты крови фиксировали в смеси метанол -уксусная кислота. Цитогенетические препараты окрашивали азур-эозином по Гимзе-Ромаиовскому (Роскии Г.И., 1957). Перед началом анализа все препараты шифровали. Цнтогснетический анализ проводили с использованием стандартного международного (Fenech M. et al, 2000, 2003) и расширенного (Ингель Ф.И., 2006) протоколов микроядерного теста.

Для морфометрического анализа на тех же препаратах фотографировали по 100 двуядерных клеток с отдельно лежащими ядрами без видимых повреждений (микроскоп Motic DM-BA-300 со встроенной цифровой камерой, увеличение 10x40). На полученных изображениях, используя инструменты Quick selection и Lasso ADOBE Photoshop, обводили контуры каждого ядра, после чего программа автоматически подсчитывала их площадь как количество пикселей, окруженных контуром. Затем для каждой двуядерной клетки рассчитывали отношение площади большего ядра к площади меньшего ядра (Sli/S2i) и сумму площадей ядер ([£S]i = Sli+S2i). Таким образом, для каждой концентрации изучаемого вещества и для контроля получали по 100 значений S1/S2 и ZS. Для этих выборок рассчитывали следующие морфометрические индексы: арифметическое среднее (М), геометрическое среднее (G), гармоническое среднее (Н), медиана (Med), 10%о, 25%о, 75%о, 90%о, 75%о - 25%о, 90%о - 10%», среднеквадратическое отклонение (СКО).

Таблица 1 - Объем проведенных исследований

исследовано веществ (образцов) 7

в цитогенетическом анализе просмотрено более 61 000 клеток

в морфометрическом анализе измерены площади ядер более 4 000 клеток

проанализировано значений цитогенетических показателей более 1150

проанализировано значений морфометрических индексов более 900

в экспериментах использована кровь 5 доноров

В работе использовали пакеты программ ADOBE Photoshop CS3, ADOBE Illustrator CS5 и Image Pro Insight (в режиме тестирования); для математического моделирования - MathCAD vl4; статистический анализ данных проводили в STATSOFT Statistica 8.0 и MathWave Technologies EasyFit 5.4 Professional.

Статистический анализ результатов цитогенетического анализа проводили с использованием непараметрических методов (критерии х" с поравкой Йетса, Манна-Уитни). Для сравнения выборок Sli/S2i и [IS]i, полученных методом морфометрического анализа для контроля и каждой из исследуемых доз использовали метод Краскела-Уоллеса.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Математическое описание метода морфометрического анализа 2-ялерных клеток

Поскольку в доступной литературе не удалось найти' математического обоснования морфометрического анализа как такового, первый этап работы был посвящен его созданию. В основу было положено соображение о том, что наблюдаемые в оптический световой микроскоп

двумерные изображения клеток, их ядер и других элементов, являются проекциями реальных трехмерных объектов на плоскость предметного стекла в направлении оптической оси микроскопа (Рис. 1, 2).

Визуальный анализ изображений ~4000 двуядерных клеток показал, что большинство проекций ядер имеют овальную форму, которую мы предложили аппроксимировать эллипсом. Для оценки ошибки такой аппроксимации из всего объема изображений случайным образом извлекли изображения 100 ядер, и измерили их площадь а) автоматизированным оконтуриванием ядра в ADOBE Photoshop с использованием инструментов Quick selection и Lasso и подсчетом количества пикселей, ограниченных полученным контуром и б) измерением полуосей воображаемого эллипса, контур которого максимально близок к контуру ядра. Затем для каждого ядра вычислили относительную ошибку аппроксимации, принимая за истинное значение площадь, полученную методом оконтуривания, и проанализировали массив полученных значений.

/

V /

Рис. 1 - Представление объема площадью в оптическом световом микроскопе (слева), аппроксимация ядра как эллипсоида с полуосями а, Ь, с (справа).

мнпвнннивмнш

Рис. 2 - Объемная реконструкция клетки, лежащей на участке предметного стекла, выполненная методом displacement по значениям цветовой шкалы.

Результаты показали, что с коэффициентом доверия 90% точность аппроксимации составляет не менее 9%. Т. е., с достаточной степенью точности форму ядра лимфоцита (аналогично форме его проекции) допустимо аппроксимировать эллипсоидом, причем, если представить для простоты, что полуоси эллипсоида а и b (совпадают с осями х, у на Рис. 1) параллельны плоскости предметного стекла, то проекция ядра на эту плоскость совпадает с его поперечным сечением. После проведения соответствующих преобразований можно доказать, что объем ядра связан с площадью проекции следующей зависимостью:

v = -~ -xSxVs

3/? \ 7Г

(1)

а = а/Ь

Результаты оценки вариабельности параметра а в контрольной выборке из 100 ядер показали, что для 90% ядер 0.858 < а < 0.995. Т.е., если принять а= 0.926, тогда в 90% случаев отклонение от этого значения будет не более ±0.065 (7%), и с коэффициентом доверия 90% точность утверждения а = 0.926 = const составит не менее 7%. Распространяя аналогичные рассуждения на параметр р, и учитывая соотношение (1), получим, что объем клеточного ядра ФГА-стимулированного лимфоцита прямо пропорционален площади ядра в степени 3/2:

V ~ S x Vs (2)

Следует отметить, что косвенное подтверждение постоянства формы и ориентации ядер относительно предметного стекла содержится в ряде статей по количественной микроскопии: большинство авторов (кроме Radwan М. М., 2003) (Ozer Е., 2002; Болгова Л.С., 2002; Не Yin-Cheng, 2003; Wolfe P., 2004; Simeonov R., 2009) не обнаружили статистически значимых различий между опухолевыми и нормальными клетками по показателю коэффициента формы ядер (что указывает на отсутствие изменений формы ядра даже при опухолевой трансформации клетки). Этим данным соответствуют наши результаты; если ядра клеток рассматривать как эллипсоиды, то постоянство (а строго говоря - изменение в малых пределах) отношения осей собственно, и означает постоянство их формы. В целом же неточность утверждения (2) может быть обусловлена тем, что в действительности: 1) ядра не являются эллипсоидами, и отклонение формы проекции ядра от эллипса может составлять до 9% (коэффициент доверия 0.9); 2) параметры а и ß также не являются константами и варьируют в пределах 7% от принятого значения (коэффициент доверия 0.9); 3) полуоси эллипсоида а и b могут не быть параллельными плоскости предметного стекла.

Для оценки погрешности измерения площадей ядер были созданы и исследованы искусственные изображения ядер с априори известной площадью. Для создания таких изображений были использованы программы ADOBE Photoshop и ADOBE Illustrator, применены приемы наложения векторных масок на графические шаблоны, построенные на основе реальных микрофотографий клеточных ядер (Рис. 3). Анализ тест-изображений показал, что относительная погрешность измерения площади каждого отдельного ядра с 90% доверительным пределом лежит в интервале от 0 до 16%.

Рис. 3 - Искусственно сгенерированные изображения клеточных ядер:

А - имитация фона и цитоплазмы клеток, В - создание векторной маски ядер, С - создание изображений ядер на основе маски,

О - полученные тест-изображения.

2. Параллельный анализ цитогенетических и морфометрических эффектов на

культуре крови человека 2.1. Для тарирования метода морфометрического анализа использовали малые дозы стандартного мутагена МННГ (81атепоуа Э. е1 а1, 1997). Результаты цитогенетического анализа (некоторые данные представлены на Рис. 4) показали, что влияние МННГ на пролиферацию клеток проявилось в дозозависимом снижении частоты двуядерных клеток и численности всей фракции делящихся клеток. При этом доля клеток, прошедших за время культивирования 2 и более митотических цикла в пролиферативном пуле увеличивалась, что в совокупности может свидетельствовать об укорочении клеточного цикла у значительного числа клеток, способных к делению. Указанные эффекты сопровождались снижением частоты апоптоза и увеличением асимметрии деления во 2-м митозе (увеличением доли 3-ядерных клеток по сравнению с 4-ядерными). Кроме того, с увеличением концентрации МННГ в

культурах наблюдали увеличение частот двуядерных и четырехъядерных клеток с повреждениями (МЯ), а также суммарной частоты делящихся клеток с генетическими повреждениями (МЯ и НПМ).

Рис. 4 - Некоторые эффекты МННГ, определенные в микроядерном тесте с использованием расширенного протокола цитогенетического анализа; *) различия с контролем значимы, р<0.005. 'морфометрический анализ тех же препаратов показал, что суммарные размеры ядер двуядерных клеток и степень асимметрии их площадей уменьшаются под действием МННГ, что в целом говорит о снижении доли двуядерных клеток с большими асимметричными ядрами с ¡увеличением дозы мутагена. Эти эффекты были ярче выражены для малых доз МННГ по сравнению с действием максимальной дозы. Следует отметить, что снижение плоидности ядер при увеличении концентрации МННГ было описано В.А.Тимошевским и С.А.Назаренко (2010) в тесте на индукцию хромосомных аберраций в культуре клеток человека (ТХАЧ). Важно, что между цитогенетическими и морфометрическими индексами выявлен ряд сильных корреляционных взаимосвязей (см. Рис. 5). Например, при р=0.037 и 0.014 арифметическое среднее 31/82, Медиана, 75%о, 90%о, 75-25%о и 90-10%о коррелировали с частотой 3-ядерных клеток в популяции и частотой клеток в состоянии митоза Я= -0.90 и 1.00, соответственно; 25%о Э1/32 - с частотой 2-ядерных клеток с МЯ при Я= -0.90 и р=0.037; средние значения 81+82, 125%о, 90%о, 90-10%о, СКО при р=0.037 коррелировали с частотой клеток в состоянии митоза при 11=0.90, что свидетельствует о принципиальной пригодности морфометрического анализа площадей ядер в двуядерных клетках в системе оценки нестабильности генома.

3-ядерные клетки, % 9 клетки в состоянии митоза, % 5 4 , 4-ядерные клетки, % 16 14

3 2 0 0,00 0.75 1.50 3,00 6,00 Р_0 037 Доза МННГ, мкг/мл і 0 0.00 0.75 1.50 3.00 6.00 р=0 014 Доза МНИГ' мкг/мл а 6 4 0,00 0,75 1,50 3.00 6,00 р=0 037 Д°зл WH,,r'MKr/M/1

R=-0.90 эо%о si/s2, ед. 1.5 13 Я= 1.00 Медиана Б1/52, ед. 1,11 1.10 1.09 1 1.08 \ R=-0.90 75%о S1+S2, рх 3500 3300 3100 2900 \ 2700 \ т 2500 іЬч/** 2300 ** ** 2100

1,1 ** 1.0 0,00 0,75 1,50 3.00 6,00 Доза МННГ, мкг/мл 1,06 1.05 **

0,00 0,75 1,50 3.00 6,00 Доза МННГ, мкг/мл 0,00 0,75 1.50 3.00 6.00 Доза МННГ, мкг/мл

Рис. 5 - Примеры высокозначимых корреляций между цитогенетическими показателями (верхний ряд) и морфометрическими индексами (нижний ряд) в динамике доз МННГ; *) различия с контролем значимы, р<0.05; **) различия с контрольной группой значимы, р<0.05.

- % двуядерных клеток с повреждениями

- % ускоренно делящихся к 1*

£

I 30

с повреждениями

0,75 1,5 3

Концентрация МННГ (мкг/мл)

f f 60 I é 50

Ьч

- 2-ядерных клеток -ускоренно делящихся клеток

зо

0,75 1,5 3 Концентрация МНИГ (мкг/мл)

Возможность использования морфометрии площадей ядер в двуядерных клетках при оценке нестабильности генома в условиях корпускулярного мутагенеза, характерного для

НМ, проверяли на химически инертных частицах латекса для фагоцитоза. Цитогенетический анализ обнаружил увеличение частоты 3-ядерных клеток 7.29 ±0.92% до 24.62±3.85% (р=0.007) и увеличение степени асимметрии деления клеток во втором митозе с 0.39 до 1.91 (оценивается как соотношение частот 3-ядерных и 4-ядерных клеток, р = 0.00). Кроме того, на фоне выраженного снижения частоты МЯ в 2-х и 4-ядерных клетках в 5-10 раз увеличивались частоты клеток НПМ, что может объясняться особенностью проявления генотоксической активности латекса. Среди других эффектов нестабильности генома наблюдали увеличение доли ускоренно делящихся клеток в пролиферативном пуле с 15.28±2.21% до 21.78±3.00% (р=0.021) и повышение митотической активности с 0.6% до 2.6% (р-0.046). Следует отметить, что генотоксические эффекты частиц латекса были впервые показаны в 1992 г в ТХАЧ (Когкша Ь.в е1 а1).

Морфометрический анализ выявил снижение асимметрии ядер при воздействии минимальной дозы частиц латекса, причем дальнейшее увеличение дозы не вызывало существенного увеличения эффекта (Рис. 6). Площади ядер под действием минимальной дозы латекса уменьшались на 28% (р<0.01), большие дозы не вызывали столь существенного эффекта. Корреляционный анализ выявил 22 значимых высокоуровневых корреляции между цитогенетическими показателями и морфометрическими индексами (11= +/- 0.90; р=0.037), описывающими соотношение площадей ядер в двуядерных клетках, и 12 подобных связей между цитогенетическими показателями и морфометрическими индексами, характеризующими сумму площадей ядер в двуядерных клетках (некоторые представлены на Рис. 6).

Ч ускоренно делящихся К 4-ядерных клеток с НПМ пролифератиеный пул, Ч

клеток с поппежленилми ^

; 1,00 too : iodo ч

00 1,5 5,0 10.0 20,0 0,0 2.5 5.0 10.0 20,0 0 0 2,5 5,0 10,0 20,0

дом частиц латекса, мнг/мл доі> частиц латекса, мкг/мп __ доэа частиц латекса, мкг/мя

Рис. 6 - Взаимосвязь между некоторыми морфометрическими индексами и индуцированными микрочастицами латекса цитогенетическими эффектами' в культуре лимфоцитов крови человека; *) различия с контролем значимы, р<0.05; **) различия с контрольной группой значимы, р<0.05.

2.2. Возможность использования морфометрического анализа площадей двуядерных клеток для скрининга эффектов нестабильности генома, индуцированных

НМ, изучали на:

• НЧ магнетита в кремниевой оболочке Ке304(8і02) (эксперименты проведены на крови 2 доноров). Цитогенетический анализ обнаружил значимое дозозависимое повышение

12

митотической активности в культуре на 44-76% и увеличение частоты полиядерных клеток в среднем в 2.5 раза. Кроме того, в 3.0-3.5 раза повышалась частота делящихся клеток с повреждениями и в 3.2-5.6 раза увеличивалась частота апоптоза. Различия в цитогенетических эффектах на клетках крови двух доноров были обусловлены разностью в скорости пролиферации клеток. Морфометрический анализ показал, что в культурах клеток обоих доноров площади клеточных ядер дозозависимо увеличивались, что коррелировало с цитогенетическими показателями, в частности, с частотами 3-ядерных клеток с НПМ и 4-ядерных клеток в популяции (11=1.0; р=0.042; Рис. 7). Следует отметить, что для обоих доноров с цитогенетическими показателями, характеризующими уровень повреждения генома, были ассоциированы, преимущественно, морфометрические индексы асимметрии площадей в 2-ядерных клетках, а с показателями пролиферации клеток в культуре - индексы суммы площадей 2-ядерных клеток. Статистически значимых различий в морфометрических индексах между двумя донорами обнаружено не было.

К 3-ядерных клеток с МЯ, НЧ Ре304|5Ю2), донор 1

р=0.042 "Л= 1.00

вреднее значение 51/52 (ед], НЧ ре304(5Ю2),донор 1

1,12 1.11 1,10 1,09 1,08 1,07 1,06

5 10 15 Доза, мкг/мл

% 3-ядерных клеток с НПМ, НЧ Ге304[5Ю2), донор 1

Р=0-042 Доза, мкг/мл

Я= 1.00

Среднее значение 51*52 [рх], НЧ Ге304|5Ю2),Донор 1

0 5 10 15

Доза, мкг/мл

% 4-ядерных клеток в популяции, НЧ Ре304(5Ю2), донор 2

Доза, мкг/мл

Рис. 7 - Примеры взаимосвязи между морфометрическими индексами и индуцированными НЧ Ре304(8Ю2) цитогенетическими эффектами в культуре лимфоцитов крови человека; **) различия с контрольной группой значимы, р<0.05.

• нановолокнах и микродисперсии гидроксида алюминия. Цитогенетические эффекты НВ и МД были близки как в динамике, так и по степени выраженности и проявились в значимом дозозависимом снижении практически всех показателей, включая частоты ускоренно делящихся клеток в пролиферативном пуле, снижении доли 3-ядерных клеток в популяции и пролиферативном пуле, снижении митотической активности и апоптоза, снижении общей частоты клеток с повреждениями (МЯ+НПМ) в двуядерных, а также всех делящихся и ускоренно делящихся клетках (Рис. 8), Обнаруженные эффекты могут быть связаны с некротической гибелью клеток, которая не определяется в данном тесте. Однако пролиферативный пул, частоты ускоренно делящихся клеток и делящихся клеток с повреждениями - особенно на высоких дозах - были выше для МД, а асимметрия деления клеток во 2 митозе - у НВ, что в совокупности может свидетельствовать о различиях в механизмах возникновения и развития цитогенетических эффектов под действием этих веществ. .

% делящихся клеток в популяции

—flh— ультрадисперсия нановолокна

% ускоренно делящихся клеток

*— ультрадисперсия г - нановолокна

-р=0.016 -Z= -2.40

Доза, мкг/ о

Доза, мкг/ л

% делящюкя клегокс повренадениями —•—ультрадисперсия нановолокна

асимметрия деления во 2-м митозе, ер,

ультрадисперсия - «♦» » нановолокна

Рис. 8 - Динамика изменения цитогенетических эффектов, индуцированных разными формами

гидроксида алюминия в культуре лимфоцитов крови человека. Морфометрический анализ обнаружил тенденцию к увеличению доли асимметричных ядер в присутствии НВ, влияние же МД было менее выраженным (Рис. 9). В тоже время, МД индуцировала стабильный дозозависимый рост размеров клеточных ядер, а для НВ увеличение размеров ядер было ярко выражено только на минимальной и максимальной дозе. Некоторые значимые корреляции между результатами цитогенетического и морфометрического анализов представлены на Рис. 9.

% З-ядерных клеток с МЯ, нановолокна

% З-ядерных клеток в популяции, ультрадисперсия

р 0.005

р=0.005_

до за, миг/ л

% 4-ядерных клеток с МЯ, ультрадисперсия

jp=0.036_

-0.943 Среднее S1/S2 [ед.|, нановолокна

R= -0.943 Среднее S1+S2 ípxl.

R= 0.841

Среднее S1/S2 [ед.], ультрадисперсия

Aoja, мкг/ л

Рис. 9 - Примеры взаимосвязи между морфометрическими индексами и индуцированными разными формами гидроксида алюминия цитогенетическими эффектами в культуре лимфоцитов крови человека; *) различия с контролем значимы, р<0.05; **) различия с

контрольной группой значимы, р<0.05. • нано- и микрочастицах диоксида титана (эксперименты проведены на крови 2 доноров) Как показал цитогенетический анализ, на это воздействие культуры крови обоих доноров отвечали сходным образом - увеличением численности фракций ускоренно делящихся

клеток, т.е., ускорением пролиферации. Однако в присутствии НЧ эти показатели у разных доноров изменялись на 20-60%, а МКЧ - на 10-15%. Повышение частоты клеток с повреждениями также было близким как в динамике, так и по уровню для обоих веществ. На показатели симметрии клеточных ядер в культурах обоих доноров НЧ ТЮ2 также действовали сходным образом, причем в обоих случаях наблюдалась тенденция к снижению доли асимметричных ядер. В ходе корреляционного анализа был выявлен ряд высокоуровневых значимых корреляций между цитогенетическими и морфометрическими индексами (Рис. 10).

микро- и наночастицами диоксида титана цитогенетическими эффектами в культуре лимфоцитов крови человека (донор №1); *) различия с контролем значимы, р<0.05; **) различия с контрольной группой значимы, р<0.05.

2.3. Сравнительный анализ эффектов нестабильности генома в культурах разных доноров, экспонированных одним веществом, обнаружил, что суммарные уровни нестабильности генома различались мало, в то время как цитогенетические эффекты в разных клеточных популяциях могли заметно разниться. То есть, обнаруженные различия обусловлены особенностями индивидуальной чувствительности клеток к воздействию, чаще всего проявлявшейся в разнице в скоростях пролиферации клеток. В то же время, для всех воздействий, изученных на клетках разных доноров, соответствующие морфометрические индексы статистически не различались (Рис. 11), что может свидетельствовать не только о большей точности оценок, получаемых в морфометрическом анализе, но и о возможности нивелирования межиндивидуальных различий при использовании этого подхода. Поскольку на этапе накопления материала в качестве морфометрических индексов мы использовали максимальное количество характеристик, традиционно применяемых при описании выборочных распределений, следовало среди них обоснованно выбрать наиболее информативные показатели. С этой целью мы провели кросскорреляционный анализ, который продемонстрировал, что показатели средних значений высокозначимо (Я = 0.71-0.99; р = 0.00) коррелируют с прочими морфометрическими показателями. Исключение составил только 10%о для 81/82. Учитывая простоту интерпретации, мы выделили средние значения отношения и суммы площадей ядер в 2-ядерных клетках в качестве основных морфометрических индексов.

1.18 1.16 1.14 1,12 1Д0 1.08 1,06 Среднее значение 51/Б2 (ед], магнетит - - - - донор 1 —— донор 2 Среднеезначение$1Л2 [ед], наноДТ - - - * донор 1 ——донор 2 1,18 : ..... - 1,16 {............................................................—.................... 1,14 і • Среднеезначение$1/$2[ед], микро ДТ ----донор 1 ■ ■" ■ донор 2 1.19 •;..... ....... ........... 1.16 "

0.00 5,00 10.00 15,00 Дом, мкг/мл 1,12 1.10 J.03 1,06 0,00 1,60 40,00 S00.00 Доза, мкг/л 1,08 ■ ■■■■■-■■■■ 1,06 0,00 1,60 40,00 500,00 Дом, мкг/л

Среднее значениеS2*S2[pxt магнетит 3700 f-c-'.■¿¿морі.......""—.';;.....noHopY^* 3500 ! ...............т / • 3300 4--------- -------------- ......... 3100 t ■ ■ / / ......... 2900 : / 2700 • / ¿ 2500 • 2300 / - - - 2100 i '................ 1900 4-............................-......i....................................... 0,00 5,00 10,00 15,00 Дом, миг/мл Среднее значение SI+S2 fpxj, наноДТ ---.-донор 1 -—донор 2 3700 • 3500 -------------------------------......... 3300 3100 ............—..............-....................-........................------------------- 2900 : "пл ------------ --------------^..... т......... 2500 -.........—................................. --Í......... 2300 ..........- 2100 ......-.................................................. 1900 • 0,00 1.60 40.00 500,00 Дом, мкг/л Среднее значение Б1+52 (рх], микро ДТ - - - - донор 1 —— донор 2 3700 3500 ... 3300 ................-----------------—........................-..........— 3100 ........* 2900 2700 - ..........— .............^""--л....... 2300 • • ....... „.»«■• • 2100 - V 1900 •• 0,00 1,60 40,00 500,00 Доп. ММ г/л

Рис. 11 - Сравнительный анализ влияния нано- и микроформ ряда веществ на размеры и симметрию ядер митоген-стимулированных лимфоцитов крови различных доноров (статистически значимые различия отсутствуют).

Анализ корреляций меяеду морфометрическими и цитогенетическими показателями для разных веществ выявил повторяющиеся сильные и статистически значимые взаимосвязи между всеми проанализированными морфометрическими индексами (таблица 2)'. Общее количество значимых высокоуровневых корреляций по всем изученным веществам для группы морфометрических индексов, описывающих симметрию ядер в двуядерных клетках (81/82), составило 174, для суммы площадей ядер (81+82) - 136. Поэтому группы индексов, описывающие степень асимметрии площадей ядер в двуядерных клетках, могут оказаться более информативными, чем измерение суммарных площадей ядер клеток. В то же время, корреляция разных морфометрических индексов со специфическими цитогенетическими показателями нестабильности генома может говорить о необходимости использования для скрининга нестабильности генома как соотношения площадей ядер в двуядерных клетках, так и их суммы. Представляется весьма важным, что в наших экспериментах морфометрические индексы суммы площадей клеточных ядер чаще всего коррелировали с показателями пролиферативной активности (индексами репликации и пролиферации, объёмом пролиферативного пула культуры). В то же время, для морфометрических индексов, характеризующих симметрию ядер в двуядерных клетках, наибольшее количество значимых высокоуровневых корреляций наблюдалось с частотой 3-ядерных клеток с МЯ. Обнаружение всех этих связей и закономерностей доказывает принципиальную возможность использовать инструментальный и более быстрый морфометрический анализ для скрининга и прогноза развития эффектов нестабильности генома, которые могут затем быть исследованы более глубоко с использованием стандартного цитогенетического анализа на тех же препаратах в расширенном варианте микроядерного теста. -

' вещества в таблице закодированы цифрами: 1 - МННГ, 2 - частицы латекса, 3 - Ре304(5Ю2) донор 1, 4-Ре304(5Ю2) донор 2, 5 - нановолокна гидроксида алюминия, 6 - ультрадисперсная форма гидроксида алюминия, 7 - НЧ диоксида титана донор 1, 8 - НЧ диоксида титана донор 2, 9 - МКЧ диоксида титана донор 1,0- МКЧ диоксида титана донор 2) Знак «+» или «-», поставленный после цифры, показывает, положительная или отрицательная корреляционная связь зафиксирована между индексами для данного вещества

Таблица 2 - Корреляции между рядом морфометричееких индексов (описывающих 51/82, 81+52) и цитогенетическими показателями

S1/S2 S1+S2

Среднее Медиана 25%о 75Хо 75-25%о СКО 1кор. Среднее Медиана 109âo 90%о 90-1054« СКО 1кор.

% 1-яд. клеток в популяции 2+(Н- 8- 0+ 2+7+ 2+7+ 2+ 9 2+ 1

% 2-яд. клеток в популяции 4+ 6+ 2 7- 4- 2

% 3-яд. клеток в популяции 1- 1- 1- 1- 4 6- 6-9- 6- 6- 6- 6-7+ 8

% 4-яд. клеток в популяции 4- 5+ 2 1- 4+ 2

% полняд. клеток в популяции 4-8+ 5+ 7- ■ 8+ 8+ 8+ 7 0- 0- 0- 4+6+0- 3+4+ 4+6+ 10

пролнферативный пул 2-8+9+ 2- 2-7-8+9+ 2-7-8+ 2-8+ 13 2-0- 0- 2-0- 2-0- 7

% 2-яд. клеток в пролиф. пуле 4+8- 2+ 8- 8- 8- 6 7- 4- 2+ 3

% 3-яд. клеток в пролиф. пуле 3- 3- 3- 5- 4 6- 6-9- 6- 6- 6- 6-7+ 8

% 4-яд. клеток в пролиф. пуле ,4-8+ ■ 6+ 3 7+ 3- 2

% полияд. клеток в пролиф. пуле 8+ 5+ 7- 8+ 8+ 8+ 6 0- 0- 0- П 6+0- 4+ 4+6+ 8

% уснор. делящ. в пролиф. пуле 4-8+ ' 2-- 8+ 8+ 8+ 6 7+ 4+ 2- 3

% 2-ядерных клеток с МЯ 1-6+ 6-0- 4 0

% 2-ядерных клеток с НПМ 8+ 3+7-9+ 8+ 8+ 3+8+ 8 0- 0- 0- 0- 3+ 5

% 3-ядерных клеток с МЯ 3-5-9+ 3-9+ 3-4-5-9+ : 4-5-9+ 4- 13 4+ 4+ 4+ 3

% 3-ядерных клеток с НПМ 4-7- 7- 0+ 5-0+ 6 3+ 3+ 3+ 3+4+ 5

% 4-ядерных клеток с МЯ 6+9+ 2+6+8+ 7- 9+ 0- 6+ 9 4+ 4+ 2

% 4-ядерных клеток с НПМ 2- 2-4- 2-4-0+ 4- 7 4+ 4+ 4+7+ 3+ 2- 6

% полиядерных клеток с МЯ 3- 3-0+ 8+ 3-6-7+ 3-6-7+ 0+ 11 9- 4+ 4+ 3

% полиядерных клеток с НПМ 7-8+ 7- 8+ 3-8+ 8+ 7 9+ 1

% делят, клеток с повреждениями 2- 8+ 2 7+ 3+4+ 4+ 4

% 2-яд.кл. с повреждениями 8+ 8+ 8+ 8+ 4 0

% ускор. делящ. кл, с поврежд 2-8+ 5- 2- 4 2-0- 2-0- 2-7+0- 2-0- 3+4+ 4+ 12

индекс репликации, ед. 2-8+ 2-9- 2-4-8+ 2-4-6+8+ 2-4-8+ 14 2-4+0- 4+0- 2-4+0- 2-0- 7+ 11

индекс пролиферации, сд. 2-8+ ->_ 2-4-8+ 2-4-6+8+ 2-4-8+ 13 2-4+0- 4+0- 24+7+0- 2-0- 11

% митоза 4- 6- 2 8+ 8+ 8+ 4+8+ 2-3+ 7

% апоптоза 1+ 1 + 8- 1+0- 1+ 1+ 7 1+ 7+ 1+ 1+4+ 1+4+ 7

асимметрия деления (2 митоз, ед). 7+ 1 6- 6-8+, 6-8+ 5

Всего корреляций 35 21 19 35 41 23 174 21 21 27 26 20 21 136

3. Обсуждение

Г.Н.Красовский, Ю.А.Рахманин и H.A. Егорова, обсуждая альтернативные биологические модели, принципиально пригодные для прогноза токсических. эффектов для человека, подчеркивают необходимость использования лабораторных животных (Красовский Г.Н., и др., 2009). Вместе с тем, для целого ряда токсических эффектов релевантными являются менее затратные и более гуманные модели. Прежде всего, это теоретические исследования, направленные на поиск количественных закономерностей проявления соотношений структура -свойство, проводящиеся в рамках международных исследований по программам SAR - QSAR. Например, в ФГБУ «НИИ ЭЧиГОС им А.Н.Сысина» МЗ РФ Н.В.Харчевникова и З.И.Жолдакова активно развивают новый метод прогноза квантово-химических параметров соотношений структура-токсичность для некоторых групп химических соединений на основе гипотезы о ключевой реакции биотрансформации, характерной для этого ряда соединений (Жолдакова З.И., Харчевникова Н.В., 2000; 2002). Все шире для анализа и прогноза токсических и генотоксических эффектов используются культуры клеток человека и животных (Abbott Chalew Т. Е„ Schwab К. J., 2013; Liu C.Y. et al, 2012). Так, исследователи, работающие в рамках международного проекта по изучению эффектов в микроядерном тесте in vitro (IVMN), доказали адекватность использования первичной культуры крови и некоторых тканей человека и лабораторных животных, а также ряда клеточных линий для оценки генотоксических эффектов факторов различной природы, включая НЧ (Kirsch-Volders М. et al, 2011). В частности, установлено, что микроядерный тест с цитохалазиновым блоком, проводимый на культуре клеток крови животных и человека, позволяет оценивать не только кластогенные и анеугешгые эффекты, но и особенности пролиферации, в совокупности определяемые как нестабильность генома. Некоторые варианта этого метода поддаются автоматизации и хорошо зарекомендовали себя в батарее тестов при оценке потенциальной мутагенной и / или канцерогенной активности. Поэтому результаты оценки нестабильности генома, полученные в этом тесте для новых материалов (в частности НЧ), могут быть, экстраполированы по крайней мере, на лабораторных животных (EVCAM, 2006; ESAC, 2006). Следует также отметить, что этот тест недавно был включен в последний вариант руководства ОЭСР (OECD, 2010). этих тестов обнаружены сильные воспроизводимые для всех изученных веществ статистически значимые корреляционные взаимосвязи, которые чаще всего обнаруживается между асимметрией площадей ядер в двуядерных клетках (прошедших за время культивирования один митотический цикл) и генетическими повреждениями в клетках, содержащих 3,4 и более ядер (прошедших в той же культуре более одного цикла деления). Это подтверждает возможность реализации скрытых предсуществующих (в данном случае, в двуядерных клетках) генетических повреждений в видимые (МЯ и/или НПМ) при прохождении клеткой более одного последующего цикла деления. Обнаружение этих корреляционных связей доказывает принципиальную возможность прогнозировать на основе данных о симметрии ядер двуядерных лимфоцитов эффекты нестабильности генома вообще и возможность прогноза асимметричного распределения генетического материала между дочерними ядрами как одного из наиболее важных эффектов нестабильности генома, связанного с риском развития опухоли - в частности. Кроме того, на основании данных об изменении размеров ядер, может быть дан прогноз пролиферативной активности лимфоцитов крови человека в культуре. Однако характер и знак корреляционных связей зависит как от донора, так и от типа вещества, и данный феномен требует дополнительных глубоких исследований.

Следует также отметить, что для всех исследованных веществ как в цитогенетическом, так и в

морфометрическом анализах были характерны проявления эффекта малой дозы, когда ответ культуры клеток на минимальный уровень воздействия оказывается более выраженным по сравнению с более высокими дозами. Этот эффект может быть связан с тем, что слабое воздействие вызывает в клетках изменения, приводящие к возникновению скрытых повреждений, реализующихся не в ближайшем, а в более поздних циклах деления, в то время как под действием большей дозы чаще возникают серьезные повреждения, запускающие либо апоптоз, либо некроз.

Кроме того, у изученных веществ степень и характер проявления эффектов нестабильности генома несколько различались для разных доноров, что было связано с индивидуальными особенностями пролиферации клеток в культуре. В то же время, уровни и динамика дозозависимого изменения морфометрических индексов были близки для культур крови разных доноров, экспонированных одним и тем же веществом, что свидетельствует не только о высокой точности морфометрического анализа площадей ядер в двуядерных клетках, но и позволяет при его использовании значительно снизить индивидуальные различия между донорами.

Точность прогноза, в основе которого лежат количественные критерии, быстрота и простота исполнения, а также использование современных компьютерных программ сделало разработанный метод морфометрического анализа перспективным и эффективным инструментом генетико-токсикологического скрининга, а создание математического обоснования морфометрического анализа площадей ядер в двуядерных клетках и современной методической базы - пригодным для автоматизации.

По результатам проведенного исследования получен патент РФ на изобретение № 2467329 «способ экспресс-оценки степени потенциальной генотоксической активности веществ и факторов среды по наличию анеуплоидии в лимфоцитах периферической крови человека, образовавшихся в результате культивирования в условиях оптокинетического блока» Полученные результаты позволили создать следующий алгоритм метода морфометрического анализа площадей ядер в двуядерных клетках, согласованный с международными подходами в системах OECD и GLP:

1. Постановка культур, подготовка цитогенетических препаратов (1 контроль и 5 концентраций для каждого исследуемого вещества);

2. Фотографирование по 100 двуядерных лимфоцитов с отдельно лежащими ядрами без видимых повреждений для контроля и каждой концентрации вещества;

3. Измерение площадей ядер (Sli, S2i) каждого лимфоцита в ADOBE Photoshop (оконтуривание ядер и автоматический подсчет количества пикселей внутри контуров)

4. Расчет отношения (Sli/S2i) и суммы площадей большего (1) и меньшего (2) ядра ([ES]i = Sli+S2i) для каждого лимфоцита, формирование выборок для контроля и каждой из доз

5. Расчет морфометрических индексов для полученных выборок (арифметическое среднее S1/S2, S1+S2)

6. Статистическое сравнение выборок Sli/S2i и [£S]i, полученных для контроля и каждой из исследуемых доз (метод Краскела-Уоллеса). Анализ зависимости симметрии и размеров ядер от дозы вещества.

7. При обнаружении дозовых зависимостей и/или статистически значимых различий с контролем изучаемое вещество следует направить на углубленное изучение нестабильности генома.

Анализ данных, полученных в процессе работы, позволил нам построить сравнительную таблицу, характеризующую достоинства и недостатки примененных в ходе исследования методов (Таблица 3).

Таблица 3 - Сравнительная оценка методов морфометрического анализа и микроядерного теста

по результатам работы

Цитогенетический анализ Морфометричсский анализ

Пригоден для углубленного исследования Пригоден для скрининга

Многогранность наблюдаемых эффектов нестабильности генома (определяет 22 основных и 11 производных показателей) Определяет только ключевые показатели нестабильности генома

Сложность сравнения результатов, полученных на клетках разных доноров Нивелирует индивидуальные различия между донорами

Визуальный анализ 1500 клеток на экспериментальную точку Визуальный выбор 100 клеток на экспериментальную точку, их фотографирование и автоматизированный анализ изображений

Трудоемкость и продолжительность исследования Быстрота и простота работы

Сложность разработки системы автоматического определения большинства показателей Система готова для автоматизации

Требует стандартного оборудования Требует стандартного оборудования и стандартных компьютерных программ

Х.Х.Хамидулина и Ю.О.Давыдова (Хамидулина Х.Х., Давыдова Ю.О., 2011) указывают на существенное отставание (по сравнению с расширением производства и ростом исследований) в разработке регламентов безопасности производства и применения НМ, как в России, так и во всем мире. Авторы отмечают следующие методологические и технические трудности, которые препятствуют устранению этого отставания: а) сложности измерения полученной дозы; б) отсутствие данных о качественной и количественной идентичности проявлений токсичности НЧ разной формы и размеров; в) низкая воспроизводимость результатов, полученных в разных лабораториях; г) сложность экстраполяции данных, полученных in vitro; д) необходимость оснащения лабораторий принципиально новым дорогостоящим и сложным оборудованием. Обсуждая эту публикацию, следует отметить, что проблемы, связанные с отсутствием данных о качественной и количественной идентичности проявлений токсичности НЧ разной формы и размеров, сложностью экстраполяции данных, полученных in vitro, а также с проблемами точного измерения полученной дозы являются фундаментальными и требуют проведения серьезных дополнительных исследований. В то же время, воспроизводимость результатов, полученных в разных лабораториях, может быть существенно увеличена при использовании автоматизированных методов исследования. В частности, разработанный метод морфометрического анализа площадей ядер в двуядерных клетках, образовавшихся из одной материнской, пригоден для автоматизации.

Проблема оснащения лабораторий принципиально новым дорогостоящим и сложным оборудованием тоже - на наш взгляд - не более, чем требование времени. Во всем мире создаются новые методы и новое оборудование разрабатывается для их автоматизации.

выводы

1. Создан новый подход в биологической морфометрии, базирующийся на сравнительном анализе площадей ядер двуядерных клеток, образовавшихся в культуре крови человека в результате деления единого материнского ядра в условиях блока цитокинеза. Разработан математический аппарат и экспериментально-методическая база для морфометрического анализа ядер в двуядерных клетках. Показано, что форма изображений ядер в двуядерных клетках с точностью не менее 9% (р=0.90) может быть аппроксимирована эллипсом. Установлено, что площадь этого эллипсоида связана с его объемом соотношением У~83/2.

2. Разработан морфометрический метод количественного анализа степени симметрии распределения генетического материала между дочерними ядрами на препаратах цельной крови человека, подготовленных для анализа в микроядерном тесте с цитокинетическим блоком. Разработаны правила интерпретации морфометрических данных и обоснован минимальный комплекс морфометрических параметров, включающий соотношение и сумму площадей ядер в двуядерных клетках.

3. Обоснованы критерии и алгоритм использования морфометрического анализа ядер в двуядерных клетках с целыо скрининга эффектов нестабильности генома для последующего углубленного изучения биологической активности исследуемых веществ. Критериями выбора таких веществ являются статистически значимые различия с контролем и дозозависимые изменения арифметических средних отношения и суммы площадей ядер в двуядерных клетках. Для надежного заключения требуется анализ эффектов 5-6 доз изучаемого фактора.

4. Установлено, что стандартный мутаген МННГ, а также нано- и микрочастицы диоксида титана, нановолокна и ультрадисперсия гидроксида алюминия, частицы магнетита, покрытого силикатом, и микрочастицы латекса для фагоцитоза индуцируют в культивируемых лимфоцитах крови человека эффекты нестабильности генома. Различия генотоксических эффектов между нано- и микроформой веществ проявляются, преимущественно, в клетках, прошедших в культуре второй митоз. Различия в эффектах нестабильности генома при действии нано- и микроформ одних и тех же веществ на клетки разных доноров связаны с индивидуальными различиями в пролиферативиой активности клеток в культуре.

5. Показано, что изменения уровней нестабильности генома в культуре лимфоцитов крови человека сопровождаются соответствующими изменениями суммы и отношения площадей ядер в двуядерных клетках: в зависимости от дозы сумма площадей ядер устойчиво и высоко достоверно коррелирует с пролиферативиой и митотической активностью клеток, а изменение отношения площадей ядер - с частотами клеток с повреждениями, прошедших за время культивирования более одного митотического цикла

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

В изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Л. В. Ахальцева, Н. Е. Мошков, Ф. И. Мигель, Н. А. Юрцева, В. В. Юрченко Влияние нано-и микрочастиц диоксида титана на показатели микроядерного теста на культуре лимфоцитов крови человека // Гигиена и санитария. 2011; 5: 61-63

2. Мошков Н. Е., Иигель Ф. И., Кривцов Г. Г. Морфометрия клеточных ядер для скрининга эффектов нестабильности генома в микроядерном тесте на лимфоцитах крови человека, культивируемых в условиях цитокинетического блока // Наиотехиолопш и охрана здоровья, 2012; IV, 1 (10): 24-32

3. Мошков Н. Е. Симметрия и размеры ядер двуядерных лимфоцитов как показатели генотоксической активности веществ: тестовое исследование Ы-метил-Ы-нитро-Ы-нитрозогуанидина // Токсикологический вестник, 2012;3:14-19

4. Мошков Н.Е. Площадь ядра ФГА-стимулированного лимфоцита как характеристика его объема. Физический смысл измерения площади клеточного ядра в методах количественной микроскопии И Токсикологический вестник, 2012; 5:.37-40

В других изданиях

5. Мошков Н.Е., Ахальцева Л.В., Ингель Ф.И. Морфометрические параметры лимфоцитов крови человека при экспозиции in vitro наночастицами гидроксида алюминия. // Материалы VI съезда Российского Общества Медицинских Генетиков. Ростов-на-Дону, 14 - 19 мая 2010, Медицинская генетика, 2010, С. 129.

6. Ингель Ф.И., Ахальцева Л.В., Кривцов Г.Г., Мошков Н.Е., Яковлева Г.В., Стехин A.A. Оценка стабильности генома лимфоцитов крови человека in vitro в присутствии малых количеств наночастиц // Сборник тезисов докладов иаучно-техиологических секций Международного форума по нанотехнологиям «Rusnanotech 08», Москва -3-5 декабря 2008

7. Moshkov N.E., Inge! F.I., Ahaltseva L.V., Krivtsov G.G., Yakovleva G.V., Stekhin A.A. Evaluation of safety of nanoparticles and water with modified structure in cytogenetic studies // ISEE 2009 "Environmental, Food and Global Health". 25-29.08.09, Dublin, Electronic abstract book, PN. 147

8. Мошков H.E., Ахальцева Л.В., Кривцов Г.Г., Яковлева Г.В., Стехин A.A. Экспериментальная оценка морфометрических параметров лимфоцитов крови человека in vitro в присутствии малых количеств наночастиц и воды с измененной структурой // Материалы V съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. 21-27 июня 2009г. Москва, Ч.Н, С.343

9. Мошков Н.Е. Экспресс-контроль генотоксических эффектов наночастиц // Сборник тезисов докладов участников III Международного конкурса научных работ молодых ученых в области нанотехнологий «Rusnanotech 10». 1 -3 ноября 2010г., Москва

10. Мошков Н.Е., Ингель Ф.И., Кривцов Г.Г. Новый метод морфометрии ядер как экспресс тест для скрининга генетической безопасности наночастиц // Материалы пленума Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды «Актуализированные проблемы здоровья человека и среды обитания и пути их решения» 14-15 декабря 2011г., Москва,.С.288-292

11. Мошков Н.Е., Ингель Ф.И., Кривцов Г.Г. Новый метод морфометрии ядер для скрининга безопасности наиочастиц//Материалы IV Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии нанотехнологий и медицины» 22-25 сентября 2011г. Ростов-

на-Дону, С. 151

12. Moshkov N.E, Ingel F.I., Krivtsov G.G., Savostikova O.N., Alekseeva A.V. Morphometry of nucleus in binuclear cells as screening test for safety of nanoparticles evaluation.// Abstracts from 42nd Annual meeting of the European Environmental Mutagen Society 16-20.09.2012, Warsaw, Poland, Abstr.Dook, P.102.

13. Мошков H.E. Скрининг потенциальной геиотоксической активности ианоматериалов и наночастиц. // Материалы IV Всероссийской научно-практической конференция молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье. Молодые ученые за устойчивое развитие страны в глобальном мире» с международным участием на базе ФГБУ «НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина» Минздравсоцразвития России (27-28 сентября 2012 г., Москва). Под ред. академика РАМН Ю.А.Рахманина. С.239-242.

14. Мошков Н.Е., Ингель Ф.И., Кривцов Г.Г. «Способ экспресс-оценки степени потенциальной геиотоксической активности веществ и факторов среды по наличию анеуплодии в лимфоцитах периферической крови человека, образовавшихся в результате культивирования в условиях цитокинетического блока», Патент №2467329 Российская Федерация Патентообладатель: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. Приоритет изобретения: 03 марта 2011г., Зарегистрировано в Гос.реестре (публикация) 20 ноября 2012г. Срок действия - до 03 марта 2031г. Бюл. Изобретения и ПМ № 32 от 20.11.2012. http://www.findpatent.ru/natent/246/2467329.html

мд

мкч

мннг

мя

нв

нм

нпм

нч

ТХАЧ

уд

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

- микродисперсия

- микрочастицы

- М-метил-М-нитро-1чГ-нитрозогуанидин

- микроядро

- нановолокна

- нано материал

- нуклеоплазменный мост

- наночастицы

- тест на индукцию хромосомных аберраций в культуре лимфоцитов периферической крови человека

- ультрадисперсия

Заказ № 30-П/03/2013 Подписано в печать 15.03.2013 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

¿¡-"Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru ; е-таИ:т/о@с/г.т