Автореферат и диссертация по медицине (14.00.07) на тему:Научное обоснование и разработка системы оценки мутагенного эффекта химических загрязнений окружающей среды у млекопитающих in vivo с учетом органной специфичности

РГБ ОД

4 т ш

На правах рукописи

СЫЧЁВА ЛЮДМИЛА ПЕТРОВНА

НАУЧНОЕ ОБОСНОВАНИЕ И РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ ОЦЕНКИ МУТАГЕННОГО ЭФФЕКТА ХИМИЧЕСКИХ ЗАГРЯЗНЕНИЙ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ IN VIVO С УЧЕТОМ ОРГАННОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ

14.00.07. - ГИГИЕНА 03.00.15.-ГЕНЕТИКА

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА-2002

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательско: институте экологии человека и гигиены окружающей среды им- А.Н. Сысин Российской академии медицинских наук.

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Журков В.С.

Рахманин Ю./>

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАМН,

Ракитский В.Н

доктор медицинских наук,' профессор доктор медицинских наук, профессор доктор биологических наук, профессор

Курило Л.Ф.

Королев А.А.

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт канцерогенеза Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина

Защита состоится 31 января 2002 г. в 11 часов на заседании диссертационно совета Д 001.009.01 в НИИ экологии человека и гигиены окружающей сре; им. А.Н.Сысина РАМН (119992, Москва, ул. Погодинская, 10).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ экологии человек и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН.

Автореферат разослан « 2 ^ » декабря 2001 г. Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук

Н.Н. Беляева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из важных задач гигиены окружающей :реды является оценка факторов окружающей среды, в том числе их 1утагенных и канцерогенных свойств (Г.И. Сидоренко и соавт., 1995; Ю.А. 'ахманин и соавт. 2001; Н.П. Бочков, А.Н. Чеботарев, 1989; Н.П. Бочков, 2001; З.С. Журков, 1986; 1998; Г.Н. Красовскнй и соавт., 1985; А.П. Ильницкий и оавт., 1993; Ю.А. Ревазова, B.C. Журков, 2001). Общее число ежегодно ;интезируемых химических соединений превышает 5 млн. При выборочных 1спытаниях в разных тест-системах у 5-7% (250-350 тыс.) этих соединений 1ыявлены мутагенные свойства (В.М. Кривочуров и соавт., 1998). Примерно акое же количество веществ (5-10%), с которыми контактирует человек, южет обладать канцерогенной активностью (Н.П. Бочков, А.Н. Чеботарев, 989). Химические канцерогены являются причиной развития онкологических аболеваний приблизительно в 80% случаев (Эпидемиология рака, 1979). По овременным представлениям канцерогенный эффект развивается юследовательно, проходя этапы инициации, промоции и прогрессии. В основе 1азвития опухолей как на стадии инициации, так и, по-видимому, промоции, ежат генотоксические эффекты, и установлена высокая (до 90%) корреляция ■утагенных и канцерогенных свойств химических соединений (J.Ashby, LW.Tennant, 1994; R.Benigni, 1995). Можно считать доказанным, что озникновению и развитию злокачественного роста предшествует накопление [утаций в определенных генах в тех тканях, которые вовлекаются в нкологический процесс (В.Н. Горбунова, 2001). Роль мутагенов не граничивается индукцией опухолей, она более многозначна. Мутационные овреждения зародышевых клеток приводят к спонтанным абортам и рожденным порокам развития. Мутации в половых клетках вызывают овышение частоты наследственных болезней в популяции. Мутационные овреждения соматических клеток обуславливают преждевременное старение

организма. Генетические дефекты являются причиной значительной дол заболеваний у человека, хотя пока не ясно, в какой мере присутствующие окружающей среде химические вещества обусловливают генетические болезн (Руководство по краткосрочным тестам, 1989).

В настоящее время большинство исследований мутагенных свойст химических соединений проводится на прокариотах с помощью теста Эймс; Значительно меньше исследований выполнено на млекопитающих in vivo. ] этих опытах данные преимущественно получены на клетках костного мозг мышей и крыс. Система выявления и оценки мутагенных свойств химически веществ при их гигиеническом регламентировании предусматривае исследование мутагенного действия веществ на клетках костного мозг млекопитающих in vivo и в тесте доминантных летальных мутаций (Журко B.C., 1986). В клетках других органов мутагенный эффект различных факторо мало изучен. Однако по нашим данным и результатам других исследовани (G.Krishna, J.C.Theiss, 1995; F.A.Angelosanto, 1995; М. Hayashi et al., 2000) ря мутагенов не индуцирует цитогенетические повреждения клеток костног мозга, но вызывает эффект в других органах. Общепринятый подход к оценк цитогенетического действия химических соединений на млекопитающих in viv приводит к тому, что вещества, не индуцирующие эффект в клетках костног мозга, могут считаться не мутагенными, несмотря на то, что их эффект в други органах не исследован. Например, известные гепатоканцерогеш нитрозодиметиламин и нитрозодиэтиламин не повышали уровен цитогенетических повреждений в клетках костного мозга, в связи с ч& считали, что они не мутагенны для млекопитающих, до тех пор пок положительный эффект не был выявлен в клетках печени (H.Barbason et al 1975; A. Tates et al, 1980). Кроме того, уровень мутагенного эффект отличается в клетках разных органов. По нашим данным минимально действующие дозы мутагена могут отличаться в различных тканях и органах

5-125 раз. В связи с этим, изучение органной специфичности мутагенов имеет большое значение для более корректного их регламентирования.

Другим важным аспектом проблемы оценки органной специфичности мутагенов является использование тестов на мутагенность для прогноза канцерогенных свойств. В настоящее время оценка мутагенных и канцерогенных свойств химических соединений с целью их гигиенического регламентирования проводится независимо. Дня тестирования канцерогенов предусмотрено проведение двухгодичных экспериментов на лабораторных животных двух видов обоего пола с гистологическим выявлением опухолей во всех основных органах животного (Методические рекомендации, 1985). Однако объем, длительность и стоимость долгосрочных экспериментов на млекопитающих не позволяет проводить рутинное тестирование всех веществ на канцерогенность. Поэтому для решения вопроса о необходимости тестирования вещества на канцерогенность желательно проводить предварительную оценку его мутагенных свойств в системе краткосрочных тестов (А.П. Ильницкий и соавт., 1993; Г.А. Белицкий, В.В. Худолей, 1986; М. Hayashi et al., 2000). При изучении канцерогенов в краткосрочных тестах важно оценивать их органную специфичность, так как это одно из основных свойств канцерогенов. Развитие систем тестирования мутагенных и канцерогенных свойств химических соединений идет в направлении их сближения путем изучения мутагенной активности веществ в разных органах млекопитающих in vivo.

В связи с изложенным определена цель исследования - научное обоснование и разработка системы оценки мутагенного эффекта химических загрязнений у млекопитающих in vivo с учетом органной специфичности. Для достижения этой цели поставлены следующие задачи: 1. Провести сравнительный анализ имеющихся подходов к оценке органной специфичности мутагенного действия факторов окружающей среды и обосновать использование микроядерных тестов на клетках разных органов

млекопитающих in vivo как наиболее информативных и адекватных задачам гигиены окружающей среды.

2. Разработать и усовершенствовать суспензионные методики приготовление препаратов клеток разных органов млекопитающих in vivo для оценка частоты микроядер.

3. Провести сравнительную оценку спонтанного и индуцированногс химическими веществами и у-излучением уровня цитогенетическш повреждений в клетках разных органов с помощью микроядерных тестов и выявить органы-мишени мутагенного действия.

4. Провести анализ цитогенетического повреждения клеток разных органог млекопитающих in vivo в зависимости от дозы, типа мутагена i исследуемого органа; сравнить информативность показателе? количественной оценки для определения органов-мишеней мутагенного действия.

5. Определить зависимость органной специфичности мутагенного действия химических соединений от вида и пола животных, генотипа мышей.

6. Разработать систему оценки мутагенного эффекта химических загрязнений окружающей среды на млекопитающих in vivo с учетом органной специфичности.

7. Провести сравнительный анализ органной специфичности цитогенетического и канцерогенного эффекта веществ; обоснован возможность использования системы для прогноза канцерогенных свойстг химических соединений.

Научная новизна исследований заключается в том, что впервые

- научно обоснована и разработана система оценки мутагенного эффекте химических загрязнений окружающей среды на млекопитающих in vivo с учетом органной специфичности путем анализа цитогенетическо? активности различных факторов и их совокупности в клетках opranoi

основных систем организма (пищеварительной, дыхательной, выделительной, кроветворной);

- определены уровни спонтанной частоты микроядер в клетках разных органов (печени, легких, мочевом пузыре, разных отделах желудочно-кишечного тракта) мышей и/или крыс;

- проведена количественная оценка органной специфичности и определены органы-мишени мутагенного действия бенз(а)пнрена (БП), 1,2-диметилгидразина (ДМГ), 1,2-дибром-З-хлорпропана (ДБХП), 1,2-дибромпропана (ДБП), 1,1,3-трибромпропана (ТБП), циклофосфамида (ЦФ), нитрозодиметиламина (НДЭА), бензамида, хризотил-асбеста, йодированной питьевой воды, смесей продуктов хлорирования циклогексена и бутанола у мышей и/или крыс;

- обоснована необходимость количественной оценки органной специфичности мутагенного действия вещества для определения минимально-действующей (МДД) и «допустимой» дозы мутагена (ДДмут), классификации мутагенов, при изучении видовой, половой и клеточной специфичности;

• показано, что видовая, половая и линейная чувствительность к мутагенному действию химических соединений, определенная с учетом органной специфичности, отличается по уровню эффекта, но не по его наличию или отсутствию;

• определены показатели (МДД, удваивающие дозы и/или коэффициенты Р регрессионных уравнений) для выявления наиболее чувствительных органов-мишеней мутагенного и канцерогенного действия; для сравнения видовой, половой и линейной специфичности с учетом эффекта в разных органах наиболее информативным и чувствительным является показатель "удваивающая доза мутагена";

установлено, что локализация мутагенного эффекта вещества может изменяться в зависимости от дозы, поэтому при оценке органной специфичности необходимо исследовать не менее трех доз;

- обосновано использование системы для оценки мутагенного эффекта и определения органов-мишеней при действии факторов разного типа (химических соединений, относящихся к разным структурным группам; смесей химических веществ, корпускулярных агентов, у-излучения);

- обоснована возможность использования системы оценки мутагенного эффекта химических загрязнений окружающей среды на млекопитающих in vivo с учетом органной специфичности для прогноза канцерогенных свойств химических соединений и определения органов-мишеней канцерогенного действия.

Практическая значимость работы заключается в использовании системы оценки- мутагенного действия химических соединений с учетом органной специфичности для гигиенической оценки и регламентирования факторов окружающей среды. Оценка мутагенного эффекта химических соединений с учетом органной специфичности на млекопитающих in vivo позволяет повысить надежность выявления мутагенов, снизить количество ложно-положительных и ложно-отрицательных результатов при скрининге, прогнозировать канцерогенные свойства и включать эти вещества в список приоритетного тестирования на канцерогенность в долгосрочных экспериментах.

На основе системы впервые разработан алгоритм тестирования веществ для оценки их мутагенной активности с учетом органной специфичности. Он предназначен для использования в практических лабораториях, занимающихся тестированием мутагенных свойств различных факторов.

Установлена мутагенная и потенциальная канцерогенная опасность двух галопропанов - ДБП и ТБП.

В опытах на млекопитающих доказана возможность образования мутагенных продуктов при хлорировании циклогексена и бутанола -гигиенически значимых соединений, загрязняющих в составе сточных вод открытые водоемы.

Дано заключение о безопасности бензампда (промежуточного продукта производства красителей) при оценке мутагенных свойств в клетках костного мозга, преджелудка и желудка мышей в опытах in vivo в диапазоне доз от 12 до 300 мг/кг.

Установлена безопасность длительного потребления йодированной литьевой воды (концентрации йода 62,5 -1000 мкг/л) при оценке мутагенного эффекта в клетках костного мозга и мочевого пузыря крыс.

Материалы диссертационного исследования были использованы при тодготовке следующих методических документов:

■ "Методических указаний по изучению мутагенной активности химических веществ при обосновании их ПДК в воде" (М., 1986), утвержденных Минздравом СССР, №4110-86 от 12.06.1986 г.;

"Временных методических указаний по обоснованию предельно-допустимых концентраций (ПДК) загрязняющих веществ в атмосферном воздухе населенных мест" (М., 1989) утвержденных Минздравом СССР, №468Í-88 от 15.07.1988 г.;

■ Методических рекомендаций "Оценка мутагенных свойств фармакологических средств" (М.,1998), утвержденных Фармкомитетом Минздрава России 11.06.1998 (протокол №6);

"Методических указаний по прогнозированию канцерогенное™ фармакологических средств и вспомогательных веществ в КСТ", вошедших в "Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ" (М., 2000), утвержденное Фармкомитетом Минздрава России;

Методических рекомендаций "Оценка мутагенной активности факторов окружающей среды в клетках разных органов млекопитающих микроядерным методом" (М., 2001), утвержденных Межведомственным научным советом по экологии человека и гигиене окружающей среды.

Работа выполнена в плановом порядке и обобщает результат! многолетних (1986-2001 гг.) исследований, проведенных в лаборатори; мутагенеза в соответствии с планом Проблемной комиссии союзного значени "Научные основы гигиены окружающей среды" в рамках научне исследовательских работ НИИ экологии человека и гигиены окружающе среды им. А.Н. Сысина РАМН при участии с.н.с. к.б.н. И.Ф.Выскубенко и к.бл О.Г. Саламатовой с личным вкладом не менее 80%. №№ государственно регистрации тем 01.850000495; 01.870025753; 01.89.0040738; 01.91.001358С 01.920013586; 01.970002123; 01.970002125.

В работе использованы материалы совместных исследований по оценк мутагенной активности различных факторов с сотрудниками лаборатори комплексного эколого-гигиенического нормирования (рук.: д.м.н., проф. 3.1 Жолдакова), цитогистологии (рук.: д.б.н. Н.Н. Беляева), гигиены питьевог водоснабжения (рук.: д.м.н. Р.И. Михайлова) НИИ экологии и гигиен! окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН; НИИ канцерогенеза ВОНЦ (pyi лабораторий: д.м.н., проф. Г.А. Белицкий; д.м.н., проф.Л.А. Пылев); Институт общей генетики РАН (д.б.н., проф.М.Д. Померанцевой, к.б.н. JI.K. Рамайя).

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на 2 международных, всесоюзных или российских симпозиумах, конференциях совещаниях: IX Всероссийском съезде гигиенистов и санитарных враче (Москва, 2001); 1 съезде токсикологов России (Москва, 1998); Четверто; международном конгрессе "Вода: экология и технология" (Москва, 2000 г. Международной конференции "Загрязнение окружающей среды. Проблем: токсикологии и эпидемиологии" (Пермь, 1993г.); Международном симпозиум «Проблемы токсикологии и прикладной экологии» (Москва-Пермь, июль 199 г.); 1-ом Международном симпозиуме "Окружающая среда и здравоохранени Исследования и разработки в странах Европейского сообществ (ЕС) и в CCCI (Франция, Аббеи де Воде-Серкэ, март 1990 г.); II Всесоюзном (Алма-Ат декабрь 1990 г.), I (третьем) и II (четвертом) Российском съездах медицински

енетиков (Москва, 1994г., Курск, 2000); I Съезде Российского общества енетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова (Санкт-Петербург, 2000); 11 1ациональном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2001); I (сесогозном радиобиологическом съезде (Пущино, 1989); Ежегодных овещаниях Европейского общества по мутагенам окружающей среды: 21 - в Ipare (1991); 26 - в Риме (1996); 28 - в Зальцбурге (1998), 29 - в Копенгагене 1999); 7 Международной конференции по мутагенам окружающей среды Гулуза, 1997); заседаниях секции генетических аспектов проблемы "Человек и иосфера" при ГКНТ СССР "Тест-системы для оценки мутагенного потенциала агрязнителей окружающей среды" (Иркутск, 1984 г.); "Генетические оследствия загрязнения окружающей среды мутагенными факторами" Самарканд, 1990 г.); Всесоюзном симпозиуме "Объем и методы енотоксической оценки и побочных эффектов биологически активных еществ" (Ленинград, май 1989г.); Научно-практической конференции стран 'НГ, Балтии, Закавказья "Проблемы антимутагенеза" (Минск, 1993); оссийской конференции "Мутагены окружающей среды" (Казань, 1996); аседании комиссии по канцерогенным факторам МЗ РФ (Москва, 1997).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 45 печатных работ.

Структура и объел» диссертации. Диссертационная работа состоит из ведения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, трех пав обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Текст зложен на страницах машинописи, иллюстрирован ÍZG таблицами и 9. исунками. Указатель литературы содержит 419 источников, из них f/S течественных иЗй&шостранных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту Система оценки мутагенного эффекта химических загрязнений окружающей среды с учетом органной специфичности в опытах на млекопитающих in vivo.

• Качественная и количественная оценка органной специфичное™ мутагенного действия десяти химических соединений и двух смесей i опытах на млекопитающих.

• Использование системы оценки мутагенного действия химически: соединений для анализа видовой и половой специфичности ; млекопитающих.

• Регламентирование веществ, обладающих мутагенными свойствами < учетом органной специфичности.

• Сравнительная оценка органной специфичности мутагенного i канцерогенного действия и прогноз канцерогенных свойств химически; соединений.

Материал, методы и объем исследований. Эксперименты проведень на неинбредных крысах и мышах, а также мышах (CBAxC57Bl/6)F|, СВА С57В1/6, Balb/c, 101/Н самцах и/или самках. Основными экспериментальным! методами были цитогенетические: анализ аберраций хромосом в клетка: костного мозга и печени и мнкроядерный тест на клетках разных тканей i органов мышей и крыс. Статистическая обработка полученных результато: проводилась с помощью интегрированного пакета анализа данных i компьютерной системе Statistica for Windows (в том числе, корреляционный дисперсионный и регрессионный анализ).

Для исследования выбраны хорошо изученные вещества, обладающие мутагенным и канцерогенным действием (табл. 1): БП, ДМГ, ДБХП, НДЭА ЦФ. Наряду с ДБХП были изучены его структурные гомологи - ДБП и ТБП обладающие мутагенным эффектом на Salmonella typhymurium или Drosophil melanogaster. Их канцерогенный эффект на млекопитающих не изучен Исследованные вещества являются представителями разных наиболее опасны: классов мутагенных соединений: полициклических ароматически: углеводородов (БП); азотистых ипритов (ЦФ); нитрозосоединений (НДЭА] гидразинов (ДМГ), гапогенсодержащих соединений (ДБХП, ДБП, ТБП); амидо

(бензамид). В опытах на крысах изучен эффект одного из представителей группы минеральных пылей - хризотил-асбеста. Подход апробирован также при изучении двух смесей продуктов хлорирования циклогексена и бутанола. В хроническом опыте на крысах исследована цитогенетическая активность йодированной питьевой воды. Микроядерные тесты апробированы при действии ■у-излучения на клетках печени, легких и толстой кишки мышей. Всего было изучено действие 10 веществ, 2 смесей и разных режимов у-излучения. Проведено 38 экспериментов на 934 животных, у которых в совокупности исследовано 2711 органов и 3079980 клеток.

Таблица 1.

Органная специфичность цитогеиетического действия химических соединений

у мышей и крыс

Изученные вещества Исследованные органы

костный мозг легкие печень X о и >, г; О * ч V о. с | желудок Е " и * а. 3 и Й С * Г! подвздошная кишка толстая . кишка мочевой пузырь | почки семенники

БП + 4- - -

ЦМГ - + - - - - +

ЦБХП - + + - - - +

ЦБП - - + - - - +

ГБП - + - - - - +

ВДЭА - + + - - - - - - - -

ЦФ + + - - - + +

Бензамид - - -

Иод - -

Хризотил-асбест -

Продукты хлорирования циклогексена - + +

Продукты хлорирования эутанола + + -

Примечание. Исследованные органы обозначены серым цветом "+" -эффект выявлен;"-" -эффект не выявлен.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Сравнительный анализ подходов к оценке органной специфичности мутагенного действия химических соединений для обоснования методологии, наиболее информативной и адекватной задачам гигиены окружающей среды. Основные подходы к оценке мутагенного эффекта с учетом органной специфичности, отражены в таблице 2. Для гигиенических целей наиболее адекватным по информативности (регистрируемым мутационным событиям, возможности повторного анализа тем же исследователем или другими исследователями) методическим (времени постановки методики, длительности сохранения органов) и стоимостным аспектам является использование микроядерных тестов на разных клетках у органах млекопитающих.

Разработка и усовершенствование суспензионных методик приготовления препаратов клеток разных органов млекопитающих in vive для оценки частоты мнкроядер. Эпителиальные клетки, первым! контактирующие с факторами окружающей среды, представляют особы! интерес для генотоксикологов. Однако плотные контакты этих клетхн затрудняют приготовление суспензионных препаратов. В связи с этик исследования проводятся преимущественно с использованием гистологически? срезов. Но на срезах возможна утрата части ядерного материала. Нам! совместно с д.б.н. H.H. Беляевой впервые разработан способ приготовлени) суспензионных препаратов ex tempore путем диссоциации клеток разны: органов 5% раствором сахарозы для постановки микроядерных тестон Выбраны и отработаны оптимальные способы и условия фиксации препарате: и окраски их азуром Ii-эозином с предварительным мягким гидролизом i последующей дифференцировкой. Для обеспечения длительного сохранена органов и возможности приготовления препаратов в любое удобное врем отработан второй способ приготовления препаратов разных органов путем

Таблица 2.

Сравнительный анализ имеющихся подходов к оценке органной

специфичности мутагенного действия химических соединений

Сравниваемые параметры Тест Comet Оценка органной специфичности на трансгснных мышах Микроядерныи тест

Регистрируемые мутационные события предмутационнме повреждения ДНК генные мутации хромосомные и геномные (анеугенные) мутации

Исследуемые ткани или органы любые любые любые проли-фериругощие

Используемые животные крысы. Ml,или любых линий крысы или мыши со встроенными генами специально сконструированные крысы, мыши любых липни

Стоимость исследований средняя наиболее высокая, превышает стоимость других методов в десятки раз наиболее низкая

Время постановки методики сразу же после окончания воздействия фактора желательно после окончания воздействия фактора (но органы можно заморозить) анализ в удобное для исследователя время (органы фиксируют в формалине)

Длительность сохранения органов не сохраняются непродолжительная неограниченная

Возможность повторного анализа, контроля отсутствует ограничена микроскопические препараты можно анализировать неоднократно

Возможность анализа материала разными исследователями одного и того же эксперимента отсутствует отсутствует неограниченна

фиксации органов в ( юрмалине и дальнейшей щелочной диссоциации клеток

50% раствором КОН, ранее примененный В.В. Юрченко (1983) для анализа частоты микроядер в гепатоцитах экспериментальных животных. Этот способ

адаптирован для получения препаратов клеток разных отделов желудочно-кишечного тракта, легких, мочевого пузыря, почек и других органов. Также адаптированы способы фиксации, окраски ацето-орссином и дифференцировки таких препаратов.

Сравнительная оценка спонтанного уровня цнтогенетических повреждений п клетках разных органов мышеи и крыс с помощью мнкроядерного теста. Обобщенные данные всех экспериментов по спонтанной частоте клеток с микроядрами в разных органах представлены в таблице 3.

Таблица 3.

Спонтанная частота клеток с микроядрами (х±ш, в%о)

_в разных органах крыс и мышей_

Органы крысы 3 сн- и 3 а. X мыши БНК, 6 мыши СВАх С57В1//6 <3 мыши СВАх С57В1//6 ? <" из и к э 3 5 мыши Ва1Ь/с, »о £ о § г мыши С57В1/6 5

Кост- 0,86± 2,00± 0,76± 1,45± 1,17± 0,80± 2,08± нт нт

ный 0,30 0,45 0,23 0,46 0,54 0,25 0,27

мозг (30) (6) (17) (24) (6) (10) (6)

Печень 1,17± 0,48 (6) нт нт 4,33=Ь 1,22 5,75± 1,16 3,00± 0,58 нт нт 7,00± 2,52

(18) (26) (6) (3)

2,67 ± 0,30 (12) 2,17± 0,50± 0,67±

Легкие нт нт 0,65 (12) нт нт 0,34 (6) 0,21 (6) нт

Пред-желу- 0,78± 0,28 1,3 4± 0,61 нт 0,53± 0,19 0,33± 0,21 0,42± 0,15 3,0± 0,82 нт нт

док (18) (6) (18) (6) (10) (б)

Желудок 1,22± 0,32 (18) 0,66± 0,33 (6) нт 0,67± 0,27 (18) 0,83± 0,31 (6) 0,30± 0,08 (10) 3,71± 0,94 (6) нт нт

12- перст- ная кишка 0,61± 0,37 (18) 1,00± 0,26 (6) нт 1,33± 0,42 (6) нт нт нт нт нт

Подвздошная кишка 1,11* 0,57 (18) 0,33± 0,33 (6) нт 0,68± 0,38 (12) нт нт нт нт нт

Толстая кишка 0,77± 0,30 (30) 1,17± 0,65 (6) нт 1,16± 0,22 (23) 0,83± 0,31 (6) 1,17± 0,48 (6) 2,17± 0,67 (6) 1,83± 0,91 (6) нт

Моче- 0,49± нт ИТ 2,13± нт нт нт нт

вой 0,21 0,69

пузырь (15) (18)

нт нт нт 1,83± нт нт нт нт

Почки 0,54 (6)

Семен- нт нт нт 1,00± 11Т нт нт нт ИТ

ники 0,36(6)

Примечание: нт - не тестировали, в скобках - число животных.

Изучение мутагенной активности химических соединений и выявление оргаиов-мишеней у лабораторных животных с помощью микроядерных тестов. В наших опытах испытанные дозы БП (1,0; 5,2; 26,0; 75 и 130 мг/кг) не были эффективными в костном мозге мышей. В то же время корреляционный анализ показал значимую связь между дозой БП и частотой клеток с микроядрами (г=0,992; Р<0,05). Впервые показано значимое

цитогенетическое действие БП в клетках преджелудка мышей при внутрижелудочном введении препарата. Выявлено повышение частоты клеток с микроядрами в печени мышей. Минимально-действующая доза БП в микроядерном тесте на клетках преджелудка и печени мышей составила 26 мг/кг. Установлено отсутствие цитогенетического действия БП в желудке и толстой кишке мышей. Цитогенетический эффект БП был показан также в микроядерном тесте на культуре плевральных мезотелиальных клеток крысы 18 пассажа в концентрации 2 мкг/мл (совместное исследование с д.м.н., проф. Л.Н. Пылевым и к.б.н. Л.А.Васильевой).

ДМГ. Впервые показана значимая цитогенетическая активность ДМГ в клетках печени мышей. Установлено мутагенное действие ДМГ в эпителиальных клетках толстой кишки мышей и крыс. Минимально-действующая доза (МДЦ) в толстой кишке крыс была равна 3,32 мг/кг; в клетках печени и толстой кишки мышей - 0,72 мг/кг. Показано отсутствие мутагенного эффекта ДМГ в других органах (преджелудке, желудке, двенадцатиперстной и подвздошной кишке) желудочно-кишечного тракта, а также в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей и крыс при его введении в широком диапазоне доз от 0,02 до 0,5 ЛД50. Отмечена более высокая чувствительность мышей по сравнению с крысами к цитогенетическому действию ДМГ при анализе микроядер в клетках толстой кишки. Отмечено отсутствие половых различий цитогенетического действия ДМГ в опытах на мышах и более высокая чувствительность самок в опытах на крысах. Установлено, что не было достоверных отличий при действии ДМГ на

клетки толстой кишки крыс при однократном и четырехкратном введении ДМГ и цитогенетический эффект не зависел от времени приготовления препаратов после воздействия в течение 1-3 суток.

Действие галопропанов изучено при испытании следующих доз: ДБХП в опытах на мышах - 5,1; 25,7 и 51,4 мг/кг (0,02; 0,1 и 0,2 ЛД50); в опытах на крысах - 6; 30 и 60 мг/кг (0,02; 0,1 и 0,2 ЛДзо); ДБП в опытах на мышах - 13,5; 67,6 и 338 мг/кг (0,02, 0,1 и 0,5 ЛД50); в опытах на крысах - 21,4; 107 и 214 мг/кг (0,02, 0,1 и 0,2 ЛД50); ТБП в опытах на мышах - 10; 50 и 100 мг/кг; в опытах на крысах - 20; 100 и 200 мг/кг (на обоих видах приблизительно 0,02; 0,1 и 0,2 ЛД50). Все три галопропана не индуцировали микроядра в костном мозге мышей и крыс в подострых опытах, но ДБХП проявил небольшой цитогенетический эффект в остром опыте на мышах в дозе на уровне 0,1 ЛД50. Этот препарат повышал частоту клеток с микроядрами в преджелудке и толстой кишке крыс (МДЦ соответствовала 0,1 и 0,2 ЛД50) и мышей (0,2 ЛДз0); печени мышей (0,02 ЛД50); ДБП - в преджелудке мышей (0,5 ЛД50); в толстой кишке и преджелудке крыс (0,1 ЛД50); ТБП - толстой кишке крыс (0,2 ЛД50) и печени мышей (0,02 ЛДз0). Эти вещества не индуцировали микроядра в клетках желудка, 12-перстной и подвздошной кишке крыс и мышей. ДБП индуцировал микроядра большего размера, чем ДБХП и ТБП, что может определяться разным механизмом их цитогенетического действия. Крысы обладали более выраженной чувствительностью к цитогенетическому действию галопропанов по сравнению с мышами. Химическое строение галопропаноЕ оказывало существенное влияние как на качественные (органоспецифичность. механизм действия), так и количественные характеристики ответа (уровне эффектов).

Цитогенетический эффект НДЭА выявлен в легких и печени мышеГ (МДД - 1,2 и 15 мг/кг) и крыс (МДЦ - 2,4 и 30 мг/кг) после частичное гепатоэктомии. Индукция микроядер не отличалась от контроля при действии НДЭА в почках, мочевом пузыре и сперматидах мышей, а также в клетках

состного мозга, преджелудка, желудка, 12-перстной, тонкой и толстой кишке срыс (колебания от 0,17 до 1,33%о). Цитогенетический эффект НДЭЛ в -епатоцитах мышей и крыс описывается линейными уравнениями. Увеличение »ффекта на единицу дозы приблизительно одинаково у крыс и мышей коэффициент регрессионного уравнения РкРыс=0,40 и ßM,.micn=0,42). Дитогенетический эффект НДЭЛ в легких мышей и крыс показан только на минимальных исследованных дозах 1,2 и 2,4 мг/кг, соответствующих 0,008 1Д50. Кривая эффекта имела характер "подъем-спад". Пневмоцнты оказались золее чувствительными к цитогеиетическому действию НДЭЛ по сравнению с шьвеолярными макрофагами легких крыс, в которых эффект повышался также, сак в пневмоцитах, но отличие от контроля не было статистически значимо. Чувствительность мышей и крыс к действию НДЭА приблизительно одинакова: ювпадает органная специфичность генотоксического действия; как в печени, гак и в легких мышей и крыс эффект НДЭЛ выявлен на одинаковой дозе зтносительно ЛД50; показан одинаковый характер дозовых кривых в обоих зрганах.

Цитогенетический эффект ЦФ выявлен микроядерным методом в толихроматофилышх эритроцитах костного мозга мышей в остром и юдостром экспериментах; методом анализа хромосомных аберраций в клетках состного мозга крыс; в эпителиальных клетках мочевого пузыря, легкого и толстой кишки мышей в подостром эксперименте; в гепатоцнтах крыс при цштельностн воздействия в течение 4 и 17 дней при проведении метафазного шализа. МДЦ в опытах па мышах соответствовала 10 мг/кг при анализе всех зрганов. ЦФ не индуцировал микроядра в клетках преджелудка, желудка и гонкой кишки мышей в подостром эксперименте в дозах 10-40 мг/кг.

Эффект бензамндя (промежуточного продукта при производстве срасителей и пестицидов) не выявлен при исследовании клеток костного мозга, феджелудка и желудка микроядерным методом в диапазоне доз от 12 до 300 ,1г/кг (0,02-0,5 ЛД50) в подостром эксперименте.

Йод при добавлении к питьевой воде в концентрациях от 62,5 до 1000 мкг/л в течение 12-месяцев не обладал мутагенной активностью в микроядерном тесте на полихроматофильных эритроцитах костного мозга крыс и не индуцировал появление мнкроядер в клетках мочевого пузыря крыс.

Хрнзотнл-асбест Баженовского месторождения в дозе 25 мг/кг не повышал частоту клеток с микроядрами в легком крыс через 4 суток после интратрахеального введения в опыте in vivo. Хризотил-асбест в концентрации 25 мкг/мл не повышал частоту плевральных мезотелиальных клеток крысы с микроядрами, но в 2 раза повышал частоту клеток с ядерными аномалиями (кариопикнозом и кариорексисом).

Продукты хлорирования цнклогекссиа. Впервые показана органная специфичность цитогенетического действия смеси продуктов хлорирования циклогексена в подостром опыте на мышах. Наиболее выраженный эффект отмечен в микроядерном тесте на эпителиальных клетках мочевого пузыря. Отмечено статистически значимое повышение частоты эпителиальных клеток толстой кишки мышей с микроядрами при действии двукратно разведенной смеси продуктов хлорирования циклогексена. Цитогенетический эффект смеси продуктов хлорирования циклогексена, определенный по частоте ПХЭ костного мозга мышей с микроядрами, статистически не значим.

Продукты хлорирования бутанола. Впервые показана органная специфичность цитогенетического действия смеси продуктов хлорирования бутанола в подостром опыте на крысах. Наиболее выраженный эффект наблюдался в микроядерном тесте на эпителиальных клетках толстой кишки. Отмечено статистически значимое повышение частоты эпителиальных клеток толстой кишки крыс с микроядрами при действии смеси, в которой концентрация бутанола составляла 5 мг/кг, и повышение частоты полихроматофильных эритроцитов костного мозга крыс с микроядрами при действии смеси продуктов хлорирования бутанола, в которой концентрация

бутанола составляла 20 мг/кг. В мочевом пузыре повышение частоты клеток с микроядрами статистически не значимо.

Изучение цитогснетичссгсого действия у-нзлучення в разных органах мышей. Цитогенетический эффект в гепатоцнтах линейных мышей и мышей гибридов, экспонированных в 1988 и 1989 гг. в 10-километровой зоне ЧАЭС, был приблизительно одинаковым; частота клеток с микроядрами в опыте в 3-4 раза превышала таковую в контроле. Оцененный в одном и том же эксперименте при одинаковой накопленной дозе 3 Гр эффект внешнего облучения Сб137 в гепатоцнтах мышей оказался в 2 раза выше, чем эффект инкорпорированного облучения Сэ137. Цитогенетический эффект у-излучения в 10 км зоне ЧЛЭС в накопленной дозе 0,7-0,95 Гр был в 2,5 раза выше по сравнению с контролем в гепатоцнтах, ПХЭ костного мозга и нормохромных эритроцитах крови мышей-гибридов; у линейных мышей цитогенетический эффект был более выражен в гепатоцнтах, чем в эритроцитах крови. Удлинение срока экспозиции без изменения поглощенной дозы не повлияло на уровень ответа в клетках костного мозга и периферической крови мышей гибридов и привело к небольшому повышению эффекта в гепатоцнтах. Дозы б и 7 Гр у-излучения вызывали повышение частоты клеток легких с микроядрами у мышей линий 101/Н и Ва1Ь/с в 40 раз и выше по сравнению с контролем через 22 дня после воздействия, тогда как в эпителиальных клетках толстой кишки мышей обеих линий эффект не был выявлен.

Оценка мутагенного действия химических соединений в клетках разных органов представлена в таблице 1. В клетках костного мозга мутагенный эффект был выявлен у ЦФ, а также БП в дозе, соответствующей 1/2 ЛД50. По результатам микроядерпого теста на ПХЭ костного мозга шесть веществ и две смеси можно было бы считать не мутагенными для млекопитающих. Следовательно, при гигиенической оценке различных факторов нельзя ограничиваться исследованием цитогенетического эффекта только в клетках костного мозга.

Почти все исследованные вещества или смеси индуцировали мутагенный эффект в эпителиальных клетках толстой кишки. Из других органов желудочно-кишечного тракта следует отметить преджелудок, эпителиальные клетки которого одними из первых встречаются с ксенобиотиками при их пероральном поступлении. В эпителиальных клетках слизистой преджелудка частота микроядер была повышена при действии БП, ДБП и ДБХП, тогда как ни одно из исследованных веществ не индуцировало эффект в эпителиальных клетках слизистой желудка. Эффект исследованных соединений не был установлен в эпителиальных клетках двенадцатиперстной и подвздошной кишки.

В легких мышей был выявлен эффект НДЭА и ЦФ при действии доз ниже 0,05 ЛДзо. В клетках мочевого пузыря был установлен цитогенетический эффект ЦФ и смеси продуктов хлорирования циклогексена. Этот орган оказался хорошим индикатором мутагенного действия продуктов хлорирования органических соединений.

Все исследованные вещества, кроме ДБП, индуцировали мутагенный эффект в гепатоцитах, что свидетельствует о высокой чувствительности этих клеток. Однако применение микроядерного теста на клетках печени ограничено необходимостью проведения частичной гепатоэктомии для стимуляции митозов.

Количественные характеристики мутагенного действия химических соединений. Для выявления органов-мишеней мутагенного действия достаточно качественной оценки органной специфичности (определение наличия или отсутствия эффекта). Проведение количественной оценки (уровня эффекта в зависимости от дозы) дает дополнительную информацию для решения следующих задач: 1) определения наиболее чувствительных органов-мишеней мутагенного и канцерогенного действия; 2) более корректного определения МДД и ДДМ)Т; 3) классификации мутагенов; 4) оценки видовой и половой специфичности; 5) оценки клеточной специфичности.

Выбор показателем количественном оценки opraimoii специфичности для определения наиболее чунстпигельпых оргапов-мншснен. Сравнение мутагенного эффекта фактороп в разных органах млекопитающих проведено с использованием следующих показателей: коэффициента регрессионного уравнения Р; МДД, определенной для каждого органа; удваивающей дозы (УД), определенной как УД = (2 х к„„|р.х МДД)/ х мдд, где х - частота клеток с микроядрами в %о в контроле и при действии МДЦ; МДЦ, выраженной в виде доли от ЛД50,; допустимой дозы мутагена (ДЦмут), составляющей 1/200 МДЦ в соответствии с подходом B.C. Журкова (1986) (табл. 4).

В ряде случаев вещества индуцировали эффект в двух-трех органах при одинаковой МДД, что не позволяет использовать его и связанные с ним ДЦмут и МДД в долях от ЛД50, для выявления наиболее чувствительного органа. Показатели р и УД учитывают нарастание эффекта вещества с дозой. Однако коэффициент Р невозможно определить в тех случаях, когда зависимость эффекта вещества от дозы имеет вид «подъем-спад» (например, для БП, ДБХГ1, ТБП, НДЭА, ЦФ). Поэтому оптимальным является показатель "удваивающая доза". Удваивающие дозы исследованных химических соединений, представлены в таблице 4. Сравнение значений этого показателя в горизонтальном ряду позволяет определить наиболее чувствительные органы-мишени цитогенетического действия вещества, а сравнение значений в вертикальном ряду для одного и того же вещества позволяет определить наиболее чувствительный вид и/или пол животных. При сравнении удваивающих доз химических соединений были определены наиболее чувствительные органы-мишени: печень для БП, ДБХП и ТБП; толстая кишка для ДМГ, ДБП; легкие для НДЭА; мочевой пузырь для ЦФ.

Удваивающие дозы, рассчитанные на основе экспериментальных данных оценки мутагенного действия веществ с учетом органной специфичности, также могут быть использованы для ранжирования веществ и составления

Таблица 4.

Количественная характеристика органной специфичности цитогенетического

действия химических соединений у мышей и крыс

Вещество Орган Показатели

Р УД, мг/мг МДЦ, мг/мг Доля от ДЦ5о ДДмут., мг/мг

БП Преджслудок, мыши 0.011 14,09 26 0,1 0,13

Печень, мыши - 11,73 26 0,1 0,13

дмг Толстая кишка, самцы мышей 0,47 0,16 0,72 0,02 0,0036

Толстая кишка, самки мышей 0,41 0,22 0,72 0,02 0,0036

Толстая кишкл, самцы крыс 0,08 14,23 16,6 0,1 0,083

Толстая кишка, самки крыс 0,02 1,73 3,32 0,02 0,0166

Печень, самцы мышей 0,96 0,63 0,72 0,02 0,0036

Печень, самки мышей 0,82 0,49 0,72 0,02 0,0036

ДБХП Прсджслудок, мыши - 34,27 51,4 0,2 0,26

Преджслудок, крысы 0,059 29,89 30 0,1 0,15

Толстая кншкп, мыши 0,027 48,65 51,4 0,2 0,26

Толстая кишка, крысы 0,063 12,76 30 0,1 0,15

Печень, мыши 1,18 5,14 0,02 0,0257

ДБП Преджслудок, мыши 0.004 231,51 338 0,5 1,69

Преджслудок, крысы 0,016 74,31 107 0,1 0,535

Толстая кишка, крысы 0,015 65,37 107 0,1 0,535

ТБП Печень, мыши 0,85 10 0,05

Толстая кншкя, крысы 0.017 87,86 100 0,1 0,5

НДЭА Печень, мыши 0,42 12 15 0,1 0,075

Печень, крысы 0,40 5,28 30 0,1 0,15

Легкие, мыши - 1,45 1,2 0,008 0,006

Легкие, крысы - 2,16 2,4 0,008 0,012

ЦФ Костный мозг, мыши 0,82 4,6 10 0,07 0,05

Легкие, мыши - 6,67 10 0,07 0,05

Толстая кшшел, мыши 0,07 9,23 10 0,07 0,05

Мочевой пузырь, мыши - 2,44 10 0,07 0,05

¡писков приоритетной оценки химических соединений и классификации мутагенов.

Выбор доз для тестировании вещества. Наши данные показывают, что три изучении вещества только в одной дозе можно вообще не выявить его (ффект или определить только один из органов-мишеней. В основном (табл. 5), у!ДЦ определены в диапазоне 0,02-0,1 ЛД50 (20 случаев из 25), минимально-действующая доза НДЭА в легких была ниже, а ДБХП и ДБП в преджелудке -зыше этого диапазона. По-видимому, для исследования органной ;пецифичности мутагенного действия следует тестировать вещества в дозах, юответствующих 0,1 и 0,02 ЛД5„ и 0,004 ЛД50, что хорошо согласуется с 'Методическими указаниями по изучению мутагенной активности химических геществ при обосновании их ПДК в поде" (М., 1986).

Типы зависимости мутагенного эффекта в разных органах млекопитающих от дозы. В целом организме проявление мутагенного |ффекта определяется многими молекулярными процессами, протекающими на фовне органелл, клеток, тканей, органов и в межклеточных жидкостей. Тоэтому дозовые зависимости мутагенного эффекта химических соединений .южно рассматривать только как совокупный векторный ответ на воздействие фактора. Направление вектора определяет конечный тип дозовой зависимости, фоявляющийся как уровень того или иного вида повреждения генетического материала при определенной дозе мутагена. В наших экспериментах остановлены следующие тппы зависимости мутагенного эффекта от дозы: шнейный; "подъем-спад"; "подъем-плато" (как вариант зависимости "подъем-:пад"); флуктуирующий (как вариант одной из первых трех зависимостей). В >сновном, зависимость эффекта от дозы имела прямолинейный характер, что юзволило определить коэффициенты регрессионного уравнения р. !ависимость "подъем-спад" была отмечена при действии галопропанов на ;летки печени мышей и во всех экспериментах на клетках легких.

Смеси продуктов хлорирования циклогексена и бутанола давали разнь типы зависимости эффекта от дозы в клетках толстой кишки или мочевог пузыря. Какие-либо дозовые закономерности при действии смесей и выявлены. В опыте на мышах зависимость эффекта продуктов хлорирован« циклогексена от дозы в толстой кишке была прямолинейной, тогда как мочевом пузыре имела флуктуирующий характер.

Зависимость локализации мутагенного эффекта от дол исследуемого вещества или концентрации смеси. Обобщение результате оценки органной специфичности мутагенного действия веществ позволил обосновать тезис о том, что локализация эффекта зависит от дозы исследуемог вещества или концентрации смеси (табл. 5.). В частности, при действии ДБХ] в дозах меньших или равных 0,1 ЛД50, эффект был выявлен только в печен мышей, тогда как при действии дозы, соответствующей 0,2 ЛД50, органами мишенями были также преджелудок и толстая кишка. НДЭА в дозе соответствующей 0,008 ЛД30, индуцировал эффект в легких, тогда как в дозе 0, ЛД50 - в печени мышей и крыс. ЦФ индуцировал эффект в легких в дозе 0,0 ЛД5о, тогда как при действии более высоких доз этот эффект не был выявлен Особенно выражена зависимость чувствительность органа-мишени от дозы ил1 концентрации при изучении смесей веществ. Таким образом, при действии тре; веществ (ДБХП, НДЭА и ЦФ) и двух исследованных смесей локализаци: эффекта и, соответственно, органы-мишени изменялись в зависимости о исследованной дозы. Из этого следует необходимость оценки органно] специфичности мутагенного эффекта при изучении не менее чем трех доз.

Зависимость органной специфичности мутагенного действш химических соединений от вида и пола животных, генотипа мышей Видовая специфичность мутагенного действия рассмотрена на примере пят! веществ: ДБХП, ДБП, ТБП, ДМГ и НДЭА. Анализ полученных данных (табл б) показал, что видовая чувствительность к мутагенному действию изученны; химических соединений определяется уровнем эффекта, но не его наличие?.

ли отсутствием. Ее определение более корректно с учетом органной пецифичности, чем при анализе эффекта только в одном из органов. При оличественной оценке видовой специфичности отмечены все три возможных арианта: мыши чувствительнее крыс к действию ДМГ, ДБХП и ТБП; крысы увствительнее мышей к действию ДБП; чувствительность мышей и крыс к ЩЭА приблизительно одинакова. Наиболее информативным и [увствительным для сравнения органной специфичности животных разного шда и пола был показатель УД.

Таблица 5.

Зависимость локализации эффекта химических соединений от дозы

Вещество Оргапм-мпшепн в зависимости от действующих доз, выраженных относительно ЛД50 в мг/кг

<0,1 ЛД<„ 0,1 ЛД50 >0,1 ЛД50

5П, мыши - Преджелудок, печень Преджелудок, печень

}МГ, мыши Толстая кишка, печень Толстая кишка, печень Толстая кишка, печень

ЩГ, крысы Толстая кишка Толстая кишка Толстая кишка

ДБХП, мыши Печень Печень Преджелудок, печень, толстая кишка

З.БХП, крысы - Преджелудок, толстая кишка Преджелудок, толстая кишка

'¡БП, мыши - - Преджелудок

5БП, крысы - Преджелудок, толстая кишка Преджелудок, толстая кишка

ГБП, мыши Печень Печень Печень

ГБП, крысы - Толстая кишка Толстая кишка

1ДЭА, крысы Легкие Печень нт

:1ДЭА, мыши Легкие Печень нт

ЦФ, мыши нт ПХЭ костного мозга, мочепои пузырь, легкие, толстая кишка ПХЭ костного мозга, мочевой пузырь, толстая кишка

Смеси

Минимальная исследованная концентрация Средняя исследованная концентрация Максимальная исследованная концентрация

Продукты хлорирования циклогексена Мочепои пузырь Толстая кишка Мочевой пузырь

Продукты хлорирования бутанола Толстая кишка ПХЭ костного мозга Толстая кишка

Примечание, "нт" - не тестировали вещество на этих дозах.

Таблица б

Сравнение чувствительности мышей и крыс к действию галопропанов

с учетом органной специфичности

Показатели Преджелудок Толстая кишка Печень

Мыши Крысы Мыши Крысы Мыши

ДБХП

коэффициент регрессионного уравнения Р 0,059 0,027 0,063

МДД, мг/кг 51,4 30 51,4 30 5,14

МДЦ относительно ЛД50 0,2 0,1 0,2 0,1 0,02

УД, мг/кг 34,27 29,89 87,98 12,76 1,18

ДБП

коэффициент регрессионного уравнения р 0,004 0,016 н.э. 0,015 н.э.

МДД, мг/кг 338 107 н.э. 107 н.э.

МДД относительно ЛД50 0,5 0,1 н.э. 0,1 н.э.

УД, мг/кг 231,51 74,31 н.э. 65,37 н.э.

ТБП

коэффициент регрессионного уравнения Р н.э. н.э. н.э. 0,017

МДД, мг/кг н.э. н.э. н.э. 100 10

МДД относительно ЛД50 н.э. н.э. н.э. =0,1 0,02

УД, мг/кг н.э. н.э. н.э. 87,86 0,85

Примечание: н.э.- эффект исследовали, но не выявили; -показатель не определен.

Половая чувствительность к одному и тому же мутагену такжо отличалась только по уровню эффекта. Самцы и самки мышей были одинаково чувствительны к действию ДМГ при сравнении цитогенетического эффекта I клетках печени и толстой кишки. Самки крыс были приблизительно в 1,5 разе чувствительнее самцов к цитогснетическому действию ДМГ на клетки толсто? кишки при сравнении коэффициентов р.

Значительно больше были выражены межлинейные различия Количественные отличия отмечены как по спонтанному, так и пс индуцированному уровню цитогепетических повреждений в разных органах

инейных животных. Спонтанная частота клеток с микроядрами у мышей иных линий отличалась в 2-12 раз в разных органах. Наиболее высокая астота клеток с микроядрами отмечена у мышей Dalb/c в клетках костного озга, преджелудка, желудка и толстой кишки по сравнению с мышами других иний. Приблизительно одинаковая частота клеток с микроядрами отмечена у ышей линии СВА и мышей-гибридов (CBAxC57Bl/6)F| в костном мозге, ечени, преджелудке и толстой кишке. Чувствительность мышей-гибридов HBAxC57Bl/6)Fl к цитогенетпческому действию ЦФ была приблизительно в ,3 или 2 раза выше, чем белых непнбредных мышей SHK при сравнении ¡)фекта в толстой кишке и костном мозге, соответственно, по удваивающим озам. Мыши линий Balb/c и 101/Н были приблизительно одинаково увствительны к действию у-излученпя в дозах 6 и 7 Гр при сравнении эффекта клетках легких.

Система оценки мутагенного действии химических соединений с четом органной специфичности па млекопитающих in vivo с спользованием мнкроядерпых тестон представлена на рнс.1. Ее элементами вляются исследуемые факторы; способы, дозы и длительность воздействия; бъекты и методы исследования; способы приготовления и анализа препаратов; оказатели выявления органов-мишеней. Результатом исследования утагенных свойств различных факторов в этой системе является разработка игиенических регламентов и/плн прогноз канцерогенных свойств и оргаиов-[ишеней канцерогенного действия.

Регламентирование химических веществ, обладающих мутагенными войствами, с учетом органной специфичности проводится в соответствии с одходом В.С.Журкова (1986) путем определения МДЦ для органов-мишеней и асчета ДЦмут. В схему регламентации веществ, обладающих мутагенными войствами, внесены изменения, связанные с необходимостью оценки органной пецифичности. На этапе количественной оценки рекомендуется определять

Исследуемый фактор (физический, химический, биологический)

+

Способ воздействия: любой

_Дозы: 0,1 ЛДч>. 0.02 и 0.004 _

Длительность: подострый эксперимент (2-4недели), может быть совмещен с токсикологическим

л

Органы, исследуемые на 1 этапе

Костный мозг Легкие Пред- желудок Толстая кишка Мочевой I пузырь I

Модельный объект: лабораторные мыши или крысы (5- 6 животных в группе)

>шы, исследуемые дшшлшпельно

Желудок Тонкая кишка Эритроциты крови Печень Почки, др. органы

Метод оценки мутагенного эффекта: мпкроядернын тест

♦ *

Приготовление препаратов для оценки частоты клеток с мпкроядрамн

Выявление оргапов-мншенен цптогснетнческого действия при сравнении МДД, удваивающих доз, регрессионного показателя р

Прогноз канцерогенных свойств вещестоа, предполагаемых органов-мишелен н возможных пороговых доз канцерогенного действия Регламентирование вещества с учетом ДЦмут, определенной па основе МДД в оргаПах-мншснях

Рнс. 1. Система оценки мутагенного эффекта химических соединений с учетом органной специфичности в опытах на млекопитающих

»рганы-мишени мутагенного дсПствия вещества с помощью основных ■шкроядерных тестов на клетках костного мозга, легких, преджелудка, толстой :ишки, мочевого пузыря мышей и/илн крыс и, возможно, дополнительных - на :летках желудка, тонкой кишки, печени, почек, эритроцитов крови мышей i/или крыс по МДЦ, УД и ß. На заключительном этапе определяется ДДмут на »сновании МДД, определенной для органов-мишеней,: ДДмут= МДЦмут/200. 1ри ДДмут>ПДК - регламент не меняется; при ДДмут<ПДК - регламент 'станавливается на уровне ДДмут. ДДмут исследованных веществ составили (ля БП - 0,13 мг/кг; ДМГ - 0,004 мг/кг; ДБХП - 0,005 мг/кг; ДБП - 0,535 мг/кг; ГБП - 0,05 мг/кг; НДЭА - 0,006 мг/кг; ЦФ - 0,05 мг/кг: (табл. 4).

Сравнительная оценка органной специфичности мутагенного п санцерогенпого действия н прогноз канцерогенных свойств химических :осдинений. В представленной системе в опытах на млекопитающих in vivo федусмотрена оценка органной специфичности. Микроядерный тест может )ыть использован для оценки мутагенного эффекта в полном наборе органов :аждого животного, подвергнутого воздействию вещества в подостром опыте. 1ричем, если не оценивать органную специфичность мутагенного действия, то щенка связи мутагенных и канцерогенных эффектов будет опосредованной: мутагенный эффект вещества в костном мозге сравнивается с канцерогенным эффектом, установленном при оценке нескольких органов. Разработанная :истема позволяет проводить прямые сравнения: мутагенный эффект в )пределенном органе можно сравнить с канцерогенным эффектом в том же >ргане или: мутагенный эффект сравнить с канцерогенным эффектом в одной и ■ом же системе органов.

Использование оценки мутагенного действия в клетках нескольких )рганов основных систем организма, а не только полихроматофильных |ритроцитов костного мозга, позволяет более корректно прогнозировать :анцерогенность вещества для человека. Известно, что среди онкологических аболеваний у мужчин первое место занимает рак легкого, затем желудка,

толстой и прямой кишок, полости рта и глотки, предстательной желе: пищевода, печени, мочевого пузыря и только затем новообразоваг лимфатической ткани и лейкозы.

Таблицг

Качественная оценка органной специфичности канцерогенного и цитогенетического эффекта химических соединений

Изученные вещества Эффект костный мозг легкие печень преджелудок желудок 12-перстная кишка подвздошная кишка ! толстая [ кишка мочевой

БП Канцерогенный + + - + ' - - - -

Цитогенетич. +/- нт + + нт нт Н'

ДМГ Канцерогенный - - + .. -

Цитогенет. - нт + ' '■■г'- Н'

ДБХП Канцерогенный - - - + - -

Цитогенет. - нт + + + Н'

ДБП Канцерогенный нт нт нт нт нт нт нт нт Н'

Цитогенет. - нт - + - - - + н:

ТБП Канцерогенный нт нт нт нт нт нт нт нт н:

Цитогенет. - нт + - - - - + Н"

НДЭА Канцерогенный - + +

Цитогенет. - + + - -

ЦФ Канцерогенный + + + - - - V'. - - +

Цитогенет. + + +* - " нт -.Г

Примечание. *данные В.В. Юрченко (1983). "+" - положительный эффект; отрицательный эффект "нт" -не тестировали.

Оценка мутагенной активности известных канцерогенов с помощ] системы микроядерных тестов, как пример подобных исследоваш представлена в таблице 7. Все канцерогены проявили мутагенную активное при исследовании в системе микроядерных тестов; были выявлены все орган мишени канцерогенного действия, если учитывать только изученные орган Поскольку в настоящее время невозможно прямое тестирование всех вещее на канцерогенность, представленная краткосрочная система тестирован веществ может быть определенной альтернативой длительному тестирован*

г

веществ на канцерогенность. Основными ее преимуществами перед другими краткосрочными тестами являются: проведение опытов на млекопитающих in vivo; оценка эффекта практически в любом из органов или любом наборе органов; использование недорогих методик для проведения микроядерных гестов; наиболее простой из цитогенетических тестов способ анализа препаратов путем оценки частоты микроядер; возможность на этих же препаратах (при необходимости) оценивать частоту других клеточных и ядерных повреждений для выяснения их роли в процессах канцерогенеза; возможность на этих же препаратах определять мнтотический индекс для оценки влияния вещества на пролиферацию тканей; возможность количественной оценки эффекта и определения МДЦ и ДЦмут, которые могут быть ориентировочными дозами для определения безопасных уровней канцерогенного действия веществ.

Алгоритм тестирования веществ длп оценки их мутагенной активности с учетом органной специфичности. Система оценки мутагенного эффекта химических соединений с учетом органной специфичности (рис. 1) является открытой и предоставляет возможность выбора тех или иных элементов при тестировании. Она в большей степени предназначена для исследователей, которых интересуют процессы мутагенеза на клеточном, тканевом и органном уровнях, связь процессов мутагенеза и канцерогенеза. Для практических целей на основе системы разработан алгоритм тестирования веществ, представляющий собой последовательность действий для оценки мутагенной активности веществ с учетом органной специфичности и регламентирования веществ на этой основе. В алгоритм включены оптимальные элементы системы, необходимые для достижения цели, и он предназначен для использования в учреждениях, занимающихся токсикологической оценкой различных факторов и, в том числе, тестированием их мутагенных свойств. Подробное описание всех этапов тестирования

Алгоритм тестирования веществ для оценки мутагенного эффект с уметом органной специфичности

* Провести эксперимент «я мышах или крысах при ежедневном воздейств!' вещества в течение 2-4 недель в трех дозах, соответствующих 0,1,0,02 и 0,004 ЛД«

* После окончания эксперимента провести цервикальную дислокацию, вскрьп брюшную полость, выделить л фиксировать в 10% центральном формалине

» мочевой пузырь;

• часть толстой кишки имеете с примой, начинал от ануса и выше длиной 5 см;

• нреджелудок;

• вскрыть грудную клетку, выделить и зафиксировать легкие;

• выделить бедренные кости н приготовить препараты клеток костного моз, обычным способом.

* Провести анализ препаратов костного мозга (в это время остальные opram фиксируются в формалине).

* Последовательно готовить еуснстионпые препараты клеток легких, толсто кишки, преджелудка, мочевого пузыря путем щелочной диссоциации 50% КО) (не менее чем через 2 недели после начала фиксации органов).

* Последовательно проводить микроскопический апалш клеток каждого орган для определения частоты клеток с микроядрамя в контрольных и опытны группах. На зашифрованных препаратах при иммерсионном увеличит анализировать не менее 1000 клеток каждого типа.

* Провести статистическую оценку результатов по каждому органу путе? сравнения долен клеток с мпкролдрамп в опытных и контрольных группах помощью иепараметричсского критерия Маииа-Унтин; оценить зависимосп эффекта от дозы с по,мощью определения коэффициента регрессионной уравнения р.

* Определить оргапы-мншенн цитогеистпческого действия вещества npi сравнении для каждого органа наличия эффекта, минимально-действующих до (МДЦ), удваивающих доз, коэффициентов р.

* Регламентирование проводить в соответствии с подходом В.С.Журкова (1986 путем определения МДЦ для органов-мишеней и расчета "допустимой" дозь мутагена (ДДмут) по формуле ДДмут=МДДмут/200. Решение принимается путе* сопоставления ДДмут и 11ДК дли веществ. При ДДмут>ПДК - регламент ш меняется; при ДДмут<ПДК - регламент устанавливается на уровне ДДмут.

1риведено в Методических рекомендациях "Оценка мутагенной активности {»акторов окружающей среды в клетках разных органов млекопитающих никроядерным методом" (М., 2001).

Характеристика системы. Система оценки мутагенного действия шмических соединений с учетом органной специфичности является ■ многоэтапной, поскольку проведение оценки предусматривает определенную последовательность этапов, описанную выше;

• комплексной, так как позволяет использовать суспензионные препараты клеток разных органов одновременно для оценки генотоксического и цитотоксического действия;

• универсальной, поскольку позволяет оценивать мутагенные свойства практически любых факторов; любых органов, клеток и тканей; возможность оценки мутагенного действия факторов на млекопитающих любого вида;

- дополняющей, поскольку система может быть встроена в качестве самостоятельного раздела в токсиколого-гигненическую оценку опасности химических веществ; система может быть также встроена в алгоритм оценки канцерогенных свойств различных факторов как первый этап выявления инициаторов канцерогенеза.

- открытой, поскольку можно изменять отдельные элементы системы (количество применяемых доз вещества; длительность экспериментов; количество и вид исследуемых органов; животных; методики приготовления препаратов, применяемые статистические критерии оценки);

- саморазвивающейся, поскольку получение результатов с помощью этой системы приводит к необходимости проведения новых исследований; увеличения спектра исследуемых органов и клеток; совершенствования и развития как отдельных элементов системы, так и системы в целом.

Заключение

Разработка системы оценки мутагенного эффекта химически?

загрязнений окружающей среды с учетом органной специфичности направлен;

на решение нескольких важных задач:

- повышение надежности регламентации веществ, обладающих мутагенным! свойствами (вещества могут проявлять мутагенный эффект не в клетка? костного мозга, а в клетках других органов);

- более точного определения МДД мутагенов, которые в органах-мишеня> могут быть в 5-125 раз ниже, чем в костном мозге;

- оценку комплексного, сочетанного и комбинированного действия различны?) факторов путем использования в качестве биомаркера вредного действия основного показателя системы - частоты и типа микроядер;

- использование системы для изучения модифицирующего действия различных факторов на эффект мутагенов и канцерогенов; для оценки реальной нагрузки;

- исследование механизмов действия факторов на уровне клеток, тканей, органов и целого организма;

- исследование взаимосвязи мутагенного и канцерогенного эффекта различных факторов при изучении этих эффектов в одних и тех же клетках, тканях и органах и прогноз канцерогенных свойств исследуемых препаратов в системе краткосрочных тестов;

- определение и сопоставление органов-мишеней мутагенного и канцерогенного действия химических соединений; обеспечение более корректной экстраполяции данных по мутагенному эффекту у млекопитающих на людей с учетом органной специфичности.

Отдельно хочется отметить еще один важный аспект использования

системы в качестве методической основы для дальнейшего развития

генотоксикологии. В настоящее время большинство закономерностей мутагенного действия различных факторов у млекопитающих ¡n vivo получено при изучении клеток костного мозга (кроветворных), тогда как эффект в эпителиальных и других клетках разных органов мало изучен. Недостаточно исследованы общие закономерности развития мутагенных эффектов в отдельных органах, их системах и целом организме с учетом токсикокинетики веществ, пролиферации отдельных клеток и темпа обновления тканей и органов (стабильных, лабильных и быстро обновляющихся), процессов этапного становления генетического повреждения в клетках разных органов in vivo, в отличии, например, от классической токсикологии. Представленная система позволяет изучать эти закономерности на клеточном, тканевом, органном уровнях и в организме в целом. Использование суспензионных методов после фиксации органов формалином позволяют анализировать эффект одновременно во многих органах и клетках у одного и того же животного к моменту цервикальной дислокации. Представленная система позволяет изучать временные параметры развития мутагенного эффекта параллельно в разных органах. Метод фиксации органов формалином, подобно тому, как это делают патоморфологи, но с использованием дальнейшей диссоциации тканей, позволяет изучать морфологию единичных клеток, проводить морфо- и кариометрию. Этот подход позволяет дифференцировать одно- и двуядерные клетки и оценивать одновременно не только генотоксическое, но и цитотоксическос действие фактора, подсчитывать частоту повреждений отдельно в одно- и двуядерных клетках.

Система позволяет заполнить пробел между достаточно хорошо изученными событиями повреждения генетического материала на молекулярном уровне и реализованными канцерогенными эффектами.

Рассмотренные в диссертации вопросы также направлены на решение практических задач гигиены. Они позволяют приблизиться к разработке единой системы выявления генотоксических соединений - мутагенов и канцерогенов.

Следует подчеркнуть, что окончательное решение о канцерогенности може-быть принято после проведения длительных экспериментов на животных Однако первый этап - выявление генотоксических свойств химически? соединений - может быть единым для мутагенов и канцерогенов, и он может быть представлен разработанной системой оценки мутагенного эффекте химических соединений с учетом органной специфичности в опытах ш млекопитающих. В дальнейшем возможно дополнение предлагаемой системь: методами оценки пролиферативной и трансформирующей активности химических соединений.

Выводы

1. Обоснована необходимость оценки мутагенного действия химических соединений с учетом органной специфичности для гигиенического регламентирования и прогноза канцерогенных свойств и органов-мишеней канцерогенного действия. На основе сравнительного анализа имеющихся подходов для оценки органной специфичности выбраны микроядерные тесты как наиболее информативные и адекватные задачам гигиены окружающей среды.

2. Впервые научно обоснована и разработана система оценки мутагенного эффекта химических загрязнений окружающей среды с учетом органной специфичности, включающая

- использование микроядерных тестов на клетках нескольких органов млекопитающих in vivo;

- поэтапное тестирование веществ с обоснованием каждого этапа;

- определение органов-мишеней мутагенного действия;

- гигиеническое регламентирование вещества с учетом ДЦмут, рассчитанной на основании минимально-действующей дозы вещества в наиболее чувствительном органе-мишени;

прогноз канцерогенных свойств вещества и предполагаемых органов-мишеней.

. Для практических лабораторий, занимающихся токсикологической оценкой различных факторов, разработан алгоритм оценки их мутагенной активности с учетом органной специфичности.

. Разработаны суспензионные методы приготовления препаратов клеток разных органов (легких, преджелудка, толстой кишки, печени и других) для оценки частоты микроядер, включающие ускоренные методы приготовления препаратов с использованием 5% раствора сахарозы; методы приготовления препаратов разных органов мышей и крыс после фиксации формалином и щелочной диссоциации клеток.

¡. Спонтанный уровень частоты клеток разных органов с микроядрами, в основном не превышал 2%о, для клеток легких -3 %о; частота гепатоцитов с микроядрами варьировала в пределах 3- 7%о.

3. Определены качественные и количественные параметры органной специфичности мутагенного действия БП, ДМГ, ЦФ, НДЭА, ДБХП, ДБП и ТБП, бензамида, хризотил-асбеста, йодированной питьевой воды, смесей продуктов хлорирования циклогексена и бутанола, а также у-излучения, определены органы-мишепи этих факторов.

7. Выделены наиболее информативные показатели количественной оценки органной специфичности и определения органов-мишеней мутагенного действия: МДДмут, удваивающие дозы и коэффициенты р регрессионных уравнений "доза-эффект".

8. С помощью разработанной системы выявлен мутагенный эффект исследованных канцерогенов и все органы-мишени канцерогенного действия. Это позволило рекомендовать использование системы оценки мутагенного действия химических соединений с учетом органной специфичности для прогноза канцерогенного действия химических веществ и определения предполагаемых органов-мишеней канцерогенного действия.

9. Определены зависимости органной специфичности мутагенного действи химических соединений от вида, пола животных и линии мышей:

- видовая, половая и линейная чувствительность к мутагенному действш изученных химических соединений отличалась по уровню эффекта, но не п его наличию или отсутствию;

- при количественной оценке видовой специфичности отмечены все тр возможных варианта: мыши чувствительнее крыс к действию ДМГ, ДБХП ТБП; крысы чувствительнее мышей к действию ДБП; чувствительност мышей и крыс к НДЭА приблизительно одинакова;

- половая чувствительность к одному и тому же мутагену может отличаться ; животных разного вида: у самцов и самок мышей чувствительность клето печени и толстой кишки к действию ДМГ была одинакова, тогда как самю крыс были более чувствительны по сравнению с самцами;

- у мышей разных линий спонтанная частота клеток с микроядрами може отличаться от 2 до 12 раз в разных органах;

- наиболее информативным и чувствительным для сравнения видовой половой и линейной специфичности с учетом эффекта в разных органах бьи показатель "удваивающая доза мутагена".

СПИСОК

работ, опубликованных по теме диссертации

1. Оценка органной специфичности мутагенного эффекта циклофосфамида ) мышей микроядерным методом. //Бюлл. экспер. биол. мед.-2001.-№4.-С.445 447.

2. Lung and liver are the target organs of mutagenic effects of diethylnitrosamine (DENA) in mice and rats. //Pharmacology and Toxicology.- 1999.- V.85 Suppl. 1.- P.20.

Оценка мутагенной активности факторов окружающей среды с учетом органной специфичности. //Материалы IX Всероссийского съезда гигиенистов и санитарных врачей. - М,- 2001- Т. I.-C.638-641. Сравнение органной специфичности цитогенетического и канцерогенного эффектов химических веществ. //II съезд Вавнловского общества генетиков и селекционеров. (1-5 февраля 2000 г.). Тезисы докладов. Том 2,- С.-Пб.-2000,- С.210.

Микроядерный тест на клетках легкого крыс и мышей in vivo: оценка генотоксического эффекта химических соединений. //1-ый съезд токсикологов России. Тезисы докладов,- М.-1998.- С. 321. Гепатоциты экспериментальных животных как тест-объект для оценки мутагенной активности химических соединений. //Тезисы докладов II съезда медицинских генетиков 4-6 декабря 1990 г.- Алма-Ата.- 1990.- С.427-428. Методологические аспекты создания единой системы оценки генотоксических свойств химических соединений на этапе скрининга канцерогенов и мутагенов. //Сб. Проблемы исследований и преодоления экологической опасности в промышленном регионе. - Кемерово,-1990.-С.95. Induction of micronuclei in mammalian cells in vivo by carcinogens: the organospecificity. //Mutat. Res. - 1992.-V.271, N2. - P. 182-183 (co-authors Zhurkov V.S., Viskubenko I.F., Salamatova O.G., Feldt E.G., Sherenesheva N.I.). Selective induction of micronuclei in the rat/mouse colon and liver by 1,2-dimethylhydrazine: a seven-tissue comparative study. //Mutat. Res.-1996.-V.368.-P.l 15-120 (co-authors: Zhurkov V.S., Salamatova O.G., Vyskubenko I.F., Feldt E.G., Sherenesheva N.I.). IComparatively assessment of genetictoxicity of mutagens/carcinogens by micronucleus test in mouse/tats several organs. //Mutat. Res.- 1997-V.379.-Suppl.l,-P. S81 (co-authors: Zhurkov V.S., Salamatova (Ashby)O.). l.Genotoxicity and carcinogenicity of 1,2-dibromopropane and 1,1,3-tribromopropane in comparison to l,2-dibromo-3-chloropropane. //Cell Biology

and Toxicology.-1994.-V.10.-P. 265-279 (co-authors: Belitsky G.A., Lythc T.A., Khitrovo I.A., Safaev R.D., Zhurkov V.S. et a!.). 12.Применение мякроядерных тестов для выявления мутагенов и канцерогено

//Вестник РАМН.-1997.-№7.-С. 14-18 (соавт.: Журков B.C.). 13.Оценка мутагенной активности циклогексена и продуктов его хлорировани. //Бюлл. зкспер. биол. мед.-2000.-Т.29, №6.-С.683-685 (соавт.: Жолдако! З.И., Полякова Е.Е., Лукманова Н.Э., Ахальцева Л.В., Журков B.C.). 14.Гигиеническая оценка мутагенного потенциала промышленных отходо; //Гигиена и санитария.-1998,- № 4.- С. 30-32 (соавт.: Журков B.C., Русакс Н.В., Тонкопий Н.И., Ахальцева Л.В., Неяскина Е.В., Пиртахия Н.В. и др.). 15.Органная специфичность цитогенетического действия 1,2-диметш гидразина.//Гигиена и санитария.-1993.-N9.-C.42-44 (соавт.: Журков В.С Саламатова О.Г., Выскубснко И.Ф., Фельдт Е.Г., Шеренешева Н.И.).

16.Видовая и органная специфичность цитогенетического действи канцерогена 1,2-дибром-З-хлорпропана при пероральном введени млекопитающим. //Гигиена и санитария.- 1993.-N12.-C.41-43 (соавт.: Журко B.C., Саламатова О.Г., Выскубенко И.Ф., Фельдт Е.Г).

17.Исследование генотоксической активности нитрозодиэтиламин микроядерным методом в разных органах крыс. //Гигиена и санитария, 1992.-С.72-73 (соавт.: Саламатова О.Г.).

18.Сравнение чувствительности к мутагену соматических клеток разных ткане; млекопитающих. //Гигиена и санитария.-1986.-№3.-26-28 (соавт.: Журко; B.C., Выскубенко И.Ф.).

19.Методические указания по оценке мутагенных свойств фармакологически, веществ. //Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучении новых фармакологических веществ. - М., Минздрав РФ, ЗАО"ИИ/ "Ремедиум" - 2000- С.47-60. (соавт.: Дурнев А.Д., Ревазова Ю.А., Верстаков; О.Л.,Гуськова Т.А., Журков В.С.,Ингель Ф.И., Танирбергнов Т.Б., Хрипа' Л.В., Цуцман Т.Е., Юрченко В.В.)

.Методические указания по оценке канцерогенности фармакологических средств и вспомогательных веществ в краткосрочных тестах. //Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М.: Минздрав.- 2000 - С.47-60. (соавт.: Белицкий Г.А., Ревазова Ю.А., Абилев С.К. и др.).

.Генетические эффекты хлорированных дибенз-(п)-диоксинов у человека. //Токсикологический вестник. - 1998, № 5.- С. 2-6 (соавт.: Журков B.C., Юрченко В.В.).

.2-Метилпропаналь. //Токсикологический вестник.-2001-Ы6.-С.40. (соавт.: Шипулина З.В., Типикина Л.А., Карташова A.B.).

.Частота микроядер в соматических клетках мышевидных грызунов, пребывающих в 30-километровой зоне Чернобыльской АЭС. //Радиационная биология. Радиоэкология,-1994.-Т.34 (соавт.: Чехович A.B., Бахитова Л.М., Померанцева М.Д.).

[.Оценка мутагенных свойств фармакологических средств. //Ведомости Фармакологического Комитета,-1998 - №4.-С.32-39 (Соавт.:Дурнев А.Д., Ревазова Ю.А., Верстакова О.Л., Гуськова Т.А., Журков B.C., Ингель Ф.И., Танирбергенов Т.Б., Хрипач Л.В., Цуцман Т.Е., Юрченко В.В.). i.Прогноз канцерогенности фармакологических средств и вспомогательных веществ в краткосрочных тестах (Методические рекомендации). //Ведомости Фармакологического Комитета.-1999- №1.-С.18-31 (соавт.: Белицкий Г.А., Ревазова Ю.А., Абилев С.К. и др.). ».Применение микроядерного теста на клетках легких для оценки генотоксического действия химических веществ и радиации. //Пульмонология. Тезисы докладов 11 Национального конгресса по болезням органов дыхания. М.- 2001,- С. 320 (соавт.: Журков B.C., Кияткина М.А., Померанцева М.Д., Рамайя Л.К.). '.Микроядерный метод на лабораторных животных в системе оценки генотоксических свойств химических веществ. //Ланималогия.-1993.-Н 1-

С.55-56 (соавт.: Журков B.C., Саламатова О.Г., Выскубенко И.Ф., Фелв Н.Г.).

28.Using of micronucleus test in evaluation of specific chemical carcinogens actic //Simposium of the problems of environment and health. Studies in Europe countries and in USSR. 11-14 march 1990.-Paris-France.- 1990.-T. 1.-C.73-J (co-author: Zhurkov V.S.).

29.Estimation of mutagenicity of the chlorination products of cyclogexer //Environmental Genotoxicology Field and Human Studies in the Nordic/Bal Region. (Satellite Meeting to the 29 th Annual Meeting of Nord EMS. 30 Jun 3July 1999; Vilnius, Lithuania). Abstracts.-Viinius University.-1999.-P.54-55 (c authors Zholdakova Z.I, Poliakova E.E., Lukmanova N.E., Akhaltseva L.A Zhurkov V.S.).

30.Comparative study of 12 chemicals in liver and bone marrow micronucleus assa on mice and rats. //In: Abstract book 28th Annual Meeting of Europe: Environmental Mutagen Society. Salzburg.- 1998.-P 138.-P.276. (co-authoi Jurchenko V.V., Zhurkov V.S., Salamatova O.G.).

31.Induction of micronuclei in mammalian cells in vivo by carcinogens: tl organospecificity. Ill Iм Annual Meeting of EEMS on Environment carcinogenesis.- Praque.-1991.-P.62 (co-authors Zhurkov V.S., Viskubenko I.F Salamatova O.G., Feldt E.G., Sherenesheva N.I.).

32.Цитогенетические исследования на млекопитающих как подход к изучени; органоспецифичности канцерогенов. //Сб. Методология фундаментальны исследований в гигиене окружающей среды. - М.- 1989.- С.227-235 (соавт Выскубенко И.Ф., Фельдт Е.Г., Шеренешева Н.И.).

33.Оценка радиационного поражения животных, экспонированных в зон Чернобыльской АЭС, микроядерным методом на гепатоцитах. //С( Генетические последствия загрязнения окружающей среды мутагенным факторами,-Самарканд- 1990.-С. 176-177. (соавт.: Чехович А.В.).

4.0ценка генотоксичности химических соединений микроядерным методом на гепатоцитах микроядерным методом. //Сб. Объем и методы генотоксической оценки и побочных эффектов биологически активных веществ,- Ленинград. -1989.- С.90. (соавт. Беляева H.H.).

5.Частота хромосомных аберраций в соматических клетках тканей с разной пролиферативной активностью в зависимости от продолжительности действия циклофосфамида. //Сб. Тест-системы для оценки мутагенного потенциала загрязнителей окружающей среды. - Иркутск.-1984.- С.14 (соавт. Выскубенко И.Ф.).

б.Схема поэтапной оценки мутагенной активности факторов окружающей среды при их гигиеническом регламентировании. //Сб. Ускоренное прогнозирование отдаленных проявлений реакции живых систем на химические воздействия. - Рязань. - 1983. - С.32-34 (соавт. Журков B.C.).

^.Опасность хлорорганических соединений, образующихся при хлорировании циклогексена. //Четвертый международный конгресс «Вода: экология и технология» (Москва, 30 мая-2 нюня 2000 г.). Тезисы докладов. - М.-2000.-С.769 (соавт.: Полякова Е.Е., Жолдакова З.И., Лебедев З.И., Журков B.C.).

8.Органная специфичность при оценке мутагенной активности 13 веществ в микроядерном тесте на клетках костного мозга и печени мышей и крыс. II Г'й съезд токсикологов России. Тезисы докладов. - М.-1998.- С. 329 (Соавт.: Юрченко В.В., Журков B.C.).

19.Анализ органоспецифичиости цитогенетических эффектов галопропанов в экспериментах на мышах. //Проблемы токсикологии и прикладной экологии (Тезисы докладов международного симпозиума. Москва-Пермь, 16-26 июля 1991 г.). - Ленинград, ВНИИГ,- 1991.- С.114-115 (соавт.: Журков B.C., Саламатова О.Г.).

Ю.Оценка органной специфичности нитрозодиэтиламина микроядерным методом на мышах и крысах. //Тезисы докладов международной конференции "Загрязнение окружающей среды. Проблемы токсикологии и

эпидемиологии."- Пермь.- 1993,- С.237-238 (соавт.: Журков B.C., Саламато О.Г.).

41.Органная и видовая специфичность цитогенетического действ1 бромпропанов. //Тезисы докладов международной конференщ "Зафязнение окружающей среды. Проблемы токсикологии и эпидемиолоп Пермь.-1993.- С.237-238 (соавт.: Журков B.C., Саламатова О.Г.).

42.Микроядерный тест в оценке мутагенов у млекопитающих и человек //Второй (четвертый) Российский съезд медицинских генетиков (Курск, Г 19 мая 2000 г.). Тезисы докладов. Часть 1.-Курск. - 2000.-С. 83 (соавт Юрченко В.В.).

43.Учет микроядер в клетках разных органов млекопитающих как быстрый те« выявления канцерогенов. //Первый (третий) Российский съезд медицинскг генетиков (Москва, 14-16 декабря 1994 г.). Тезисы докладов. Часть I.-M 1994- С. 101.(соавт.: Журков B.C., Ахальцева Л.В.).

44.Индукция микроядер в соматических клетках мышей, экспонированных районе Чернобыльской АЭС. //Тезисы докладов I Всесоюзног радиобиологического съезда. - Пущино.-1989.- Т.З.- С. 678 (соавт.: Чехови A.B.).

45.Тестирование химических веществ на мутагенность микроядерным тестом клетках костного мозга и других органов. //Российская конференци "Мутагены и канцерогены окружающей среды. Проблемы антимутагенеза (Казань, 30-31 мая 1996 г.). Тезисы докладов. - Казань, КГМУ.-1996.-С.З (соавт.: Журков B.C., Саламатова О.Г., Ахальцева Л.В.).

Участок множительной техники РОН11 им. H.H. Блохина РАМН

Заказ 360 Тираж 100 экз.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Одной из важных задач гигиены окружающей среды является оценка факторов окружающей среды, в том числе их мутагенных и канцерогенных свойств [90, 80, 12, 29, 30, 50, 93, 82]. Общее число ежегодно синтезируемых химических соединений превышает 5 млн. При выборочных испытаниях в разных тест-системах у 5-7% (250-350 тыс.) этих соединений выявлены мутагенные свойства [51]. Примерно такое же количество веществ (5-10%), с которыми контактирует человек, может обладать канцерогенной активностью [12]. Химические канцерогены являются причиной развития онкологических заболеваний приблизительно в 80% случаев [111]. По современным представлениям канцерогенный эффект развивается последовательно, проходя этапы инициации, промоции и прогрессии. В основе развития опухолей как на стадии инициации, так и, по-видимому, промоции, лежат генотоксические эффекты, и установлена высокая (до 90%)) корреляция мутагенных и канцерогенных свойств химических соединений [127, 140\ Можно считать доказанным, что возникновению и развитию злокачественного роста предшествует накопление мутаций в определенных генах в тех тканях, которые вовлекаются в онкологический процесс [21]. Роль мутагенов не ограничивается индукцией опухолей, она более многозначна. Мутационные повреждения зародышевых клеток приводят к спонтанным абортам и врожденным порокам развития. Мутации в половых клетках вызывают повышение частоты наследственных болезней в популяции. Мутационные повреждения соматических клеток обуславливают преждевременное старение организма. Генетические дефекты являются причиной значительной доли заболеваний у человека, хотя пока не ясно, в какой мере присутствующие в окружающей среде химические вещества обусловливают генетические болезни [88].

В настоящее время большинство исследований мутагенных свойств химических соединений проводится на прокариотах с помощью теста Эймса. Значительно меньше исследований выполнено на млекопитающих in vivo. В этих опытах данные преимущественно получены на клетках костного мозга мышей и крыс. Система выявления и оценки мутагенных свойств химических веществ при их гигиеническом регламентировании предусматривает исследование мутагенного действия веществ на клетках костного мозга млекопитающих in vivo и в тесте доминантных летальных мутаций [29]. В клетках других органов мутагенный эффект различных факторов мало изучен. Однако по нашим данным и результатам других исследований [268, 121, 221] ряд мутагенов не индуцирует цитогенетические повреждения клеток костного мозга, но вызывает эффект в других органах. Общепринятый подход к оценке цитогенетического действия химических соединений на млекопитающих in vivo приводит к тому, что вещества, не индуцирующие эффект в клетках костного мозга, могут считаться не мутагенными, несмотря на то, что их эффект в других органах не исследован. Например, известные гепатоканцерогены нитрозодиметиламин и нитрозодиэтиламин не повышали уровень цитогенетических повреждений в клетках костного мозга, в связи с чем считали, что они не мутагенны для млекопитающих, до тех пор пока положительный эффект не был выявлен в клетках печени [132, 391]. Кроме того, уровень мутагенного эффекта отличается в клетках разных органов. Но нашим данным минимально-действующие дозы мутагена могут отличаться в различных тканях и органах в 5-125 раз. В связи с этим, изучение органной специфичности мутагенов имеет большое значение для более корректного их регламентирования.

Другим важным аспектом проблемы оценки органной специфичности мутагенов является использование тестов на мутагенность для прогноза канцерогенных свойств. В настоящее время оценка мутагенных и канцерогенных свойств химических соединений с целью их гигиенического регламентирования проводится независимо. Для тестирования канцерогенов предусмотрено проведение двухгодичных экспериментов на лабораторных животных двух видов обоего пола с гистологическим выявлением опухолей во всех основных органах животного [60]. Однако объем, длительность и стоимость долгосрочных экспериментов на млекопитающих не позволяет проводить рутинное тестирование всех веществ на канцерогенность. Поэтому для решения вопроса о необходимости тестирования вещества на канцерогенность желательно проводить предварительную оценку его мутагенных свойств в системе краткосрочных тестов [41, 6, 221]. При изучении канцерогенов в краткосрочных тестах важно оценивать их органную специфичность, так как это одно из основных свойств канцерогенов. Развитие систем тестирования мутагенных и канцерогенных свойств химических соединений идет в направлении их сближения путем изучения мутагенной активности веществ в разных органах млекопитающих in vivo.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Необходимость учета органной специфичности как для повышения эффективности выявления и количественной оценки мутагенов, так и для прогноза канцерогенности химических соединений, позволяет нам ставить следующие цели и задачи. Целью настоящего исследования является научное обоснование и разработка системы оценки мутагенного эффекта химических загрязнений окружающей среды у млекопитающих in vivo с учетом органной специфичности. Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ имеющихся подходов к оценке органной специфичности мутагенного действия факторов окружающей среды и обосновать использование микроядерных тестов на клетках разных органов млекопитающих in vivo как наиболее информативных и адекватных задачам гигиены окружающей среды.

2. Разработать и усовершенствовать суспензионные методики приготовления препаратов клеток разных органов млекопитающих in vivo для оценки частоты микроядер.

3. Провести сравнительную оценку спонтанного и индуцированного химическими веществами и у-излучением уровня цитогенетических повреждений в клетках разных органов с помощью микроядерных тестов и выявить органы-мишени мутагенного действия.

4. Провести анализ цитогенетического повреждения клеток разных органов млекопитающих in vivo в зависимости от дозы, типа мутагена и исследуемого органа; сравнить информативность показателей количественной оценки для определения органов-мишеней мутагенного действия.

5. Определить зависимость органной специфичности мутагенного действия химических соединений от вида и пола животных, генотипа мышей.

6. Разработать систему оценки мутагенного эффекта химических загрязнений окружающей среды на млекопитающих in vivo с учетом органной специфичности.

7. Провести сравнительный анализ органной специфичности цитогенетического и канцерогенного эффекта веществ; обосновать возможность использования системы для прогноза канцерогенных свойств химических соединений.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЙ заключается в том, что впервые

- научно обоснована и разработана система оценки мутагенного эффекта химических загрязнений окружающей среды на млекопитающих in vivo с учетом органной специфичности путем анализа цитогенетической активности различных факторов и их совокупности в клетках органов основных систем организма (пищеварительной, дыхательной, выделительной, кроветворной);

- определены уровни спонтанной частоты микроядер в клетках разных органов (печени, легких, мочевом пузыре, разных отделах желудочно-кишечного тракта) мышей и/или крыс;

- проведена количественная оценка органной специфичности и определены органы-мишени мутагенного действия бенз(а)пирена (БП), 1,2диметилгидразина (ДМГ), 1,2-дибром-З-хлорпропана (ДБХП), 1,2-дибромпропана (ДБП), 1,1,3-трибромпропана (ТБП), циклофосфамида (ЦФ), нитрозодиметиламина (НДЭА), бензамида, хризотил-асбеста, йодированной питьевой воды, смесей продуктов хлорирования циклогексена и бутанола у мышей и/или крыс; обоснована необходимость количественной оценки органной специфичности мутагенного действия вещества для определения минимально-действующей (МДД) и «допустимой» дозы мутагена (ДДмут), классификации мутагенов, при изучении видовой, половой и клеточной специфичности; показано, что видовая, половая и линейная чувствительность к мутагенному действию химических соединений, определенная с учетом органной специфичности, отличается по уровню эффекта, но не по его наличию или отсутствию; определены показатели (МДД, удваивающие дозы и/или коэффициенты р регрессионных уравнений) для выявления наиболее чувствительных органов-мишеней мутагенного и канцерогенного действия; для сравнения видовой, половой и линейной специфичности с учетом эффекта в разных органах наиболее информативным и чувствительным является показатель "удваивающая доза мутагена"; установлено, что локализация мутагенного эффекта вещества может изменяться в зависимости от дозы, поэтому при оценке органной специфичности необходимо исследовать не менее трех доз; обосновано использование системы для оценки мутагенного эффекта и определения органов-мишеней при действии факторов разного типа (химических соединений, относящихся к разным структурным группам; смесей химических веществ, корпускулярных агентов, у-излучения); обоснована возможность использования системы оценки мутагенного эффекта химических загрязнений окружающей среды на млекопитающих in vivo с учетом органной специфичности для прогноза канцерогенных свойств химических соединений и определения органов-мишеней канцерогенного действия.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ работы заключается в использовании системы оценки мутагенного действия химических соединений с учетом органной специфичности для гигиенической оценки и регламентирования факторов окружающей среды. Оценка мутагенного эффекта химических соединений с учетом органной специфичности на млекопитающих in vivo позволяет повысить надежность выявления мутагенов, снизить количество ложно-положительных и ложно-отрицательных результатов при скрининге, прогнозировать канцерогенные свойства и включать эти вещества в список приоритетного тестирования на канцерогенность в долгосрочных экспериментах.

На основе системы впервые разработан алгоритм тестирования веществ для оценки их мутагенной активности с учетом органной специфичности. Он предназначен для использования в практических лабораториях, занимающихся тестированием мутагенных свойств различных факторов.

Установлена мутагенная и потенциальная канцерогенная опасность двух галопропанов - ДБП и ТБП.

В опытах на млекопитающих доказана возможность образования мутагенных продуктов при хлорировании циклогексена и бутанола -гигиенически значимых соединений, загрязняющих в составе сточных вод открытые водоемы.

Дано заключение о безопасности бензамида при оценке мутагенных свойств в клетках костного мозга, преджелудка и желудка мышей в опытах in vivo в диапазоне доз 12-300 мг/кг.

Установлена безопасность длительного потребления йодированной питьевой воды (концентрации йода 62,5 -1000 мкг/л) при оценке мутагенного эффекта в клетках костного мозга и мочевого пузыря крыс.

Материалы диссертационного исследования были использованы при подготовке следующих методических документов:

- "Методических указаний по изучению мутагенной активности химических веществ при обосновании их ПДК в воде" (М., 1986), утвержденных Минздравом СССР, №4110-86 от 12.06.1986 г.;

- "Временных методических указаний по обоснованию предельно-допустимых концентраций (ПДК) загрязняющих веществ в атмосферном воздухе населенных мест" (М., 1989) утвержденных Минздравом СССР, Хо4681-88 от 15.07.1988 г.;

- Методических рекомендаций "Оценка мутагенных свойств фармакологических средств" (М.,1998), утвержденных Фармкомитетом Минздрава России 11.06.1998 (протокол №6);

- "Методических указаний по прогнозированию канцерогенности фармакологических средств и вспомогательных веществ в КСТ", вошедших в "Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ" (М., 2000), утвержденное Фармкомитетом Минздрава России;

- Методических рекомендаций "Оценка мутагенной активности факторов окружающей среды в клетках разных органов млекопитающих микроядерным методом" (М., 2001), утвержденных Межведомственным научным советом по экологии человека и гигиене окружающей среды.

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА в плановом порядке и обобщает результаты многолетних (1986-2001 гг.) исследований, проведенных в лаборатории мутагенеза в соответствии с планом Проблемной комиссии союзного значения "Научные основы гигиены окружающей среды" в рамках научно-исследовательских работ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН при участии с.н.с. к.б.н. И.Ф.Выскубенко и к.б.н. О.Г. Саламатовой с личным вкладом не менее 80%. №№ государственной регистрации тем 01.850000495; 01.870025753; 01.89.0040738; 01.91.0013580; 01.920013586; 01.970002123; 01.970002125.

В работе использованы материалы совместных исследований по оценке мутагенной активности различных факторов с сотрудниками лабораторий комплексного эколого-гигиенического нормирования (рук.: проф., д.м.н. З.И. Жолдакова), цитогистологии (рук.: д.б.н. Н.Н. Беляева), гигиены питьевого водоснабжения (рук.: д.м.н. Р.И. Михайлова) НИИ экологии и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН; НИИ канцерогенеза ВОНЦ (рук. лабораторий: проф., д.м.н. Г.А. Белицкий; проф., д.м.н. Л.А. Пылев); Института общей генетики РАН (проф., д.б.н. М.Д. Померанцева, к.б.н. Л.К. Рамайя).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации представлены на 23 международных, всесоюзных или российских симпозиумах, конференциях и совещаниях: IX Всероссийском съезде гигиенистов и санитарных врачей (Москва, 2001); 1 съезде токсикологов России (Москва, 1998); Четвертом международном конгрессе "Вода: экология и технология" (Москва, 2000 г.); Международной конференции "Загрязнение окружающей среды. Проблемы токсикологии и эпидемиологии" (Пермь, 1993г.); Международном симпозиуме «Проблемы токсикологии и прикладной экологии» (Москва-Пермь, июль 1991 г.); 1-ом Международном симпозиуме "Окружающая среда и здравоохранение. Исследования и разработки в странах Европейского сообществ (ЕС) и в СССР" (Франция, Аббеи де Воде-Серкэ, март 1990 г.); II Всесоюзном (Алма-Ата, декабрь 1990 г.), I (третьем) и II (четвертом) Российском съездах медицинских генетиков (Москва, 1994г., Курск, 2000); I Съезде Российского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова (Санкт-Петербург, 2000); 11 Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2001); I Всесоюзном радиобиологическом съезде (Пущино, 1989); Ежегодных совещаниях Европейского общества по мутагенам окружающей среды: 21 - в Праге (1991); 26 - в Риме (1996); 28 - в Зальцбурге (1998), 29 - в Копенгагене (1999); 7 Международной конференции по мутагенам окружающей среды

Тулуза, 1997); заседаниях секции генетических аспектов проблемы "Человек и биосфера" при ГКНТ СССР "Тест-системы для оценки мутагенного потенциала загрязнителей окружающей среды" (Иркутск, 1984 г.); "Генетические последствия загрязнения окружающей среды мутагенными факторами" (Самарканд, 1990 г.); Всесоюзном симпозиуме "Объем и методы генотоксической оценки и побочных эффектов биологически активных веществ" (Ленинград, май 1989г.); Научно-практической конференции стран СНГ, Балтии, Закавказья "Проблемы антимутагенеза" (Минск, 1993); Российской конференции "Мутагены окружающей среды" (Казань, 1996); заседании комиссии по канцерогенным факторам МЗ РФ (Москва, 1997).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 45 печатных работ.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

• Система оценки мутагенного эффекта химических загрязнений окружающей среды с учетом органной специфичности в опытах на млекопитающих in vivo.

• Качественная и количественная оценка органной специфичности мутагенного действия десяти химических соединений и двух смесей в опытах на млекопитающих.

• Использование системы оценки мутагенного действия химических соединений для анализа видовой и половой специфичности у млекопитающих.

• Регламентирование веществ, обладающих мутагенными свойствами с учетом органной специфичности.

• Сравнительная оценка органной специфичности мутагенного и канцерогенного действия и прогноз канцерогенных свойств химических соединений.

Выводы

1. Обоснована необходимость оценки мутагенного действия химических соединений с учетом органной специфичности для их гигиенического регламентирования, прогноза канцерогенных свойств и выявления органов-мишеней канцерогенного действия. На основе сравнительного анализа имеющихся подходов для оценки органной специфичности выбраны микроядерные тесты как наиболее информативные и адекватные задачам гигиены окружающей среды.

2. Впервые научно обоснована и разработана система оценки мутагенного эффекта химических загрязнений окружающей среды с учетом органной специфичности, включающая

- использование микроядерных тестов на клетках нескольких органов млекопитающих in vivo;

- поэтапное тестирование веществ с обоснованием каждого этапа;

- определение органов-мишеней мутагенного действия;

- гигиеническое регламентирование вещества с учетом ДДмут, рассчитанной на основании минимально-действующей дозы вещества в наиболее чувствительном органе-мишени;

- прогноз канцерогенных свойств вещества и предполагаемых органов-мишеней.

3. Для практических лабораторий, занимающихся токсикологической оценкой различных факторов, разработан алгоритм оценки их мутагенной активности с учетом органной специфичности.

4. Разработаны суспензионные методы приготовления препаратов клеток разных органов (легких, преджелудка, толстой кишки, печени и других) для оценки частоты микроядер, включающие ускоренные методы приготовления препаратов с использованием 5% раствора сахарозы, а также методы приготовления препаратов разных органов мышей и крыс после фиксации формалином и щелочной диссоциации клеток.

5. Спонтанный уровень частоты клеток разных органов с микроядрами, в основном не превышал 2%о, для клеток легких -3 %о; для гепатоцитов он соответствовал 3- 7%о.

6. Определены качественные и количественные параметры органной специфичности мутагенного действия БП, ДМГ, ЦФ, НДЭА, ДБХП, ДБП и ТБП, бензамида, хризотил-асбеста, йодированной питьевой воды, смесей продуктов хлорирования циклогексена и бутанола, а также у-из л учения, определены органы-мишени этих факторов.

7. Выделены наиболее информативные показатели количественной оценки органной специфичности и определения органов-мишеней мутагенного действия: МДДмут, удваивающие дозы и коэффициенты р регрессионных уравнений "доза-эффект".

8. С помощью разработанной системы выявлен мутагенный эффект исследованных канцерогенов и все органы-мишени канцерогенного действия. Это позволило рекомендовать использование системы оценки мутагенного действия химических соединений с учетом органной специфичности для прогноза канцерогенного действия химических веществ и определения предполагаемых органов-мишеней канцерогенного действия.

9. Определены зависимости органной специфичности мутагенного действия химических соединений от вида, пола животных и линии мышей:

- видовая, половая и линейная чувствительность к мутагенному действию изученных химических соединений отличалась по уровню эффекта, но не по его наличию или отсутствию;

409

- при количественной оценке видовой специфичности отмечены все три возможных варианта: мыши чувствительнее крыс к действию ДМГ, ДБХП и ТБП; крысы чувствительнее мышей к действию ДБП; чувствительность мышей и крыс к НДЭА приблизительно одинакова;

- половая чувствительность к одному и тому же мутагену может отличаться у животных разного вида: у самцов и самок мышей чувствительность клеток печени и толстой кишки к действию ДМГ была одинакова, тогда как самки крыс были более чувствительны по сравнению с самцами;

- у мышей разных линий спонтанная частота клеток с микроядрами может отличаться от 2 до 12 раз в разных органах;

- наиболее информативным и чувствительным для сравнения видовой, половой и линейной специфичности с учетом эффекта в разных органах был показатель "удваивающая доза мутагена".

Заключение

Диссертация посвящена разработке и обоснованию системы оценки мутагенного эффекта химических соединений с учетом органной специфичности. Необходимость разработки этой системы обоснована во введении. Выбор оптимального подхода к оценке органной специфичности мутагенного действия различных факторов с помощью микроядерных тестов проведен при сравнении всех имеющихся в настоящее время способов оценки органной специфичности (глава 1). Отбор, усовершенствование и разработка микроядерных методов для оценки органной специфичности подробно изложены в главе 2. Становление этой системы тестов и обобщение результатов, полученных к настоящему времени разными исследователями на разных органах (легких, печени, преджелудке, толстой кишке, мочевом пузыре), изложено в главе 6. Спонтанный уровень цитогенетических повреждений клеток разных органов у контрольных животных разного вида, пола, линии приведен в главе 5. Апробация системы и ее корректировка проведена при исследовании цитогенетических эффектов 9 веществ и двух смесей в разных органах млекопитающих in vivo (глава 4). Возможность использования элементов этой системы показана при изучении действия у-излучения в опытах на мышах (глава 5). Качественная и количественная оценка органной специфичности мутагенного действия исследованных нами веществ и смесей и сопоставление ее у животных разного вида, пола, линий и в разных типах клеток рассмотрено в главе 7. Характеристика системы, алгоритм тестирования, регламентация веществ с учетом органной специфичности и прогноз канцерогенных свойств вещества и возможных органов-мишеней канцерогенного действия приведены в главе 8.

Разработка системы и внедрение в практику направлены на решение нескольких важных задач:

- повышение надежности регламентации мутагенов на основе 1) более корректного выявления мутагенов для млекопитающих, поскольку многие вещества могут проявлять мутагенный эффект в органах, отличных от костного мозга; 2) более точного определения МДДмут, которые в органах-мишенях могут быть в 5-125 раз ниже, чем в костном мозге;

- оценка комплексного, сочетанного и комбинированного действия различных факторов путем использования в качестве биомаркера вредного действия основного показателя системы - частоты и типа микроядер, который может быть применен и для оценки реальной нагрузки;

- исследования механизмов действия факторов на уровне клеток, тканей, органов и целого организма;

- прогноз канцерогенных свойств исследуемых препаратов в системе краткосрочных тестов;

- определение и сопоставление органов-мишеней мутагенного и канцерогенного действия химических соединений;

- исследование взаимосвязи мутагенного и канцерогенного эффекта различных факторов при изучении этих эффектов в одних и тех же клетках, тканях и органах;

- изучение мутагенных эффектов различных факторов при их комплексном, сочетанном или комбинированном действии;

- изучение модифицирующего действия различных факторов на эффект мутагенов и канцерогенов;

- обеспечение более корректной экстраполяции данных по мутагенному эффекту у млекопитающих на людей с учетом органной специфичности.

Отдельно хочется отметить еще один важный аспект использования системы, который состоит в применении ее в качестве методической основы для дальнейшего развития генотоксикологии. В настоящее время большинство закономерностей в этом разделе токсикологии получено при изучении клеток костного мозга. Пока не существует общего представления о закономерностях развития мутагенных эффектов в целом организме с учетом токсикокинетики веществ, пролиферации отдельных клеток и темпа обновления тканей и органов (стабильных, лабильных и быстро обновляющихся), процессов этапного становления генетического повреждения в клетках разных органов in vivo, в отличии, например, от классической токсикологии. Это не является случайным, поскольку генотоксикология - это сравнительно молодая и еще не оформившаяся наука, базирующаяся на данных генетики, тогда как токсикология основывается на данных более "древних" наук - морфологии, физиологии, биохимии, патоморфологии, патофизиологии и других. Представленная система позволяет изучать закономерности действия различных факторов в совокупности основных систем организма (дыхательной, пищеварительной, выделительной, кроветворной) на клеточном, тканевом и органном уровнях и в организме в целом. Использование суспензионных методов после фиксации органов формалином позволяют анализировать эффект одновременно во многих органах и клетках у одного и того же животного к моменту забоя. К сожалению, пока не изучены временные параметры развития мутагенного эффекта параллельно в разных органах. Но представленная система позволяет проводить такие исследования. Именно метод фиксации органов формалином, подобно тому, как это делают патоморфологи, но с использованием дальнейшей диссоциации тканей, позволяет изучать морфологию единичных клеток, проводить морфометрию и кариометрию. Этот подход позволяет дифференцировать одно- и двуядерные клетки и оценивать одновременно не только генотоксическое, но и цитотоксическое действие фактора, подсчитывать частоту повреждений отдельно в одно- и двуядерных клетках, что трудно сделать на гистологических срезах.

Система позволяет заполнить пробел между достаточно хорошо изученными событиями повреждения генетического материала на молекулярном уровне и реализованными канцерогенными эффектами. Причем, на молекулярном уровне почти расшифрован генетический код и возможно автоматизированное изучение его изменения, однако значение этих изменений на уровне клеток, тканей, органов и организма в целом пока не ясно, т.е. неизвестно, каким образом изменение генетической программы отразится на здоровье организма и будущих поколений.

Рассмотренные в диссертации вопросы также направлены на решение практических задач гигиены и, в частности, проблемы регламентирования химических веществ с учетом отдаленных эффектов. Они позволяют приблизиться к разработке единой системы выявления генотоксических соединений - мутагенов и канцерогенов. Следует подчеркнуть, что окончательное решение о канцерогенности может быть принято после проведения длительных экспериментов на животных. Однако первый этап -выявление генотоксических свойств химических соединений - может быть единым для мутагенов и канцерогенов, и он может быть представлен разработанной системой оценки мутагенного эффекта химических соединений

С учетом органной специфичности в опытах на млекопитающих. Возможно, в систему следует ввести оценку пролиферативной и трансформирующей активности химических соединений, причем, это можно сделать используя те же суспензионные препараты, что и для оценки цитогенетических эффектов.