Автореферат и диссертация по медицине (14.02.01) на тему:Экспериментальная оценка цитогенетического и цитотоксического действия акриламида на клетки щитовидной железы

На правах рукописи

4839914

Алтаева Александра Андреевна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОГО И ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ АКРИЛАМИДА НА КЛЕТКИ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

14.02.01.-Гигиена 03.02.07. - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

О 3 [.нр

Москва - 2011

' /

4839914

Работа выполнена в лабораториях цнтогистологии и генетического мониторинга Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация: Учреждение Российской Академии Медицинских Наук НИИ медицины труда РАМН, Москва, Россия.

Беляева Наталия Николаевна Сычева Людмила Петровна

Жолдакова Зоя Ильинична Курило Любовь Федоровна

Защита диссертации состоится 24 марта 2011 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 208.133.01 в ФГБУ «НИИ ЭЧ и ГОС им. А.Н. Сысина» Минздравсоцразвития России по адресу: 119992, г. Москва, ул. Погодинская, д. 10/15, строение 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ ЭЧ и ГОС

им. А.Н. Сысина» Минздравсоцразвития России по адресу: 119992, Москва, ул.

Погодинская, д. 10/15, строение 1.

Автореферат разослан ' 4Ы ^САС^М /Си" 2011 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Беляева Наталия Николаевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность. Оценка безопасности факторов окружающей среды (ФОС) для человека включает в себя изучение генотоксического, цитотоксического и мутагенного действия этих факторов на различных биологических объектах. Мутагенные свойства ФОС изучают с использованием стандартной тест-системы, включающей в качестве обязательных, два теста: тест Эймса на Salmonella typhimurium для выявления генных мутаций и учет хромосомных аберраций или микроядер в клетках костного мозга мышей или крыс in vivo (Ревазова Ю.А., Журков B.C.; OECD Guideline for the testing of chemicals, 1997). В настоящее время рекомендуется оценка мутагенного эффекта в клетках других органах млекопитающих (Eastmond D.A. et al., 2009). Одним из таких методов исследования является разработанный в НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина полиорганный микроядерный тест, включающий цитогенетический анализ клеток органов желудочно-кишечного тракта, дыхания, выделения, сперматид (Сычева Л.П., 2002, 2007; Коваленко М.А., 2005; Шереметьева С.М., 2006; Юрченко В.В. и др., 2000). В настоящее время он дополнен большим набором показателей состояния ядра клетки и применяется в виде более информативного полиорганного кариологического анализа (Рахманин Ю.А. и др., 2007).

Щитовидная железа (ЩЖ) является одним из основных органов поддержания внутреннего гоместаза организма и реагирует на любые изменения в организме, как эндогенного, так и экзогенного характера.

Ввиду интенсивного роста техногенной нагрузки неуклонно увеличивается частота заболеваний ЩЖ. Распространенность рака данного органа по данным ВОЗ увеличилась за последние 20 лет более чем в два раза (Фадеев В.В., 2003). По прогнозам ученых, при сложившейся неблагоприятной экологической ситуации рост числа заболеваний ЩЖ будет прогрессировать и далее за счет узловых форм зоба, рака ЩЖ, а также аутоиммунных заболеваний (Сошникова Н.В., 2008). Показано, что загрязнение окружающей среды вызывает токсические изменения клеток ЩЖ (Беляева H.H., 1998; Гансбургский М.А., 2005; Green L.M. et al., 2001).

Огромное количество химических веществ, с которыми контактирует человек в промышленности, быту, и других факторов являются известными индукторами тиреоидной патологии, среди них: 4,4- метилендианилин, флуориды, 2,4- диаминоанизол, пропилтиоурацил, 4,4-тиодианилин, нитробензол, метимазол, диэтилтиомочевина, этилентиомочевина, метилнитрозомочевина и др. Одним из таких соединений является акриламид, повсеместно распространенный в окружающей среде.

Акриламид используется для приготовления клеев, красок, тканей; в парфюмерно-косметической продукции; на полимерном производстве (стойматериалы, упаковка); в виде полимера - полиакриламида для осветления питьевой воды, для обработки муниципальных и промышленных отходов; как изолятор при строительстве дамб, туннелей и резервуаров для воды. Полиакриламидные гели применяют также в качестве имплантов в пластической хирургии (Неробеев А.И., 1997; Huo М. et al, 2002; Острецова Н.И, 2003).

В последние годы мировое сообщество обеспокоено обнаружением акриламида в продуктах, подвергнутых высокотемпературной обработке - жареном картофеле (330 мкг/кг), картофельных (1343 мкг/кг) и кукурузных чипсах (167 мкг/кг) и др. Поступление акриламида с пищей и водой, табачным дымом при обычном или пассивном курении значительно увеличивает его концентрацию в организме. Установлено, что в среднем человек потребляет 0,3-0,8 мкг/кг акриламида в день, а по данным ВОЗ ПДЦ поступления акриламида в организм человека вместе с продуктами питания -1 мкг/день.

Согласно руководству Европейской Комиссии (1988), акриламид относится: к группе 2А канцерогенов (МАИР) - «вероятно, вызывает рак у людей», ко 2-й группе мутагенов - «может вызывать генетические повреждения» и к 3-ему классу по токсичности - «возможен риск бесплодия».

ПДК акриламида в воде водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования (ГН 2.1.5.1315-03) - 0,0001мг/л, лимитирующий признак вредности установлен по санитарно-токсикологическому показателю. Но по данным ВОЗ содержание акриламида в питьевой воде не должно превышать 0,0005 мг/л.

Известны мутагенные свойства акриламида, определенные при оценке клеток костного мозга. Мутагенный эффект в костном мозге мышей в виде появления микроядер, хромосомных аберраций и ДНК повреждений выявлен только в дозах 4 мг/кг и выше. В костном мозге крыс цитогенетические эффекты не выявлены при действии акриламида в дозе 100 мг/кг (Krishna G., Theiss J.C, 1995; Paulsson В. et al., 2002). В результате проведения комплексных Международных исследований по оценке эффектов акриламида, показана его тропность к ЩЖ -индукция опухолей в этом органе при действии дозы 2 мг/кг/сут. (Johnson К.А. et al., 1986). Зависимость «доза-время-эффект» при действии акриламида на ЩЖ почти не изучена, хотя в настоящее время данным исследованиям придается огромное значение (Пинигин М.А., 2001; Синицына О.О., Жолдакова З.И., Рахманин Ю.А., 2002).

Исследования ЩЖ, проводимые в настоящее время в профилактической медицине для определения негативного влияния того или иного фактора окружающей среды (ФОС), не всегда дают объективную оценку. Изучение канцерогенного действия является длительным и дорогостоящим, и ЩЖ часто не включена в перечень исследуемых органов при тестировании канцерогенов (JARC, 1994).

Обобщающие руководства по морфологической диагностике разных состояний ЩЖ, отражающие современные подходы, в отечественной литературе немногочисленны (Бомаш Н.Ю., 1981; Хмельницкий O.K. 2002). Исследования по изучению цитотоксического и генотоксического действия факторов окружающей среды на клетки ЩЖ единичны (Беляева H.H., Михайлова Р.И., Кирьянова Л.Ф. и др., 2002; Гансбургский М.А., 2005, Кораблева Т.В., 2007., Ермакова О.В., 2008; Павлов A.B.,2010). Поэтому важной проблемой в эколого-гигиенических и токсикологических исследованиях является разработка адекватных, простых в исполнении, экономически доступных и отвечающих современным диагностическим стандартам тест-систем для оценки генотоксического действия ФОС на клетки ЩЖ.

Методы оценки мутагенного эффекта различных факторов на клетках ЩЖ в эксперименте почти не разработаны. Решению этой задачи посвящены исследования, проводимые в Ярославском медицинском институте под руководством профессора A.B. Павлова. Но для постановки микроядерного теста на клетках ЩЖ авторы применяют дорогостоящий ферментный метод диссоциации клеток с исследованием ограниченного количества показателей (Гансбургский М.А., 2005; Кораблева Т.В., 2007).

Мутагенное действие акриламида на клетки ЩЖ in vivo практически не изучено. Таким образом, хорошая общая изученность вещества, его тропность к ЩЖ, индукция опухолей в этом органе, выявленная мутагенность для других органов стали основанием для выбора акриламида в качестве модельного мутагена в нашем исследовании. Поэтому целью данного исследования явилась разработка метода оценки опасности химических веществ по цитогенетическим и цитотоксическим показателям действия на клетки ЩЖ и апробация его на примере акриламида.

Для достижения цели исследования сформулированы следующие задачи:

1. Разработать метод кариологического анализа клеток ЩЖ (расширенный микроядерный метод) в эксперименте in vivo для оценки цитогенетического и цитотоксического действия химических соединений.

2. Оценить цитогенетическое и цитотоксическое действие акриламида на клетки

ЩЖ в опытах in vivo.

3. Изучить закономерности цитогенетического и цитотоксического действия акриламида на клетки ЩЖ «доза- эффект» и «время- эффект», а также от времени введения акриламида при гемитиреоидэктомии (ГТЭ).

4. Определить сопряженность кариологических и морфо-функциональных показателей состояния эпителия ЩЖ при действии акриламида и возможность использования этих показателей при тестировании химических веществ, в том числе генотоксикантов и канцерогенов.

Научная новизна. Впервые:

1) разработан метод кариологического анализа клеток ЩЖ в эксперименте in vivo для оценки цитогенетического и цитотоксического действия химических соединений, отвечающий диагностическим стандартам и экономическим критериям;

2) на препаратах, полученных данным методом, проведена морфологическая классификация типов клеток ЩЖ крыс по форме и структуре клеточных компонентов;

3) установлены зависимости «доза- эффект» и «время- эффект» при действии акриламида на клетки ЩЖ во всем исследованном диапазоне доз. Определены цитогенетический и цитотоксический эффекты акриламида на клетки ЩЖ в эксперименте in vivo в дозах 0,004; 0,02 и 0,1LD50;

4) дано теоретическое обоснование полученной зависимости «доза- эффект», заключающееся в снижении цитогенетического эффекта при действии акриламида в средней дозе, соответствующей 0,02 LD50, за счет его влияния на клеточную кинетику (изменения пролиферативной активности и апоптоза);

5) преимущество комплексного подхода к оценке действия акриламида на ЩЖ подтверждено выявленной сопряженностью цитогенетических, цитотоксических и морфо - функциональных показателей.

Практическая значимость. Разработанный метод подан как Евразийская заявка на изобретение № 201000068 от 18.11.2009 г. «Способ выявления цитогенетического и цитотоксического действия факторов окружающей среды в клетках щитовидной железы».

По материалам диссертационной работы подготовлены методические рекомендации «Оценка цитогенетического и цитотоксического действия факторов окружающей среды на клетки щитовидной железы экспериментальных животных in vivo», рекомендованные для учреждений, занимающихся гигиеническими и токсикологическими исследованиями. Утверждены председателем научного совета

Российской Федерации по экологии человека и гигиене окружающей среды академиком РАМН Ю.А. Рахманш/ым.

Результаты диссертационной работы внедрены в практикум для студентов, проводимого Учебно-научным центром Учреждения Российской академии наук Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН и кафедры генетики Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова (акт о внедрении № 12504-01-2115/66 от 31.01.2011), а также используются в учебном процессе на лекциях и семинарских занятиях Чеченского государственного университета (акт о внедрении № 1424-06-19 за 10.12.2010г.).

Работа выполнена в лабораториях цитогистологии и генетического мониторинга и НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина в рамках двух плановых тем НИР 080 и 090.

Апробация работы. Материалы диссертации апробированы на заседании Межотдельческой комиссии по апробации докторских и кандидатских диссертаций ФГБУ «НИИ ЭЧ и ГОС им. А.Н.Сысина» Минздравсоцразвития России 23 ноября 2010г.; представлены: на 2-й и 3-й Всероссийских научно-практических конференциях молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Рязань, 2007, Москва 2009); Научной сессии «Экологические риски здоровью населения на Крайнем Севере» (Надым, 2007); Международном экологическом форуме «Экофорум- 2008» (Санкт-Петербург, 2008); XX Международном Конгрессе Генетиков «Genetics- understanding living systems» (Берлин, Германия, 2008); 111 Съезде Токсикологов (Москва, 2008); V Международной конференции «Донозоология-2009» (Москва, 2009); X Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье» (Москва, 2009); Межвузовской научной конференции с международным участием «Современные проблемы гигиены, общественного здоровья и здравоохранения» (Москва, 8 декабря 2009); VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 14-18 мая 2010); VI Международном симпозиуме «Медико-биологические проблемы безопасности населения» (Греция, 2010); Пленуме Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды и Научного совета по медико-экологическим проблемам здоровья работающих «Научно-методические и законодательные основы обеспечения генетической безопасности факторов и объектов окружающей и производственной среды в целях сохранения здоровья человека» (Москва, 15-16 декабря, 2010).

Публикации по теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, из них 2 - в журналах, рекомендуемых ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Текст изложен на 155 страницах машинописи, иллюстрирован 30 таблицами, 39 рисунками. Указатель литературы содержит 155 источников, из них 62 отечественных и 93 иностранных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Новый высокоинформативный подход к оценке цитогенетического и цитотоксического действия химических соединений, основанный на проведении кариологического анализа клеток ЩЖ в эксперименте in vivo, включающий учет цитогенетических показателей, показателей пролиферации и деструкции ядра;

2. Мутагенный эффект и влияние акриламида на показатели клеточной кинетики ЩЖ в дозах, соответствующих 12,4 (0,1LD50), 2,48 (0,02LD50) и 0,496 (0,004LD50) мг/кг как одна из причин развития новообразований, отмечаемых в этом органе;

3. Зависимость «доза- эффект» и «время- эффект» цитогенетического и цитотоксического действия акриламида на ЩЖ;

4. Оценка сопряженности ряда кариологических и морфофункциональных показателей состояния эпителия ЩЖ при действии акриламида, позволяющая рассматривать механизмы действия токсиканта на клеточном, тканевом и органном уровнях.

Материал, методы и объем исследований

Эксперименты проводили на лабораторных крысах Wistar (питомник «Столбовая» РАМН), половозрелых самцах, массой 170-240 г, в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных целей (Страсбург, 1986) и этическим комитетом НИИ ЭЧ и ГОС им. А.Н. Сысина. Животных содержали на стандартной диете в виварии Института в условиях свободного доступа к воде и пище. Объем проведенных исследований представлен в таблице 1.

Для стимуляции пролиферации опытным и контрольным группам животных проводили левостороннюю ГТЭ под эфирным наркозом. Рану ушивали. Через 2 часа после операции животные восстанавливали привычную активность.

Для определения дозовых зависимостей акриламид вводили крысам в дозах, соответствующим 0,1LD50 (12,4 мг/кг), 0,02LD50 (2,48 мг/кг) и 0,004LD5O (0,496 мг/кг) внутрижелудочно зондом трехкратно на 2-е, 4-е и 6-е сутки после проведения ГТЭ. Взятие органов осуществляли на 3-й сутки после последнего введения вещества. У контрольных животных взятие органов осуществлялось на 9-е сутки после ГТЭ.

Таблица I.

Объем проведенных исследований___

Концентрация акриламида Проведение ГТЭ Кратность введений Взятие материала после ГТЭ Количество животных в группе Количество показателей Количество клеток /точек

Кариологический анализ

0,1 LDso За 48 часов до первого введения 3 9 сутки 7 24 7000

0,02 LDso За 48 часов до первого введения 3 9 сутки 7 24 7000

0,004 LD50 За 48 часов до первого введения 3 9 сутки 7 24 7000

Контроль На первые сутки эксперимента - 10 сутки 6 24 6000

0,1 LDso За 48 часов до первого введения 1 5 сутки 7 24 7000

0,1 LDso Через 24 часа после первого введения 1 3 сутки 7 24 7000

Гистологические исследования

ОД LDso За 48 часов до первого введения 3 9 сутки 7 6 1400 точек

0,02 LDso За 48 часов до первого введения 3 9 сутки 6 6 1200 точек

0,004 LDso За 48 часов до первого введения 3 9 сутки 7 6 1400 точек

Контроль На первые сутки эксперимента - 9 сутки 7 6 1400 точек

0,1 LDso За 48 часов до первого введения 1 5 сутки 7 6 1400 точек

0,1 LDso Через 24 часа после первого введения 1 3 сутки 6 6 1200 точек

Дополнительная группа Отработка проведения гемитиреоид-эктомии и методики получения, приготовления препаратов ЩЖ, с последующим их анализом 29 24 29000

Итого Цитологический и морфо-функцио-нальный анализ 110 30 70000 клеток 8000 точек

Для определения зависимости действия акриламида от кратности воздействия исследовали три группы экспериментальных животных. Согласно базе данных СЕЫЕТОХ Ь05о для крыс при пероральном введении соответствует 124 мг/кг.

Одной группе животных раствор акриламида, в дозе 12,4 мг/кг (0,1LDSO), приготовленный ex tempore, вводили внутрижелудочно однократно на 2-е сутки после проведения ГТЭ. Другой группе ту же дозу вводили трехкратно на 2, 4 и 6-е сутки после ГТЭ. Органы для исследования брали на третьи сутки после

последнего введения исследуемого вещества, т. е. на 9-е сутки после ГТЭ. У контрольных животных после ГТЭ забор материала осуществлялся в этот же срок.

Уровень цитогенетических нарушений в зависимости от срока стимуляции пролиферации, сравнивали у крыс, которым акриламид (12,4 мг/кг) вводили однократно за 24 часа до ГТЭ и однократно в той же дозе через 48 часов после ГТЭ.

Препараты для кариологического анализа готовили с помощью разработанного метода получения изолированных клеток ЩЖ путем фиксации в формалине и щелочной диссоциации для последующего анализа, окрашивания азур-эозином по Романовскому и по Фельгену. Кариологический анализ проводили в соответствии с подходом, разработанным для других тканей (Сычева Л.П.,2007). В А-клетках ЩЖ (тироцитах) анализировали частоту цитогенетических показателей: долю клеток с микроядрами, протрузиями, межъядерными мостами, сумму цитогенетических нарушений, а также другие кариологические показатели: пролиферацию (сумму клеток с двумя и более ядрами) и показатели деструкции клетки (доля клеток с кариопикнозом, кариорексисом, кариолизисом, апоптический индекс). Микроскопический анализ зашифрованных препаратов проводили под иммерсионным объективом при увеличении хЮОО. Подсчитывали 1000 клеток от каждого животного.

Материал для морфологического исследования забирали от тех же животных, что и для кариологического анализа. Микропрепараты готовили по стандартной методике, окрашивали гематоксилином-эозином. Стереометрически анализировали следующие показатели: соотношение фолликулярной (фолликулы с коллоидом) и интерфолликулярной (островки скопления эпителия) ткани; отношение кубических и цилиндрических тироцитов (КЦЭ) к плоским тироцитам (ПЭ); соотношение коллоида с резорбцией (с внутриклеточными каплями коллоида) и без нее. Стереометрию осуществляли путем наложения сетки со стороной квадрата 2,5 см. на монитор компьютера со спроецированным изображением исследуемого участка ЩЖ с микроскопа «Motic». Долевое соотношение определяли по числу точек пересечения сторон квадрата.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы STATISTICA for Windows 5.0. Межгрупповое сравнение кариологических показателей проводили с использованием критерия 2, рекомендованным международными исследовательскими группами для проведения цитогенетических исследований (Evaluation of short-term tests for carcinogens, 1988); морфологических показателей с использованием t-критерия Стьюдента. Корреляцию

кариологических и морфологических показателей определяли с помощью критериев Пирсона и Спирмена. Отличия считали достоверными при Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ Кариологический анализ клеток ЩЖ. Наши исследования позволяют рекомендовать следующий алгоритм проведения карнологического анализа клеток ЩЖ: воздействие исследуемого фактора; через 48 часов после воздействия проведение левосторонней ГТЭ для стимуляции клеток к делению; на 6 сутки после ГТЭ забор и фиксация в формалине правой доли ЩЖ; длительность фиксации - не менее 1 месяца; далее - диссоциация клеток ЩЖ с помощью щелочного раствора; отмывание клеток и приготовление клеточной суспензии; окраска препаратов азуром и эозином по Романовскому или по Фельгену; шифрование подготовленных к исследованию препаратов; микроскопический анализ мазков с помощью карнологического анализа. Данный анализ включает дифференцировку типов клеток ЩЖ с последующим определением в А-клетках: четырех показателей цитогенетического действия (клетки с микроядрами, ядерными протрузиями, межъядерными мостами, суммарный показатель цитогенетического действия как сумма клеток с этими показателями); также клетки с атипичной формой ядра; показатели пролиферации (двуядерные, трехъядерные клетки, клетки со сдвоенными ядрами, сумма клеток с тремя и более ядрами, митотический индекс); показатели деструкции ядра в клетках с целой, неразрушенной цитоплазмой (конденсацию хроматина, кариопикноз, кариолизис, кариорексис; апоптический индекс, как сумму клеток с кариопикнозом, кариолизисом и кариорексисом; вакуолизацию цитоплазмы). Комплексный подход, включающий оценку для ЩЖ дополнительных, а также интегральных показателей: сумму цитогенетических нарушений, сумму клеток с двумя и более ядрами, апоптический индекс предложен и апробирован в данном исследовании впервые.

Кариологические показатели ЩЖ у контрольных животных. Спонтанный уровень клеток ЩЖ крыс с микроядрами составил 0,17±0,17%о, клеток с протрузиями - 0,66±0,33%о, межъядерными мостами - 0,33±0,21%о, сумма цитогенетических нарушений - 1,17±0,5496о. Последнее значение близко к данным, полученным М.А. Гансбургским (2005), в исследовании которого доля клеток с микроядрами равна 2%о. По данным Кораблевой Т.В. (2007), уровень тироцитов с микроядрами у крыс репродуктивного возраста достигал 3-4%о, остальные цитогенетические показатели в данном исследовании не учитывали. Дополнительные цитогенетические показатели такие, как клетки с протрузиями, клетки с межъядерными мостами и интегральный показатель цитогенетических нарушений учитывались в нашей работе впервые.

У контрольных животных сумма цитогенетических нарушений составила 1,17±0,54%о. Данный показатель сопоставим с уровнем микроядер в других органах контрольных крыс: доля полихроматофильных эритроцитов костного мозга с микроядрами - 0,86±0,30%о, клеток легкого с микроядрами - 0,43±0,14%о, эпителиальных клеток мочевого пузыря - 0,71±0,29%о, толстой кишки -0,77±0,30%о, преджелудка - 0,78±0,28%о, желудка - 1,22±0,32%о, 12-ти перстной кишки - 0,61 ±0,37%о, подвздошной кишки - 1,11±0,57%о, частота гепатоцитов с микроядрами после частичной гепатэктомии - 1,17±0,48%о (Сычева Л.П., 2002; Коваленко М.А., 2005; Шереметьева С.М.,2006).

Суммарный показатель пролиферации в ЩЖ крыс в нашем исследовании, включающий клетки с двумя, тремя и более ядрами, сдвоенными ядрами, составил 13,17±3,24%о. Апоптический индекс - 3,5±1,65%о. При кариологическом анализе суспензионных препаратов ЩЖ из показателей деструкции ядра наблюдали только кариопикноз.

Завнсаимость «доза- эффект» цнтогенетического и цитотоксического действия акриламида на тироциты экспериментальных животных. В

исследовании выявлено мутагенное действие акриламида на клетки ЩЖ. Акриламид во всем исследованном диапазоне доз вызывал значительное четырех-восьмикратное повышение уровня цитогенетических нарушений. Цитогенетические нарушения при действии мутагена представлены, в основном, клетками с протрузиями, образующимися, по-видимому, за счет анеугенных механизмов повреждения веретена деления. Исследования I.D. Adler с соавторами (1993) по оценке действия акриламида на костный мозг и сперматоциты грызунов также указывают на его анеугенное, колхициноподобное действие. В то же время небольшое количество выявленных в нашем исследовании микроядер отличалось мелкими размерами, что, по-видимому, характеризует их образование в результате ДНК-повреждений, т.е. кластогенного эффекта. Это наблюдение подтверждается данными Klaunig J.E. et al. (2005), выявившим повреждение ДНК клеток ЩЖ крыс при введении акриламида в дозах 2 и 15 мг/кг, что приблизительно соответствуют нашим данным. Вероятно, акриламид преимущественно индуцирует анеугенное действие, но в определенной степени оказывает и кластогенное действие на клетки ЩЖ.

При действия акриламида прямой зависимости «доза- эффект» не выявлено. Максимальное повышение частоты тироцитов с цитогенетическими нарушениями в 8 раз отмечено при действии мутагена в минимальной дозе (табл. 2, рис. 1.).

Мутаген в средней дозе вызывал достоверное повышение частоты клеток ЩЖ с цитогенетическими нарушениями над контролем в 3,6 раза, и также

достоверно отличалась от показателей при действии акриламида в минимальной дозе. Эффект мутагена в высокой дозе, соответствующей 0,1 ЬВ50, был достоверно, в 4,9 раза выше по отношению к контролю, но достоверно не отличался от эффекта при введении минимальной дозы. Полученные данные позволяют предположить, что пороговая доза акриламида составит менее 0,004 Ь05о.

Таблица 2

Кариологические показатели ЩЖ крыс при трехкратном введении акриламида

Показатели Доля клеток с исследуемыми показателями (х ср. ± ш), б %о

Контроль 0,496 мг/кг 2,48 мг/кг 12,4 мг/кг

Цитогенетические показатели

Доля клеток с 0,17±0,17 0,57±0,3* 0,43±0,2 0,57±0,3*

микроядрами

Доля клеток с 0,66±0,33 7,71±1,84*** 2,43±0,37* 3,85±1,53***

протрузиями

Доля клеток с 0,33±0,21 1,14±0,4 1,29±0,52 1,28±0,36

межьядерными мостами

Сумма клеток с цитогенетическими 1,17±0,54 9,43±2,23*** 4,14±0,4** 5,71±1,71***

нарушениями

Показатели пролиферации

Сумма клеток с двумя и 13,17±3,24 25,86±5,23*** 14,29±2,74 32,43±12,45***

более ядрами

Показатели деструкции ядра

Доля клеток с 3,5±1,65 7,57±1,39** 17,0±5,32*** 16,29±4,98***

кариопикнозом

Доля клеток с 0 0 0 0

кариолизисом

Доля клеток с 0 0,14±0,14 0 0,29±0,18

кариорексисом

Апоптический индекс 3,5±1,65 7,71±1,43** 17,0±5,32*** 16,57±5,04***

Примечание. *-Р<0,05; **-Р<0,005; ***-Р<0,001- значимые отличия от контрольной группы при сравнении данных по %2.

Оценка показателей пролиферации и деструкции ядра в этом исследовании позволяет интерпретировать дозовую кривую действия акриламида на клетки ЩЖ (рис.1). При действии акриламида в наименьшей дозе, соответствующей 0,004 ЬО50, отмечено небольшое повышение апоптического индекса приблизительно в 2 раза, пролиферативная активность также в 2 раза была повышена, т.е., по-видимому, элиминация и восстановление клеток в популяции было сбалансировано. На этом фоне выявлен максимальный уровень цитогенетических нарушений. Пятикратное увеличение дозы вызвало значительное, в 4,8 раза повышение апоптического индекса, при этом отмечено торможение пролиферации до контрольного уровня. По-видимому, это привело к значительной элиминации клеток с цитогенетическими повреждениями, которые в отсутствие пролиферативной активности не восстанавливались. При действии акриламида в

наиболее высокой дозе апоптический индекс остался на прежнем достаточно высоком уровне, т.е. общее количество клеток в популяции, по-видимому, снизилось и это включило компенсаторную реакцию и, соответственно, пролиферативную активность (пролиферация повысилась в 2,5 раза). По данным Беляевой H.H. (2002), повышение пролиферации свидетельствует об увеличении токсического эффекта исследуемого вещества, приводящего к компенсаторным реакциям и необходимости восстановления клеточных популяций.

Рис. 1. Кариологические показатели тироцитов в зависимости от дозы акриламида. ЦГ -интегральный показатель цитогенетических нарушений; Пролиф,- интегральный показатель пролиферации. По горизонтали - доза акриламида. По вертикали - кратность превышения анализируемых показателей при действии акриламида над уровнем таковых в контроле. *- достоверные изменения по отношению к контролю.

На этом фоне снова отмечено повышение уровня цитогенетических повреждений приблизительно в 5 раз.

Таким образом, процессы деструкции ядра, которые, в основном, были представлены кариопикнозом, сопровождали цитогенетические нарушения в клетках ЩЖ, повышались с дозой и выходили на плато. С повышением дозы акриламида отмечено две волны пролиферативной активности. Наиболее выраженное цитогенетическое действие акриламида выявлено при действии мутагена в минимальной дозе и это, вероятно, связано, с неполным включением апоптоза.

Сопряженность наркологических показателей. В исследовании выявлена значимая корреляция доли клеток ЩЖ с микроядрами и с атипичной формой ядра; значимая корреляция между долями клеток с протрузиями и с ядром атипичной формы, как при групповом, так и при индивидуальном сравнении. Коэффициенты Пирсона и Спирмена при групповом сравнении составили 0,88 (Р<0,05) и 0,99 (Р<0,05) соответственно, а при индивидуальном сравнении коэффициент Пирсона составил 0,55 (Р<0,05), Спирмена 0,64 (Р<0,05). Как при групповом, так и при индивидуальном сравнении отмечена значимая корреляция между долей клеток с

о

9

0,5 мг/кг 2,5 мг/кг 12,4 мг/кг доза акриламида, мг/кг

межъядерными мостами и ядром атипичной формы (г=0,86; Р<0,05). Высокие корреляции цитогенетитческих показателей указывают на однонаправленное действие акриламида, индуцирующего все типы цитогенетических нарушений.

Показана взаимосвязь между долей клеток с микроядрами и митотическим индексом. Коэффициенты Пирсона и Спирмена при групповом сравнении составили 0,84 (Р<0,05) и 0,88 (Р<0,05); при индивидуальном сравнении коэффициент Пирсона составил 0,39 (Р<0,05). Доля клеток с ядром атипичной формы также коррелировала с митотическим индексом при индивидуальном сравнении (г=0,33; Р<0,05). Эти корреляции свидетельствуют о возможности выявления цитогенетических нарушений в клетках после деления

Зависимость «доза - эффект» выраженности морфологических изменений в ЩЖ экспериментальных животных при действии акриламида. Исследуемые показатели сравнивали с двумя контролями. Контролем 1 служила ЩЖ интактных животных, контролем 2 - доля ЩЖ, оставшаяся после ГТЭ.

Не определены достоверные изменения соотношения фолликулярной и интерфолликулярной ткани в группе крыс с трехкратным введением акриламида как в минимальной, так и в средней дозе при сравнении с ЩЖ обеих контрольных групп (контроль 1 и 2). Однако сравнение действия мутагена в максимальной дозе с обоими контролями выявило достоверное (Р<0,005) увеличение в 1,8 раз количества интерфолликулярной ткани и, соответственно, достоверное уменьшение доли фолликулярного эпителия (рис. 2 и 3).

В группе с трехкратным воздействием акриламида в минимальной дозе акриламида по сравнению с контролем 2, определены тенденции к уменьшению доли КЦЭ (рис. 4), увеличению доли ПЭ (рис. 4) и доли коллоида с резорбцией (рис. 5).

0,96

% 0.95

= 0,94

| 0,93

1 0.92

I 0,91 I- 0,9

Ш 0,89

Рис.2

■ фол ли™

111.

контр. 0.5 2,5 12,4

1-2 мг/кг мг/кг мг/кг доза акриламида

0,1

Л 0,09

X 0,08

н 0,07

га 0,06

о. 0,05

0,04

0,03

с с 0,02

о 0,01

-е-

о. 0

Рис. 3

И интерфол.

контр 0,5 2,5 12,4 .1-2 мг/кг мг/кг мг/кг

доза акриламида

Трехкратное воздействие различных доз акриламида на фолликулярную (рис. 2) и интерфолликулярную (рис. 3) ткань ЩЖ. По горизонтали- группы животных: контрольные (контр. 1-2) и с воздействием различных доз акриламида. По вертикали-доли анализируемых показателей. * Достоверные изменения по отношению к контролям 1 и 2.

По сравнению с контролем 1 в группе с трехкратным действием акриламида в средней и максимальной дозе в ЩЖ отмечено достоверное (Р<0,05) увеличение в 2,1 раза доли КЦЭ при достоверном уменьшении в 2,8 раз доли ПЭ (рис. 4).

Так как состояние коллоида в норме и с резорбцией в ЩЖ крыс двух контрольных групп достоверно не отличалось между собой, мы усреднили эти показатели. При действии акриламида в дозе 0,004 ЬО50 и 0,1 ЬЭ5о отмечено уменьшение, но недостоверное, состояния коллоида без резорбции и увеличение доли коллоида с резорбцией, а при воздействии мутагена в дозе 0,02 ЬО50 это соотношение уже является достоверным (Р<0,05): с уменьшением в 1,3 раза доли фолликулов с коллоидом без резорбциии и увеличением в 9,2 раза - с резорбцией (рис. 5).

впэ

В КЦЭ

доза акриламида

контр. 0,5 2,5 12,4 1-2 мг/кг мг/кг мг/кг доза акриламида

Рис. 4 .

Рис. 5.

Изменения формы эпителия фолликулов ЩЖ (рис. 4) и состояние коллоида (рис. 5.) при воздействии разных доз акриламида. По горизонтали - группы животных: контрольных (к. 1, к. 2 и контр. 1-2) и с воздействием различных доз акриламида. По вертикали - доли анализируемых показателей. * Достоверные изменения по отношению к контролям 1 и 2.

Таким образом, наибольшие морфологические изменения ЩЖ наблюдались

при действии акриламида в максимальной и средней дозе: 12,4 мг/кг (0,1 ЬВ50) и 2,48 мг/кг (0,02 ЬО50). Увеличение долей интерфолликулярной ткани и КЦЭ при воздействии акриламида характеризует активизацию морфогенетических процессов, связанных с усилением пролиферации и активизацией фолликулогенеза, что также отмечала О.В.Ермакова (2008) в эпителии ЩЖ полевок, обитающих на участках с повышенной радиоактивностью. Увеличение доли тироцитов с резорбцией коллоида свидетельствует о повышении секреторной активности ЩЖ.

Зависимость выраженности цитогенетического и цитотоксического действия акриламида на фолликулярные тироциты крыс при разных режимах введения. Для определения зависимости действия акриламида от кратности введения исследовали две группы экспериментальных животных по отношению к контрольной. Одной группе раствор акриламида вводили однократно внутрижелудочно в дозе 12,4 мг/кг (0,1 ЬО50) на вторые сутки после ГТЭ, другой -трехкратно, в той же дозе на 2, 4 и 6-е сутки после ГТЭ. Взятие органов для

исследования осуществляли на третьи сутки после последнего введения исследуемого вещества.

При однократном и трехкратном действии мутагена отмечена приблизительно одинаковая частота клеток с цитогенетическими нарушениями по сравнению с контролем (табл.3, рис.6).

Таблица 3.

Кариологические показатели тироцитов крыс при однократном и трехкратном

введении акриламида в дозе, соответствующей 0,1 ЬЭ 50

Показатели Доля клеток с исследуемыми показателями (х ср. ± ш), В%0

Контроль 1 введение 3 введения

Цитогенетические показатели

Доля клеток с микроядрами 0,17±0,17 0,86±0,26* 0,57±0,3

Доля клеток с протрузиями 0,66±0,33 3,86±0,91*** 3,85±1,53***

Доля клеток с межъядерными мостами 0,33±0,21 0,29±0,29 1,28±0,36*

Сумма клеток с цитогенетическими нарушениями 1,17±0,54 5,0±1,11*** 5,71±1,71 ***

Показатели пролиферации

Сумма клеток с двумя и более ядрами 13,17±3,24 8,0±1,29** 32,43±12,45***

Показатели деструкции ядра

Доля клеток с кариопикнозом 3,5±1,65 6,86±1,56*** 16,29±4,98***

Доля клеток с кариорексисом 0 0,14±0,14 0,29±0,18

Доля клеток с кариолизисом 0 0 0

Апоптический индекс клеток 3,5±1,65 7,0±1,63* 16,57±5,04* * *

Примечание. *-Р<0,05; ***-Р<0,001- значимые отличия от контрольной группы при сравнении данных по х2-

Однако доля клеток с межъядерными мостами при трехкратном введении увеличилась достоверно по отношению к контролю только при трехкратном введении.

Сумма клеток с двумя и более ядрами при однократном введении значимо снижалась, а при трехкратном введении была в 2,5 раза выше, чем в контроле. Апоптический индекс достоверно повышался в 2 раза при однократном и в 4,7 раза - при трехкратном введении акриламида.

—♦— Пролиф - -Апоптоз

контроль

Контроль 12,4мг/кгх1 12,4мг/кгхЗ кратность введения акриламида, мг/кг

Рис. 6. Сравнение кариологических показателей тироцитов крыс в зависимости от количества введений акриламида в дозе, соответствующей 0,1 ЬВ50. ЦГ- интегральный показатель цитогенетических нарушений; Пролиф,- интегральный показатель пролиферации. По горизонтали - кратность введения акриламида; по вертикали - доля клеток с анализируемыми показателями в %о. *- достоверные изменения по отношению к контролю.

Таким образом, при трехкратном введении акриламида в дозе 12,4 мг/кг (0,1 ЬО50) отмечено более выраженное повышение уровня цитогенетических показателей, показателей деструкции ядра и пролиферации.

Эффект выраженности морфологических изменений в ЩЖ крыс при действии акриламида в зависимости от кратности его введения. При

трехкратном введении акриламида, которое приводит к накоплению эффекта, доля интерфолликулярной ткани уже достоверно увеличивалась при соответствующем снижении доли фолликулярной ткани, что подтверждается увеличением доли КЦЭ при соответствующем снижении ПЭ (табл.4). Это изменение показателя является последствием ГТЭ, так как практически одинаковое увеличение доли КЦЭ в ЩЖ определено после ГТЭ как при однократном введении акриламида, так и без него в контроле, что не позволяет отнести отмеченные изменения к последствиям воздействия акриламида.

Однако, для другого изученного показателя - состояние коллоида - при однократном введении исследуемого вещества выявлена тенденция к уменьшению доли коллоида без резорбции и трехкратному увеличению доли коллоида с резорбцией. Увеличение кратности воздействия вызывает еще большее уменьшение доли коллоида без резорбции и пятикратное повышение доли коллоида с резорбцией, свидетельствующее об усилении функциональной активности ЩЖ.

Таблица 4.

Морфофункциональиые показатели ЩЖ крыс при однократном и трехкратном введении акриламида в дозе, соответствующей 0,1 ЬО50

Показатели Доля гистологических показателей ЩЖ в разных группах крыс, х cp.ini

к 1 | к 2 1 введение 3 введения

Фолликулярная ткань 0,95±0,01 0,94±0,01 0,91±0,01** к1, к 2

Интерфолликулярная ткань 0,05±0,01 0,06±0,01 0,09±0,01** к1,к2

Форма фолликулярного эпителия: - доля КЦЭ - доля ПЭ 0,38±0,12 0,62±0,12 0,72±0,08 0,28±0,08 0,62±0,07 0,38±0,07 0,76±0,06* к1 0,24±0,06*к1

Состояние коллоида: -без резорбции - с резорбцией 0,97±0,02 0,03±0,02 0,92±0,04 0,08±0,04 0,87±0,07 0,13±0,07

Примечание. *-Р<0,05; **- Р<0,01 - значимые отличия от контрольных групп, к. 1- ЩЖ интактных крыс; к. 2- оставшаяся доля ЩЖ после ГТЭ. В том случае, когда показатели в двух контрольных группах достоверно не отличались, они были объединены в общий контроль.

Увеличение пролиферативной активности ЩЖ, определяемой по повышению доли интерфолликулярной ткани при структурно-функциональном анализе, согласуется с увеличением интегрального показателя пролиферации клеток, выявленном при кариологическом анализе. Усиление пролиферативной активности, наблюдаемое при увеличении кратности воздействия, является важным прогностическим признаком неопластического роста. На этом фоне выявлено повышение функциональной активности ЩЖ по увеличению доли коллоида с резорбцией. Это подтверждается данными литературы о способности акриламида вызывать изменения гормонального фона и индуцировать новообразования в органах эндокринной системы и ЩЖ (Во\ууег .и., Ьа1епс1ге5зе Д.Я. й а1, 2008).

Временные параметры стимуляции пролиферации при проведении токсикологического эксперимента. ЩЖ, как и печень, относится к органам с медленно обновляющимися клеточными популяциями, поэтому для индикации генотоксического действия исследуемого мутагена необходимо проведение ГТЭ. Эксперимент по оценке мутагенного действия метилнитрозомочевины на ЩЖ был проведен Гансбургским М.А. (2005), при этом исследуемый мутаген вводили после ГТЭ. В то же время, описанные в литературе экспериментальные исследования на клетках печени предлагают иной алгоритм проведения подобных тестов с проведением стимуляции пролиферации (частичной гепатэктомии) после введения мутагена (Сычева Л.П., 2002). В нашей работе мы вводили мутаген до и после ГТЭ. Согласно полученным данным, максимальный уровень клеток с

цитогенетическими нарушениями, показателей пролиферации и апоптического индекса наблюдали при введении мутагена за 24 часа до ГТЭ (рис. 7).

Сумма цитогенетических нарушений в клетках ЩЖ достоверно увеличилась в 5,5 раз (Р<0,001) при введении акриламида до ГТЭ, составив 6,42%о, и в 4,3 раза (Р<0,001), составив 5,0%о при введении мутагена после операции, (рис. 7).

Доля клеток с ядрами атипичной формы достоверно (Р<0,001) увеличилась в условиях обеих схем введения акриламида, но в большей степени в 3,8 раза в группе с его введением после операции, составив 12,6%о, и в 2,5 раза (Р<0,001) в группе с введением акриламида до ГТЭ, составив 8,3%о (табл. 7).

Показатель пролиферации клеток ЩЖ в группе с введением акриламида до операции увеличился в 1,4 раза (Р<0,05) и составил 18,14%о, тогда как введение акриламида после операции снижало пролиферативную активность тироцитов в 1,6 раза (Р<0,005), составив 8,0%о при 13,17%о в контроле (рис. 7).

Апоптический индекс клеток при введении акриламида до ГТЭ составил 18,1%о (достоверное увеличение показателя в 5,2 раза), а в группе с введением вещества после операции - 7%о (достоверное увеличение показателя в 2 раза) (рис.

Рис. 7. Сравнение кариологических показателей тироцитов при действии акриламида в дозе 12,4 мг/кг в зависимости от срока проведения ГТЭ. ЦГ- интегральный показатель цитогенетических нарушений; Пролиф,- интегральный показатель пролиферации. По горизонтали - время введения акриламида (до или после ГТЭ). По вертикали- доля клеток с анализируемыми показателями при действии акриламида. *- достоверные изменения по отношению к контролю.

Таким образом, максимальный уровень цитогенетических нарушений, показателей пролиферации и деструкции ядра отмечен в тироцитах при введении акриламида за 24 часа до ГТЭ. В то же время, изменения других кариологических показателей (доли клеток с атипичной формой ядра, конденсацией хроматина, кариорексисом) были более выражены при введении акриламида через 48 часов после ГТЭ.

вцг

□ Пролиф.

□ Аполтоз

Контроль

До ГТЭ группы животных

После ГТЭ

Для изучения зависимости действия акриламида на морфо-функциональную структуру ЩЖ от времени проведения ГТЭ анализировали две группы тех же животных с однократным введением одинаковой дозы исследуемого вещества -12,4 мг/кг (0,1Ь050). Первой группе животных акриламид вводили через 48 часов после проведения ГТЭ, второй - за 24 часа до операции. Контролем служила ЩЖ также 2-х контрольных групп: ЩЖ у интактных крыс и доля ЩЖ, оставшаяся после ГТЭ.

Наиболее выраженные и достоверные изменения морфофункциональных показателей наблюдали в группе с введением акриламида за 24 часа до проведения ГТЭ. Отмечено увеличение в 1,9 раза (Р<0,05) доли интерфолликулярной ткани по сравнению с ЩЖ обеих контрольных групп (рис. 8).

к. 1 к. 2 до ГТЭ после ГТЭ

группы животных

Рис. 8. Зависимость действия акриламида в дозе 12,4 мг/кг на соотношение долей фолликулярной и интерфолликулярной ткани ЩЖ крыс от времени проведения ГТЭ. По горизонтали - исследуемые группы животных: к.1 и к. 2 и группы опытные группы с введением акриламида за 24 часа до и через 48 часов после проведения ГТЭ. По вертикали - доли фолликулярной и интерфолликуллярной ткани. * - достоверные изменения по отношению к к.1 и к. 2.

Введение акриламида после ГТЭ привело к увеличению доли КЦЭ в 2,5 раза

(Р<0,05) по сравнению с 1 контролем и в 1,3 раза по сравнению с контролем 2. В то же время доля ПЭ уменьшилась в 6,9 раз (Р<0,05) по сравнению с контролем 1 и в 3 раза по сравнению с контролем 2. Эти изменении в ЩЖ наиболее выражены при введении акриламида до ГТЭ, так как значение данного показателя в 4,2 раза превышено в ЩЖ крыс, которым акриламид вводили через 48 часов после ГТЭ (рис.9).

В обеих группах наблюдали тенденцию к уменьшению доли коллоида без резорбции и к увеличению доли коллоида с резорбцией. По сравнению с группой воздействия после ГТЭ, в группе с воздействием до ГТЭ доля коллоида без резорбции уменьшилась в 1,1 раза, а доля коллоида с резорбцией увеличилась в 2,1 раза.

к. 2 до ГТЭ

группы животных

после ГТЭ

I 2 до ПЭ после ГТЭ

группы животных

Рис.9. Рис.10.

Зависимость действия акриламида в дозе 12,4 мг/кг на соотношение долей КЦЭ и ПЭ (рис. 9) и состояния коллоида фолликулов ЩЖ без - и с резорбцией от времени проведения ГТЭ. По горизонтали - исследуемые группы животных: к.1 и к. 2 и опытные группы с введением акриламида за 24 часа до и через 48 часов после проведения ГТЭ. По вертикали - доли КЦЭ и ПЭ (рис. 9) и состояние коллоида фолликулов (рис. 10). *-достоверные изменения по отношению к к. 1 и к. 2.

Таким образом, наиболее выраженные изменения морфофункционального состояния ЩЖ крыс наблюдали при введении акриламида за 24 часа до ГТЭ, как и при исследовании кариологического статуса тироцитов крыс.

Представленная методика тестирования воздействия акриламида на ЩЖ сопоставима с проведением исследований по оценке влияния мутагенов на клетки печени, при которой исследуемый фактор индуцирует повреждение ДНК в интерфазиых клетках (Сычева Л.П., 2002). Эти повреждения сохраняются до начала митоза, но не выявляются микроскопически. Для стимуляции митозов проводят частичную гепатэктомию. В процессе митоза повреждения ДНК трансформируются в микроядра, протрузии, межъядерные мосты, которые выявляют под микроскопом в клетках, прошедших деление.

Таким образом, при проведении исследований по изучению воздействия на организм различных факторов окружающей среды в медленнообновляющихся популяциях, к которым относятся ЩЖ, печень и некоторые другие органы, данная постановка опытов может быть рекомендована как основная при оценке генотоксичности.

Сопряженность кариологических (цитогенетических, цитотоксических) и морфо-функциональных показателей при оценке действия акриламида. При

межгрупповом сравнении кариологических и морфо-функциональных показателей установлен высокий значимый (Р<0,05) уровень корреляции Спирмена. Так, доля интерфолликулярной ткани коррелировала с долей клеток с микроядрами (г=0,8), с суммой цитогенетических нарушений (г=0,87), с долей суммарного показателя

пролиферации (г=0,8), с долей A-клеток с кариопинозом (г=0,79) и с апоптическим индексом (г=0,8-0,84).

Морфологические изменения ЩЖ (уменьшение доли КЦЭ и увеличение коллоида в состоянии резорбции), наблюдали при действии акриламида в средней 2,48 мг/кг (0,02 LD50) и, в меньшей степени, максимальной дозе - 12,4 мг/кг (0,1LD5o). При анализе кариологических показателей при действии мутагена в средней дозе наблюдали подъем апоптического индекса, что может быть причиной отмеченных морфологических изменений.

При повышении кратности воздействия акриламида отмечено увеличение интерфолликулярной ткани, свидетельствующее об увеличении пролиферативных процессов, что отмечено и со стороны кариологических показателей: интегральный показатель пролиферации клеток ЩЖ максимально повышался при трехкратном воздействии акриламида. Также при трехкратном воздействии максимальной дозы акриламида наблюдали повышение функциональной активности ЩЖ, о чем свидетельствует увеличение доли коллоида с резорбцией.

Введение акриламида до проведения ГТЭ вызывало максимальные изменения не только генотоксических, цитотоксических, но и морфологических показателей. Выявленные сопряженные изменения показателей характеризуют однонаправленное дисрегулирующее действие акриламида на ткань ЩЖ.,

Критерии необходимости проведения кариологического анализа ЩЖ при гигиенических и токсикологических исследованиях, в том числе, при обосновании нормативов следующие:

1) наличие данных о токсичности исследуемого фактора для ЩЖ у млекопитающих и человека;

2) наличие данных о ДНК-повреждениях в клетках ЩЖ при действии исследуемого фактора в опытах in vivo и in vitro;

3) наличие данных о канцерогенном эффекте исследуемого фактора в ЩЖ;

4) наличие данных, полученных в эпидемиологических исследованиях о вредных эффектах исследуемого фактора на ЩЖ людей.

Краткосрочный тест для прогноза канцерогенного действия ФОС на клетки ЩЖ. Сопоставление данных наших экспериментов с данными литературы показали органную специфичность акриламида. Минимальная действующая доза в клетках костного мозга мышей составила 4 мг/кг, в сперматидах мышей - 10 мг/кг. В сперматидах крыс действующая доза составила 50 мг/кг, в клетках костного мозга крыс эффект не выявлен даже в дозе 100 мг/кг. В щитовидной железе крыс,

минимальная исследованная нами действующая доза составила 0,5 мг/кг, что указывает на наибольшую чувствительность этого органа к действию акриламида. По данным литературы доза 0,5 мг/кг индуцирует опухоли мошонки, а доза 2 мг/кг - опухоли щитовидной железы, поэтому предлагаемый метод можно рассматривать как краткосрочный тест для прогноза канцерогенного эффекта.

ВЫВОДЫ

1. Для гигиенических и токсикологических исследований разработаны метод, алгоритм и критерии оценки цитогенетического действия химических соединений на клетки ЩЖ экспериментальных животных in vivo. Метод заключается в проведении кариологического анализа, включает количественное определение частоты клеток с микроядрами, а также дополнительных показателей цитогенетического действия, пролиферации и деструкции ядра, что значительно расширяет объем получаемой информации, позволяя оценивать механизмы действия различных факторов. Ограничением данного метода служит необходимость проведения ГТЭ для стимуляции пролиферации тироцитов, поскольку они относятся к медленно обновляющимся клеточным популяциям.

2. Критериями обязательного проведения кариологического анализа на клетках ЩЖ являются: токсичность исследуемого фактора для ЩЖ у млекопитающих и человека; ДНК - повреждения в клетках ЩЖ в опытах in vivo и in vitro; канцерогенный эффект в ЩЖ; вредное действие на ЩЖ людей по данным эпидемиологических исследований.

3. Цитогенетическое действие акриламида на клетки ЩЖ крыс в эксперименте in vivo проявляется при действии всех исследованных доз, соответствующих 0,004LDso (0,496 мг/кг), 0,02 LD50 (2,48 мг/кг) и 0,1LD50 (12,4 мг/кг), не вызывающих эффекта в клетках костного мозга. Для установления максимальной недействующей дозы необходимо расширить диапазон исследуемых доз.

4. Установлено, что однократное и трехкратное воздействие акриламида в дозе 0,1LD so вызывает приблизительно одинаковый уровень цитогенетических нарушений в клетках ЩЖ. Пролиферативная активность ткани достоверно снижается в 1,7 раза при однократном действии акриламида и повышается в 2,5 раза по отношению к контролю при трехкратном введении. Апоптический индекс достоверно повышается с кратностью воздействия в 2 и 4,7 раза по отношению к контролю.

5. При действии акриламида на клетки ЩЖ проявилась сопряженность морфо-функциональных и кариологических показателей. Так, доля интерфолликулярной

ткани коррелировала с долей клеток с микроядрами (г=0,8), с суммой цитогенетических нарушений (г=0,87), с долей суммарного показателя пролиферации (г =0,8), с долей А-клеток с кариопинозом (г =0,79) и с апоптическим индексом (г=0,8-0,84). Изменения в ЩЖ при действии акриламида сопровождались повышением функциональной активности, оцениваемой по увеличению доли коллоида с резорбцией. Полученные данные позволяют предположить, что акриламид, вызывая цитогенетические нарушения и изменение пролиферации клеток ЩЖ, приводит к развитию новообразований в этом органе. 6. Установленная в наших исследованиях высокая тропность акриламида к ЩЖ крыс сопоставима с данными литературы. Минимальная из исследованных нами действующая доза составила 0,5 мг/кг, что в 8 раз ниже, чем МДЦмут для сперматид мышей; в 100 раз ниже МДЦ„ут для сперматид крыс, при отсутствии эффекта в костном мозге крыс даже при действии акриламида в дозе 100мг/кг. Доза акриламида, соответствующая 0,004LDso, сопоставима с минимальными дозами, индуцирующими опухоли у крыс: 0,5 мг/кг- опухоли мошонки, 2 мг/кг- опухоли ЩЖ. В связи с этим предлагаемый метод рекомендуется как краткосрочный тест для прогноза канцерогенного эффекта исследуемых факторов в ЩЖ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации В изданиях, рекомендованных ВАК

1. Беляева H.H., Сычева Л.П., Коваленко М.А., Шереметьева С.М., Алтаева A.A., Олесинов A.A., Александрова В.П., Пономарева О.Ю., Бяхова М.А., Юрченко В.В Необходимость использования морфофункционапьных и цитогенетических исследований при анализе воздействия на организм факторов окружающей среды. //Гигиена и санитария. 2007.-№5.- С. 63-65.

2. Алтаева А.А Влияние разных режимов введения акриламида на цитогенетические и структурно-функциональные показатели щитовидной железы крыс.//Токсикологический вестник 2010.-№ 5.-С. 46-49.

В журналах:

3. Беляева H.H., Сычева Л.П., Алтаева A.A. Микроядерный тест на клетках щитовидной железы как скрининговый метод в эколого-гигиенических исследованиях. //Вестник Военно-Медицинской Академии. Приложение 2, часть-1.-2008.-С.81-82.

4. Алтаева A.A., Беляева H.H., Сычева Л.П. Оценка эффекта мутагенов на клетках щитовидной железы на примере акриламида.// Медицинская генетика. Материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков. Ростов-на-Дону, 14-18 мая 2010,-С. 7-8.

В материалах международных и российских конгрессов, съезда, пленумов, конференций, симпозиума, научной сессии.

5. Beljaeva N.N., Sycheva L.P., Altaeva А.А Micronuclear test on thyroid cells as a method of screening in ecological and hygienic researches.// XX International Congress

of Genetics «Genetics- understanding living systems» Germany, Berlin, July 12 - 17, 2008.-P.23.

6. Алтаева A.A., Беляева H.H., Сычева Л.П. Влияние акриламида на щитовидную железу.// XI Всероссийский Конгресс диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье», сборник материалов, Москва, 30 ноября - 2 декабря, 2009.- С.2.

7. Алтаева A.A., Беляева H.H., Сычева Л.П. Микроядерный тест на клетках щитовидной железы как скрининговый метод в токсикологических исследованиях.// Тезисы докладов 3-его съезда токсикологов России под ред. Г.Г.Онищенко и Б.А.Курляндского) М, 2008.-С.38-39

8. Алтаева A.A., Сычева Л.П,, Беляева H.H. Кариологический анализ цитогенетического и цитотоксического действия акриламида на щитовидную железу крыс.// Материалы объединенного пленума научных совета Российской Федерации по экологии человека и гигиене окружающей среды и по медико-экологическим проблемам здоровья работающих «Научно-методические и законодательные основы обеспечения генетической безопасности факторов и объектов окружающей и производственной среды в целях сохранения здоровья человека», (под ред. акадмиков РАМН Ю.А.Рахманина и Н.Ф.Измерова. Москва. 15- 16 декабря, 2010.-С.30-32.

9. Беляева H.H., Сычева Л.П., Журков B.C., Алтаева A.A., Пономарева О.Ю. Сопряженность изменений морфофункциональных, цитогенетических и цитотоксических показателей при оценке воздействия на организм факторов окружающей среды.// Там же. - С.39-41.

10. Алтаева A.A., Беляева H.H., Сычева Л.П. Диагностика цитогенетических нарушений в клетках щитовидной железы микроядерным методом.// V Международная научная конференция Донозоология 2009 «Здоровый образ жизни как базис первичной профилактики болезней, оптимального здоровья, долголетия и высокой работоспособности людей в XXI веке», материалы. Санкт-Петербург, 1718 декабря, 2009,-С. 76-77.

11. Алтаева A.A., Сычева Л.П., Беляева H.H. Кариологический анализ действия акриламида на клетки щитовидной железы.// Материалы межвузовской научной конференции с международным участием: «Современные проблемы гигиены, общественного здоровья и здравоохранения», Москва, 8 декабря 2009.- С.99-101.

12. Алтаева А.А Разработка расширенного микроядерного теста на клетках щитовидной железы.// II Всероссийская научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» Рязань, 2007.-. С. 202-203.

13. Алтаева A.A. Цитогенетическое и цитотоксическое действие акриламида на клетки щитовидной железы крыс.// III Всероссийская научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье». Сборник материалов под редакцией академика РАМН Ю.А. Рахманина. 2009, №3, Р 27; ББК 614.87 (082).

14. Беляева H.H., Сычева Л.П., Алтаева A.A., Пономарева О.Ю., Бударина О.В Использование структурно-функциональных показателей при оценке воздействия на организм наночастиц (диоксид титана), канцерогенов (акриламид) и ингаляционных промышленных выбросов (кофейный комбинат).// VI Международный симпозиум «Медико-биологические проблемы безопасности населения». Греция, г. Салоники. 24 октября-3 ноября, 2010.- С.12-15.

15. Беляева H.H., Горелова Ж.Ю., Александрова В.П., Олесинов А.А, Пономарева О.Ю., Алтаева A.A. Структурно-функциональные клеточные показатели оценки состояния здоровья населения при действии факторов окружающей среды. //Материалы научной сессии «Экологические риски здоровью населения на Крайнем Севере». Надым, 25 апреля 2007г. Сибпресс, г. Тюмень, С. 21-24.

16. Сычева Л.П., Коваленко М.А., Бяхова М.М., Стацук Т.А., Алтаева А.А.Оценка цитогенетического статуса человека с использованием неинвазивного микроядерного метода. // Материалы научной сессии «Экологические риски здоровью населения на Крайнем Севере». Надым, 25 апреля 2007г. Сибпресс, г. Тюмень, С.127-130.

17. Сычева Л.П., Беляева H.H., Алтаева A.A. Методические рекомендации. Оценка цитогенетического и цитотоксического действия факторов окружающей среды на клетки щитовидной железы экспериментальных животных in vivo. М., 2011.- 22 с. Утверждены председателем научного совета Российской Федерации по экологии человека и гигиене окружающей среды академиком РАМН Ю.А. Рахманиным 03.02.2011г.

Алтаева A.A., Рахманин Ю.А., Сычева Л.П., Беляева H.H. Способ выявления цитогенетического и цитотоксического действия факторов окружающей среды в клетках щитовидной железы. Подана Евразийская заявка на изобретение № 201000068 от 18.11.2009 г.

Список сокращений:

ЩЖ- щитовидная железа

ФОС- фактор/факторы окружающей среды

ГТЭ- гемитиреоидэктомия

КЦЭ- кубический и цилиндрический эпителий

ПЭ- плоский эпителий

ВОЗ- Всемирная Организация Здравоохранения

ГН- Гигиенические Нормативы

ПДК- предельно-допустимая концентрация

ПДЦ- предельно-допустимая доза

МДДмут- минимальная действующая доза мутагена

ЗаизХ ¡4702/2011 Подписано в печать 21.02.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ: info@cfr.ru

Оценка безопасности факторов окружающей среды (ФОС) для человека включает в себя изучение генотоксического, цитотоксического и мутагенного действия этих факторов на различных биологических объектах. Мутагенные свойства ФОС изучают с использованием стандартной тест-системы, включающей в качестве обязательных, два теста: тест Эймса на Salmonella typhimurium для выявления генных мутаций и учет хромосомных аберраций или микроядер в клетках костного мозга мышей или крыс in vivo [43, 129]. В настоящее время рекомендуется оценка мутагенного эффекта в клетках других органах млекопитающих [28, 85]. Одним из таких методов исследования является разработанный в НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина полиорганный микроядерный тест, включающий цитогенетический анализ клеток органов желудочно-кишечного тракта, дыхания, выделения, сперматид [23, 28, 41, 42, 48, 49, 57, 61]. В настоящее время он дополнен большим набором показателей состояния ядра клетки и применяется в виде более информативного полиорганнош кариологического анализа [40, 47].

Щитовидная железа (ЩЖ) является одним из основных органов поддержания внутреннего гомеостаза организма и реагирует на любые изменения в организме, как эндогенного, так и экзогенного характера.

Ввиду интенсивного роста техногенной нагрузки неуклонно увеличивается частота заболеваний ЩЖ. Распространенность рака данного органа по данным ВОЗ увеличилась за последние 20 лет более чем в два раза [51]. По прогнозам ученых, при сложившейся неблагоприятной экологической ситуации рост числа заболеваний ЩЖ будет прогрессировать и далее за счет узловых форм зоба, рака ЩЖ, а также аутоиммунных заболеваний [45]. Показано, что загрязнение окружающей среды вызывает изменение цитологического статуса ЩЖ [5, 12, 94].

Огромное количество химических веществ, с которыми контактирует человек в промышленности, быту, и других факторов являются известными индукторами тиреоидной патологии, среди них: 4,4-метилендианилин, флуориды, 2,4- диаминоанизол, пропилтиоурацил, 4,4-тиодианилин, нитробензол, метимазол, диэтилтиомочевина, этилентиомочевина, метилнитрозомочевина и др. Одним из таких соединений является акрил амид, повсеместно распространенный в окружающей среде.

Акриламид используется для приготовления клеев, красок, тканей; в парфюмерно-косметической продукции; на полимерном производстве (стойматериалы, упаковка); в виде полимера - поли акр ил амида для осветления питьевой воды, для обработки муниципальных и промышленных отходов; как изолятор при строительстве дамб, туннелей и резервуаров для воды. Полиакриламидные гели применяют также в качестве имплантов в пластической хирургии [32, 34, 101].

В последние годы мировое сообщество обеспокоено обнаружением акрил амида в продуктах, подвергнутых высокотемпературной обработке -жареном картофеле (330 мкг/кг), картофельных (1343 мкг/кг) и кукурузных чипсах (167 мкг/кг) и др. Поступление акриламида с пшцей и водой, табачным дымом при обычном или пассивном курении значительно увеличивает его концентрацию в организме. Установлено, что в среднем человек потребляет 0,3-0,8 мкг/кг акриламида в день, а по данным ВОЗ ПДД поступления акриламида в организм человека вместе с продуктами питания -1 мкг/день.

Согласно руководству Европейской Комиссии (1988), акриламид относится: к группе 2А канцерогенов (МАИР) - «вероятно, вызывает рак у людей», ко 2-й группе мутагенов - «может вызывать генетические повреждения» и к 3-ему классу по токсичности - «возможен риск бесплодия».

ПДК акр и л амид а в воде водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования (ГН 2.1.5.1315-03) - 0,0001мг/л, лимитирующий признак вредности установлен по санитарно-токсикологическому показателю. Но по данным ВОЗ содержание акриламида в питьевой воде не должно превышать 0,0005 мг/л.

Известны мутагенные свойства акриламида, определенные при оценке клеток костного мозга. Мутагенный эффект в костном мозге мышей в виде появления микроядер, хромосомных аберраций и ДНК повреждений выявлен только в дозах 4 мг/кг и выше. В костном мозге крыс цитогенетические эффекты не выявлены при действии акриламида в дозе 100 мг/кг [112, 132]. В результате проведения комплексных Международных исследований по оценке эффектов акриламида, показана его тропность к ЩЖ - индукция опухолей в этом органе при действии дозы 2 мг/кг/сут [106]. Зависимость «доза-время-эффект» при действии акриламида на ЩЖ почти не изучена, хотя в настоящее время данным исследованиям придается огромное значение [38, 44].

Исследования ЩЖ, проводимые в настоящее время в профилактической медицине для определения негативного влияния того или иного фактора окружающей среды (ФОС), не всегда дают объективную оценку. Изучение канцерогеннбго действия является длительным и дорогостоящим, и ЩЖ часто не включена в перечень исследуемых органов при тестировании канцерогенов [104].

Обобщающие руководства по морфологической диагностике разных состояний ЩЖ, отражающие современные подходы, в отечественной литературе немногочисленны [7, 52]. Исследования по изучению цитотоксического и генотоксического действия факторов окружающей среды на клетки ЩЖ единичны [6, 12, 19, 24, 25, 35, 77, 94, 114, 119-122]. Поэтому важной проблемой в эколого-гигиенических и токсикологических исследованиях является разработка адекватных, простых в исполнении, 7 экономически доступных и отвечающих современным диагностическим стандартам тест-систем для оценки генотоксического действия ФОС на клетки ЩЖ.

Методы оценки мутагенного эффекта различных факторов на клетках ЩЖ в эксперименте почти не разработаны. Решению этой задачи посвящены исследования, проводимые в Ярославском медицинском институте под руководством профессора A.B. Павлова. Но для постановки микроядерного теста на клетках ЩЖ авторы применяют дорогостоящий ферментный метод диссоциации клеток с исследованием ограниченного количества показателей [12, 24].

Мутагенное действие акр и л амида на клетки ЩЖ in vivo практически не изучено. Таким образом, хорошая общая изученность вещества, его тропность к ЩЖ, индукция опухолей в этом органе, выявленная мутагенность для других органов стали основанием для выбора акриламида в качестве модельного мутагена в нашем исследовании. Поэтому целью данного исследования явилась разработка метода оценки опасности химических веществ по цитогенетическим и цитотоксическим показателям действия на клетки ЩЖ и апробация его на примере акриламида.

Для достижения цели исследования сформулированы следующие задачи:

1. Разработать метод кариологического анализа клеток ЩЖ (расширенный микроядерный метод) в эксперименте in vivo для оценки цитогенетического и цитотоксического действия химических соединений.

2. Оценить цитогенетическое и цитотоксическое действие акриламида на клетки ЩЖ в опытах in vivo.

3. Изучить закономерности цитогенетического и цитотоксического действия акриламида на клетки ЩЖ «доза- эффект» и «время- эффект», а также от времени введения акриламида при гемитиреоидэктомии (ГТЭ).

4. Определить сопряженность наркологических и морфо-функциональных показателей состояния эпителия ЩЖ при действии акр ил амид а и возможность использования этих показателей при тестировании химических веществ, в том числе генотоксикантов и канцерогенов.

Научная новизна. Впервые:

1) разработан метод кариологического анализа клеток ЩЖ в эксперименте in vivo для оценки цитогенетического и цитотоксического действия химических соединений, отвечающий диагностическим стандартам и экономическим критериям;

2) на препаратах, полученных данным методом, проведена морфологическая классификация типов клеток ЩЖ крыс по форме и структуре клеточных компонентов;

3) установлены зависимости «доза- эффект» и «время- эффект» при действии акр ил амида на клетки ЩЖ во всем исследованном диапазоне доз. Определены цитогенетический и цитотоксический эффекты акриламида на клетки ЩЖ в эксперименте in vivo в дозах 0,004; 0,02 и 0,1LD50;

4) дано теоретическое обоснование полученной зависимости «доза-эффект», заключающееся в снижении цитогенетического эффекта при действии акриламида в средней дозе, соответствующей 0,02LDso, за счет его влияния на клеточную кинетику (изменения пролиферативной активности и апоптоза);

5) преимущество комплексного подхода к оценке действия акриламида на ЩЖ подтверждено выявленной сопряженностью цитогенетических, цитотоксических и морфо - функциональных показателей.

Практическая значимость. Разработанный метод подан как Евразийская заявка на изобретение № 201000068 от 18.11.2009 г. «Способ выявления цитогенетического и цитотоксического действия факторов окружающей среды в клетках щитовидной железы».

По материалам диссертационной работы подготовлены методические рекомендации «Оценка цитогенетического и цитотоксического действия факторов окружающей среды на клетки щитовидной железы экспериментальных животных in vivo», рекомендованные для учреждений, занимающихся гигиеническими и токсикологическими исследованиями. Утверждены председателем научного совета Российской Федерации по экологии человека и гигиене окружающей среды академиком РАМН Ю.А. Рахманиным 03.02.2011г.

Результаты диссертационной работы внедрены в практикум для студентов, проводимого Учебно-научным центром Учреждения Российской академии наук Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН и кафедры генетики Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова (акт о внедрении № 12504-01-2115/66 от 31.01.2011г.), а также используются в учебном процессе на лекциях и семинарских занятиях Чеченского государственного университета (акт о внедрении № 1424-06-19 за 10.12.2010г.).

Работа выполнена в лабораториях цитогистологии и генетического мониторинга и НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина в рамках двух плановых тем НИР 080 и 090.

Апробация работы. Материалы диссертации апробированы на заседании Межотдельческой комиссии по апробации докторских и кандидатских диссертаций ФГБУ «НИИ ЭЧ и ГОС им. А.Н.Сысина» Минздравсоцразвития России 23 ноября 2010г.; представлены: на 2-й и 3-й Всероссийских научно-практических конференциях молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Рязань, 2007, Москва 2009); Научной сессии «Экологические риски здоровью населения на Крайнем Севере» (Надым, 2007); Международном экологическом форуме «Экофорум- 2008» (Санкт-Петербург, 2008); XX Международном Конгрессе Генетиков «Genetics- understanding living systems» (Берлин, Германия, 2008); Ш Съезде Токсикологов (Москва, 2008); V ю

Международной конференции «Донозоология-2009» (Москва, 2009); X Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье» (Москва, 2009); Межвузовской научной конференции с международным участием «Современные проблемы гигиены, общественного здоровья и здравоохранения» (Москва, 8 декабря 2009); VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 1418 мая 2010); VI Международном симпозиуме «Медико-биологические проблемы безопасности населения» (Греция, 2010); Пленуме Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды и Научного совета по медико-экологическим проблемам здоровья работающих «Научно-методические и законодательные основы обеспечения генетической безопасности факторов и объектов окружающей и производственной среды в целях сохранения здоровья человека» (Москва, 15 - 16 декабря, 2010).

Публикации по теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, из них 2 - в журналах, рекомендуемых

ВАК.

Личный вклад автора в работу составил 80%.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Текст изложен на 155 страницах машинописи, иллюстрирован 30 таблицами, 39 рисунками. Указатель литературы содержит 155 источников, из них 62 отечественных и 93 иностранных авторов.

выводы

1. Для гигиенических и токсикологических исследований разработаны метод, алгоритм и критерии оценки цитогенетического действия химических соединений на клетки ЩЖ экспериментальных животных in vivo. Метод заключается в проведении кариологического анализа, включает количественное определение частоты клеток с микроядрами, а также дополнительных показателей цитогенетического действия, пролиферации и деструкции ядра, что значительно расширяет объем получаемой информации, позволяя оценивать механизмы действия различных факторов. Ограничением данного метода служит необходимость проведения ГТЭ для стимуляции пролиферации тироцитов, поскольку они относятся к медленно обновляющимся клеточным популяциям.

2. Критериями обязательного проведения кариологического анализа на клетках ЩЖ являются: токсичность исследуемого фактора для ЩЖ у млекопитающих и человека; ДНК - повреждения в клетках ЩЖ в опытах in vivo и in vitro; канцерогенный эффект в ЩЖ; вредное действие на ЩЖ людей по данным эпидемиологических исследований.

3. Цитогенетическое действие акр ил амида на клетки ЩЖ крыс в эксперименте in vivo проявляется при действии всех исследованных доз, соответствующих 0,004LD50 (0,496 мг/кг), 0,02LD5o (2,48 мг/кг) и 0,1LD50 (12,4 мг/кг), не вызывающих эффекта в клетках костного мозга. Для установления максимальной недействующей дозы необходимо расширить диапазон исследуемых доз.

4. Установлено, что однократное и трехкратное воздействие акриламида в дозе 0,1LD5o вызывает приблизительно одинаковый уровень цитогенетических нарушений в клетках ЩЖ. Пролиферативная активность ткани достоверно снижается в 1,7 раза при однократном действии акриламида и повышается в 2,5 раза по отношению к контролю при трехкратном введении. Апоптический индекс достоверно повышается с кратностью воздействия в 2 и 4,7 раза по отношению к контролю.

5. При действии акр ил амид а на клетки ЩЖ проявилась сопряженность морфо-функциональных и кариологических показателей. Так, доля интерфолликулярной ткани коррелировала с долей клеток с микроядрами (1-0,8), с суммой цитогенетических нарушений (г=0,87), с долей суммарного показателя пролиферации (г =0,8), с долей А-клеток с кариопинозом (г =0,79) и с апоптическим индексом (г=0,8-0,84). Изменения в ЩЖ при действии акриламида сопровождались повышением функциональной активности, оцениваемой по увеличению доли коллоида с резорбцией. Полученные данные позволяют предположить, что акриламид, вызывая цитогенетические нарушения и изменение пролиферации клеток ЩЖ, приводит к развитию новообразований в этом органе.

6. Установленная в наших исследованиях высокая тропность акриламида к ЩЖ крыс сопоставима с данными литературы. Минимальная из исследованных нами действующая доза составила 0,5 мг/кг, что в 8 раз ниже, чем МДДмуг для сперматид мышей; в 100 раз ниже МДДмуг для сперматид крыс, при отсутствии эффекта в костном мозге крыс даже при действии акриламида в дозе 100мг/кг. Доза акриламида, соответствующая 0,004Ь050, сопоставима с минимальными дозами, индуцирующими опухоли у крыс: 0,5 мг/кг- опухоли мошонки, 2 мг/кг- опухоли ЩЖ. В связи с этим предлагаемый метод рекомендуется как краткосрочный тест для прогноза канцерогенного эффекта исследуемых факторов в ЩЖ.