Автореферат и диссертация по медицине (14.00.07) на тему:Обоснование использования метода учета микроядер в эпителиальных клетках желудочно-кишечного тракта млекопитающих для прогнозирования канцерогенной активности химических загрязнений окружающей среды

П — '.V

к й , I ^ ^

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА И ГИГИЕНЫ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ им. А. Е СЬЮИНА

На правах рукописи УДК 614.7:614.7:616-006.6

САЛАМАТОВА Ольга Григорьевна

"Обоснование использования метода учета микроядер в эпителиальных клетках желудочно-кишечного тракта млекопитающих для прогнозирования канцерогенной активности химических загрязнений окр/тающей среды".

14. 00. 07 - гигиена

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1993г.

Работа выполнена в научно-исследовательском институте экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сысина

доктор медицинских наук К С. КУРКОВ

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук 3. И. ЖОЛДАКОВА

доктор медицинских наук А. Д. ДУРНЕВ

Ведущее учреждение - научно-исследовательский институт профилактической токсикологии и дезинфекции ГКСЭН РФ.

в ".'М" часов на заседании Специализированного Совета (Д. 001. 09. 01) при НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сысина РАМН (119833, Москва, ул. Погодинская, 10).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сысина РАЖ

Автореферат разослан "Ж". ____1992 г.

РАМЕ

Научный руководитель:

Защита диссертации состоится

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор медицинских наук

К С. Курков

p Or-M^C^q с—;------

fi't- ••

ОСУ};:.-. ■ , ■ . . у.

JJ 'j

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ Разработка и внедрение надежных краткосрочных тестов для нормирования или выявления специфических эффектов химических веществ является одним из важных направлений гигиенической науки (Г. И.Сидоренко, 1985). Это особенно актуально для изучения отдаленных эффектов. В настоящее время разработана и внедрена в практику система оценки канцерогеннос-ти химических загрязнителей при их гигиеническом регламентировании. Однако объем, длительность и стоимость опытов на млекопитающих значительны, поэтому интенсивно ведутся разработки по предсказанию канцерогенного эффекта с применением краткосрочных тестов оценки генотоксичности (WHO, 1985; Г. А.Белицкий, В.В.Ху-долей, 1986). Ввиду низкой информативности генотоксических тестов in vitro представляется перспективным развитие краткосрочных тестов выявления канцерогенов в опытах на млекопитающих. Такие исследования позволяют учитывать не только пути введения и особенности токсикокинетики, но и видовую, половую и органную специфичность действия соединений.

Внедрение в практику этих методов позволит увеличить прогностическую ценность результатов для выявления канцерогенов, установить возможную органную специфичность канцерогенной активности веществ непосредственно на тех видах млекопитающих, которые используются в классических исследованиях.

Из онтогенетических тестов наиболее перспективен учет клеток с микроядрами в разных тканях млекопитающих. Разработанные в лаборатории отдаленных эффектов НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н Сысина РАМН: модификации методов учета микроядер в клетках костного мозга (Методические рекомендации, 1984), эпителиоцитах желудка и толстой кишки (Выскубенко И. Ф. и Шеренешева а И. , 1990), а также испытания трех модельных канцерогенов, показали перспективность метода для выявления ор-ганоспецифичности действия химических канцерогенов. На данном этапе возникла необходимость дальнейшего изучения возможности микроядерного теста в исследованиях с различными канцерогенами при пероральном пути поступления.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ - обоснование использования метода учета микро-

ядер в эпителиоцитах желудочно-кишечного тракта (ЖШ млекопитающих для прогнозирования канцерогенной активности химических загрязнителей окружающей среды и оценка связи органоспецифич-ности онтогенетического и канцерогенного действия химических веществ.

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Усовершенствование метода оценки микроядер в клетках разных отделов ЖКТ млекопитающих и характеристика спонтаного уровня микроядер.

2. Анализ органной специфичности цитогенетического действия известных канцерогенов и веществ с неизвестной канцерогенной активностью в опытах на мышах и крысах.

3. Изучение количественных зависимостей "доза канцерогена --эффект", индукции канцерогеном микроядер в эпителиальных клетках тех органов, в которых отмечается цитогенетический эффект воздействующего соединения.

4. Сравнение видовой, половой и органной специфичности, мутагенного и канцерогенного действия химических соединений.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Разработана модификация методики приготовления препаратов эпителиальных клеток разных отделов ЖКТ млекопитающих для анализа микроядер, позволяющая внедрить ее в токсикологическую практику.

Даны характеристики спонтанного уровня клеток с микроядрами в разных отделах ЮТ крыс и мышей.

Выявлено совпадение органоспецифичности канцерогенного и цитогенетического эффектов химических веществ в органах ЖКТ млекопитающих.

Показана линейная зависимость частоты клеток с микроядрами от дозы канцерогена и обоснована возможность использования микроядерного теста для оценки видовой, половой и органной чувствительности к эффекту мутагенов.

В опытах на клетках различных отделов ЖКТ мышей и крыс выявлено качественное и количественное различие цитогенетического эффекта галопропанов в зависимости от химического строения.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

На основании полученных данных, показана возможность приме-

нения микроядерного геста на клетках разных отделов ЖКТ млекопитающих для качественной и количественной характеристики орга-носпецифичности онтогенетического действия химических веществ, оценки видовой и половой специфичности.

Совпадение органоспецифичности канцерогенного и цитогенети-ческого действия веществ позволяет рекомендовать'включить метод оценки частоты клеток с микроядрами в разных отделах ЖКТ в систему краткосрочных тестов выявления канцерогенов. Результаты цитогенетического анализа можно использовать при регламентировании веществ в воде водоемов.

Результаты исследований, проведенных с применением микроядерного теста, учтены при обосновании ОДУ Реалона и цинкового комплекса ИОМС-1 в воде водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования (утверждены МЗ СССР 21 октября 1991 г. N 6025-91).

На защиту выносятся следующие положения:

1. Гигиеническое обоснование учета ьшкроядер в клетках ЖКТ млекопитающих для прогнозирования канцерогенной активности химических соединений.

2. Характеристика показателей нормы микроядерного теста в разных тканях ЖКТ мышей и крыс.

3. Установление количественных закономерностей цитогенетического эффекта и сравнение (качественное и количественное) органоспецифичности мутагенного и канцерогенного эффекта

4. Гигиеническая оценка мутагенной активности веществ (Реалона и цинкового комплекса ИОМС-1) и использование полученных данных при их регламентировании в воде водных объектов.

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых и специалистов Института (Москва, 1990, 1991), Всесоюзном координационном совещании "Генетические последствия загрязнения окружающей среды мутагенными факторами" (Самарканд, 1990), XXI ежегодной конференции Европейского общества по мутагенам окружающей среды (Прага. 1991), межотделенческой комиссии НИИ экологии человека и гигиены окружающей' среды им. А. Н. Сысина РАМН по апробации кандидатских диссертаций (октябрь 1992 г.).

. ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 119 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы, двух глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 21 таблицей и 6 рисунками. Библиография включает 33 отечественных и 93 иностранных источника

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выбор изученных веществ определялся задачами работы. В I группу включены 3 соединения с установленной канцерогенной активностью в опытах на млекопитающих при пероральном поступлении: 1,2-диметилгидразин (ДМГ) индуцировал опухоли в толстой кишке; 1,2-дибром-З-хлорпропан (ДБХП) - в пищеводе и преджелудке; N-нитрозодиэтиламин (НДЭА) - в печени и других органах, но не в ЖКТ (Канцерогенные вещества, 1987). II группа включала вещества. у которых не изучена^канцерогенная активность, но они перспективны в отношении использования в практике: 1,2-дибромпропан (ДБП); 1.1,3-трибромпропан (ТБП); Реалон и цинковый комплекс ИОМС-1.

Эксперименты проведены на самцах мышей CBAB16F1 массой 2025 г. (питомник "Столбовая"), самцах и сачках белых неинбредных крыс массой 250-300 г.(питомник "Крюково"). В каждой экспериментальной группе было по 6 животных.

Для анализа онтогенетического эффекта использован учет микроядер в клетках костного мозга и разных отделов ЖКТ млекопитающих (микроядерный тест).

Препараты клеток костного мозга мышей,готовили по стандартной методике. При приготовлении препаратов костного мозга крыс, для избежания появления базофильных гранул, была введена новая модификация метода, включающая пропускание суспензии костномозговых клеток через колонку с силикохромом 11 и отечественной волокнистой целлюлозой. У каждого животного анализировали число полихроматофильных эритроцитов (ПХЭ) с микроядрами на 1000 ПХЭ.

В экспериментах на мышах и крысах проанализирована частота эпителиальных клеток с микроядрами в преджелудке. желудке.

12-перстной, тонкой и толстой кишках. Для приготовления препаратов модифицирована методика, предложенная к. б. н. И. Ф. Виску-бенко и д. м. н. ЕИ. Шеренешевой (1988) для преджелудка, желудка и толстой кишки мышей. Модификации включали: замену сыворотки крови человека группы AB (IV) на сыворотку пуповинной крови человека; использование для промывания органов вместо сыворотки крови - 5% раствора сахарозы; использование микропробирок. Предложенная модификация позволила существенно снизить стоимость метода без снижения качества препаратов.

Микроядра анализировали в эпителиальных клетках с хорошо сохраненной цитоплазмой. Критерии учета микроядер: они должны лежать в плоскости клетки, быть четко отделены от ядра; иметь такую же окраску как ядро или более интенсивную; иметь круглую или овальную форму; диаметр микроядра не должен превышать 1/2 диаметра ядра

В препаратах анализировали по 1000 клеток, подсчитывая долю клеток с микроядрами на 1000 и количество микроядер в клетке.

Во всех опытах, кроме эксперимента с ДМГ, в клетках с мкк-роядром с помощью окуляр-микрометра измеряли большой (L) и малый (В) диаметр ядра и микроядра Вычисляли объем ядра и микроядра по формулам, предложенным К. Ташкэ (1980) и определяли отношение объема микроядра (Умя) к объему ядра (Уя) в процентах.

Во всех экспериментах вещество вводили внутрижелудочно 4-х-кратно с интервалом 24 часа между введениям. Длительность воздействия определялась процессом обновления клеточной популяции в разных отделах ЖКТ. Вещества вводили в дозах, в основном, соответствующих 0,2; 0,04 и 0,008 ЛД 50. Приготовление препаратов проводили через 24 часа после последнего введения вещества

При статистической обработке использовали методы парных сравнений, корреляционный, регрессионный и дисперсионный анализы (Закс. 1976).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ.

Частота клеток с микроядрами в органах ЖКТ интактных крыс и мышей.

Знание спонтанного уровня частоты клеток с микроядрами в разных органах млекопитающих и факторов, влияющих на него, сос-

тавляет основу планирования экспериментов, оценки его результатов и. т. д. Были обобщены данные по контрольным животным собственных и лабораторных экспериментов на крысах и мышах.

В 4 опытах обследовано 18,самцов (для преджелудка - 24 самца) и 6 самок белых нелинейных крыс. Среднее число клеток с микроядрами на 1000 в опытах варьировало в различных.органах от 0,33 до 1,50. Дисперсионный анализ не выявил влияния органа, пола животных и опыта на величину показателя. Средняя доля клеток с микроядрами на 1000 у крыс составила- в предхелудке 0,90+ +0,18; желудке - 1,08+0,20; 12-перстной кишке - 0,71+0.18; тонкой кишке - 0.92+0.25 и толстой кишке - 1,13+0,23.

Материалы по мышам включают данные собственного эксперимента на самцах СВАВ16Р1 и данные опытов, выполненных в лаборатории на самцах и самках мышей СВАВ16Р1. самцах СБА и БНК. Как и у крыс, так и у мышей среднее число клеток с микроядрами на 1000 по опытам варьировало от 0.33 до 1,33 и не зависело от линии и пола животных. Средняя частота клеток с микроядрами составила в преджелудке - 0,63+0,12 (28 мышей); желудке -

- 0,79+0,11 (28); 12-перстной кишке - 1,33+0,42 ( 6); тонкой кишке. - 1,00+0,26 ( 6); толстой кишке - 0,95+0,16 (28).

Анализ органоспецифичности индукций микроядер в клетках различных органов ЖКТ и костного мозга млекопитающих при действии химических соединений.

ДМГ. Самцам и. самкам крыс вводили зондом внутрижелудочно ДМГ в дозах 33,2; 16,6 и 3,32 иг/кг. что соответствовало 0,2; О, 1 и 0,02 ЛД 50 для крыс. Частота ПХЭ с микроядрами в костном мозге и эпителиальных клеток с микроядрами в преджелудке, желудке, 12-перстной и тонкой кишке при всех испытанных дозах не отличалась от уровня в контрольной группе.

В то же время, в толстой кишке отмечен значимый цитогенети-ческий эффект (Таблица 1). Минимально-действующая доза веществ составила 3,32 мг/кг (0,02 ЛД 50) у самок и 16,6 мг/кг (0.1 ЛД 50) - у самцов крыс. Доля клеток с микроядрами возрастала с увеличением дозы, а зависимость "доза-эффект" описывалась линейными уравнениями: у - 1,60 + (0,08 + 0,02) х для самцов и у

- 2,91 + (0,12 + 0,04) х - для самок крыс, где х - доза ДМГ (мг

/кг). у - доля клеток с микроядрами на 1000. Дисперсионный ана-

Таблица 1.

Доля клеток с микроядрами в толстой кишке самцов и самок крыс после внутрижелудочного введения ДМГ.

I-г

1 ДОЗА, | Клеток с микроядрами на 1000 + ш|

Самцы 1 Самки |

I Контроль| 1.50 + 0.34 1.17 + 0.65 1

I 3.32 | 1. 67 + 0. 33 4. 50 + 0. 76 * |

| 16.60 | 3. 50 + 0. 88 * 6.17 + 1.30 * |

| 33.20 | 4. 00 + 0. 58 * 6.00 + 0.97 * |

I_I_I_I

* Различие с контролем Р < 0.01. лиз всего объема данных выявил значимое влияние на долю клеток с микроядрами в толстой кишке крыс как дозы ДМГ (Р < 0,01), так и пола животных (Р < 0,01).

При сравнении результатов опыта на крысах с ранее полученными в лаборатории СИ. Ф. йюкубенко и соавт., 1990) данными на мышах можно сделать следующее заключение о цитогенетической активности ДМГ. Во-первых, на мышах и на крысах подтверждена индукция цитогенетических нарушений в эпителиальных клетках толстой кишки. Эффект возрастал с дозой канцерогена и минимальная эквитоксическая доза 0,02 ЛД 50 вызывала значимый эффект. Во-вторых, выявлено отсутствие цитогенетического эффекта в более высоких отделах ЖКТ. В-третьих, в стандартном опыте на ПХЭ костного мозга не обнаружено значимого эффекта. В-четвертых, отмечена существенно более высокая чувствительность самок в опытах на крысах и отсутствие половых различий в опытах на мышах.

НДЭА. В опыте на самцах белых нелинейных крыс НДЭА вводил^ внутрикелудочно в дозах 60; 12 и 2,4 мг/кг, что соответствовало

0,2; 0,04 и 0,008 ЛД 50 для крыс. При всех исследуемых дозах частота ПХЭ с микроядрами в костном мозге и эпителиальных клеток с микроядрами в разных отделах ЖКТ не отличалась от контроля. Дисперсионный анализ не выявил влияния дозы НДЭА и органа ЖКТ на среднюю долю клеток с микроядрами. Соотношение объема микроядра к объему ядра в клетках с микроядрами во всех органах при действии НДЭА не отличалось от таковых в объединенной группе контрольных животных. Таким образом, в подостром эксперименте на крысах НДЭА при внутрижелудочном введении не повышал частоту клеток с микроядрами как в костном мозге, так и в эпителии разных отделов ЖКТ.

Галопроизводные пропана

Учитывая органоспецифичность канцерогенного эффекта ДБХП при пероральном поступлении (преджелудок) и. отсутствие данных по испытанию канцерогенного действия ДБП и ТБП, была изучена органоспецифичность цитогенетического эффекта этих соединений в опытах на мышах и крысах.

Самцам мышей CBAB16F1 вводили внутрижелудочно растворы га-лопропанов в подсолнечном масле в следующих дозах: ДБП - 338; 67,6 и 13,5 мг/кг (0.5; 0.1 И 0,02 ЛД 50); ТБП - 100; 50 И 10 мг/кг и ДБХП - 51,4; 25,7 и 5,14 мг/кг (0,2; 0,1 и 0.02 ЛД 50). Все изученные вещества не влияли на частоту клеток с микроядрами в костном мозге, жэлудке, 12-перстной и тонкой кишке. Данные по частоте клеток с микроядрами в преджелудке и толстой кишке представлены в Таблице 2. ТБП был не эффективен в этих органах. ДБП не индуцировал микроядер в клетках толстой кишки, а в преджелудке только в максимальной дозе вызывал значимое повышение частоты клеток с микроядрами над контролем. Однако, корреляция доли клеток с микроядрами в преджелудке мышей.с дозой ДБП была не значима ДБХП в максимальной дозе (0.2 ЛД 50) показал значимый цитогенетический эффект и в преджелудке, и в толстой кишке. Корреляция доли клеток с микроядрами в преджелудке с дозой ДБХП была не значима (г - 0,32; df - 22; Р > 0.1). В толстой кишке корреляция была не высокой, но статистически значимой (г -0,42; df - 22; Р < 0,05), а зависимость доли клеток с микроядрами от дозы мутагена описывалась линейным уравнением, парамет-

Таблица 2.

Доля клеток с микроядрами в преджелудке и толстой кишке самцов мышей и крыс при пероральном введении галопропанов.

Вид животного Вещество Доза, мг/кг Клеток с микроядрами на 1000 1 т

Преджелудок Толстая кишка

.Мыши Контроль 1. 00 ♦ 0. 25 1. 42 ♦ 0. 20

ДБП 13. 5 2. 08 1 0. 66 1. 84 ♦ 0. 60

67. б 2. 33 ♦ 0. 75 2. 17 ! 0. 65

зза. 0 2. 92 1 0. 70* 1. 84 1 0. 60

ТЕП 10. 0 1. 75 ♦ 0. 48 1.17 ! 0. 40

50. 0 2. 17 ♦ 0. 49 2. 34 1 0. 61

100. 0 2. 33 ♦ 0. 60 2. 50 ! 0. 76

ДБХП 5. 14 2. 33 ♦ 0. 87 1. 84 ! 0. 54

25. 7 2. 90 1 1. 17 1. 84 1 0. 48

51. 4 3. 00 1 0. 89* 3. 00 ♦ 0. 73*

Крысы Контроль 1.33 1 0. 42 1.17 1 0. 48

ДБП 21. 4 1. 67 ♦ 0. 33 1.83 1 0. 31

107. 0 3. 83 1 0. 60** 3. 83 ♦ 0. 70* *

214. 0 м м 4. 67 1 0. 88 щ к 4. 33 1 0. 56

ТБП 20. 0 1. 33 ♦ 0. 42 2. 17 1 0. 48

100. 0 2. 67 4 0. 67 3. 87 * 0. 80*

200. 0 1. 8 3 1 0. 48 к к 4. 67 1 0. 42

ДБХП 6. 0 1. 83 1 0. 31 3. 17 ♦ 0. 60*

30. 0 II К 2. 67 1 0. 42 к м 5. 50 1 0. 89

60. 0 N К 5. 00 ♦ 0. 86 5. 33 1 0. 71**

Различие с контролем: « Р < О. 05;. «к Р <0.01

- 12 -

■ ры которого приведены в Таблице 3.

Кариометрические исследования показали, что распределение клеток с одним микроядром по величине соотношения Умя/Уя в преджелудке и толстой кишке мышей для каждого из галопропанов статистически не различались и были близки к таковым в контроле. Однако, ДБП как в преджелудке. так и в толстой кишке индуцирует микроядра большего объема, по сравнению с другими гало-пропанами. показатели которых практически сходны (Таблица 4).

В опытах на крысах растворы галопропанов вводили внутриже-лудочно в дозах 0,2; 0,1 и 0.02 ЛД 50: ДБП - 21,2; 107 и 214 МГ/ /кг; ТБП - 20; 100 и 200 мг/кг и ДБХП - 6; 30 и 60 мг/кг. Как и в опыте на мышах, вещества не влияли на частоту ПХЭ с микроядрами в костном мозге и эпителиальных клеток с микроядрами в желудке, 12-перстной и тонкой кишке. В преджелудке ТБП не показал мутагенного эффекта. ДБП и ДБХП проявили выраженную цитогенети-ческую активность. Минимально-действующая доза веществ была на уровне 0,1 ЛД 50. Доля клеток с микроядрами,возрастала с увеличением дозы веществ и зависимость "доза-эффект" хорошо описывалась линейным уравнением (Таблица 3). В толстой кишке все 3 га-лопропана индуцировали образование микроядер.

Минимально-действующая доза ДБП и ТБП соответствовала 0,1 ЛД 50, а ДБХП - 0,02 ЛД 50. Отмечено возрастание доли клеток с микроядр-лми и увеличением дозы веществ, а зависимость "доза-эффект" хорошо описывалась линейным уравнением (Таблица 3).

Картометрия показала, что распределение клеток с одним микроядром по величине соотношения Умя/Уя в преджелудке и толстой кишке для ДБП существенно отличалось от такового для ТБП и ДБХП Для последних двух соединений это распределение было сходным. Предняя величина соотношения для ДБП была в 1,5-2 раза больше, чем для ДБХП и ТБП (Таблица 4). Это указывает на индукцию ДБП болр^ крупных по объему микроядер, чем при действии ДБХП и ТБП.

Полученные результаты, а также данные по индукции ДБХП ци-тогенетических нарушений в клетках костного мозга (Kapp, 1979; И. Ф. Выскубенко, B.C. Журков, 1999; George et al., 1990), позволяют оценить специфичность мутагенного действия галопропанов на соматических клетках млекопитающих (Таблица 4):

Таблица 3.

Результат регрессижнсго анализа завгамэсги доли юета с к

ивфотярэм в преджалудн; и толстей нише и млей стг

дозл гаткпрспансо Лнейная недель: у = а + Ьх, те х - доза вешгства (мт/ет); у - кпетхк с мофаящеж на 1000; а и Ь - иээиадиялы урвташИ

Жшетоюг Оегвн Вшесгао Коэфф ксгрелящм КоэФФ утешения кк Г регресст Р

г р а±йа ъ*а>

Крьсы Прея-жеяугкк Д Б X П ДБП а 746 а 7оз <а 001 <0.001 1. зо!а зе 1. 4910 42 а 059*0.011 а 01б«а 004 27. 56 21.43 <0,001 <0,001

■Клепая ниа Д Б X П ДБП ТБП а бзг а 702 а 705 <а 001 <0.001 <аоо1 г 29«а 55 1. 52»а 39 1. 59*а 40 а Обзю. 016 а 015«а ооз а ота оог 14. 74 21. 23 21.65 <0,001 <0,001 <0,001

Или Напетая кика ДБ X П ачго «105 1.4б»а зг а 02710.013 4ч 67 <ао5

« Г^агомы? значения для №22: г =а г =0,629.

а 05 а 001

«« Граничив значения для 1(1=1; Хг=гг! р =4. 30; К =14. 38.

а 05 а 001

Таблица 4.

Специфичность действия галопропанов в микроядерном (мя) тесте на мышах и крысах.

Орган Частота клеток с микроядрами

ДБХП ДВП ТБП

мыши крысы мыши крысы мыши крысы

Костный мозг -- -- — — -- --

Преджелудок + + + + + + -- --

Хелудок -- -- — — -- —

12-перстная кишка -- -- — — -- —

Тонкая кишка -- -- — — -- --

Толстая кишк 1 + + + + — + + -- + +

V мя / V я {/.) Преджелудок 1.67 2.82 2. 07 4.49 1.54 2.17 Толстая кишка 1.35' 2.83 1.87 3.93 1.55 2.66

отсутствие эффекта; * значимое превышение показателя в максимальной дозе над контролем и отсутствие значимой зависимости "доза-эффект"; ■»+ значимый цитогенетический эффект и линейное возрастание показателя с увеличением дозы вещества.

- ДБП и ТБП не влияют на частоту ПХЭ с микроядрами в костном мозге мышей и крыс, тогда как ДБХП обладает слабым цитоге-нетическим эффектом у крыс в дозах, близких к ЛД 50;

- ДБХП индуцирует микроядра в клетках преджелудка я толстой кишки крыс и мышей; ДБП - в преджелудке крыс и мышей и в толстой кишке крыс; ТБП - только в толстой кишке крыс;

- ДБП индуцирует в клетках преджелудка и толстой кишки крыс микроядра более крупного размера, чем ДБХП и ТБП, что указывает на возможное различие в механизмах их цитогенетического действия (ДБП вызывает нарушение расхождения хромосом в митозе; ДБХП и ТБП - хромосомные аберрации);

- крысы обладают выраженной чувствительностью к онтогенетическому действию галопропанов, что выражается как в более низких действующих дозах, так и в степени зависимости "доза-эффект".

Таким образом, химическое строение галопропанов оказывает существенное влияние как на качественные (видовая и* органная специфичность)так и на количественные (уровни эффектов, дозо-вые зависимости) характеристики цитогенетического эффекта в органах 1КТ млекопитающих.

Реалон и цинковый комплекс ИОМС-1.

Цитогенетический эффект этих двух соединена, для которых разрабатывались ПДК в воде водоемов, изучен в клетках преджелудка самцов крыс при 30-суточном введении водных растворов внутрижелудочно.

Реалон предназначен для предотвращения отложения минеральных солей в теплоэнергетике. Опыты проведены с техническим продуктом. Испытаны максимальная доза, составляющая 1/5 от дозы, не давшей в остром токсикологическом эксперименте значимого эффекта, 3000 от/кг и дозы 600 и 111 мг/кг. При всех дозах не выявлено статистически значимого повышения частоты клеток с микроядрами над контролем. Расчетная минимально-действующая доза препарата при хроническом воздействии определена 2.2 мг/кг (Т.О. Дергачева. 1990). Полученные данные указывают на генетическую безопасность зещества

Цинковый комплекс ИОМС-1 предназначен для предотвращения

отложений минеральных солей и коррозии в системах охлаждения и отопления. Технический продукт содержит 28% основного вещества: ИОМС-1 - 23,7% и сернокислый цинк - 4,2%. Испытаны дозы 4000; 800 и 160 мг/кг, составляющие 0,2; 0,04 и 0,008 от максимальной испытанной дозы в остром эксперименте на крысах, которая не вызывала гибели животных. При дозе комплексона 4000 мг/кг средняя доля клеток с микроядрами составила 3,17 + 0.83 на 1000, статистически значимо превышая показатель в контроле (0,83 + + 0,31). Средняя частота клеток с микроядрами на 1000 при дозах 800 и 160 мг/кг составила соответственно 2,00 + 0,58 и 1,50 + + 0,67 и статистически не отличалась от контроля.

Для цели регламентирования, согласно "Методических указаний по изучению мутагенной активности химических веществ при обосновании их ПДК в воде водоемов" (1986), была разработана "допустимая доза" мутагена (ДДмут) по формуле МДДмут/200. ,0на составила 20 мг/кг по цинковому комплексу ИОМС-1; 4,74 мг/кг - по ИОМС -1; 0,84 мг/кг - по сернокислому цинку и 0,34 мг/кг по Zn 2+.

Из токсикологического эксперимента (Т. С. Дергачева, 1990) расчетная минимально недействующая доза комплексона при хроническом воздействии составила 2,5 мг/кг, что в 16 раз ниже ДДмут. В основу норматива цинкового комплекса ИОМС-1 положен органолептический признак вредности, на основе которого ПДК составила 2 мг/кг, что еще больше повышает надежность норматива в отношении мутагенного эффекта

Обсуждение.

В настоящее время, в системе краткосрочных тестов оценки генотоксичности для выявления канцерогенов основным тестом in vivo является учет цитогенетических нарушений в клетках костного. мозга млекопитающих (WHO, 1990). Однако, не все известные канцерогены индуцировали хромосомные нарушения в клетках костного.мозга млекопитающих. В ряде случаев это связано с тем, что активные вещества или метаболиты не доходят до клеток костного мозга и проявляют мутагенный эффект в местах поступления или местах метаболизма Результаты работы, а также данные, полученные в лаборатории с 2-мя веществами (И. Ф. Выскубенко и со-

авт. , 1990), указывают на существенный онтогенетический эффект ряда химических соединений в клетках разных отделов ЖКТ млекопитающих при отсутствии или слабой цитогенетической активности в клетках костного мозга (Таблица 5).

Таким образом, расширение спектра исследуемых тканей значительно повышает надежность прогнозирования цитогенетической активности химических соединений и позволяет выявить органы (ткани) мишени.

Зависимость доли клеток с микроядрами от дозы вещества во всех случаях хорошо описывалась линейным уравнением. Это позволяет при сопоставлении эффектов веществ в клетках разных органов или, при сравнении цитогенетической эффективности разных веществ, сравнивать коэффициенты регрессии, отражающие степень нарастания эффекта на единицу дозы вещества

Простота методики и относительно быстрый анализ результатов дает возможность проведения опытов на нескольких видах животных обоего пола, используемых в экспериментах по оценке канцероген-ности химических веществ. Это позволяет охарактеризовать в эксперименте органную, половую и видовую специфичность цитогенети-ческого действия веществ (опыты с ДМГ и галопропанами).

Для известных канцерогенов - ДМГ. НДЭА и бенз(а)пирена -при пероральном поступлении показано совпадение органоспецифич-ности индукции микроядер и опухолей (Таблица б). ДБХП повышал частоту клеток с микроядрами в преджелудке и толстой кишке, однако, опухоли выявлены только в преджелудке. Наличие онтогенетического эффекта в клетках того или иного органа при отсутствии индукции опухолей не должно казаться странным, так как канцерогенез - процесс многоэтапный и повреждение ДНК отражает только один из первых этапов (инициацию). В целом, проведение онтогенетического анализа клеток разных органов существенно повышает предсказательную оенность микроядерного теста для выявления канцерогенов и перспективно для предсказания возможной органоспеоифичности канцерогенного действия веществ, особенно в тех случаях, когда при цитогенетическом анализе выраженна дозо-вая зависимость.

Результаты работы показали: перспективность включения учета микроядер в клетках разных отделов ЖКТ, наряду с костным моз-

- 1в -

Таблица 5.

Сравнение результатов микрюядерного теста на клетках костного мозга и разных отделов ИСТ млекопитающих при пероральном введении химических веществ (все ткани взяты у одних и тех же животных).

Вещество Животные к Индукция микроядер

костный мозг пред-желудок желудок 12-перст, кишка тонкая кишка толстая кишка

Д Б X П крысы — + + — — — + +

мыта — + — — — + +

ДБП крысы — + + — — — + +

мьши — + — — — —

ТБП крысы — — — — + +

кыш — — — — — —

Н Д Э А крысы — — — — — —

Д Н Г крысы — — — — — + +

хм мыли — — — нт нт ♦ ♦

Б(а)П » N мьши + / — + + — нт нт —

Цф к к мыли + + нт нт нт V нт 4

« + + значимый, зависимый от дозы эффект;

+ значимый эффект только при максимальной изучено» дозе; */— эффект при всех дозах не значим, но значимо возрастание эффекта с увеличением дозы вещества; — отсутствие эффекта; нт эффект в данном органе не изучался; «« данные И. ф. ШскуОенко и соавт. (1990).

Таблица б.

Сравнение результатов микроядерного теста и органо-специфичности канцерогенного действия у млекопитаюяих при пероральном поступлении веществ.

Вещ-во Микроядерный тест«« Канцерогенность *««

костный мозг пред-желудок толстая кишка пред-желудок толстая кишка другие органы

Д И Г -- -- + + -- + +

Н Д Э А -- -- -- + / -- -- +

Б(а) П» + / -- ♦ ♦ -- + -- +■

Д Б X П -- + + + + + -- +

Д Б П -- + + + нт нт нт

Т Б П -- -- + + нт нт нт

« Данные и. Ф. ВыскуСенко и соавт. , 1990; «« Оценка ответа в никроядерном тесте:

♦ + значимый эффект, зависимый от дозы;

+ значимый эффект только при максимальной изученной дозе;

+ / -- яри всех дозах уровень клеток с микроядрани не значим, однако, значимо возрастание эффекта с увеличением дозы вещества; отсутствие эффекта; «»» Индукция опухолей в органах по данным литературы; + значимая индукция веществом опухолей в органе; + / -- противоречивые данные по индукции опухолей з органе, причем положительный результат получен только при действии высоких доз; нет значимой индукции опухолей в органе; нт эффект не изучался;

гом, в систему краткосрочных тестов выявления канцерогенов (особенно, при пероральном поступлении); возможность использования в экспериментах крыс и мышей обоего пола, рекомендуемых для тестирования канцерогенов; необходимость оценки индукции микроядер в клетках всех отделов ЖКТ; обязательность исследования канцерогенности в опытах на млекопитающих веществ, показавших выраженный цитогенетический эффект хотя бы в одном отделе ЖКТ. Исходя из этого, представляется необходимым изучить канце-рогенность ДБП и ТБП, индуцирующих выраженный цитогенетический эффект в клетках преджелудка (ДБП) и толстой кишки (ДБП и ТБП) крыс.

Полученные данные могут быть использованы как показатель мутагенного эффекта для соматических клеток при гигиеническом регламентировании веществ. Этот подход применен при разработке ПДК цинкового комплекса ИОМС-1 в воде путем расчета "допустимой дозы" мутагена (ДДмут) и сопоставления ее с минимально-действующими дозами по токсикологическому и органолептическому показателям. Онтогенетические данные по другим веществам позволили расчитать ДДмут при пероральном поступлении, которые составили: для ДМГ - 0,0036 мг/кг; ДБХП - 0,03 мг/кг; ДБП - 0,535 мг/кг; ТБП - 0,50 мг/кг.

ВЫВОДЫ

1. Разработана модификация•методики приготовления препаратов эпителиальных клеток преджелудка, желудка, двенадцатиперстной, тонкой и толстой кишок мышей и крыс для анализа микроядер. Использование отечественных реактивов, возможность картометрии и использования другого вида животных позволяют широко применять методику в цитогенетических и токсикологических исследованиях.

2. Частота клеток с микроядрами в исследуемых отделах желудочно-кишечного тракта интактных крыс и мышей составляла в среднем 1 на 1000.

3. В подострых опытах с известными канцерогенами 1,2-диметилгидразином (ДМГ); 1,2-дибром-З-хлорпропаном (ДБХП) и М--нитрозодиэтиламином (НДЭА) при пероральном введении крысам в

дозах от 0,02 до 0,2 ЛД50 не выявлено повышения частоты клеток с микроядрами в костном мозге. В то же время ДМГ индуцировал образование микроядер в толстой кишке, ДБХП - в предкелудке и толстой кишке, а НДЗА был неактивен в клетках всех отделов желудочно-кишечного трэкта.

4. Химическое строение галопропанов оказывает существенное влияние на качественные и количественные характеристики образования микроядер в клетках желудочно-кишечного тракта крыс и мышей при персральном введении:

- 1,2-дибром-З-хлорпропан (ДБХП) активен в преджелудке и толстой кишке крыс и мышей; 1,2-дибромпропан (ДБЛ) - в предже-лудке и толстой кишке крыс и в'преджелудке мышей; 1,1.3-три-бромпропан (ТБП) - в толстой кивке крыс;

- крысы обладают большей чувствительностью к цитогене-тическому действию галопропанов чем мыши;

- ДБП индуцирует микроядра существенно большего диаметра, чем ДБХП и ТБП, что указывает на разные механизмы их цито-генетического действия.

5. Зависимость доли клеток с микроядрами от дозы вещества в отделах желудочно-кишечного тракта описывается линейны;® уравнениям!. Сравнение коэффициентов регрессии позволяет дать количественную оценку различий видовой, половой и органной чувствительности к эффекту мутагенов.

6. Показано совпадение органоспецифичности цитогенети-ческого и канцерогенного действия веществ в отделах желудочно-кишечного тракта млекопитающих. Полученные данные позволяют рекомендовать включить учет микроядер в клетках разных отделов желудочно-кишечного тракта, наряду со стандартным учетом микроядер в {слетках костного мозга, в систему краткосрочных тестов выявления канцерогенов, особенно при пероральном поступлении веществ. Данные по эффекту ДБП и ТБП указывают на необходимость оценки их канцерогенности в опытах на крысах.

7. Для веществ, показавших цитогенетическую активность в отделах желудочно-кишечного тракта, рекомендуется на основе минимально-действующей дозы (МДДмут) рассчитывать допустимую дозу мутагена (ДДмут), которая используется при установлении гигиеничес:сих регламентов химических веществ в соответствии с

существующими рекомендациями для других тестов на млекопитающих. Данный подход применен при установлении ОДУ Реалона и цинкового комплекса ИОМС-1 в воде водоемов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Изучение цитогенетической активности трех галогенпроиз-водных пропана в эпителиальных клетках желудочно-кишечного тракта - В книге: Гигиена окружающей среды. (Сборник научных трудов НИИОКГ им. А. Е Сысина РАМН) - М. , 1990. - с. 226-227.

2. Цитогенетические исследования клеток разных тканей млекопитающих - один из подходов к повышению надежности выявления канцерогенов среди химических загрязнителей среды. - В сб.: Генетические последствия загрязнения окружающей среды мутагенными факторами. (Материалы Всесоюзного координационного совещания). Самарканд, 1990. - с. 54-55 (в соавт. с И. Ф. Выскубенко, Е. Г. Фельдт).

3. Анализ органоспецифичности цитогенетических эффектов га-лопропанов в экспериментах на мышах. - В сб.: Проблемы токсикологии и прикладной экологии. (Тезисы докладов международного симпозиума). Ленинград, ВНИИГ, 1991. - с. 114-115 (в соавт. с R С. Журковым, JL Е Сычевой).

4. Induction of micronuclei in mammalian cells in vivo by carcinogens: The organospecificity. - 21st Annual Meeting of EEMS on Environmental Mutagens-Carcinogens. Abstracts Book. Praque, 1991, p. 8-62 (with V. S. Zhurkov, L. P. Sychova, I. F. Vyskubenko, E. G. Feldt, N. I. Sherenesheva).

5. Исследование генотоксической активности нитрозодиэтил-амина микроядерным методом в разных органах крыс. - "Гигиена и санитария". 1992, N 3. - с. 72-73 (в соавт. с JL П.Сычевой).

Подписано к печати 21.12.92 г. Формат 60x84/16 Обьеи 1,0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ 1846

Типография ГОСНИТИ