Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Оценка степени злокачественности эпителиальных новообразований толстой кишки на основе определения эпителиальных новообразований толстой кишки на основе определения иммунофенотипа опухолевых клеток

На правах рукописи

□030576Т1

Корсакова Нина Анатольевна

ОЦЕНКА СТЕПЕНИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОСТИ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ ТОЛСТОЙ КИШКИ НА ОСНОВЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИММУНОФЕНОТИПА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК

14.00.15.- патологическая анатомия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2007

003057671

Работа выполнена в клиническом институте им.

Московском областном научно-исследовательском М.Ф.Владимирского (МОНИКИ)

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Ирина Александровна Казанцева

доктор биологических наук Лариса Евсеевна Гуревич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор,

заслуженный деятель науки РФ Леонард Леонидович Капуллер

доктор медицинских наук, профессор Юрий Георгиевич Пархоменко

Ведущая организация:

Кафедра патологической анатомии Российского Университета Дружбы Народов

Защита состоится

2007г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д.001.004.01 ГУ НИИ морфологии человека РАМН по адресу: 117418 Москва, ул.Цюрупы, д.З

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РУ НИИ морфологии человека РАМН

Автореферат разослан » 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Лилия Петровна Михайлова

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АК аденокарцшюма(ы)

ВД АК пысокоднфференцированная аденокарцшюма

Е-кад Е-кадхерин

ИГХ иммуногистохимия; иммуногистохимический

НД АК низкодифференцировапная аденокарпцшюма

ТВА тубуло-ворсннчатые аденомы

ТК толстая кишка

УДАК умереннодифференцированная аденокарципома

р-кат Р-катенин

СК цитокератип(ы)

мис мущш(ы)

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Проблема морфологической диагностики рака толстой кишки в настоящее время имеет особую актуальность, что связано с постоянным ростом заболеваемости раком этой локализации. В большинстве экономически развитых стран Европы и Северной Америки частота заболеваемости колоректальным раком среди злокачественных новообразований занимает второе-третье место у лиц обоего пола [ Р.ВискЬаиЦэ ее а1, 2001 ]. В России колоректальньш рак в общей структуре онкозаболеваемости в !999г. занял 5 место и составил 9,3%- Показатель неблагоприятного прогноза данного заболевания, «груз заболеваемости», т.е. соотношение показателей смертности к заболеваемости, по данным 1999 г. в России достиг 0,72 при раке ободочной и 0,76 при раке прямой кишки [Е.М.Аксель, Т.И.Ушакова, 2001; В.И. Кныш., 1997 ].

Высокий уровень смертности во многом связан с поздней диагностикой, что и определяет низкую эффективность лечения. Известно, что значительный процент опухолей выявляют в инкурабельном состоянии, поэтому 90% пациентов умирает от рецидива заболевания [Ю.И.Патютко, И.В.Сайгадак, 2001]. В связи с этим очень важной проблемой является изучение факторов прогноза, которые непосредственно влияют на выживаемость больных.

Основным критерием степепи злокачественности в патоморфологической диагностике адепокарцииом толстой кишки согласно «Международной Гистологической Классификации опухолей кишечника» (ВОЗ, Женева, 2000) является степень дифферепцировки опухолевых клеток. Подобное подразделение опухолей по мнению большинства исследователей достаточно субъективно н не может характеризовать истинный злокачественный потенциал новообразования [ А.Г. Перевощиков, 1997; С.С.СошрЮп. ее а1, 2000; С.С.СошрЮп, 2000; С.С. Сошрюп е! а1, 1999]. Для того, чтобы оцепить ипвазивность опухоли и судить о ее прогнозе недостаточно рутинного гистологического исследования. Особое значение имеет изучение экспрессии ряда клеточных маркеров, участвующих в механизмах канцерогенеза, таких как онкобелки, протеины, связанные с апоптозом, межклеточной адгезией и пролиферацией.

С этих позиций исследование иммунофенотипа клеток эпителиальных опухолей толстой кишки имеет большое практическое значение, оно позволяет уточнить диагноз и более объективно судить о прогнозе заболевания.

прогрессии с определением иммунофеиотипа клеток разных гистологических вариантов опухолей толстой кишки направлено на совершенствование морфологической диагностики предраковых заболеваний и рака толстой кишки, а также уточнение прогноза заболевания, что может быть использовано при разработке оптимальной тактики их лечения.

Цель исследования:

На основе иммунофенотипирования клеток опухоли установить морфологические критерии дифференциальной диагностики и прогноза эпителиальных опухолей толстой кишки.

Задачи исследовании

1. Сравнительное изучение различных тканеспецифических маркеров, исследование особенностей экспрессии их в клетках эпителиальных опухолей толстой кишки разной степени дифференцировки.

2. Исследование экспрессии молекул клеточной адгезии в различных гистологических вариантах опухолей толстой кишки.

3. Изучение особенностей экспрессии в опухолевых клетках протеинов, участвующих в регуляции процессов апоптоза и клеточной пролиферации ( р53, ВАХ, Вс1-Х и Кл 67).

4. Выявление клинико-морфологических корреляций при раке толстой кишки с учетом фенотипической характеристики опухолевых клеток.

Научная новизна исследования

В работе впервые выполнено комплексное гистологическое и иммуногистохимическое исследование клеток доброкачественных и злокачественных эпителиальных новообразований толстой кишки с использованием специально разработанной панели молекулярно-биологических маркеров - антител. Осуществлен сравнительный анализ фенотипических особенностей клеток нормальной слизистой и новообразований толстой кишки - аденом и аденокарцином. Показано, что при изменении клеточной дифференцировки и инвазивных свойств аденокарцином менялся иммунофенотип клеток опухолей. На основе анализа результатов исследования иммунофеиотипа опухолевых клеток проведена оценка биологического потенциала опухолей толстой кишки. В работе выявлены существенные различия в интенсивности и локализации экспрессии тканеспецифических протеинов (цитокератинов 19, 20 типа и муцинов 1, 2 типа), а также молекул межклеточной адгезии (Е-кадхерина, р-катенина и СЭ44Н) и протеинов -регуляторов клеточного цикла (ВАХ и Вс1-Х, р53, Ю67) в клетках тубуло-ворсинчатых аденом и аденокарцином толстой кишки в зависимости от степени дифференцировки и

клинической стадии заболевания. Показано, что при снижении степени дифференцировки и возрастании инвазивного потенциала опухолей интенсивность экспрессии антигенов, характерных для нормального эпителия толстой кишки, цитокератинов 19 и 20, муцина 2 типа в цитоплазме опухолевых клеток снижается, а муцина 1 типа возрастает. Для низкодифференцированных аденокарцином с высоким потенциалом злокачественности было свойственно появление аномальных типов экспрессии молекул межклеточной адгезии Е-кадхерина, [3-катенина и СВ44Н. Показано, что следствием нарушения дифференцировки клеток является и изменение локализации, а также и интенсивности экспрессии в клетках злокачественных опухолей протеинов-регуляторов апоптоза ВАХ и Вс1-Х. Выявлено, что сверхэкспрессия белка р53 свидетельствует о неблагоприятном прогнозе течения заболевания. Уровень пролиферативной активности эпителиальных опухолей толстой кишки варьирует в широких пределах и, по нашим данным, индекс пролиферации К: 67 не может служить безусловным признаком злокачественного потенциала опухолей этого типа. Полученные результаты могут быть использованы для диагностики и прогнозирования новообразований толстой кишки, а также для разработки более эффективных схем их терапии. Теоретическая и практическая значимость работы

В работе показаны различные молекулярно-клеточные механизмы, лежащие в основе злокачественной трансформации клеток эпителиальных опухолей толстой кишки. Установлены иммуногистохимические маркеры, совокупность которых позволяет проводить дифференциальную диагностику этих новообразований. Полученные данные могут быть использованы для более точной оценки инвазивного потенциала и прогноза данной группы опухолей.

Результаты работы могут быть использованы для дифференциальной диагностики в практической деятельности патологоанатомических отделений, в работе отделений колопроктологии, онкологии, а также для научно-исследовательских разработок па кафедрах и в научно-исследовательских институтах. Структура диссертации

"Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, собственных результатов, обсуждения результатов исследования, выводов, практических рекомендаций и списка испльзованной литературы. Работа иллюстрирована 37 таблицами, 43 микрофотографиями, 6 графиками.

Апробация работы

Результаты работы доложены на IX научной конференции «Новые направления и разработки в онкоморфологии», посвященной 75-летнему юбилею академика РАМН, профессора Ю.Н. Соловьева (Москва, 2003); клинической межотделенческой конференции в МОНИКИ (октябрь, 2006 г.); межлабораторной конфереции ГУ НИИ Морфологии человека РАМН (февраль, 2007 г.).

ХАРАКТЕРИСТИКА МАТЕРИАЛА II МЕТОДОВ

В работе был использован операционный и аутопсинный материал эпителиальных опухолей толстой кишки от 71 пациента, из них 5 - тубуло-ворсинчатые аденомы, 66 -аденокарциномы различной степени дифференцировки.

АК толстой кишки были выявлены у 66 пациентов, из которых 30 случаев (45,5%) были отнесены ко II клинической стадии, 28 (42,5%) - к III, а 8 (12%) - к IV стадии. В соответствии с гистологическим строением в 13 наблюдениях (20%) установлена высокая степень дифференцировки, в 44 (66%) - умеренная степень, а в 9 (14%) - низкая степень дифференцировки опухолевых клеток. В качестве контроля была исследована внеопухолевая слизистая ТК, которая была получена при радикальной резекции фрагмента кишечника с опухолью.

Материал фиксировали в 10% растворе формалина, забуференном по Лилли при рН-7,4, затем заливали в парафин по обычной методике.

Серийные срезы толщиной 5 мкм депарафинировали по стандартной схеме и окрашивали гематоксилином и эозином. Иммуногистохимический метод

ИГХ исследование проводили в соответствии со стандартным протоколом. Был использован набор маркеров, приведенный в таблице 1. Эти ИГХ маркеры (антитела) в соответствии с поставленными задачами разделили на 3 группы: 1 группа -тканеспецифические антитела, использованные для фенотипирования клеток опухолей; 2 группа - антитела к молекулам межклеточной адегезии; 3 группа -антитела к протеинам, регулирующим клеточный цикл.

Для ИГХ исследования ткани фиксировали в 10%-ном забуференном формалине (рН 7,2), проводили по спиртам и ксилолам, заливали в парафин.

■а

Использовали парафин с температурой плавления 54 С (Германия).

Затем с помощью одноразовых лезвий марки R35 готовили серийные парафиновые срезы толщиной 3-5 мкм и наносили их на стекла с адгезивным покрытием (полилизин), депарафинировали по стандартному протоколу.

Далее срезы по 5 минут промывали в деионизированной дистиллированной воде и фосфатном буфере (рН-7,4).

Исследование проводили в соответствии с методикой C.R.Taylor., R.Cote., [1994] и L.A.Sternberger. [1979]. Предварительная обработка срезов производилась по методу восстановления антигенных детерминант ткани по методике S-R.Shi и соавт. [1997] с помощью предварительной обработки срезов, погруженных в цитратный буфер (рН-6,0) в микроволновой печи при мощности 690 Вт 2 раза по 5 минут.

Таблица 1 Характеристика антител.

Антитела Клон Развед. Фирма

Дифференциально-диагностические

1 Карциноэмбриональный антиген (КЭА) кроличьи Ready to use DAKO

2 Эпителиально-мембранный антиген (ЭМА) Е29/ЕР1 « «

3 Цитокератины широкого спектра (А1/АЗ) АЕ1/АЕЗ « «

4 Цитокератин 19 RCK 108 1:100 «

5 Цитокератин 20 Ks 20.8 Ready to use «

6 Муцин 1 типа Ма695 1:100 «

7 Муцин 2 типа Сср58 1:200 Novocastra

Адгезивные молекулы

8 Е-кадхерин 36В5 1:50 Novocastra

9 Р-катенин 17С2 1:200 «

10 CD 44 H F 10-44-2 1:50 «

Регуляторныс протеины

И Ki 67 В 56 1:10 Bioscienses

12 р 53 DO-7 1:100 DAKO

13 ВАХ Кроличьи, А 3533 1:50 «

14 Bcl-X Кроличьи, А 3535 1:50 «

Затем срезы охлаждали 20 минут при комнатной температуре, слегка подсушивали и на них наносили первичные антитела. Инкубация с первичными антителами составляла

30 минут при комнатной температуре, затем 12 часов при 4 С. Использовались позитивные и негативные контроли - иммунные и неиммунные сыворотки. Срезы тщательно отмывали в буфере, подсушивали, затем на них наносили систему En Vision (anti-mouse и anti-rabbit, фирмы DAKO, Дания) или универсальный LSAB System kit (фирмы DAKO, Дания). При использовании одноступенчатой системы En Vision реактив наносился на срезы на 30-40 минут. При использовании двуступенчатого универсального авидин-стрептавидинового комплекса на срезы на 30 минут наносились вторичные антитела, которые затем промывались забуференным физиологическим раствором, а затем еще на 30 минут - пероксидазный комплекс.

После каждой инкубации срезы тщательно отмывали, подсушивали вокруг, затем, для визуализации реакции, на них наносили DAB +(3,3 диаминобензидин) или АЕС (3-амино-9этилкарбазол (фирмы DAKO), что позволяло получать соответственно специфическую коричневую или красную окраску. Интенсивность ИГХ реакции в каждом препарате контролировалась под микроскопом: по достижении необходимой интенсивности окрашивания срезы отмывали в дистиллированной воде, после чего в течение 2-5 минут докрашивали гематоксилином Майера, снова промывали и погружали в проточную воду, в которую для получения щелочной среды добавляли несколько капель нашатырного спирта.

После того, как срезы приобретали голубой оттенок, стекла извлекали, обезвоживали в батарее спиртов и ксилолов по стандартной схеме, заключали в бальзам и исследовали под микроскопом.

Системы оценки экспрессии различных ИГХ маркеров

1. Интенсивность пероксидазной метки для каждого маркера оценивали полуколичественным методом - число позитивных на 100 учтенных опухолевых клеток. Параллельно оценивали интенсивность окрашивания: + - слабое, ++ умеренновыраженное, +++ - интенсивное.

Разработанная система оценки экспрессии тканеспецифических антигенов, адгезивных молекул и протеинов ВАХ и Bcl-Х описана при изложении соответствующего материала.

Определение индексов пролиферации Ki 67, а также экспрессии протеина р 53 в ядрах клеток вычислялось как среднее от числа меченных ядер на 100 учтенных ядер ( при учете 500-1000 опухолевых клеток).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование гистогенеза, биологического потенциала и инвазивных свойств эпителиальных опухолей толстой кишки проводилось на основании гистологического

исследования в соответствии с классификацией эпителиальных новообразований толстой

*

кишки (ВОЗ, 2000), а также молекулярно-генетических особенностей клеток новообразований.

Исследование фенотипа клеток АК

Исследовано 5 тубуло-ворсинчатых аденом с признаками дисплазии эпителия желез слабой и умеренной степени.

Аденокарциномы ТК в зависимости от выраженности железистых структур, а также от клеточного и ядерного полиморфизма делят на высоко-, умеренно- и низкодифференцированные опухоли. Однако подобное разделение является в определенной степени условным и не дает полной информации об инвазивном потенциале клеток АК. [ А.Г. Перевощиков, 1997]

Таблица 2. Распределение адеиокарцином толстой кишки на группы по

степени днффсрснцнровкн и на основании клинической стадии заболевания.

Стадия опухолевого развития Аденокарциномы Всего

высокодифференипрованные умереннодифференцнрованные нижодифференцированные

II тзггомо 8 61% 9 69% 11 25% 20 45% 0 1 11% 30 45,5%.

Т4ХОМО 1 8%. 9 20% 1 11%,

III тзммо 2 15% 4 31% 7 16% 18 41%. 1 11%. 6 67% 28 42,5%

Т-1.\Ч.\Ю I 8% 7 16% 2 22%.

Т3-4ГО- змо 1 8% 4 9% 3 33%

IV ТЗ-4М1-ЗМ1 '0 6 14% 2 22% 8 12%

Всего наблюдений 13 20% 44 66% 9 14% 66

Клинически в соответствии с Международной классификацией по системе ТКМ АК ТК были разделены на 4 группы, в которой Т-степень инвазии, И-метастазы в

регионарные лимфатические узлы и М-отдаленные метастазы [В.J1.Черкес, 2001; C.C.Compton, 2000]. Всего было исследовано 66 АК ТК.

Самую многочисленную группу опухолей составили АК умеренной степени дифференцировки - 66% (44 из 66) (таблица 2). Характерно, что большинство ВД АК ТК в (69% случаев, 9 из 13) выявлялись во II стадии, их не было в IV клинической стадии, а большинство НД АК (89% наблюдений, 8 из 9) выявлялись в поздних стадиях - III и IV.

При сравнительной клшшко-морфологической оценке АК ТК была выявлена обратная корреляция между такими параметрами опухолевой прогрессии, как степень дифференцировки и клиническая стадия заболевания

Исследование экспрессии ткаиеспенифических маркеров в клетках эпителиальных опухолей ТК

В клетках исследованных эпителиальных опухолей ТК (ТВА и АК ТК) наблюдалась выраженная экспрессия цитокератинов широкого спектра в цитоплазме, канцеро-эмбрионального и эпителиально-мембранного антигенов в просвете желез, в цитоплазме и на мембране клеток.

Экспрессия цитокератинов 19 и 20. Цитокератины 19 и 20 типа относятся к промежуточным филаментам и составляют структурную основу эпителиальной клетки [P.A Coulombe et al, 2002]. СК 20 в норме выявляется в эпителиоцитах слизистой тонкой и толстой кишки и является маркером зрелых энтероцитов [ P.Tamboli et al, 2002 ]. Цитокератин 19 выявляется в более широком спектре тканей: в многослойном плоском, протоковом и железистом эпителии [R.Moll et al, 1982].

В результате проведенного исследования было выявлено, что в эпителии нормальной слизистой ТК экспрессия цитокератинов имела некоторые топографические особенности. СК 20 выявлялся преимущественно в клетках апикальных отделов крипт, тогда как СК 19 отмечался в эпителиальных клетках вне зависимости от зональной принадлежности крипты, хотя реакция в поверхностных участках слизистой ТК была более интенсивной.

В клетках ТВА экспрессия исследуемых цитокератинов была достаточно равномерной, интенсивной и обнаруживалась как в поверхностных, так и в центральных отделах опухолей.

В клетках АК ТК отмечалась неоднородность экспрессии СК 19, которая отличалась и по интенсивности, и по локализации в клетке. В связи с этим была разработана система оценки экспрессии СК 19: равномерная экспрессия более, чем в 90% клеток - 1 балл; цитоплазматическая экспрессия более, чем в 50% клеток - 2 балла; цитоплазматическая экспрессия менее, чем в 50% клеток - 3 балла.

Нами было выявлено, что при уменьшении степени дифференцировки опухолей наблюдалось уменьшение интенсивности экспрессии СК 19. В группе ВД АК интенсивная иммунореактивность к СК 19, которая отмечалась в нормальной неповрежденной слизистой ТК, была обнаружена в 43% ( 6 из 14) случаев, в группе УД АК количество наблюдений с выраженной экспрессией СК 19 уменьшилось в полтора раза (35% - 11 из 31), а в группе НД АК - в 3 раза (14% - 1 из 7) (рис.1).

Экспрессия СК 20 в АК ТК также была неравномерной, но выявлялась как в центральных, так и периферических участках опухолей. В связи с этим оценка иммунореактивности СК 20 проводилась с учетом следующих критериев: цитоплазматическая экспрессия более, чем в 70% опухолевых клеток - 1 балл; цитоплазматическая экспрессия не менее, чем в ?0% клеток - 2 балла; цитоплазматическая экспрессия менее, чем в 30% клеток - 3 балла.

В группе ВД АК экспрессия СК 20 была интенсивной (1 балл) в клетках 11% (1 из 9) АК, в клетках УД АК этот показатель соответствовал 10% (3 из 29) случаев, в НД АК данный тип экспрессии отсутствовал.

Итак, было обнаружено, что при снижении степени дифференцировки опухолевых клеток уменьшается процент позитивных клеток, т.е. содержания СК 19 и 20 в опухолевой ткани, тогда как характерной закономерности в экспрессии протеинов в клетках эпителиальных опухолей ТК в зависимости от клинической стадии выявлено не было.

-г

ТВА ВДАК УДАК НД АК

цитокератин 20 цитокератин 19

Рис 1. Зависимость гиперэкспрессии цитокератинов от степени дифференцировки клеток

Экспрессия муцинов I и 2 типа в клетках эпителиальных опухолей ТК

Муцины - семейство высокомолекулярных гликопротеинов, которые выявляются в железистом эпителии и являются одним из основных компонентов слизи в респираторном, пищеварительном и урогенитальном тракте, выполняя защитную функцию [J.Perez-Vilar et al, 1999].

Муцин 2 типа относится к секреторным муцинам и в норме секретируется в бокаловидных клетках кишечника [A.Velcich, 1997], тогда как муцин 1 типа появляется только при дисплазии эпителия слизистой, и в клетках нормальной слизистой толстой кишки не выявляется [С. Carrato et al, 1994].

В клетках ТВА отмечалась выраженная экспрессия MUC2 в поверхностных и в центральных отделах опухоли, тогда как иммунореактивности к MUC1 выявлено не было.

Шкала полуколичественной балльной оценки экспрессии муцинов 1 и 2 типов разрабатывались нами с учетом экспрессии протеинов в клетках нормальной слизистой, в связи с чем они представляют собой противоположные последовательности.

Оценка экспрессии MUC1: отсутствие экспрессии (как в норме) - 0 баллов; экспрессия локализовалась в просвете менее 50% опухолевых желез - 1 балл; экспрессия локализовалась в просвете более 50% опухолевых желез - 2 балла; экспрессия локализовалась в просвете желез и цитоплазме менее, чем в 50% опухолевых клеток - 3 балла; в просвете желез и цитоплазме более, чем в 50% опухолевых клеток - 4 балла.

В ткани АК ТК экспрессия MUC1 была гетерогенной: выявлялась в слизистом содержимом просвета желез, на апикальной поверхности мембран железистых клеток и/или в цитоплазме опухолевых клеток.

В зависимости от клинической стадии опухоли ТК отмечалось тенденция к увеличению накопления MUC1 в тканях АК ТК: во II стадии в 17% (3 из 18) случаев выявлялась экспрессия в цитоплазме опухолевых клеток, в III стадии - в 35% (7 из 20) случаев, в IV стадии число позитивных случаев увеличивалось до 43% (3 из 7) случаев.

Оценка экспрессии MUC2 в клетках АК ТК: антиген экспрессировапи более 30% клеток опухоли - 1 балл; антиген экспресснровалн 10-30% клеток - 2 б&чла; антиген экспрессировапи менее 10% клеток - 3 балла; единичные клетки, не более 3% - 4 балла;

В 52% (14 из 27) АК ТК II клинической стадии интенсивность экспрессии MUC2 была 1-2 балла, в III стадии - 48% (12 из 25), в IV - 37,5% (3 из 8) случаев.

В результате исследования было показано, что при снижении степени дифференцировки опухолей и увеличении клинической стадии заболевания

интенсивность экспрессии муцина 2, в норме выявляющегося в бокаловидных клетках слизистой ТК, уменьшается, а муцина 1 - увеличивается.

Исследование адгезивных свойств клеток эпителиальных опухолей ТК

В процессе эмбрионального развития и гистогенеза тканевых структур важная роль принадлежит межклеточным контактам, которые осуществляются при помощи ряда адгезивных факторов. Аномалии межклеточных контактов в опухолевой ткани могут стать пусковым механизмом инвазии и опухолевой прогрессии.

Экспрессия Е-кадхерина Е-кадхерин - адгезивная молекула, характерная для клеток эпителия, в том числе, слизистой кишечника [Т.Оше1сЬепко е1 а], 2001]. В неизмененном эпителии слизистой ТК Е-кадхерин выявлялся в 100% клеток в виде равномерного мембранного окрашивания.

В опухолевой ткани реакция с антителами к Е-кад имела ряд особенностей. Поэтому анализ производился с учетом количества позитивных клеток и типа экспрессии молекул. Нами были выделены следующие типы иммунореативности к Е-кад.: 1) мембранный, нормальный, тип экспрессии - равномерное распределение по мембране; 2) мембранно-редуцнрованный тип экспрессии - распределение иммунореактивности на отдельных участках клеточной мембраны; 3) цитоплазматический тип - равномерное распределение экспрессии в цитоплазме; 4) гетерогенный тип - сочетание мембранного и цитоплазматического типов экспрессии; 5) отсутствие иммунореактивности. В соответствии с интенсивностью реакции и локализацией экспрессии Е-кад была разработана шкала оценки: 1 балл - нормальный, мембранный тип экспрессии в 100% клеток; 2 балла - цитоплазматический и гетерогенный типы экспрессии в 100% клеток; 3 балла - редуцированный мембранный, диффузный цитоплазматический и гетерогенный типы в менее 50% клеток.

В клетках исследованных нами ТВА экспрессия Е-кад соответствовала 1 баллу, т.е. была мембранной, равномерной по интенсивности, аналогичной экспрессии прилежащей к опухоли непораженной слизистой ТК.

По типу экспрессии Е-кад все исследованные опухоли толстой кишки были разделены на 2 большие группы: с нормальной, мембранной, экспрессией и с аномальной (цитоплазматической, гетерогенной и мембранно-редуцировашгой) экспрессией этих адгезивных молекул в клетках. В зависимости от клинической стадии опухоли доля клеток с мембранной экспрессией снижался. В клетках ТВА мембранная экспрессия Е-кад выявлялась в 100% случаев, в АК II стадии количество случаев с нормальной экспрессией

Е-кад соответствовало уже 30%, в АК III стадии - 8%, а в IV стадии - мембранный тип экспрессии не отмечался вообще.

Напротив, аномальная экспрессия Е-кад в клетках ТВА отсутствовала, в АК II стадии отмечалась в 70% случаев, в АК III стадии - в 89%, а в АК IV стадии - в 100%.

При снижении степени дифференцировки опухолевых клеток также меняется характер экспрессии Е-кад. Интенсивная мембранная реакция Е-кад в 100% случаев отмечалась в клетках ТВА, в 54% случаев - в клетках ВД АК, в 11% случаев - УД АК, а в клетках НД АК экспрессия Е-кад была аномальной.

Снижение степени дифференцировки эпителиальных опухолей ТК и возрастание их инвазивного потенциала сопровождалось уменьшением, а также изменением типа экспрессии Е-кадхерина в опухолевых клетках. Очевидно, что аномальная экспрессия Е-кадхерина в клетках АК ТК, которая является следствием клеточных мутаций, ведет к изменению клеточной дифференцировки и способствует прогрессированиго опухолей.

Экспрессия В-катенина. (?-катешш - это цитоплазматический протеин, который, связываясь с Е-кад, обеспечивает стабильные межклеточные адгезивные связи [М.А.СЬНаеу е1 а], 1998; М.Р.МсЕШес е1 а1, 1999 ]. В слизистой толстой кишки р-катенип равномерно выявлялся па клеточной мембране и в цитоплазме клеток поверхностных и базальных отделов крипт.

Во всех исследованных нами эпителиальных опухолях ТК отмечалась экспрессия (5-кат в подавляющем большинстве клеток, которая варьировала в зависимости от локализации молекул в клетке. Наблюдались следующие типы экспрессии Р-кат: 1) мембранный - экспрессия на поверхности клеточной мембраны; 2) цитоплазматический -локализация в цитоплазме клеток; 3) гетерогенный - сочетание мембранного и цитоплазматнческого типов; 4) ядерный - экспрессия протеина в ядре.

В неповрежденной слизистой ТК и в клетках ТВА выявлялся мембранный и цитоплазматический типы экспрессии. В 3 из 5 случаев (60%) ТВА отмечалась гетерогенная экспрессия к р-кат, представленная и мембранным, и цитоплазматическим типами.

В результате проведенного исследования было установлено, что р-кат может выявляться в различных клеточных структурах: на мембране, в цитоплазме, а также в ядре опухолевых клеток. При этом мембранный, а также цитоплазматический типы экспрессии, помимо АК ТК, были обнаружены в эпителии слизистой ТК и ТВА, тогда как ядерный тип экспрессии проявлялся только в клетках АК ТК, в основном, в Ш-1У клинических стадиях опухолей. Характерно также, что ядерный тип экспрессии чаще выявлялся в

участках инвазивного роста. В солидных участках НД АК экспрессия этих молекул также была ядерной.

Экспрессия СР44Н. СИ44Н - трансмембранный гликопротеин, участвующий в межклеточных и клеточно-матриксных взаимодействиях [Р.НеггНсЬ е1 а1, 1995; Н воЛат, 1996]. В нормальной слизистой ТК экспрессия СР44Н отмечалась в эпителии базапьных отделов крипт ТК на поверхности клеточных мембран.

Однако в ткани опухолей ТК иммунореактивность С044Н также имела различную локализацию. В связи с этим были предложены следующие критерии оценки: апикальный мембранный тип - мембранная экспрессия, преимущественно в апикальной части клетки; базальный и базолатеральный типы - мембранная экспрессия, преимущественно в базальных и базолатеральных отделах клеток; мембранный равномерный тип -равномерная экспрессия по всей поверхности мембраны клеток; цитоплазматический тип - распределение молекул в цитоплазме клеток ; отсутствие экспрессии молекул.

Установлено, что в зависимости от степени дифференцировки опухоли и стадии опухолевого процесса экспрессия С044Н имела различную интенсивность и локализацию в клетке. В клетках ТВА ТК и части ВД АК отмечалась выраженная равномерная базолатеральная и базальная экспрессия адгезивных молекул в опухолевых клетках, тогда как в низкодифференцированных (87,5%) и в ряде умереннодифференцированных (53%) АК реакция была цитоплазматической пли отсутствовала.

Изучение факторов, участвующих в регуляции клеточного чикла — п 53, ВАХ и Вс1-X, И67

Экспрессия ВАХ и Вс1-Х. Нами были исследованы особенности экспрессии протеинов индуктора и ингибитора апоптоза ВАХ и Вс1-Х в эпителиальных опухолях ТК (ЖМ.ВоесМеМ и а1, 2003; А.Сгас1ю1опе е1 а1, 2003]. Реакция оценивалась по локализации протеинов, интенсивности экспрессии и проценту позитивных клеток опухоли. Для оценки локализации экспрессии ВАХ и Вс!-Х была предложена следующая система: экспрессия в виде мелких гранул в апикальной зоне клеток - 1 балл; сочетание крупногрануляриой или диффузной цитоплазматической экспрессии с апикальной зернистостью - 2 балла; кругшогранулярная и диффузная цитоплазматическая экспрессия -3 балла.

Было выявлено, что при возрастании инвазивного потенциала АК изменяется тип экспрессии протеинов, а также уменьшается количество, главным образом, Вс1-Х-положительных клеток, особенно в зоне инвазии опухоли.

Экспрессия ВАХ и Вс1-Х в нормальной слизистой, ТВА и части АК ТК выявлялась в цитоплазме апикальной зоны клеток в виде мелких гранул. В клетках УД и НД АК отмечались и другие типы экспрессии, которые были расценены нами как аномальные -цитоплазматическая, в виде крупных гранул в перинуклеарных или базальных отделах клеток и диффузное распределение экспрессии по всей цитоплазме клеток.

Учитывая выраженную гетерогенность экспрессии протеинов Вс1~Х и ВАХ, нами была разработана формула для оценки экспрессии ВАХ и Вс1-Х, в которой учитывались процент позитивных клеток (ППК), интенсивность (И) реакции (в баллах) и локализация (Л) экспрессии протеинов ВАХ и Вс1-Х (в баллах): ППК х И х Л

Для сравнительной оценки экспрессии протеинов ВАХ и Вс1-Х мы использовали условный «коэффициент апоптоза» как отношение интенсивности экспрессии Вс1-Х к ВАХ, выраженных в баллах. В результате исследования показано, что коэффициент апоптоза снижался по мере возрастания инвазивного потенциала опухоли. Количество наблюдений с коэффициентом апоптоза менее 1 резко возрастало в группе АК с низкой степенью дифференцировки ( 86%, 6 из 7), тогда как случаев с коэффициентом апоптоза более 1 выявлено не было.

Экспрессия р53. Р53 - белок-регулятор апоптоза и клеточного цикла [Б.П.Копнин и соавт., 2000; Ы.ТСагг е1 а1, 2002]. В клетках слизистой ТК и ТВА экспрессии протеина р53 выявлено не было, тогда как в АК ТК она наблюдалась в 68% случаев.

В клетках АК II клинической стадии экспрессия протеина р53 наблюдалась в 59% ( 16 из 27) случаев, из них только в 33% (9 из 27) случаев отмечалась интенсивная реакция (более 40% меченых ядер). На III клинической стадии количество позитивных наблюдений составило 73% ( 16 из 22), при этом количество случаев с выраженной иммунореактивностыо р53 достигло 50% (11 из 22). В IV стадии в клетках всех АК выявлялась экспрессия протеина.

Соответственно, отсутствие экспрессии р53 в клетках АК II клинической стадии было обнаружено в 41% (11 из 27) случаев, в III стадии - в 27% (6 из 22) случаев, а в IV клинической стадии р53-негативных опухолей не было выявлено вообще.

В группе ВД АК отсутствие экспрессии р53 в клетках отмечалось в 42% (5 из 12), в УД АК - в 33% (11 из 33), а в НД АК - в 14% (1 из 7) случаев. При снижении степени дифференцировки опухолевых клеток отмечается увеличение р53-позитивных случаев.

Была выявлена зависимость между наличием экспрессии протеина р53 в клетках АК ТК и клинической стадией опухоли, а также степенью дифференцировки опухолей. При увеличении клинической стадии и снижении степени дифференцировки опухолей количество р53-позитивных случаев увеличивается.

Изучение пролиферативной активности эпителиальных опухолей ТК. Пролиферативная активность клеток 71 опухоли оценивалась с помощью индекса пролиферации Ki67 [Y.Suzuki et al, 2002; M.Parton et al, 2002], способ оценки которого описан выше. В прилежащей к опухоли слизистой ТК Ki 67 выявлялся в базальных отделах крипт (камбиальной зоне), где индекс пролиферации был не менее 40%. В ТВА он был достаточно высоким, максимальное значение его достигало 47%. В исследованных АК ТК индекс Ki67 варьировал в широких пределах 12-81%. Таким образом, исследование пролиферативной активности клеток нормальной слизистой и эпителиальных новообразований ТК показало, что четкой корреляции между этим показателем, степенью дифференцировки опухоли и стадией опухолевого процесса не выявляется.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение молекулярно-биологических механизмов канцерогенеза открывает новые возможности диагностики и профилактики рака толстой кишки, помогает в определении инвазивных свойств и злокачественного потенциала опухолей этой локализации.

В связи с этим, в последнее время возрастает интерес к изучению закономерностей гистогенеза рака толстой кишки, фенотипических и ультраструктурных особенностей дифференцировки опухолевых клеток [Ю.И.Патютко, И.В.Сайгадак , 2001].

Экспрессия цитокератина 20, в большей степени, и цитокератина 19, в меньшей степени, характеризует особенности дифференцировки эпителия ТК. Эти молекулы являются тканеспецифическими маркерами клеток эпителиальных опухолей ТК - аденом и аденокарцином. Однако, помимо дифференциально-диагностической значимости, выявление этих протеинов может быть использовано в качестве фактора прогноза клинического течения опухолей, как показателя степени дифференцировки опухолевых клеток. В результате проведенного исследования было установлено, что в АК ТК при уменьшении степени клеточной дифференцировки интенсивность экспрессии этих цитокератинов прогрессивно снижалась. Экспрессия цитокератинов 19 и 20, характерная для дифференцированных энтероцитов неизмененной слизистой, отмечалась в клетках 43% и 11% случаев ВД АК, 35% и 10% - УД АК и 14% и 0% - НД АК. Однако зависимости между клинической стадией опухолей и особенностями экспрессии цитокератинов 19 и 20 выявить не удалось.

Другими тканеспецифическими маркерами эпителиальных опухолей ТК являются муцины - гликопротеины, которые синтезируются в клетках опухолей ТК. В норме в клетках слизистой ТК выявляется муцин 2, тогда как экспрессия муцина 1 является одним из признаков злокачественной трансформации клеток. Уменьшение степени дифференцировки клеток сопровождалось уменьшением экспрессии муцина 2 и накоплением муцина 1 в просвете железистоподобных структур и в цитоплазме клеток опухолей. Та же картина отмечалась и по мере увеличения клинической стадии АК ТК. Следовательно, при увеличении инвазивных свойств опухолей продукция муцина 2 клетками уменьшается, а муцина 1 - увеличивается.

Роль молекул межклеточной адгезии в канцерогенезе ещё недостаточно хорошо изучена. В результате проведенного исследования были описаны характерные особенности локализации молекул межклеточной адгезии в норме и в опухолях. В неизмененной слизистой Е-кадхерин выявлялся на поверхности клеточной мембраны в 100% клеток, р-катенин - на поверхности клеточной мембраны и в цитоплазме клеток, а С044Н - на мембране клеток преимущественно базальных отделов крипт. Появление аномальных, типов экспрессии Е-кадхерина (цитоплазматического, мембранно-редуцированного), а также уменьшение интенсивности экспрессии этого протеина отмечалось на более поздних клинических стадиях заболевания. Ядерная аккумуляция р-катенина и цитоплазматический тип экспрессии С044Н, а также полное отсутствие иммунореактивности к Е-кадхерину и С044Н в клетках характеризуют наиболее злокачественные опухоли и указывают на плохой прогноз.

В эпителиальных опухолях ТК функции генов, регулирующих клеточный цикл, изучались достаточно широко, однако полученные результаты противоречивы.

В настоящем исследовании показано, что в ткани АК по сравнению с нормальной слизистой и ТВА, отмечалось сверхэкспрессия протеинов ВАХ и Вс1-Х, и выявлен ряд характерных особенностей их экспрессии. В нормальных энтероцитах экспрессия как ВАХ, так и Вс1-Х имела вид мелкой зернистости, преимущественно в апикальных участках клеток, тогда как в клетках АК ТК протеины преимущественно распределялись равномерно по всей цитоплазме или в виде крупных гранул в перинуклеарных зонах. По мнению ряда исследователей уменьшение экспрессии индуктора апоптоза ВАХ и накопление ингибитора апоптоза Вс1-Х в клетках АК ТК является критерием плохого прогноза [А.Виоссю й а1, 2001; Е. С^ига е1 а1, 1999]. Однако, по данным настоящего исследования, рост опухоли, сопровождающийся уменьшением степени дифференцировки клеток и увеличением инвазивного потенциала, ассоциирован с тенденцией к снижению интенсивности экспрессии Вс1-Х относительно ВАХ.

Во многих исследованиях было показано, что в клетках злокачественных эпителиальных опухолей ТК наблюдают сверхэкспрессию протеина р53, что свидетельствует об ухудшении прогноза опухоли и повышении резистентности клеток к противоопухолевой терапии. В настоящем исследовании экспрессия р53 отмечена в 68% (36 из 53) случаев АК, при этом количество р53-позитивных опухолей увеличивалось по мере снижения клеточной дифференцировки и увеличения клинической стадии опухоли.

Имеются данные [Н.Н.ТВаскив е1 а1, 2002], что активная клеточная пролиферация свидетельствует о неблагоприятном прогнозе, однако полученные нами результаты этому противоречат. В нашем исследовании было выявлено, что средний индекс пролиферации Ю 67 в клетках ТВА ^асто значительно выше, чем в клетках АК, т.е. пролиферативная активность опухолевых клеток не всегда коррелирует со степенью злокачественности процесса.

При сравнительной оценке экспрессии различных групп маркеров в клетках АК ТК выявлена корреляция между экспрессией молекул межклеточной адгезии и рядом тканеспецифических маркеров. Так, снижение иммунореактивности клеток к цитокератинам 19 и 20 типов сопровождалось уменьшением интенсивности экспрессии нормального типа и появлением аномальных типов экспрессии Е-кадхерина, СИ44Н и |3-катенина в клетках АК ТК. В клетках АК ТК с ядерной локализацией р-катенина отмечалась гиперэкспрессия муцина 1 и р53.

ВЫВОДЫ:

1. Важными параметрами для оценки прогноза клинического течения аденокарципом толстой кишки является совокупность особенностей гистологического строения опухоли и иммунофенотипической характеристики опухолевых клеток. При исследовании установлено, что нммунофенотни клеток адснокарцнном толстой кишки различной степени дифференцировкп и различной клинической стадии заболевания ассоциирован со степенью дпфферсицнровки опухолевых клеток.

2. Экспрессия цитокератинов 19 и 20 и ее локализация в цитоплазме характеризует степень дифференцировкп опухолевых клеток. В нпзкоднфференцированных опухолях интенсивность экспрессии цитокератинов 19 и 20 в опухолевых клетках уменьшается.

3. Муцины 1 н 2 типа являются тканеспенифнческпмн маркерами клеток железистого эпителия. Муцин 1 типа нммуногистохнмпчсскн не выявляется в эпителии нормальной слизистой и тубуло-ворсинчатых аденомах толстой кишки, тогда как муцин 2 типа экспресснруется в бокаловидных клетках слизистой, всех клетках тубуло-ворсинчатых аденом н части высокоднфферсицированных аденокарципом. Экспрессия муцина 1 выявляется в просвете желез адснокарцнном толстой кишки, а при увеличении злокачественного потенциала опухолей - и в цитоплазме опухолевых клеток. Интенсивность экспрессии муцина 2 типа при уменьшении степени опухолевой дифференцировкп и увеличении клинической стадии заболевания снижается.

4. Эпителиальные новообразования толстой кишки отличаются по интенсивности и типу экспрессии молекул межклеточной адгезии. В клетках тубуло-ворсинчатых аденом отмечалась нормальная экспрессия Е-кадхернна, р-катспина и С1)44Н. Мембранная экспрессия Е-кадхерина н СВ44Н выявлялись в 100% случаев, а р-катепин выявлялся па мембране и в цитоплазме опухолевых клеток. В клетках аденокарципом толстой кишки снижение степенй дифференцировкп, возрастание нпвазнвного потенциала и стадии опухоли ассоциировалось с уменьшением

нормальной мембранной экспрессии, а также появлением аномальных типов экспрессии Е-кадхерина, С1)44Н и р-катенина.

5. Протеины-регуляторы апоптоза ВАХ и Вс1-Х выявлялись в клетках опухолей толстой кишки в виде мелких и крупных гранул или в виде диффузного окрашивания в различных участках цитоплазмы. В эпителиоцитах нормальной слизистой, тубуло-ворсинчатых аденом и части аденокарцином отмечалась мелкогранулярная экспрессия протеинов в апикальной части клеток. В клетках низкоднфференцированных аденокарцином и на более поздних клинических стадиях заболевания иммунореактивность к протеинам ВАХ и Вс1-Х была диффузной или крупногранулярпои и выявлялась перинуклеарио.

6. Экспрессия белка р53 в эпителиоцитах нормальной слизистой, тубуло-ворсинчатых аденом и части высокодифференцированных аденокарцином отсутствовала. Среди низкоднфференцированных аденокарцином толстой кишки и при увеличении стадии опухолевого роста частота р53-позитивных опухолей увеличивалась.

7. В клетках АК ТК была выявлена зависимость между экспрессией тканеспецифических маркеров и молекул межклеточной адгезии. Снижение экспрессии цитокератинов 19 и 20 сопровождалось изменением типа и интенсивности нормальной экспрессии Е-кадхерина, С044Н и р-катенина в опухолевых клетках. В клетках низкоднфференцированных аденокарпцином толстой кишки с ядерной локализацией р-катенина отмечалась гиперэкспрессия

мис1.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. The analysis of immunophenotype of gastrin-producing tumors of pancreas and 'gastrointestinal tract// Cancer, 2003, V.98,№9, P.1967-76 ( соавт. - L.Gurevich, I.Kazantseva, V.Isakov, A.Egorov)

2. Особенности экспрессии Е-кадхерина, муцина-2 Ki 67 в аденокарциномах толстой кишки II Архив патологии,- 2003.- №5.-15-17

3. Особенности экспрессии CD44 в эпителиальных опухолях толстой кишки// Материалы IV конференции российских патологоанатомов «Новые методы и разработки в онкоморфологии», 2005. 91-92 (соавт. - Казанцева И.А., Гуревич J1.E., Устинова Е.И.)

Типография ордена "Знак Почета" издательства МГУ 119992, Москва, Ленинские горы Заказ № 135 Тираж 100 экз.

Актуальность проблемы

Проблема морфологической диагностики рака толстой кишки а пленнике время имеет особую актуальность, что связано с постоянным ростом заболеваемости раком лом локализации В большинстве экономически развитых стран Европы и Северной Америки частота заболеваемости колоректалъным раком среди злокачественных новообразований »«имеет второе-третье место у лип обскао пола [34] В России холоректильный рак в общей структуре онкозаболсвасмоети и |999г ши 5 место н составил 9,3%. Показатель неблагоприятного прогноза данного заболевания, чгрут заболеваемости те соотношение показателей смертности к заболеваем«:тн. по данным ] 999г. в России достиг 0,72 при раке ободочной и 0,76 при раке прямой kjhumi [i, б)

Высокий уровень смертности во многом связан с поздней диагностикой, 'гго н определяет низкую эффективность лечения Известно. что значительный процент опухолей выявляют в яикурабешон состоянии, поэтому 90% пациентов умирает от рецидива ябомниш. [9] В связи с ЖИМ очень важным являете* изучение факторов прогноза, которые непосредственно влияют на выживаемость больных

Основным критерием степени злокачественности в патоморфологнчсскоА диагностике адсиокарцииом Толстой кишки согласно «Международной Г и столо П1 чес кой Классификации опухолей кишечника» является степен]> диффереицировжн опухолевых клеток [11]. Пол обнос подразделение опухолей по мнению большинства исследователей достаточно субъективно и ие может характеризовав истинный злокачественный котенцкал номобрШПИШ 111( 4S, 49, 50}. Для того, чтобы оценить инвазн аноеть опухоли и судить о ее nponwse недостаточно рутинного ihctoлогического исследования. Потенциал злокачественности, ДОНСЯЩНЙ or степени иквазнвноети опухоли, во многом определяется фенотипоы опухолевых клеток, при этом особое значение имеет изучение экспрессии ряда клеточных маркеров, участвующих и механизмах канцерогене», таких как онкобелхи. протеины, связанные е алоптоэом, межклеточной адге»ией и пролиферацией

С этих позиций исследование нммунофеиогипа клеток эпителиальных опухолей толстой кишки ииеет большое прахпчесхое значение, оно позволяет уточнил. ЛИiUiюз и более объективно сулить о прогнозе заболевании

Предпринятое нами комплексное гистологическое и шымуногнстохнмическос исследование факторов. учасгвутощнл в мехами хмах даíцсроreнем и опухолевой прогрессии с определением иммунофенотипа клеток разных гистологических вариантов опухолей толстой кишкн направлено на совершенствование морфологической диагностики предраковых заболеваний и рака толстой кишкн, а также уточнение прогнои -иболемяня, что будет способствовать разработке оптимальной тактики их лечения,

Цель исследования На основе иммунофенотипнрования клеток опухоли установи п. морфологические критерии дифференциальной диагностики и прогноза эпителиальных опухолей Толстой кишки Задачи исследования

1. Сравнительное изучение ромични* ткяиеспеинфнчсских маркеров, исследование особенностей экспрессии их в клетках эпителиальных опухолей толстой кишки разной степени днфферснцировхн

2. Исследование экспрессии молекул клеточной адгезии в различных гистологических вариантах опухолей толстой кншкн.

Изукнне особенностей экспрессии в опухолевых клетках протеинов, участвующих а регуляции процессов аиоггтоза н клеточной пролиферации ( р53, ВАХ. Вс1-Х н Ki 67). 4, Выявление клннико-ыорфолотнческих корреляций при раке толстой кишки с учетом феногипической характеристики опухолевых клеток. Материал и методы исследования: | Материал операционных и лиагносгичсеких биопсий от 69 пациентов и 2 аутопсий .2 Анализ клинических данных больных; 3 результаты гистологических и иымуногнстохимнческнх исследований аленокарцнном н доброкачественных новообразований (олеиомы) толстой кишкн с использованием панели поли- и моноклинальных антител Научная повита исследования

В работе впервые выполнено комплексное гистологическое и нммунотнетохимичесхое исследование клеток доброкачественных н злокачественных глнгелнальмых новообразований толстой кишки с использованием специально разработанной панели молскудирно-биологнчсскнх маркеров - антител. Осуществлен сравнительный анализ фснотипичсских особенностей клеток нормальной слизистой и новообразовании толстой кишки - аденом н алеиокарцннам. Показано, что при изменении клеточной дифферсицировки и кнваэияных свойств адецокарцином менялся нммуиофенотнп клеток опухолей. На основе анализа результатов исследования нммунофенотина опухолевых клеток про ведена оценка биологического потенциала опухолей толстой кишки В работе выявлены существенные различил в интенсивности и локализации экспрессии тюшеспеиифнческнх протеи поп (иктокерлтипов 19,20 типа и муцинов t. 2 типа), а также молекул межклеточной адгезии (Е-калхерниа. ß-отснкна и CD44H} н протеин» ■ регуляторов плеточного цикля (8АХ и Ek1-X. р53. K¡67) в клетках ту бул о- юре и н чатых аденом и аденок арии ном толстой кишки в зависимости от степени днфференцнровкн н клинической стадии заболевания. Показано, что при снижении степени дифференцирован и возрастании ннвазнвного потенциала опухолей ннтенсивпостъ экспрессии антигенов, характерных для нормального эпителия толстой кишки, шггокератпнов 19 и 20. муцина 2 тина в цитоплазме опухолевых клеток снижается, а мушша I типа возрастает, Для шихвшфферешпропшшх аденокарииноы е высоким потенциалом злокачественности было свойственно появление аномальных типов экспрессии молекул межклеточной адгезии Е-кадхернна, ß-катеинна и CD44H. Покатано, что следствием нарушения днфференцнровкн клеток является н изменение локализации. а также и интенсивности экспрессии в клетках злокачественных опухолей протеинов-регуляторов апоптоза В АХ и Вс1-Х. Выявлено, что сверхэкспрсссни белка р53 свидетельствует о неблагоприятном прогнозе течения заболевания. Уровень п рол и фе рати ni ю й активности эпителиальных опухолей толстой кишки варьирует в широких пределах и, по нашим данным, индекс пролиферация Ki 67 не может служить безусловным признаком злокачественного потенциала опухолей этого типа. Полученные результаты могут быть использованы дли диашостнкн н прогнозирования новообразований толстой кишки, а также для разработки более эффективны?! схем их терапии.

Теоретическая и практическая значимость работы

В работе покатаны различные молекулярио-клеточные механизмы, лежащие в основе злокачественной трансформации клеток эпителиальных опухолей толстой кишки Установлены нммуногистохимичсскнс маркеры, совокупность которых позволяет проводегп, лкффсрсицимыдоо диагностику этих новообразований. Полученные дш!ные могут быть использованы для более точной оценки инваянвного потенциала и пропит данной группы опухолей,

Результаты работы могут быть использованы дня дифференциальной диагностики л практической деятельности патологоаиитомнчсскнх отделений, в работе отделений кололроктологни. онкологии, а также для научно-исследовательских разработок на кафедрах и в научно-исследовательских институтах

выводы

1. Важными параметрами „тли сценки прогноза клинического течении иленокарцнном толстой кишки ввлястсИ еоноку пноегь особенностей ■ ncio.ioi нческого строении оитшк и иммунофенотнпнческой характеристики опухолевых клеток, При исследовании тонмьтспо, что нммунпфснопш клеток ллепокарнином ТОЛСТОЙ кишки различной степени лнфференинровкн н раит.gft клинической стадии заболевания ассоциирован ео степенью днфференшгровки опухолевых клеток,

2. Экспрессия инюкеритниоа 19 и 20 и ее локализации в интонлазмс *яра.ктсризугт степень днфферпшировкн опухолевых клеток. В ншкчцнффсрсннн ронянных опухоли! интенсивность экспрессии нпюкеритннов 19 н 20 в опухолевых клетках уменьшается.

3. Мунниы I и 2 тина являются ткансспсцифнческнмн маркерами клеток железистого »нигелии, Мупнн 1 типа нммуногистохнмнческн не выявляется в лштслин нормальной слизистой н тубуло-ворсничдтых лленомах толстой кишки, тогля как мупнн 2 шил экспресснруета в бокал«пилим* клетках слизистой» всех клетках тубуло-варсиичвтыя «кнкм и части аысака.гмффсрсипнримшггых пленокирпниом- Экспрессии муиипо I выявляется п просвете желез яленокяриниом гипоП кишки, а при увеличении злокачественного потенциала опухолей - и н цитоплазме опухолевых клеток. Интенсивность экспрессии муцина 2 типа ирн уменьшении степени опухолевой лифферснинровкн н увеличении клинической стадии заболевании снижается,

Эпителиальные новообраюханнм толстой кишки отличаю!си по интенсивности и шну экспрессии молекул межклеточном адгезии, В клетках туС>ло-ворсннчатмх аденом отмечалась нормальная экснреесни Г-калхсрнна, р-катенина и С&44Н-Мембранння экспрессия Е-ка,перина и CD44H выннлилнеь в 100% случаев, л катении выявлялся на мембране и в цитоплазме опухолевых клеток, В клетка* аленокврнином толстой кишки снижение степени лнфференинровкн, ввзряетянне и н вяз и иною потенпнала и стадии опуюлн ассоциировалось с уменьшением нормальной мембранной экспрессии, а также появлением аномальны! типов экспрессии Е-калхсрнив» CD44H и р-катеннна.

5, IIpùuiiHij-|»ti y.tuiíppM апоптоза в АХ и вс1-Х «ПЫШПСЬ в кяетш опухолей толстой кишки в пинт мел kin н крупных грянул пли в iulk диффузного окрашивания в различных участках цитоплазмы. В эшпслношн л нормальной елшнетой. туСулмрсЯПИШ аденом и части адемпкарцином отмечалась чслкограну.шрнаа экспрессии пропит» в апикальной чае!и клеток. в метки нптколмфферешшрвваиных пленокарпниоч и на более поздних клинических стадиях шбемевяний цммунореактиниосгь к протеинам В АХ и Вс1-Х был* диффузной пли крупиогрзиулнрной h выивлилась перину клеарна.

6, Экспрессия белки р53 в шнтелноинтя! нормальной слизистой, тубуло-ворсинчатых пленом и части высоко,шфференцнровамшаденокярцшгом отсутствовала. Среди ннзкоднфференцирйяанных яденокарцнном толстой кишки и при увеличении стадии опухолевого роста частота р53-пазнтнвны1 опухолей увеличивалась.

7, В клетках АК ТК были выявлена зависимость меасду экспрессией тквиеснеиифическнх маркеров и »ig;icKi,i межклеточной адгезии. Сгавкенне жспрессва пптокерятннов 19 Н 20 сопровождалось изменением тина и интенсивное tu нормальной экспрессии Е-кад перина, CÍW-JH м jt-катемнна и опухолевых клетка*. В клетках ннзкодифференцнроваины* аденокврпнном толстой кишки ç ядерной локализацией Kin гмина отмечалась i ыиср женрессня MUCI.

заключение

Изучение молекулярных механизмов развития опухолей и использование молскулярно-бнологическнх методов исследования открывает новые возможности диагностики и профилактики рока толстой кишки, помогает в определении инвазнвных свойств и биологического потенциала опухолей этой локализации

В связи с этим, в последнее время возрастает интерес к изукнию закономерностей гистогенеза рака толстой кишки, фенотипнчмких и ультраструктурных особенностей лиффереипнровкн опухолевых клеток. (9]

Экспрессия СК 20 в большей степени, и СК 19, а меньшей стелет, характеризует особенности лифференцировки эпителия ТК. а также является ткансспеинфнчесхим маркером клеток эпителиальных опухолей ТК - аденом и ааснокариином Однако, помимо дифферсттальио-лиапгостнчгекой значимости» выявление этих протеинов может был, использовано в качестве фактора прогноза клинического течения опухолей, являясь своего рода показателем степени днфференцнровки опухолевых клеток. В результате проведенного исследования было установлено, что в АК ТК при уменьшении степени клеточной дифферснинровкн интенсивность экспрессии цнтокератннов в них прогрессивно снижалась. Экспрессия цитокератннов 19 и 20, характерная для дифференцированных эитсроинтов неизмененной слизистой, отмечалась в клетках 43% И 11% случаев ВД АК» 35% и 10% -УД АК и 14% н 0% - НД АК. Однако зависимости между клинической стадией опухолей и особенностями экспрессии СК 19-20 выявить iw удалось.

Другими тканесиецнфическнмн маркерами эпителиальных опухолей ТК являются муцины (MUC) - г л нкоиротсины, которые синтезируются в клетках опухолей ТК, В норме в клетках слизистой 'ГК выявляются молекулы MUC2, тогда как экспрессия MUC1 является одним из признаков злокачественной трансформации клеток, Уменьшение степени лифференцировки клеток сопровождалось уменьшением зкспресснн MUC2 и накоплением MUCI в просвете жслезисгоподобиых егрукур и в штииазме клеток опухолей. Та же картина отмечалась и по мере увеличения клинической стадии АК ТК, Очевидно, что при увеличении инвазнвных свойств опухолей продукция MUC2 клетками уменьшается и в опухолевой ткани происходит накопление MUC1

Роль молекул межклеточной адгезии в канцерогенезе недостаточно хорошо изучена В результате проведенного исследования нами были описаны характерные особенности локализации молекул межклеточной адгезии в норме и в опухолях. В нормальной неизмененной слизистой Е-кадхерина выявлялся на поверхности клеточной мембраны в 100% хлеток» р*кдтеннн - на поверхности клеточной мембраны и в шгтолдвме клеток, о СР44Н НА мембране клеток преимущественно бишшв отделов крипт. Появление аномальных типов экспрессии Е-калхерииа (щгтоплазматичеекого, мембранно-редуцированиою), А также уменьшение интенсивности экспрессии этого протеина отмечалось на более поздних, клинических стадиях заболевания. Ядерная аккумуляция р-квтенкна и шггоплаэматическнй тип экспрессии CD44H, а также полное отсутствие иммунореактиаиости к Е'Кштхернну и CD44H в клетках характеризуют наиболее злокачественные опухоли н укатывают на плохой ri рот ох

В эпителиальных опухолях ТК функции генов, регулирующих клеточный цикл, изучались достаточно широко, однако результаты достаточно противоречивы

По результатам настоящего исследования в ткани АК по сравнению е нормальной слизистой и ТВ А отмечалось увеличение инмунореоктивноеги к протеинам ВАХ и Bcl-X При этом были выявлен ряд характерных особенностей их экспрессии. В нормальных энтсроиктах экспрессия как ВАХ. так и Bcl-X отмечалась в виде мелкой зернистости, преимущественно в апикальных участках клеток, тогда как в клетках части АК ТК протеины распределялись равномерно по всей цитоплазме или в виде крупных гранул в перинуклеарных зонах. По мнению ряда исследователей уменьшение экспрессии индуктора апоптоза ВАХ и накопление ингибитора апоптоза Bcl-X в клетках АК ТК является критерием плохого прогноза, Однако, по данным настоящего исследования» а процессе роста опухоли» сопровождающегося уменьшением диффереипировки клеток и увеличением их инвазнвиого потенциала, наблюдалась тенденция к снижению экспрессии Bet-X относительно ВАХ

Во многих исследованиях было показано, что клетки злока^кственных эпителиальных опухолей ТК экспрессируют протеин р53, что связано с ухудшением прогноза опухоли и повышением резистентности клеток к противоопухолевой терапии В настоящем исследовании экспрессия р53 отмечена в 68% (36 из 53) случаев АК. и количество р53-познтинных опухолей увеличивалось По мерс снижения клеточной днфферснипрелкн н увеличением клинической стадии опухоли,

Имеются данные» что активная клеточная пролиферация свидетельствует о неблагоприятном пропюэе, однако в нашем исследовании было выявлено, что в клетках ТВ А средний индекс пролиферации Ki 67 часто значительно выше, чем в клетках некоторых АК. тс продифератнаная активность опухолевых клеток зависит от многих факторов.

При сравнительной оценке экспрессии различных групп маркеров в клетках АК ТК выявлена связь между экспрессией молекул межклеточной адгезии и рядом ткансспецнфнчсских маркеров Снижение нммунореактивности клеток к СК 19 к 20 типов сопровождалось уменьшением интенсивности экспрессии нормального гиги и появлением аномальных тало» экспрессии Е-кал. CD44H и ß-кат а клетках ЛК ТК В клетках АК ТК с ядерной докалитзцней р-игг отмечались птерэкспрессия MUCI и р53