Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Иммунофенотип и клинико-морфологические особенности нейроэндокринных новообразований пищеварительной системы



На правах рукописи

КОЗЛОВ НИКОЛАЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ИММУНОФЕНОТИП И КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ НЕЙРОЭНДОКРИННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ

14.01.12- онкология, 14.03.02 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

9 ОКТ 2014

Москва-2014

005553309

005553309

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина» Российской академии медицинских наук

Директор академик РАН и РАМН, профессор

Научный руководитель: д.м.н.

Давыдов Михаил Иванович Делекторская Вера Владимировна

Официальные оппоненты:

Казанцева Ирина Александровна

доктор медицинских наук, профессор, Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского, патолого-анатомическое отделение, заведующая отделением

Борисов Василий Иванович доктор медицинских наук, профессор,

Государственное бюджетное учреждение здравоохранения г. Москвы «Онкологический клинический диспансер № 1 Департамента здравоохранения города Москвы», заместитель главного врача по химиотерапии опухолей

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится « 2014 г. в fi( часов на

заседании диссертационного совета Д001.017.0 ^Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24; на сайте ronc.ru

Автореферат разослан «х^»

Ученый секретарь Диссертационного Совета профессор, д.м.н.

-¿¿tt-f 2014 г. -7-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы.

Нейроэндокринные новообразования пищеварительной системы (НЭН ПС) представляют собой редко встречающиеся опухоли, исходящие из клеток диффузной эндокринной системы [DeLellis 2007]. Возросшая в последние десятилетия заболеваемость НЭН ПС приблизила их по частоте встречаемости к лимфоме Ходжкина и опухолями яичка [Modlin 2008]. По распространенности среди опухолей пищеварительной системы НЭН занимают второе место, уступая только раку толстой кишки [Modlin 2005].

В последние десятилетия отмечено увеличение заболеваемости НЭН ПС с 1,09 в 1973 г. до 5.25/100000 в 2004 г. [Yao 2008]. Заболеваемость НЭН ПС отмечена во всех возрастных группах, пик ее приходится на пятое десятилетие. Мужчины болеют несколько чаще женщин. Причиной роста частоты выявления НЭО, по мнению исследователей, следует считать совершенствование методов диагностики и обследования больных.

НЭН ПС обладают вариабельным биологическим поведением, их прогноз и тактика лечения могут значительно варьировать. Так, среди высокодифференци-рованных НЭН благоприятным прогнозом отличаются опухоли аппендикса и тонкой кишки, тогда как отдельные подтипы опухолей желудка и двенадцатиперстной кишки могут протекать более агрессивно [Янкин 2005, Soga 2005, Graeme-Cook 2009].

Существование столь гетерогенной группы новообразований делает актуальным создание универсальной классификации, отражающей их биологические особенности. В настоящее время практическое применение получила классификация НЭН желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и поджелудочной железы (ПЖ), разработанная Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ, 2010) на основе системы градации гистологической степени злокачественности, предложенной ранее Европейским обществом по изучению нейроэндокринных опухолей (ENETS), и системы TNM-стадирования.

Несмотря на широкое применение современной системы градации НЭН ПС, малоизученным остается вопрос, посвященный повышению степени злокачественности первичной опухоли с течением времени, а также ее изменениям в метастазах по сравнению с исходным очагом [Klímstra 2010]. Имеются отдельные данные, что не только в пределах одного опухолевого узла, но и в процессе развития первичной опухоли и ее метастазов пролиферативная активность, измеряемая с помощью ядерного антигена Ki-67, может отличаться в значительной степени [Qvigstad 1999, Dhall 2011]. При этом особую важность приобретает оценка степени злокачественности НЭО в метастазах, так как именно уровень пролифера-тивной активности опухолевых клеток является определяющим фактором выбора схемы химиотерапии [Tang 2008, Klimstra 2010].

Помимо индекса пролиферативной активности, актуальным является изучение экспрессии маркеров, отражающих особенности клинического течения и прогноз НЭО ПС. В отношении таких факторов, как цитокератин 19, рецепторы прогестерона, C-KIT и CD99 в литературе имеются данные, подтверждающие клиническую значимость их экспрессии в НЭО, однако, результаты исследований носят противоречивый характер [Goto 2004, Schmitt 2007, Knosel 2012].

Новым, ранее не изученным в НЭО, маркером индивидуального прогнозирования может служить цитоплазматический белок, связывающий ретиноевую кислоту - CRABP1. Экспрессия CRABP1 была выявлена как при in vitro моделировании эмбриогенеза островков Лангерганса, так и при развитии НЭО ПЖ у лабораторных животных [Dodge 2009; Colvin 2011].

Кроме того, интерес представляет анализ экспрессии диагностических маркеров во вторичных очагах опухолевого роста, так как более 60% больных НЭН ПС на момент постановки диагноза имеют отдаленные метастазы [Кубышкин 2004, Modlin 2008, Caplin 2010]. В частности, значительные трудности возникают при исследовании метастазов НЭН без выявленного первичного очага, что объясняется сходством гистогенеза и иммунофенотипа НЭО ПС [DeLellis 2010]. Тем не менее, показано, что использование антител к таким транскрипционным факторам

как CDX-2 и TTF-1 в 60-85% случаев позволяет установить кишечную или легоч-

4

ную органную принадлежность первичной опухоли [Sangoi 2010]. При этом, экспрессия в НЭО факторов ISL1, PDX-1 и РАХ-8, отвечающих за панкреатическую дифференцировку, остается недостаточно изученной [Ozean 2011].

Цель исследования. Изучение клинической значимости особенностей им-мунофенотипа и пролиферативной активности первичных и метастатических НЭН ПС с учетом морфологических критериев и прогноза заболевания. Задачи исследования.

1. Изучить клинико-морфологические особенности НЭН ПС, провести их оценку и градацию в соответствие с современными критериями ВОЗ и TNM-стадирования.

2. Провести сравнительный анализ морфологических и иммунофенотипиче-ских особенностей клеток первичных и метастатических НЭН ПС.

3. Проанализировать уровень пролиферативной активности и сравнить степень злокачественности в первичных опухолях и соответствующих регионарных и отдаленных метастазах на основании определения индекса Ki-67.

4. Изучить особенности ИГХ экспрессии и прогностическую значимость маркеров CK 19, PR, C-KIT, CD99 в НЭО ПЖ.

5. Определить наличие и особенности ИГХ экспрессии белка CRABP1 в НЭН ПЖ, проанализировать связь его экспрессии с клинико-морфологическими и прогностическими параметрами заболевания.

6. Провести статистический анализ полученных данных и определить наиболее значимые прогностические критерии НЭН ЖКТ и ПЖ.

Научная новизна.

В работе впервые проведено комплексное морфоиммуногистохимическое исследование первичных и метастатических НЭН ПС с использованием широкой панели дифференциально-диагностических и прогностических маркеров. Получены данные об изменении пролиферативной активности клеток первичной опухоли в ее синхронных и метахронных метастазах. Впервые выявлена иммуногистохи-мическая экспрессия белка CRABP1 в НЭН ПЖ и изучена ее связь с клинико-

морфологическими и прогностическими параметрами заболевания.

5

Практическая значимость. В работе проведено сравнительное изучение иммуноморфологических особенностей первичных и метастатических НЭН ПС, которое дает возможность проведения более точной дифференциальной диагностики НЭН различной локализации, а также позволяет повысить точность определения степени злокачественности и прогноза НЭН ПС, что будет способствовать выбору адекватной тактики лечения пациентов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. НЭН ПС — новообразования, имеющие характерные морфологические и иммунофенотипические особенности, которые достоверно не различаются между первичными и метастатическими очагами новообразования.

2. НЭН ПС могут демонстрировать достоверное увеличение пролиферативно-го индекса (ПИ) и степени злокачественности опухоли в регионарных и отдаленных метастазах.

3. CRABP1 является одним из факторов, участвующих в механизмах прогрессии НЭН ПЖ и связанных с увеличением степени злокачественности опухоли.

Апробация диссертации. Апробация диссертации состоялась на совместной научной конференции сотрудников отдела патологической анатомии опухолей человека, отделения опухолей печени и поджелудочной железы, отделения абдоминальной онкологии, отделения проктологии, лабораторий клинической биохимии и клинической онкогенетики ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН 19 ноября 2013 г. Основные положения работы доложены на 9th Annual ENETS Conference (Копенгаген 7-9 марта 2012 г.), XX Российском Национальном Конгрессе «Человек и Лекарство» (Москва, 16 апреля 2013 г.), XXI Российском Национальном Конгрессе «Человек и Лекарство» (Москва, 7 апреля 2014 г.), 25th European Congress of Pathology (Лиссабон, 2 сентября 2013 г.), XX Форуме «Национальные дни лабораторной медицины России - 2013» (Москва, 2 октября 2013 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 7 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Личный вклад автора. Автором самостоятельно проведен аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме, разработан дизайн исследования, выкопировка данных из медицинской документации, проанализированы рутинные и иммуногистохимические препараты исследуемых случаев. Под руководством и при непосредственном участии автора проведено внедрение новых алгоритмов диагностики нейроэндокринных новообразований пищеварительной системы с использованием иммуногистохимических маркеров. Статистическая обработка данных, полученных в ходе исследования, проведена с личным участием автора. Автором осуществлен анализ и интерпретация полученных данных, сформулированы выводы и практические рекомендации, оформлена диссертационная работа.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 14.01.12 - «онкология», конкретно пунктам 2, 3, и паспорту специальности 14.03.02 - «патологическая анатомия», конкретно пунктам 2, 4, 5.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 175 страницах, состоит из введения, обзора литературы, клинико-морфологической характеристики исследуемого материала и методов исследования, собственных результатов исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 11 отечественных и 163 зарубежных источника. Работа иллюстрирована 31 таблицей и 44 рисунками.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Характеристика исследуемых случаев. В исследование было включено 146 больных, оперированных в ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН в 19942011 гг., среди которых было 60 (41%) мужчин. Средний возраст больных составил 52 года (13-79 лет). Первичной локализацией опухолей в 71 (49%) случае была поджелудочная железа, в 20 (13,7%) случаях - желудок и тонкая кишка, в 16 (10,9%) случаях - толстая кишка, в 7 (5%) случаях - двенадцатиперстная кишка; аппендикс и пищевод - 2 (1,3%) и 1 (0,6%) случай, соответственно. У 9 (6,5%)

7

больных локализация первичной опухоли была неизвестна. Исследуемый материал включал 129 высокодифференцированных и 8 низкодифференцированных НЭН ПС. На момент постановки диагноза регионарные и отдаленные метастазы были выявлены у 28 (20%) и 61 (42%) больного, соответственно.

Подготовка гистологических и иммуногистохимических препаратов. Операционный и биопсийный материал опухолей фиксировался в нейтральном забуференном формалине и заключался в парафин. Срезы с парафиновых блоков окрашивались гематоксилином и эозином. Оценка НЭН ПС проводилась по гистологическому строению согласно Soga & Tazawa, наличию очагов некроза, сосудистой и периневральной инвазии, митотическому индексу (в 50 полях зрения при х400). Иммуногистохимическое исследование выполнялось на серийных де-парафинизированнных срезах опухолевой ткани с помощью биотин-стрептавидинового иммунопероксидазного метода с антителами к синаптофизину (Syn), хромогранину A (CgA), CD56, panCK, СК18, СК19, СК7, СК20, TTF-1, CDX-2, PDX-1, ISL1, виллину, p53, CD34, CD117, PR, CD99, CRABP1, D2-40, Ki-67. Срезы толщиной 3 мкм депарафинизировали и регидратировали по стандартной схеме. Для демаскировки антигенов проводили предварительную обработку депарафинизированных срезов в водяной бане при 95 °С в течение 40 мин с использованием цитратного буфера рН 6,0 (Dako). Срезы инкубировали с первичными антителами в течение 1 часа при комнатной температуре. В качестве вторичных антител и пероксидазного комплекса использовали стандартный набор реагентов LSAB+ Kit или систему детекции Super Sensitive™ Polymer-HRP ("Bi-oGenex"). Для визуализации реакции применялся раствор диаминобензидина DAB+ (Dako). Ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера. Оценка реакции в клетках опухоли проводилась полуколичественным методом с учетом интенсивности окрашивания и количества антиген-позитивных клеток. Индекс Ki-67 оценивался в зонах максимальной экспрессии антигена при 400-кратном увеличении как процент окрашенных ядер из расчета на 500-2000 опухолевых клеток.

Методы статистического анализа данных. Анализ данных проводился с

использованием программ SPSS 17.0 и Microsoft® Office Access 2007. Рассчиты-

8

вали среднее значение показателей, стандартную ошибку среднего, медианы. Достоверность различий определяли с использованием у2 теста, теста Мантеля-Хэнзеля и Краскела-Уоллиса (различия считались значимыми при р<0.05). Анализ прогностической значимости параметров и построение кривых выживаемости проводили методом Каплан-Майера. Достоверность различий выживаемости оценивалась с помощью тестов Wilcoxon и log-rank.

I

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты исследования гистологического строения НЭН ПС показали, что большинство из них было представлено высокодифференцированными НЭО, тогда как частота встречаемости нейроэндокринного рака (НЭР) составила 5,9%.

Доминирующим типом роста первичных НЭН ПС гастропанкреатодуоде-нальной зоны, тощей, подвздошной кишки и правой половины ободочной кишки, была гнездная морфология. Исключением были НЭО нисходящей ободочной и прямой кишки, которые в 50% случаев имели трабекулярное строение. В НЭО подвздошной и правой половины ободочной кишки трабекулярные структуры были представлены в минимальном объеме. Среди первичных и метастатических НЭН нисходящей ободочной и прямой кишки полностью отсутствовали ацинар-ные структуры. Вторичные очаги опухолевого роста в большинстве случаев были либо гистологически идентичны первичной опухоли (82,8% случаев), либо их строение незначительно отличалось от первичного очага (14,9%). В единичных случаях (2,3%) строение метастазов значительно отличалось от первичной опухоли, что, однако, не выходило за рамки морфологии, типичной для НЭО.

Маркеры эпителиальной и нейроэндокринной дифференцировки. Экспрессия АЕ1/АЕЗ и СК18 в первичных и метастатических НЭН ПС в зависимости от степени дифференцировки достоверно не различалась (р=0,35). Локализация и интенсивность окраски Syn и CgA в первичных и метастатических НЭН ПС в зависимости от степени дифференцировки достоверно не различалась (р=0,87). Увеличение доли солидных структур в метастазах НЭО не оказывало достоверно-

го влияния на экспрессию маркеров эпителиальной (АЕ1/АЕЗ, СК18) и нейроэн-докринной (Зуп, CgA) дифференцировки (р=0,58 и р=0,20, соответственно).

Клетки НЭР демонстрировали пониженную интенсивность и распространенность экспрессии Буп и С§А, без достоверных различий между первичными и метастатическими очагами (р=0,87). Чувствительность экспрессии Буп и CgA в первичных НЭР ПС составляла 100% и 62,5%, соответственно, в метастазах -100% и 40,0%, соответственно.

Показано, что 62,0% НЭН ПС не экспрессировали СК7 и СК20. При этом 14,3% случаев НЭО ПЖ характеризовались «протоковым» иммунофенотипом СК7+/СК20-. В 19,0% случаев НЭН ЖКТ был отмечен «кишечный» иммунофено-тип СК7-/СК20+. Единственной опухолью с иммунофенотипом СК7+/СК20+ был метастаз без выявленного первичного очага (4,7% случаев). Экспрессии СК7 и СК20 в метастазах НЭН показала отсутствие значимых различий по сравнению с первичными опухолями (р=0,б4).

Экспрессия ТПМ, СБХ-2 и виллина была выявлена в 12,5%, 25,0% и 50,0% случаев первичных НЭР ПС и в 20,0%, 0% и 40,0% их метастазов, соответственно.

В единственном случае (12,5%) ТПМ -позитивного первичного и метастатического мелкоклеточного рака прямой кишки отсутствовала экспрессия маркеров кишечной дифференцировки (СОХ-2 и виллин). В 37,5% случаев первичные и метастатические НЭР не экспрессировали ни один из исследованных маркеров.

НЭН без выявленного первичного очага экспрессировали СОХ-2, 15Ы, РОХ-1 и ТПМ в 50,0%, 25,0%, 62,5% и 0%, соответственно. Среди маркеров панкреатической дифференцировки наиболее высокой чувствительностью обладал РОХ-1 (62,5% против 25,0%, по сравнению с 18Ы). Полученные данные позволили выделить ряд иммунофенотипических вариантов НЭН неизвестной органной принадлежности: «панкреатический», «кишечный», «нулевой».

Прогностические маркеры. Экспрессия СК19 (Рис. 1А) коррелировала с высокими значениями ПИ (р=0,044), более высокой степенью злокачественности НЭО ПЖ (р=0,0051), с большей частотой развития неблагоприятных событий (р=0,003).

ю

Несмотря на то, что экспрессия СК19 была ассоциирована со снижением средней продолжительности жизни больных (41,5 против 52,6 месяцев при экспрессии СК19), различия общей (ОВ) и безрецидивной (БРВ) выживаемости не были достоверны (р=0,079 и р=0,051, соответственно).

Экспрессия РЯ (Рис. 1Б) коррелировала с низкими значениями ПИ (р=0,006), отсутствием регионарных (р=0,008) и отдаленных метастазов (р=0,004).

Несмотря на ассоциацию высокого уровня РЛ с увеличением средней продолжительностью жизни больных (52,2 против 47,0 месяцев при высокой экспрессии РЯ), различия ОВ и БРВ не были достоверны (р=0,189). Высокий уровень экспрессии С099 демонстрировал наличие прямой достоверной связи только с размерами первичной опухоли (р=0,006).

Рисунок 1. Иммуногистохимическая экспрессия прогностических маркеров

в НЭО ПЖ: А - экспрессия СК19 (х100); Б - экспрессия РЛ (х50).

Пролиферативная активность первичных НЭН ПС. Индекс К>67 первичных НЭН ПС в 28 (21,7%) случаях соответствовал низкой (01), в 86 случаях | (66,7%) промежуточной (02) и в 23 случаях (11,6%) высокой степени злокаче-[ ственности (03). Средние значения индекса Кл-67 первичных НЭН ПС низкой, промежуточной и высокой степени злокачественности составили 1,72%, 9,75% и 40,34%, соответственно (р<0,0001). НЭО 02 являлись преобладающей группой опухолей независимо от анатомической локализации.

Результаты исследования пролиферативной активности и светооптических характеристик НЭН 03 позволили выявить групп}' из 15 наблюдений, отличав- | шихся от типичных НЭР по ряду морфологических характеристик. Новообразова- | ния выделенной группы были лишены типичных светооптических признаков низ- г1 кой дифференцировки (тяжелая атипия, образование псевдорозеток, «слипание» и напластования ядер, «географический» некроз) и, напротив, гистологически соответствовали высокодифференцированным НЭО с минимальной или умеренной у клеточной атипией и отсутствием «географического» некроза. Индекс Кл-67 в данной группе НЭН ПС находился в пределах 23-35% (среднее - 27,3%).

В связи с высокой пролиферативной активностью данная группа опухолей соответствовала НЭР вЗ, однако, ввиду отсутствия типичных признаков низкой дифференцировки, они не могли быть достоверно отнесены к крупноклеточному ; или к мелкоклеточному подтипу НЭР.

С целью исключения гиподиагностики НЭР, все новообразования высокой степени злокачественности были окрашены антителами к белку р53, как сурро- ( гатному маркеру мутации гена ТР53, характерной для нейроэндокринных карцином. Иммуногистохимическое исследование с антителами к белку р53 позволило подтвердить предположение о неоднородности высокозлокачественных НЭН. Из 15 исследуемых опухолей в 4 случаях была отмечена слабая и очаговая ядерная экспрессия р53 (Рис. 2А), тогда как все крупно- и мелкоклеточные НЭР характеризовались диффузной и интенсивной ядерной экспрессией р53 (Рис. 2Б). На ос- | новании оценки экспрессии р53 все опухоли данной группы были разделены на р53-позитивные, включавшие крупно- и мелкоклеточный НЭР, и р53-негативные, включавшие новообразования с высокодифференцированной морфологией и индексом Кл-67 более 20%.

Таким образом, все р53-негативные НЭН с индексом Кл-67 более 20% были выделены в отдельную категорию «нейроэндокринных опухолей высокой степени злокачественности / НЭО 03». Выделение данной группы было проведено на ос- , новании пролиферативного индекса, р53-статуса и степени дифференцировки

12

т

опухоли. Средние значения индекса Кь67 НЭО 03 и НЭР вЗ составили 27,3% и 65,0%, соответственно (р<0,0001).

¿' . * V» ,»« ,

• .*» ¿'V - * "»и

• ' 1 ' Г ,

1 • - -. : * -*"'/• ? ' > > с*-,' V* » V- "

, ж

Ч Ч

Рисунок 2. Иммуногистохимическая экспрессия р53 в НЭН СЗ: А — слабая фокальная экспрессия р53 в НЭО вЗ желудка (х150); Б - диффузная и интенсивная ядерная экспрессия р53 в НЭР вЗ ободочной кишки (х150).

НЭО ОЗ достоверно не отличались от НЭО 02 по среднему возрасту больных (р=0,87), частоте выявления у лиц того или иного пола (р=0,32) и размерам первичного очага (р=0,33), но достоверно отличались по митотическому индексу (р=0,002).

Клинико-морфологическая значимость пролиферативного индекса первичных НЭН ПС. Анализ взаимосвязи пролиферативной активности первичной опухоли с клинико-морфологическими параметрами показал, что высокие средние значения индекса Ю-67 достоверно коррелировали с появлением отдаленных метастазов (р=0,002) и более поздней ТЫМ-стадией заболевания (р=0,005). При этом связь индекса Кл-67 с местной, сосудистой и периневральной инвазией, а также с появлением регионарных метастазов в общей группе не была статистически достоверна (р=0,37, р=0,92, р=0,40 и р=0,39, соответственно).

Анализ клинико-морфологических и прогностических особенностей группы НЭО 02 ПС (п=86) был проведен с применением 5%-порогового значения индекса Ю-67: группа с Ю-67 = 3-5% (30 случаев), группа с Ю-67 = 6-20% (56 случаев).

Индекс Кь67 более 5% был достоверно ассоциирован с большими размерами опухоли и глубиной инвазии (рТЗ-Т4 против рТ1-Т2, р=0,014). При этом, ни в одной из исследованных групп не обнаружено достоверных различий в частоте появления сосудистой (р=0,42) или периневральной инвазии (р=1,0), регионарных (р=0,50) и отдаленных (р=0,19) метастазов.

Прогностическая значимость индекса Кл-67 среди желудочно-кишечных НЭО 02 был оценена после разделения всех новообразований на 4 подгруппы в зависимости от значений пролиферативного индекса: 1). 3-5%, 2). 6-10%, 3). 1115%, 4). 15-20%. При этом обнаружена прямая взаимосвязь между высоким значением индекса К>67 и большими размерами опухоли (р=0,0103), появлением отдаленных метастазов (р=0,0124). Также выявлена тенденция между повышением индекса К1-67 НЭО й2 ЖКТ и уменьшением частоты встречаемости гнездной морфологии (р=0,053), повышением частоты выявления местной инвазии (р=0,064) и очагов некроза (р=0,075). Не обнаружено достоверной связи между степенью злокачественности опухоли и наличием периневральной и сосудистой инвазии, а также регионарными метастазами.

Высокие значения ПИ были достоверно ассоциированы с агрессивным биологическим поведением НЭО ПЖ и наличием метастазов. Так, средние значения ПИ в первичных НЭО ПЖ без метастазов и с метастазами составили 7,07% и 11,65%, соответственно (р=0,001). Однако в группе метастатических и неметастатических НЭО ЖКТ данная связь не была достоверна (р=0,78).

В ходе исследования была подтверждена значимость других клинико-морфологических параметров НЭН ПС, определяющих прогноз заболевания. Так, ТММ-стадия на момент постановки диагноза достоверно коррелировала с ОВ и БРВ больных в общей группе НЭН ПС (р=0,002 и р=0,01, соответственно) и в выборке, включавшей только высокодифференцированные НЭН ПС (р=0,0003 и р=0,002, соответственно).

Выживаемость больных НЭО в2 ЖКТ и ПЖ в зависимости от пролифера-

тивной активности первичной опухоли оценивалась с применением 5,0%, 10,0% и

15,0%-пороговых значений индекса К1-67. В группе НЭО а ЖКТ выявлено

14

наличие достоверной связи между снижением ОВ больных и индексом Ю-67 более 10,0% (р=0,044) (Рис. ЗА), что с большей степенью достоверности было подтверждено при сравнении ОВ больных с использованием 15,0%-порогового значения Ю-67 (р=0,0023) (Рис. ЗБ). Индекс К1-67 > 15,0% достоверно коррелировал со снижением 3- и 5-летней ОВ (33,0% и 0%, соответственно) и был ассоциирован с худшим прогнозом по сравнению с другими подгруппами (р=0,005). Аналогичными были показатели 3- и 5-летней БРВ, составившие 16,0% и 0%, соответственно.

Показатели ОВ и БРВ больных НЭО ПЖ с индексом Кл-67 < 5,0% были наиболее высокими и достоверно отличались от группы сравнения, где индекс Кь 67 превышал 5,0% (р=0,03 и р=0,03, соответственно).

К,МуЛЯГ *вн в Я ДО Л Я !

"1 р=0,0023

4-, ,' 1-

1— —— ——

Рисунок 3. ОВ больных НЭО С2 ЖКТ в зависимости от индекса Ю-67: А -

пороговое значение Кл-67 - 10,0%; Б - пороговое значение Ю-67 - 15,0%.

Индекс Ю-67 более 5,0% был достоверно ассоциирован со снижением 3-х и 5-летней ОВ со 100% до 76,0% и снижением 3- и 5-летней БРВ со 100% до 82,5%, соответственно (Рис. 4А-Б). При использовании 10,0%-порогового значения К¡-67 также были выявлены достоверные различия в БРВ больных (р=0,04).

ОВ и БРВ больных с применением 15,0%-порогового значения Кд-67, как и ОВ с применением 10,0%-порогового значения Кь67 не имели статистически достоверных различий.

р=0,03

р=0,03

Рисунок 4. Выживаемость больных НЭО С2 ПЖ: А - пороговое значение К> 67 - 5,0%, ОВ; Б - пороговое значение Кл-67 - 5,0%, БРВ.

Таким образом, значения индекса Ю-67 > 5,0% для НЭО 02 ПЖ и > 15,0% для НЭО 02 ЖКТ следует считать неблагоприятными прогностическими факторами, ассоциированным со снижением ОВ и БРВ больных и являющихся наиболее оптимальными параметрами для прогностической стратификации больных в зависимости от пролиферативной активности опухоли.

Снижение ОВ и БРВ больных НЭН ЖКТ было достоверно ассоциировано с большими размерами первичной опухоли (р=0,013 и р=0,012, соответственно) и глубиной инвазии (р=0,03 и р=0,045, соответственно). Другие параметры не оказывали влияния на течение и исход НЭО ЖКТ.

Клинико-морфологический анализ группы «НЭО ОЗ» позволил выявить ряд особенностей в течении данных новообразований. Так, продолжительность жизни больных в группах НЭО в2 и НЭО ОЗ переднего отдела эмбриональной кишки составляла 47,7 и 17,7 месяцев, соответственно (р=0,008). Несмотря на то, что все НЭО ОЗ обладали высокой пролиферативной активностью, достоверные различия в выживаемости больных были получены только для НЭО вЗ желудка (р=0,003) и

НЭО ОЗ ПЖ (р=0,01). Показатели выживаемости больных НЭО С2 и НЭО 03 желудочной и панкреатической локализации демонстрировали достоверные различия. Так, 5-летняя ОВ больных НЭО С2 и НЭО 03 составила 91,5% и 31,5%, а 5-летняя БРВ - 70,8% и 62,5% (р=0,008). 5-летняя ОВ больных НЭО 02 и НЭО вЗ желудка составила 81,3% и 44,5%, соответственно (Рис. 5А-Б); 5-летняя ОВ больных НЭО 02 и НЭО ОЗ ПЖ - 92,7% и 62,2%, соответственно.

Таким образом, высокую пролиферативную активность НЭО ОЗ следует считать неблагоприятным прогностическим фактором, ассоциированным со снижением ОВ и БРВ.

Полученные результаты позволили сделать предположение, что показатели выживаемости больных НЭО ОЗ могут занимать промежуточной положение между НЭО й2 и НЭР ОЗ. Однако проведенная оценка ОВ и БРВ больных НЭО ОЗ и НЭР ОЗ не показала достоверных различий (р=0,47 и р=0,41, соответственно).

р=0,003

£ 0.5

I

-NET 01

---NET G2

--NET G3

SJ

p=0,002

Количество масяцоп

Рисунок 5. ОВ и БРВ больных НЭО G1-G3 желудка: А - общая выживаемость; Б - безрецидивная выживаемость. Примечание: NET — нейроэндокринная опухоль.

Пролиферативная активность регионарных метастазов НЭН ПС. Анализ пролиферативной активности клеток регионарных метастазов у больных НЭО ПЖ показал, что в большинстве случаев (15/18, 83,3%) индекс Ki-67 оставался неизменным. В одном (5,6%) случае отмечен рост индекса Ki-67, тогда как в двух (11,1%) случаях он была ниже, чем в первичной опухоли.

17

Большинство регионарных метастазов НЭО ЖКТ (24/35, 68,6%) обладали пролиферативной активностью, идентичной первичной опухоли. При этом в 10 (28,6%) случаях был отмечен рост индекса Ю-67 (средний индекс Ю-67 - 13,6%) по сравнению с первичной опухолью (средний индекс Кл-67 - 8,7%). В единственном (2,8%) наблюдении индекс Ю-67 был ниже по сравнению с первичной опухолью.

Пролпферативная активность отдаленных метастазов НЭН ПС. В 8

(32,0%) наблюдениях пролиферативная активность синхронных метастазов НЭО ПЖ достоверно не отличалась от первичной опухоли. В 13 (52,0%) случаях отмечался рост индекса Ю-67 в 1,7-15 раз (средний индекс Ю-67 - 15,2%) по сравнению с первичной опухолью (средний индекс Ю-67 - 8,9%). В 4 (16,0%) случаях индекс Ю-67 в синхронных метастазах был ниже по сравнению с первичной опухолью. В группе метахронных метастазов НЭО ПЖ (п=6) рост, снижение и отсутствие изменений пролиферативной активности отмечались в 2 (33,3%), 1 (16,7%) и 3 (50,0%) случаях, соответственно. Различия были статистически достоверны (р=0,0001) (Рис. 6А).

В группе, включавшей 26 случаев синхронных метастазов НЭО ЖКТ, отсутствие изменений индекса Ю-67 наблюдалось в 14 (53,8%) случаях. Тогда как в 11 (42,3%) наблюдениях был отмечен рост индекса Ю-67 в 1,5-4,5 раза (средний индекс Ю-67 - 15,6%) по сравнению с первичной опухолью (средний индекс Ю-67 - 8,2%). В одном (3,9%) случае индекс Ю-67 был ниже по сравнению с первичной опухолью. В группе метахронных метастазов НЭО ЖКТ (п=4) рост пролиферативной активности отмечался в 2 случаях, отсутствие изменений индекса Ю-67 также встречалось в 2 наблюдениях. Различия показателей были статистически достоверны (р=0,0003) (Рис. 6Б).

Рост, снижение и отсутствие изменений в пролиферативной активности метастазов в печени у 10 (16,4%) больных, перенесших неоадъювантную химиотерапию перед резекцией, отмечены в 50,0%, 10,0% и 40,0% случаев, соответственно. Полученные данные соответствовали изменениям индекса Ю-67 в общей группе отдаленных метастазов.

О 5 10 15 20 25 30

А КВ7 Т

Рисунок 6. Пролиферативная активность отдаленных метастазов НЭО ПС: А -индекс Кл-67 в синхронных метастазах НЭО ПЖ (р=0,0001); Б - индекс Кл-67 в синхронных метастазах НЭО ЖКТ (р=0,0003).

Сравнительный анализ степени злокачественности первичных и метастатических НЭН ПС. Выявленный в 20,7% регионарных и 45,9% отдаленных метастазов рост пролиферативной активности в 10 (16,4%) наблюдениях привел к изменению степени злокачественности опухоли. В частности, в одном (10,0%) регионарном и 5 (50,0%) отдаленных метастазах отмечено повышение низкой степени злокачественности (в1) до уровня промежуточной (02).

В 4 (40,0%) отдаленных метастазах отмечено повышение промежуточной степени злокачественности (02) до уровня высокой (ОЗ). Анализ выживаемости больных НЭО ПЖ с учетом степени злокачественности до и после реградации в обоих случаях показал достоверные результаты (р=0,01 и р=0,03, соответственно) (Рис. 7А-Б).

В связи с высокой гетерогенностью индекса Кл-67 в группе НЭО ЖКТ прогностическая значимость степени злокачественности не была достоверной (р=0,28).

нэо

р=0,01

р=0,03

Количеств месяц««

Рисунок 7. ОВ больных НЭО ПЖ в зависимости от степени злокачественности: А - ОВ в зависимости от степени злокачественности первичных опухолей; Б — ОВ после реградации степени злокачественности в отдаленных метастазах.

Особенности экспрессии СИАВР1 в НЭН ПЖ. Экспрессия СЯАВР1 была выявлена в 31 (43,7%) НЭН ПЖ, включая 1 (16,7%) НЭО 01, 24 (42,1%) НЭО С2 и 6 (75%) НЭР ОЗ (Рис. 8А-Г).

Высокий уровень экспрессии отмечен в 16 (22,5%) случаях, включая одну НЭО 01, 9 НЭО 02, 4 НЭО вЗ и 2 мелко клеточных рака. Средний уровень экспрессии наблюдался в 15 (21,1%) случаях НЭО С2. Отсутствие или низкий уровень экспрессии СЯАВР1 отмечен в 40 (56,3%) случаях, включавших 5 НЭО 01, 33 НЭО а и 2 НЭО вз.

Интенсивная цитоплазматическая экспрессия С11АВР1 чаще встречалась в НЭР, НЭО йЗ и НЭО а с высоким индексом Кл-67 (>15%). В 4 случаях НЭО в2 с индексом Ю-67 16-20% наблюдалась обратная картина: экспрессия СИАВР1 отсутствовала, несмотря на высокий уровень пролиферативной активности. В данных наблюдениях все опухоли были выявлены на ранних (1-И) стадиях заболевания.

Рисунок 8. Экспрессия СКАВР1 в цитоплазме клеток НЭО ПЖ: А - НЭО й2,

индекс Кл-67 - 4%, слабая фокальная экспрессия (х400); Б - НЭО 02, индекс Кл-67 - 12%, интенсивная экспрессия в части клеток (х400); В - НЭО йЗ, индекс Кл-67 -27%, диффузная экспрессия (хбОО); Г - НЭО й2, индекс Кл-67 - 17%, экспрессия на периферии опухоли и в опухолевых эмболах (х200).

Экспрессия СЯАВР1 не зависела от пола и возраста больных, сосудистой или периневральной инвазии, наличия регионарных метастазов.

Анализ экспрессии показал наличие прямой достоверной связи высокой экспрессии СЯАВР1 с митотическим (р=0,02) и пролиферативным индексами (р=0,002), степенью злокачественности опухоли (р=0,003), развитием у больных отдаленных метастазов (р=0,046).

Несмотря на то, что высокий уровень экспрессии С11АВР1 был ассоциирован с уменьшением средней продолжительности жизни больных (44 против 61

месяц при высокой экспрессии С11АВР1), анализ выживаемости не показал достоверных различий (р=0,69).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании результатов проведенного клинико-морфологического исследования первичных и метастатических НЭН ПС сделано заключение о характере гистологических, иммунофенотипических и клинических особенностей данной группы новообразований.

Анализ иммуноморфологических характеристик НЭН ПС показал отсутствие достоверных различий в гистологическом строении и экспрессии эпителиальных, нейроэндокринных и тканеспецифичных маркеров между первичными и метастатическими опухолями, независимо от их органной принадлежности и степени дифференцировки. Кроме того, полученные данные позволили выделить ряд иммунофенотипических вариантов НЭН неизвестной органной принадлежности: «панкреатический», «кишечный», «нулевой».

Экспрессия СК19 в НЭО ПЖ достоверно коррелировала с высокой проли-феративной активностью опухоли и высокой частотой развития рецидивов и отдаленных метастазов (р=0,003). В свою очередь, экспрессия РЛ в НЭО ПЖ коррелировала с низкими значениями индекса К1-67, отсутствием регионарных и отдаленных метастазов (р=0,004).

В ходе исследования пролиферативной активности НЭН ПС была выделена подгруппа опухолей с индексом Кь67 более 20% при отсутствии типичных для НЭР иммуноморфологических признаков. Выделенная категория «нейроэндо-кринные опухоли высокой степени злокачественности / НЭО ОЗ», отличалась достоверным снижением средней продолжительность жизни больных по сравнению с НЭО 02 (17,7 против 47,7 месяцев) (р=0,008).

Анализ пролиферативной активности НЭО 02 ЖКТ и ПЖ выявил наличие достоверной связи между снижением выживаемости больных и индексом К1-67 более 15% и 5%, соответственно. Полученные данные позволяют расценивать

данные значения Ю-67 как неблагоприятный прогностический фактор.

22

В 20,7% регионарных и 45,9% отдаленных метастазов НЭО ПС выявлено достоверное повышение пролиферативной активности опухолевых клеток, что в 16,4% случаев привело к повышению степени злокачественности опухоли.

Высокий уровень экспрессии С11АВР1 в НЭН ПЖ был достоверно ассоциирован с повышением пролиферативной активности опухоли (р=0,002) и появлением отдаленных метастазов (р=0,04). Полученные данные позволяют подтвердить участие белка в механизмах прогрессии НЭН ПЖ и считать СЯАВР1 перспективным маркером индивидуального прогнозирования течения заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Клинико-морфологический анализ первичных нейроэндокринных новообразований пищеварительной системы (НЭН ПС) позволил диагностировать новообразования низкой (01), промежуточной (02) и высокой (03) степени злокачественности в 21,7%, 66,7% и 11,6% случаев. Частота метастазирования в группах й1, С2 и йЗ составила 32,1%, 60,4% и 73,9% случаев, соответственно. Подтверждено наличие достоверной связи степени злокачественности и ТЫМ-стадии с прогнозом заболевания.

2. Синхронные и меггахронные метастазы НЭН ПС сохраняли характерные особенности морфологии и иммунофенотипа первичной опухоли, однако, демонстрировали отличия в пролиферативной активности клеток. Повышение уровня Кл-67 в 1,5-15 раз отмечено в 20,7% регионарных и 45,9% отдаленных метастазов, что привело к увеличению степени злокачественности в 60,0% НЭО С1 (переход

в в2) и 11,7% НЭО 0>2 (переход С2 в вЗ).

3. В группе НЭО ПС выделена прогностически неблагоприятная категория «НЭО ОЗ» высокой степени злокачественности с индексом Кл-67, превышавшим 20,0%-й пороговый уровень, и демонстрирующая более низкую выживаемостью по сравнению с НЭО й2 (5-летняя ОВ 37,5% против 81,5%). Доля НЭО ОЗ среди всех НЭО ПС составила 11,6%.

4. Нейроэндокринный рак (НЭР) вЗ характеризовался достоверно более высокими показателями пролиферативной активности по сравнению с НЭО ОЗ и НЭО 02 (средние значения индекса Кл-67 составили 65,0%, 27,3% и 9,7%, соответственно), а также выраженной экспрессией белка р53.

5. ИГХ маркерами неблагоприятного течения НЭО ПЖ явились СК19 и СЭ99, экспрессия которых была достоверно ассоциирована с высокой пролиферативной активностью, увеличением частоты развития местных рецидивов и отдаленных метастазов и большими размерами опухоли. Экспрессия РЛ, напротив, коррелировала с низкой пролиферативной активностью опухоли, отсутствием рецидивов и отдаленных метастазов. Связи данных показателей с прогнозом заболевания не выявлено.

6. Впервые показано повышение уровня экспрессии цитоплазматического белка, связывающего ретиноевую кислоту (СИАВР1), в НЭН ПЖ, достоверно ассоциированное с ростом митотического и пролиферативного индексов, степени злокачественности опухоли и появлением отдаленных метастазов.

7. Факторами, уточняющими прогноз выживаемости больных НЭО ПЖ и ЖКТ, являлись пороговые значения индекса Кь67, равные 5,0% и 15,0%, соответственно. 5-летняя ОВ больных НЭО й2 ПЖ в подгруппах с уровнем Кл-67 выше и ниже 5,0% составила 76,0% и 100%, соответственно. 5-летняя ОВ больных НЭО 02 ЖКТ в подгруппах с уровнем Кь67 выше и ниже 15,0% составила 48,3% и 96,1%, соответственно.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Определение индекса Ki-67 НЭО ПС рекомендуется проводить как в первичных, так и в метастатических очагах опухолевого роста с целью уточнения степени злокачественности новообразования, раннего выявления ее изменения и выбора варианта лечения заболевания.

2. Рекомендуется внедрение в процесс морфологической диагностики дополнительных пороговых значений индекса Ki-67, которые будут достоверно стратифицировать НЭО ПЖ и ЖКТ в пределах группы G2.

3. Во всех случаях НЭН ПС, обладающих нетипичной для НЭР морфологией, а также пролиферативным индексом более 20,0%, рекомендуется проводить ИГХ исследование экспрессии р53 для уточнения диагноза: «НЭО G3 / НЭР G3».

Список работ, опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Делекторская, В.В! Клиническая значимость определения пролиферативной активности клеток первичных и метастатических нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы / В.В. Делекторская, H.A. Козлов, Г.Ю. Чеме-рис // Технологии живых систем,- 2013. - Том 10, №3. - с.53-59.

2. Делекторская, В.В. Экспрессия белка, связывающего ретиноевую кислоту (CRABP1), и пролиферативная активность клеток в нейроэндокринных опухолях поджелудочной железы / В.В. Делекторская, Г.Ю. Чемерис, Я.А. Каинов, H.A. Козлов, И.Б. Зборовская // Молекулярная медицина. — 2013. №1. -с. 38-43.

3. Делекторская, В.В. Экспрессия Ki-67 и злокачественный потенциал нейроэндокринных опухолей желудочно-кишечного тракта и поджелудочной железы / В.В. Делекторская, H.A. Козлов, Г.Ю. Чемерис // Клиническая лабораторная диагностика. - 2013. - №9. - с. 29-30.

4. Делекторская, В.В. Клинико-морфологический анализ нейроэндокринных новообразований гастроэнтеропанкреатической системы / В.В. Делекторская, H.A. Козлов, Г.Ю. Чемерис // Клиническая лабораторная диагностика. -2013.-№10.-с. 10-13.

5. Делекторская, В.В. Степень злокачественности и прогноз высокодифферен-цированных нейроэндокринных опухолей желудочно-кишечного тракта /

B.В. Делекторская, Н.А. Козлов, Г.Ю. Чемерис // Молекулярная медицина. -2013.-№6.-с. 53-58.

6. Полозкова, С.А. Экспрессия MGMT в опухолевой ткани при лечении пациентов с нейроэндокринными опухолями режимами на основе Аранозы /

C.А.Полозкова, Е.В. Степанова, А.Ю. Барышников, В.В. Делекторская, Н.А.Козлов, В.А.Горбунова, Н.Ф. Орел, А.А. Маркович // Российский биотерапевтический журнал. - 2013.- №4. - с. 21-26.

7. Делекторская, В.В. Экспрессия Ki-67 в отдаленных метастазах нейроэндокринных новообразований поджелудочной железы / В.В. Делекторская, Н.А. Козлов, Г.Ю. Чемерис // Вестник ТГУ. - 2013,- т.18, №6. - с. 32793282.

Список других работ, опубликованных по теме диссертации

8. Delektorskaya, V.V. mTOR expression in primary pancreatic neuroendocrine tumors and their metastases / V.V. Delektorskaya, N.A. Kozlov, A.I. Pavlovskaya // Abstracts of the 9th Annual ENETS Conference. - 2012,- p. 123.

9. Delektorskaya, V.V. Cellular retinoic acid binding protein I expression and cell proliferation in pancreatic neuroendocrine tumors / V.V. Delektorskaya, N.A. Kozlov, G.Yu. Chemeris // Virchows Archiv. - 2013.- Vol. 436, №2. - p. 111.

Подписано в печать 12.09.14. Формат 60x84Vi6-Бумага офисная «SvetoCopy». Тираж 100 экз. Заказ № 468. Отпечатано на участке множительной техники ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» 115478, г. Москва, Каширское шоссе, 24