Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Особенности экспрессии рецепторов эпидермального фактора роста и белка STAT1 в уротелиальных опухолях мочевого пузыря

На правах рукописи

Шалавин Илья Анатольевич

ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ РЕЦЕПТОРОВ ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА И БЕЛКА БТАТ1 В УРОТЕЛИАЛЬНЫХ ОПУХОЛЯХ МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ

14.00.15 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

О 9 ДПР

Москва 2009

003466467

Работа выполнена на кафедре патологической анатомии медицинского факультета Российского университета дружбы народов.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Игорь Иванович Бабичснко

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Аркадий Сергеевич Ягубов

доктор медицинских наук, профессор

Юрий Владиславович Кудрявцев

Ведущая организация: Государственное учреждение Научно-исследовательский институт морфологии человека Российской академии медицинских наук

Защита состоится « 29 » апреля 2009 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д.212.203.06 в Российском университете дружбы народов по адресу: 117198 Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8, медицинский факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов

Автореферат разослан « * марта 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук,

профессор Галина Александровна Дроздова

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время уротелиальные опухоли занимают седьмое - десятое место в структуре злокачественных новообразований (Суринов А.Е„ 2006). Темпы прироста заболеваемости уротели-альными опухолями постоянно увеличиваются, составляя 40 - 49% в десятилетнем интервале. Ежегодно в России от рака мочевого пузыря (РМП) умирают 7,4 тысячи человек (Аксель Е.М., 2005). Высокая смертность от РМП свидетельствует о неэффективности терапевтического вмешательства, и диктует необходимость исследования молекулярных механизмов опухолевой прогрессии.

Неопластическая трансформация представляет собой результат разба-лансировки протоонкогенных рецептор - опосредованных механизмов и функционального состояния системы подавления опухолевого роста (Vogelstein В. et al., 1993).

Известно, что активация системы рецепторов эпидермального фактора роста (РЭФР) может быть связана с прогрессией и неблагоприятным прогнозом мышечноинвазивного уротелиалыюго рака мочевого пузыря (Chow N. Н. et al., 2001). Рецептор c-erbB-2 для проявления своего онкоген-ного потенциала должен обязательно активироваться другой рецепторной молекулой, связанной с лигандом (Shankaran Н. et al., 2008). В отсутствие второй поддерживающей разновидности РЭФР неопластическая трансформация клетки предполагается не высокой. Мало изучена роль одиночной экспрессии c-erbB-2 в индукции пролиферации клеток при РМП.

По литературным данным, роль белков STAT в неопластической трансформации клетки противоречива. С одной стороны, при стимуляции цитокинами белки STAT способствуют клеточной дифференцировке и остановке клеточного цикла (Egwuagu С.Е. et al., 2006). С другой стороны, экспрессия STAT приводит к индукции пролиферации и блокированию апоптоза в клетках (Lassmann S. et al., 2007; Wu F. et al., 2008). Факторы STAT1 могут быть активированы РЭФР (Park O.K. et al., 1996; Xia L. et al., 2002). Тем не менее, анализ литературы не выявил экспериментальных свидетельств участия STAT1 в сигналинге РЭФР в уротелиальных новообразованиях. В настоящее время отсутствуют данные, связывающие экспрессию белков STAT1 со стадией, степенью злокачественности РМП, представляющих важные гистологические критерии прогрессии уротелиальных опухолей.

Основной проблемой оперативного лечения уротелиальных опухолей мочевого пузыря остается высокая частота рецидивирования. Неинвазивные Та опухоли рецидивируют у 35 - 71% больных (Мартов А. П. и др., 2004). Пациенты с поверхностными Та-Т1 опухолями для выявления рецидивов вынуждены проходить многократные цистоскопические исследования.

В последнее время ведутся поиски маркеров, позволяющих прогнозировать клиническое течение рака мочевого пузыря у конкретного больного. Подобными молекулярными показателями могут быть РЭФР, регуляторы клеточного цикла Р53 и Ki-67, поскольку имеются сообщения, что они могут быть связанными с рецидивированием, метастазированием и низкой выживаемостью (Habuchi Т. et al., 2005). Однако результаты различных исследований противоречат друг другу, прогностическая значимость этих факторов рядом авторов оспаривается (Jimenez R.E. et al., 2001; Peyromaure M. et al., 2002).

Таким образом, актуальность темы настоящей диссертации обусловлена высокой распространенностью эпителиальных опухолей мочевого пузыря, их частым рецидивированием после оперативного лечения и неопределенностью многих аспектов онкогенеза уротелиальных новообразований.

Целью настоящего исследования явился анализ молекулярных механизмов, лежащих в основе злокачественной трансформации неинвазивных и инвазивных уротелиальных опухолей мочевого пузыря.

Задачи исследования.

1. Изучение особенностей экспрессии РЭФР (EGFR, с-егЬВ-2) и фактора STAT1 в неинвазивных и инвазивных опухолях низкой и высокой степени злокачественности.

2. Исследование взаимосвязи между экспрессией рецепторов эпидер-мального фактора роста, фактора STAT1 и пролиферативной активностью клеток в новообразованиях мочевого пузыря.

3. Изучение типоспецифической экспрессии измененного белка Р53 в группах уротелиальных опухолей отличающихся по прогнозу, стадии и степени злокачественности;

4. Изучение экспрессии цитокератина 20 в неинвазивных и инвазивных уротелиальных опухолях низкой и высокой степени злокачественности и ее зависимость от факторов STAT1 и Р53.

5. Оценка корреляции клинического течения и экспрессии рецепторов эпидермального фактора роста, транскрипционного фактора STAT1, опорного цитокератина 20, белка Р53 и пролиферативной активности клеток (по белку Ki-67).

Научная новизна. В работе проведено комплексное изучение экспрессии рецепторов эпидермального фактора роста EGFR и с-егЬВ-2 в новообразованиях мочевого пузыря. Показано, что интенсивность и локализация экспрессии рецепторов эпидермального фактора роста положительно коррелируют друг с другом и с пролиферативной активностью опухоли. Впервые установлено, что транскрипционный фактор STAT1 принимает участие в опухолевой трансформации неинвазивных и Т1 карцином низкой степени злокачественности за счет индукции пролиферации. Выявлена экспрессия белка STAT1 в цитоплазме опухолевых клеток. Показана роль фактора STAT1 в сигналинге рецептора с-егЬВ-2. Получены эксперименталь-

ные данные, подтверждающие положительное влияние транскрипционного фактора STAT1 на экспрессию опорного цитокератина 20 в уротелиальных опухолях мочевого пузыря. Показано, что функциональная недостаточность опухолевого супрессора р53 является важным звеном онкогенеза неинва-зивных и инвазивных карцином низкой степени злокачественности. Экспрессия Р53 коррелирует с интенсивностью и локализацией экспрессии с-егЬВ-2, что свидетельствует о сопряженности активации протоонкогенной рецепции эпидермальных факторов роста и подавления систем опухолевой супрессии.

Теоретическая и практическая значимость. В настоящем исследовании показана роль РЭФР в онкогенезе неинвазивных и инвазивных уротелиальных опухолей мочевого пузыря. Установлено, что в неинвазивных опухолях и Т1 карциномах экспрессируются рецепторы с-егЬВ-2 и транскрипционные факторы STAT. Полученные результаты обращают внимание на важность дальнейшего иммуноморфологического исследования механизмов сигналинга РЭФР. Распространенность экспрессии рецепторов с-егЬВ-2, определяемая по интенсивности и локализации, и транскрипционного фактора STAT1 в неинвазивных и инвазивных уротелиальных опухолях достаточно высокая. При продолжающихся исследованиях эффективности и безопасности применения антагонистов РЭФР и ингибиторов транскрипционных факторов представляется важным применение иммуногистохими-ческой методики для оценки чувствительности новообразования к селективным лекарственным средствам. В работе показано, что экспрессия цито-кератинов влияет на инвазивные свойства и степень атипии опухолевых клеток. В связи с этим подчеркивается необходимость дальнейшего исследования роли низкомолекулярных цитокератинов в прогрессии уротелиальных новообразований.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Выявление рецепторов эпидермального фактора роста и белка STAT1 позволяет дать патогенетическую прогностическую оценку различных уротелиальных опухолей мочевого пузыря. Биологическое поведение неинвазивных и инвазивных опухолей также определяется состоянием цитоскеле-та по экспрессии низкомолекулярных цитокератинов (СК20), пролифера-тивной активностью клеток (Ki-67) и связано со степенью повреждения системы опухолевой супрессии р53.

2. Уротелиальные опухоли характеризуется тремя видами экспрессии EGFR: нормальным, базальным и диффузным. В качестве наиболее информативного показателя следует рассматривать диффузный тип экспрессии EGFR, так как он не встречается в уротелиальных папилломах, слабо выражен в ОНЗП и преобладает в мышечноинвазивных карциномах высокой степени злокачественности. Интенсивная экспрессия EGFR при диффузном типе ее локализации характеризует высокий уровень рецидивирования уротелиальных новообразований.

3. Рецепторы c-erbB-2 в уротелиальных опухолях характеризуется тремя видами экспрессии: нормальным, поверхностным и диффузным. Диффузный тип экспрессии с-егЬВ-2 является наиболее информативным показателем. Диффузная экспрессия с-егЬВ-2 преобладает в рецидивных новообразованиях и характеризует неблагоприятный иммунофенотип опухоли. Показатели экспрессии EGFR и с-егЬВ-2 сильно коррелируют друг с другом.

4. Белок STAT1 характеризуется два типами реакции: отрицательной и положительной, в форме цитоплазматического окрашивания. Положительная реакция со STAT1 обратно коррелирует со стадией и степенью злокачественности уротелиальных опухолей и преобладает в неинвазивных Та опухолях и Т1 карциномах низкой степени злокачественности. В Т2 карциномах и РМП высокой степени злокачественности доминирует отрицательная реакция.

5. Особенности экспрессии белковых молекул позволяют проводить дифференциальную диагностику новообразований мочевого пузыря, отражают вероятность рецидивирования и могут использоваться в качестве прогностических иммуногистохимических маркеров.

Апробация работы. Основные результаты диссертации были представлены и обсуждены на заседании кафедры патологической анатомии медицинского факультета Российского университета дружбы народов. Результаты работы, отражающие основные положения диссертации представлялись на научных конференциях: VIII, IX Международных конгрессах «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2007, 2008), III Конгрессе Российского общества онкоурологов (Москва, 2008), Конференции молодых ученых «Актуальные вопросы лучевой диагностики и онкологии» (Москва, 2008).

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 8 печатных работах, из которых 3 статьи в рецензируемых журналах.

Связь диссертации с планом научных исследований. Диссертация выполнена в рамках реализации Инновационной образовательной программы РУДН 2007 - 2008 гг. «Создание комплекса инновационных образовательных программ и формирование инновационной образовательной среды, позволяющих эффективно реализовывать государственные интересы РФ через систему экспорта образовательных услуг» № 1.2.2.12. «Новые методы иммуногистохимической диагностики опухолевого роста».

Структура диссертации. Диссертация изложена на 147 машинописных страницах, состоит из введения, аналитического обзора литературы, описания материала и методов исследования, собственных результатов, обсуждения результатов исследования, выводов, практических рекомендаций и списка цитированной литературы, в котором приведены 8 источников на русском языке и 197 на иностранном (всего 205). Работа иллюстрирована 35 рисунками и содержит 16 таблиц.

II. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования.

В работе был использован операционный материал 83 пациентов, в том числе 33 женщин и 50 мужчин. Средний возраст больных составил 63 года. У 68 больных выполнена трансуретральная резекция опухоли мочевого пузыря (ТУР), 6 пациентов с мышечноинвазивным раком подверглись резекции мочевого пузыря (3) и цистэктомии (3). У 9 больных с новообразованиями размером менее 5 мм выполнена «холодная» биопсия. Пациенты были оперированы в отделении урологии (Заведующий к.м.н. Л.М. Дуль-кин) Центральной клинической больницы РАН. Всем больным проводились контрольные цистоскопии с интервалом 3 месяца во время первого года наблюдения, 6 месяцев - во время второго, далее ежегодно. Продолжительность наблюдения варьировала от 3 до 44 месяцев. В работе исследовали архивный материал отделения патологической анатомии Центральной клинической больницы РАН за период с 1999 по 2008 г (Заведующий д.м.н. проф. М.В. Самойлов).

Материал фиксировали в 10% забуференном формалине при рН 7,4. После проводки на гистопроцессоре тканевые фрагменты заливались в парафин. Затем изготавливались серийные срезы толщиной 5 мкм, которые впоследствии были окрашены гематоксилином и эозином.

Гистологическая оценка новообразований выполнена согласно классификации ВОЗ 2004 г. При этом были выявлены 28 неинвазивных уроте-лиальных опухолей, в том числе 22 опухоли низкого злокачественного потенциала (ОНЗП, 78%), 3 неинвазивные уротелиальные карциномы низкой степени злокачественности (6%), 3 папилломы (6%), и 55 инвазивных уро-телиальных карцином. В группе Т1 карцином инфильтрирующих субэпте-лиальную соединительную ткань в 34/83 (41%) случаев выявлен инвазив-ный рак низкой степени злокачественности, в 14/83 (17%) - высокой степени злокачественности. Семь наблюдений отнесены в группу Т2 карцином высокой степени злокачественности, инфильтрирующих мышечную оболочку мочевого пузыря.

Иммуногистохимическое исследование проводилось в соответствии со стандартным протоколом. Ткани фиксировали в 10% забуференном формалине (рН 7,4), после проводки на гистопроцессоре заливали в парафин. Использован парафин с температурой плавления +54°С. Затем с помощью одноразовых лезвий марки Я35 нарезали серийные срезы толщиной 5 мкм и наклеивали на альбуминизированные стекла. Депарафинизация выполнена в термостате при температуре +60°С в течение 1 часа. После погружения в ксилол срезы регидратировались проводкой по спиртам в убывающей концентрации в течение 15 минут.

Восстановление антигенной активности осуществлялось методом теплового демаскирования в 0,01М цитратном буфере в микроволновой печи

при мощности 300 Вт в течение 20 минут. Блокирование эндогенной перок-сидазной активности выполнено с помощью 3% перекиси водорода в течение 10 минут.

В работе использованы следующие антитела к антигенам человека:

1. Поликлональные мышиные антитела к EGFR (BioGenex, prediluted antibody)

2. Поликлональные кроличьи антитела к c-erbB-2 (Dako, 1:200)

3. Поликлональные кроличьи антитела к STAT1 (Santa Cruz Biotechnology Inc, 1:500)

4. Моноклональные мышиные антитела к СК20 (Ks 20.8, Dako, 1:100)

5. Моноклональные мышиные антитела к Р53 (DO-7, ready to use)

6. Моноклональные мышиные антитела к Ki-67 (ММ1, Diagnostic Biosystems, 1:200)

На срезы наносились 50 мкл разведенной первичной сыворотки. Срезы инкубировались при 37°С в течении 30 минут. Визуализация иммунных комплексов осуществлялась иммунопероксидазным методом с помощью системы детекции LSAB+ (Dako). После каждой инкубации срезы тщательно отмывали в фосфатно-солевом буфере, подсушивали, затем для визуализации реакции на них наносили ДАБ (3,3-диаминобензидин), что позволяло получать специфическую коричневую окраску. Интенсивность иммуноги-стохимической реакции в каждом препарате контролировалась под микроскопом: после достижения необходимой интенсивности окрашивания срезы отмывали в дистиллированной воде, а затем в течение 2 минут докрашивали гематоксилином Майера. Затем стекла извлекали, обезвоживали в батарее спиртов в восходящей концентрации, заключали в канадский бальзам и исследовали под микроскопом.

Оценку интенсивности иммуногистохимической реакции с рецепторами EGFR и c-erbB-2 осуществляли согласно порядковой шкале: 0 - мембранное окрашивание отсутствует,

1+ - слабое окрашивание неполного периметра мембран выявляется более чем в 10% клеток,

2+ - окрашивание мембран средней интенсивности по всему периметру выявляется более чем в 10% клеток,

3+ - интенсивное окрашивание мембран по всему периметру выявляется более чем в 10% клеток.

Кроме того, выполнялась регистрация локализации (типа) экспрессии рецепторов EGFR и c-erbB-2:

1. Базальный (нормальный) тип экспрессии EGFR - при окрашивании ба-зального слоя уротелия,

2. Поверхностный (нормальный) тип экспрессии c-erbB-2 - при окрашивании поверхностного слоя зонтичных клеток. Нормальный тип отмечался также и при отсутствии мембранной реакции на оба рецептора,

3. Диффузный (патологический) тип экспрессии EGFR и c-erbB-2 - при

иммунной реактивности всех клеточных слоев, в том числе зон инвазии карцином.

Иммуногистохимическая реакция на белок STAT1 оценивалась по интенсивности цитоплазматического окрашивания:

1. Отрицательная реакция, отсутствие цитоплазматического окрашивания;

2. Положительная реакция, интенсивность окрашивания цитоплазмы 1 балл;

3. Положительная реакция, интенсивность 2 балла. Реакция с СК20 оценивалась по локализации экспрессии:

1. Нормальный тип экспрессии СК20 - при окрашивании поверхностно расположенных зонтичных клеток, а также при отсутствии их окрашивания,

2. Патологический тип экспрессии СК20 - при окрашивании цитоплазмы всех клеточных слоев уротелия.

Интенсивность реакции с Р53 оценивалась как слабая (1-2+) и высокая (3+). Индекс иммунореактивности Р53 (ИИ Р53) вычислялся по отношению количества интенсивно окрашенных ядер, содержащих продукт ДАБ-реакции, к сумме клеток, содержащих и не содержащих ДАБ. Объем выборки в каждом случае составил 500 клеток.

В качестве индикатора пролиферативной активности использован индекс пролиферации Ki-67 (ИП Ki-67), который определялся долей интенсивно окрашенных ядер при учете 500 клеток, выраженной в %.

Статистическая обработка данных проводилась в программном пакете SPSS 16.0 (SPSS Inc., 2007). Анализ таблиц сопряженности выполнен с помощью теста х2 а также двустороннего критерия Фишера. При сравнении средних ИП Ki-67 и ИИ Р53 в группах опухолей, отличающихся по интенсивности окрашивания EGFR и с-егЬВ-2, использован U критерий Манна-Уитни. Оценка взаимосвязи ИП Ki-67 и ИИ Р53 осуществлена с помощью коэффициента корреляции Спирмена. Для исследования влияния независимых переменных EGFR, c-erbB-2, STAT1, СК20, Р53 на пролиферативную активность уротелиальных опухолей выполнен однофакторный дисперсионный анализ с использованием рангового метода Краскела - Уоллиса.

Особенности экспрессии РЭФР и белка STAT1 в уротелиальных опухолях мочевого пузыря.

Анализ параметров экспрессии EGFR в инвазивных карциномах МП выявил взаимосвязь активации EGFR с мышечной инвазией и высокой степенью злокачественности (Рис. 1). В Т1 опухолях диффузный тип экспрессии EGFR отмечен с частотой 7/48 (14,6%), тогда как в мышечноинвазив-ном РМП этот показатель составил 5/7 (71,4%, Vc = 0,639, р<0,001). Поскольку локализация и тип экспрессии EGFR взаимосвязаны, иммунореак-тивность 2 и более балла встретилась в 13/48 (27,1%) случаев Т1 опухолей и в 7/7 (100%) Т2 карцином (Vc = 0,465, р=0,003). По сравнению с РМП низ-

кой степени злокачественности, более половины карцином высокой степени злокачественности показали иммунореактивность с БОРИ, интенсивностью 2 или 3 балла (Ус = 0,484, р=0,005).

Рис. 1. Локализация экспрессии БвРЯ в инвазивных карциномах мочевого пузыря. В Т1 карциномах преобладает базальиый тип (60,4%) и отрицательная реакция с ЕСРГ1 (25%). В группе мышечноинвазивного РМП основная масса опухолей демонстрирует диффузную локализацию ЕвРЯ с интенсивностью окрашивания 2-3 балла.

уа ■]■-( т2 онзп и папилломы Нитка* степень высокая степень

тлокачественттостн тлокячественносттт

Рис. 2. Взаимосвязь локализации экспрессии с-егЬВ-2 со стадией и степенью злокачественности уротелиальных опухолей. Частота опухолей с диффузным типом экспрессии с-егЬВ-2 возрастала в ряду Та - Т2 опухолей, а также в карциномах низкой и высокой степени злокачественности. Доля опухолей с поверхностным типом экспрессии с-егЬВ-2 наоборот сокращалась при переходе от неинвазивных опухолей к инвазивным карциномам.

Экспрессия c-erbB-2 была взаимосвязана со стадией и степенью злокачественности (Рис. 2). В группе неинвазивных Та опухолей наблюдалось 43% случаев диффузной экспрессии c-erbB-2, в Т1 и Т2 карциномах этот показатель составил 69% и 100% (F=0,341, р=0,008). Диффузный тип экспрессии c-erbB-2 был более характерным для инвазивных карцином ВСЗ (100%) по сравнению с Т1 опухолями низкой степени злокачественности (59%, F=0,427, р=0,002).

Сопоставление результатов повторных цистоскопий и экспрессии с-егЬВ-2 выявило зависимость клинического течения уротелиальных опухолей от локализации и интенсивности экспрессии c-erbB-2 (Рис. 3). Нормальный тип экспрессии c-erbB-2, соответствующий интенсивности окрашивания 0 баллов, выявлен в 7/30 (23,3%) безрецидивных опухолей и не выявлен в опухолях давших вторичный рост. Переход к диффузному типу экспрессии c-erbB-2, а также средней (2+) и сильной (3+) мембранной им-мунореактивности c-erbB-2 был взаимосвязан со значимым возрастанием частоты рецидивирования (х2 = 25,481, р<0,001; Vc = 0,553, р<0,001). Рецидив был выявлен в 43/52 (81,1%) случаев диффузной экспрессии c-erbB-2. Похожим образом вторичный рост зарегистрирован в 34/45 (75,6%) и 8/8 (100%) опухолей с интенсивностью экспрессии 2 и 3 балла.

Рис. 3. Прогностическое значение локализации экспрессии с-егЬВ-2. В безрецидивной группе преобладал поверхностный тип экспрессии (46,67%), наряду с диффузным типом (30%), существенная доля опухолей характеризовалась отрицательной реакцией на с-егЬВ-2 и отсутствием вторичного роста. В рецидивной группе доминировал диффузный тип экспрессии с-егЬВ-2, соответствующий интенсивности окрашивания 2-3 балла.

Анализ соответствия интенсивности экспрессии ЕОБЯ и с-егЬВ-2 выявил сильную общую корреляцию (^=0,764), коэффициент сопряженности составил 0,695 (Р=0,967, р<0,001). В группе опухолей с положительной реакцией к ЕвРЯ у 14/14 (100%) больных отмечалась положительная реакция с с-егЬВ-2, в тоже время положительная реакция с с-егЬВ-2 выявлена в 38/69 (55%) случаев отрицательной реакции с ЕОИ^ (р=0,002). Критериями положительной реакции на каждый рецептор явились диффузный тип экспрессии и интенсивность реакции 2-3 балла.

Изучение экспрессии 8ТАТ1 в классификационных группах уротели-альных новообразований показало существование взаимосвязи со стадией РМП (Рис. 4). В группе неинвазивных Та опухолей преобладала положительная реакция со 8ТАТ1 интенсивностью 1 балл (12/28, 43%), тогда как в Т1 карциномах положительная реакция интенсивностью 2 балла отмечена в 20/48 случаев (42%, И=0,441, р=0,009). В тоже время, в Т2 опухолях наблюдалась обратная тенденция - положительная реакция интенсивностью 2 балла отсутствовала (Б= - 0,750, р=0,047). При сравнении экспрессии 8ТАТ1 и степени злокачественности инвазивного РМП связи не выявлено (И=0,188, р=0,380).

Экспрессия ЭТАП

га Отрицательная

реакция г—IП о л ожите л ь н а я

реакция, 1 + га Положительная реакция, 2*

О 20 40 60 80 100 Частота типоспецифической экспрессии, %

Рис. 4. Экспрессия 8ТАТ1 в уротелиальных опухолях. Частота положительной реакции интенсивностью 2 балла возрастала в Т1 карциномах низкой степени злокачественности по сравнению с неинвазивными опухолями низкого злокачественного потенциала. В тоже время суммарная частота положительной реакции уменьшалась с 75% в Та - Т1 опухолях до 57% в мышечноинвазивном РМП.

При сравнении экспрессии с-егЬВ-2 и 8ТАТ1 была выявлена умеренная общая корреляция (Ус=0,340, р=0,001). В группе опухолей с нормаль-

ным типом экспрессии с-егЬВ-2 положительная реакция со БТАТ1 определена только у 1/7 (14,3%) больных, тогда как поверхностный и диффузный типы экспрессии сопровождались положительной реакцией со 8ТАТ1 соответственно в 22/24 (91,6%) и 34/45 (75,6%) случаев. При поверхностной экспрессии с-егЬВ-2 положительная реакция со БТАТ1 средней и высокой интенсивности наблюдалась с одинаковой частотой (45,8%), а при диффузной экспрессии с-егЬВ-2 преобладала реакция высокой интенсивности, оцененная 2 баллами (35,6% и 40%).

Анализ экспрессии СК20 выявил ассоциацию с инвазивными свойствами и степенью атипии опухолевых клеток. В неинвазивных Та опухолях доля патологической экспрессии составила 18/28 (64%), тогда как в инва-зивных карциномах этот показатель составил 38/48 (79%, Р=0,211, р=0,016). В группе инвазивного РМП патологическая экспрессия СК20 встретилась в 22/37 (59%) карцином низкой и в 16/18 (89%) карцином высокой степени злокачественности (Р=0,399, р=0,027).

Изучение экспрессии Р53 выявило взаимосвязи со стадией и степенью злокачественности РМП. В группе Т2 карцином все 7 опухолей (100%) показали интенсивную экспрессию Р53, а при немышечноинвазивном РМП частота интенсивной экспрессии Р53 составила 27/48 (56%, Р=0,3, р=0,026). Средний ИИ Р53 в Т1 опухолях составил 14,6%, тогда как в Т2 опухолях -20,7% (11=87,0, р=0,041). Интенсивная экспрессия Р53 выявлена соответственно в 16/18 (88%) карцином высокой и в 18/37 (48%) опухолей низкой степени злокачественности (Р=0,389, р=0,004).

Сравнение экспрессии факторов БТАТ1 и Р53 с интенсивностью распределения СК20 выявило умеренную корреляцию. Увеличение интенсивности экспрессии БТАТ1 сопровождалось возрастанием доли опухолей с патологическим типом экспрессии СК20 с 47,4% до 79,3% (Ус=0,346, р=0,031). Аналогично влияли на синтез промежуточных филаментов и мутации Р53. В группе опухолей со слабой экспрессией Р53 патологическая активация СК20 наблюдалась в 6/38 (18,8%), тогда как интенсивная экспрессия Р53 способствовала увеличению доли новообразований с патологической экспрессией СК20 до 43/44 (97,7%, Ус=0,815, р=0,000). Таким образом, транскрипционные факторы 8ТАТ1 принимают участие в онкогенезе неинвазивных и Т1 опухолей мочевого пузыря за счет усиления синтеза опорных цитокератинов, повышающих клеточную жизнеспособность. Похожий механизм лежит также и при нарушении функционирования системы Р53.

При экспрессии с-егЬВ-2 пролиферация возрастала с 2,83% при нормальном типе экспрессии до 13,92% при диффузной экспрессии с-егЬВ-2 (уД = 28,01, р=0,001). Содружественная экспрессия обоих рецепторов приводила к двукратному повышению показателя пролиферативной активности с 8,1% до 16,9% (р=0,02). Экспрессия 8ТАТ1 сопровождалась значимым увеличением пролиферативной активности. Индекс пролиферации К>67 в

группе опухолей с положительной реакцией интенсивностью 1 балл составил 12,1%, в то же время при интенсивности реакции 2 балла этот показатель составил 25% (р<0,005). Коэкспрессия STAT1 и с-егЬВ-2 была связана с увеличением пролиферации Та и T1G1-2 опухолей (rs=0,382, р=0,024).

Нами установлено, что функциональная недостаточность системы опухолевой супрессии р53 значительно повышает скорость пролиферации уротелиальных опухолей (х\=54,28, р<0,001). Гиперэкспрессия измененного (мутированного) Р53 влечет за собой активацию генов низкомолекулярных цитокератинов, которая иммуноморфологически подтверждается патологической экспрессией СК20. В свою очередь, высокое содержание СК20 способствует синтезу белка и увеличивает популяции пролиферирующих клеток.

Изучение прогностического значения маркеров показало, что рецидив возник у 17/28 (61%) больных с неинвазивными Та опухолями, диффузная экспрессия EGFR зарегистрирована у 2/28 (7%) пациентов. В группе Т1 карцином низкой степени злокачественности рецидивы наблюдались у 29/48 (60%) больных, диффузная экспрессия EGFR обнаружена у 7 из 48 (15%). Мышечноинвазивный РМП в 7/7 (100%) случаев сопровождался рецидивами, тогда как диффузный тип окрашивания EGFR встретился только у 5 из них (71%). Чувствительность теста с EGFR возрастала с 2/17 (12%) в неинвазивных уротелиальных опухолях до 5/7 (71%) в Т2 карциномах. Так как при отсутствии вторичного роста диффузная локализация EGFR не была выявлена, то специфичность обнаружения диффузного типа реакции EGFR составила 100%. Учитывая низкое значение коэффициента сопряженности, взаимосвязь диффузной экспрессии EGFR и частоты рецидиви-рования можно охарактеризовать как слабую, что позволяет рекомендовать использование EGFR в комплексе с другими прогностическими маркерами при немышечноинвазивном РМП.

При изучении диагностических свойств типоспецифической экспрессии с-егЬВ-2 выявлены умеренные показатели чувствительности и специфичности. В неинвазивных уротелиальных опухолях диффузная экспрессия с-егЬВ-2 обнаружена у 12/28 (43%) больных с рецидивами, чувствительность теста составила 12/17 (71%), специфичность 11/11 (100%). При Т1 карциномах диффузный тип отмечен у 33/48 (69%) пациентов, и во всех Т2 опухолях (7/7, 100%). Специфичность определения типа экспрессии c-erbB-2 составила 15/19 (79%). Таким образом, тип экспрессии с-егЬВ-2 показал наибольшую чувствительность при Т1 карциномах низкой степени злокачественности (29/29, 100%), что позволяет использовать с-егЬВ-2 в качестве скринингового маркера для выделения групп больных с высоким риском рецидивирования.

В неинвазивных Та опухолях положительная реакция со STAT1 интенсивностью 2 балла выявлена в 9/28 (32%) случаев. При инвазивном РМП положительная реакция отмечена у 20/48 (42%) Т1 карцином. В Т2 опухо-

лях не выявлено ни одного положительного результата. Чувствительность метода составила 9/17 (53%) в Та опухолях и 20/29 (69%) при немышечно-инвазивном РМП. Принимая во внимание слабую ассоциацию с клиническим исходом, применение теста со БТАТ1 возможно в сочетании с другими маркерами - регуляторами клеточного цикла при неинвазивных Та опухолях.

Наибольшая прогностическая ценность была характерна для белков-регуляторов СК20 и Р53. В неинвазивных опухолях патологический тип экспрессии СК20 и интенсивная экспрессия Р53 зарегистрированы у 16/28 (57%) и 15/28 (54%) больных. В Т1 карциномах данные признаки отмечались в 33/48 (69%) и 27/48 (56%) случаев. В Т2 опухолях оба теста оказались положительными в 100%. Чувствительность тестов составила 94% и 88% в Та опухолях и 100% и 93% в РМП Т1. Принимая во внимание высокие коэффициенты сопряженности, с целью определения риска рецидиви-рования, рекомендуется применять оба теста в сочетании друг с другом или по отдельности.

ИП Кь67 в безрецидивной группе составил 4,96%, при развитии рецидива РМП этот показатель был 14,73%. Средний ранг составил соответственно 16,36 и 55,25 (и=39,5, р=0,001). Пролиферативная активность уро-телиальных опухолей, определяемая по ИП Кл-67, взаимосвязана с развитием рецидива опухоли. При определении доверительных интервалов в безрецидивной и рецидивной группах верхняя граница интервала ИП Ю-67 при отсутствии рецидива составила 6,05%, нижняя граница в рецидивной группе соответствовала значению 12,35% (р<0,05). Оптимальной точкой разделения явилось 9% значение ИП Кл-67. В этом случае достигнуты приемлемые значения чувствительности (48/53, 90%) и специфичности (21/30, 72%) для высокой и низкой степени пролиферативной активности.

ВЫВОДЫ

1. Выявление рецепторов эпидермального фактора роста и белка 8ТАТ1 позволяет дать патогенетическую прогностическую оценку различных уро-телиальных опухолей мочевого пузыря. Биологическое поведение неинвазивных и инвазивных опухолей также определяется состоянием цитоскеле-та, по экспрессии низкомолекулярных цитокератинов (СК20), пролиферативной активностью клеток (Ю-67) и связано со степенью повреждения системы опухолевой супрессии р53.

2. Уротелиальные опухоли характеризуется тремя видами экспрессии ЕСН1: нормальным, базальным и диффузным. В качестве наиболее информативного показателя следует рассматривать диффузный тип экспрессии ЕСБК, так как он не встречается в уротелиальных папилломах, слабо выражен в ОНЗП и преобладает в мышечноинвазивных карциномах высокой степени злокачественности. Интенсивная экспрессия ЕСЕИ. при диффузном

типе ее локализации характеризует высокий уровень рецидивирования уро-телиальных новообразований.

3. Рецепторы с-егЬВ-2 в уротелиальных опухолях характеризуется тремя видами экспрессии: нормальным, поверхностным и диффузным. В качестве наиболее информативного показателя следует рассматривать диффузный тип экспрессии с-егЬВ-2, поскольку частота диффузного типа экспрессии с-егЬВ-2 возрастает в ряду Та - Т1 - Т2 опухолей и последовательности: карциномы низкой степени злокачественности - карциномы высокой степени злокачественности. Диффузная экспрессия с-егЬВ-2 преобладает в рецидивных новообразованиях и сильно коррелирует с экспрессией ЕСРИ.

4. Белок 5ТАТ1 характеризуется два типами реакции: отрицательной и положительной, в форме цитоплазматического окрашивания. Положительная реакция со 8ТАТ1 обратно коррелирует со стадией и степенью злокачественности уротелиальных опухолей. Положительная реакция со БТАТ1 преобладает в неинвазивных Та опухолях и Т1 карциномах низкой степени злокачественности, тогда как в Т2 карциномах и РМП высокой степени злокачественности доминирует отрицательная реакция.

5. Уротелиальные новообразования обладают двумя видами экспрессии измененного белка Р53: слабой и интенсивной. Наибольшую ценность представляет интенсивная экспрессия Р53, так как она преобладает в инва-зивных карциномах (Т1) высокой степени злокачественности и всех мы-шечноинвазивных карциномах (Т2). Нарушение функционирования системы Р53 и транскрипционный фактор ЯТАТ1 связаны с процессами онкоге-неза неинвазивных и Т1 опухолей низкой степени злокачественности, увеличивая синтез опорных цитокератинов, повышающих клеточную жизнеспособность.

6. Для уротелиальных опухолей мочевого пузыря свойственны два вида экспрессии СК20: нормальный и патологический. В качестве наиболее информативного показателя следует рассматривать патологический тип экспрессии СК20, так как он не встречается в уротелиальных папилломах, выражен в ОНЗП, и доминирует в Т2 карциномах и карциномах высокой степени злокачественности. Проявление инвазивных свойств уротелиалыюй опухоли сопровождается патологической экспрессией СК20.

7. Особенности экспрессии белковых молекул позволяют проводить дифференциальную диагностику новообразований мочевого пузыря. Т1 карциномы низкой степени злокачественности характеризуются экспрессией с-егЬВ-2, БТАТ1 и низкомолекулярного цитокератина СК20. В инвазивных опухолях высокой степени злокачественности отмечаются высокие уровни СК20 и Р53, а для мышечноинвазивного РМП свойственна диффузная экспрессия ЕСРЯ практически при полном отсутствии иммунореактив-ности со БТАТЬ

8. Диффузный тип экспрессии рецептора с-егЬВ-2, патологическая реакция с СК20 и интенсивная экспрессия измененного белка Р53 в неинвазив-

ных и инвазивных опухолях мочевого пузыря отражают вероятность реци-дивирования и могут использоваться в качестве прогностических иммуно-гистохимических маркеров.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Иммуногистохимическое исследование является дополнительным критерием дифференциальной диагностики неинвазивных и инвазивных карцином, а также уротелиальных опухолей низкой и высокой степени злокачественности. В неинвазивных опухолях мочевого пузыря преобладает нормальная экспрессия EGFR, c-erbB-2, СК20, в мышечноинвазивных карциномах выявляется диффузный тип экспрессии EGFR. В уротелиальных опухолях низкой степени злокачественности доминирует положительная реакция со STAT1 и слабая экспрессия Р53, тогда как высокая степень злокачественности характеризуется отрицательной реакцией со STAT1 и интенсивной экспрессией измененного белка Р53.

Локализация и интенсивность экспрессии онкомаркеров характеризуют агрессивный фенотип уротелиальных новообразований и рекомендуются для прогнозирования клинического течения РМП. Диффузная экспрессия c-erbB-2, патологический тип экспрессии СК20 и интенсивная экспрессия Р53 представляют собой высоковоспроизводимые качественные показатели, указывающие на вероятность раннего рецидива опухоли. Высокие значения пролиферативной активности, определяемые по ядерному белку Ki-67, количественно подтверждают склонность к вторичному росту уротелиальных карцином.

Широкое распространение селективных фармацевтических препаратов в онкологической практике приводит к необходимости индивидуального подбора лекарственных средств. Иммуногистохимическое исследование на c-erbB-2 рекомендуется для оценки чувствительности опухолевой ткани к низкомолекулярным ингибиторам и антителам к РЭФР.

Адъювантная иммунотерапия уротелиальных опухолей должна сопровождаться иммуногистохимическим анализом системы рецепции цитоки-нов. Положительная реакция со STAT1 в неинвазивных уротелиальных опухолях и Т1 карциномах низкой степени злокачественности может служить показанием для применения интерферона и вакцины БЦЖ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шалавин И.А. Маркеры рецидива поверхностного рака мочевого пузыря // Врач-аспирант. - 2006. -№3. - С. 261-266.

2. Шалавин И.А., Осипов С.А., Самойлов М.В., Бабиченко И.И. Имму-ногистохимические критерии стадии и степени злокачественности различных уротелиальных опухолей мочевого пузыря // Материалы VIII Между-

народного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации» -М.: Изд-во РУДН, 2007. -С. 695-696.

3. Шалавин И.А., Бабиченко И.И., Осипов С.А., Самойлов М.В. Экспрессия промежуточных филаментов и регуляторов клеточного цикла в уротелиальных опухолях мочевого пузыря // Вестник РУДН. Серия: Медицина. - 2008. - №3 - С. 87 - 91.

4. Шалавин И.А., Осипов С.А., Самойлов М.В., Бабиченко И.И. Рецепторы эпидермального фактора роста - 2 и степень злокачественности уротелиальных опухолей мочевого пузыря // Материалы IX Международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке; Влияние Космической погоды на биологические системы в свете учения А.Л. Чижевского» - М.: Изд-во РУДН, 2008. - С. 637 - 638.

5. Шалавин И.А, Осипов С.А., Самойлов М.В., Бабиченко И.И. Прогностическое значение белка Р53 и рецепторов эпидермального фактора роста - 2 при раке мочевого пузыря // Материалы III Конгресса Российского общества онкоурологов - 2008. - С.126 - 127

6. Шалавин И.А., Осипов С.А., Костанян И.А., Бабиченко И.И., Самойлов М.В. Роль онкопротеинов 5ТАТ1 и Р53 в прогнозировании клинического течения рака мочевого пузыря // Тезисы докладов конференции молодых ученых «Актуальные вопросы лучевой диагностики и онкологии». - 2008. -С. 18-23.

7. Шалавин И.А., Осипов С.А., Самойлов М.В., Бабиченко И.И. Особенности экспрессии рецепторов эпидермального фактора роста в уротелиальных опухолях мочевого пузыря // Вестник Новосибирского государственного университета. Серия: Биология, клиническая медицина. - 2008. - Т.6. -Вып.З. - Часть 2. - С. 31 - 36.

8. Шалавин И.А., Бабиченко И.И., Костанян И.А., Осипов С.А., Самойлов М.В. Влияние рецепторов эпидермального фактора роста и белка 8ТАТ1 на пролиферативную активность уротелиальных опухолей мочевого пузыря И Цитокины и воспаление. - 2008. - Т.7. - №4. - С. 37 - 40.

Шалавин И.А.

Особенности экспрессии рецепторов эпидермального фактора роста и белка 8ТАТ1 в уротелиальных опухолях мочевого пузыря

В работе показано, что экспрессия рецепторов эпидермального фактора роста характерна для всего спектра уротелиальных опухолей. В неин-вазивных опухолях и Т1 карциномах низкой степени злокачественности преимущественно экспрессируются рецепторы с-егЬВ-2, в Т2 опухолях запускается гиперэкспрессия рецепторов ЕСРЯ. В сигналинге рецепторов с-егЬВ-2 в неинвазивных уротелиальных опухолях участвуют транскрипци-

онные факторы STAT. Положительная реакция со STAT1 преобладает в не-инвазивных Та опухолях и Т1 карциномах низкой степени злокачественности, тогда как в Т2 карциномах и РМП высокой степени злокачественности доминирует отрицательная реакция. Экспрессия STAT1 связана с повышенной пролиферацией и экспрессией опорного низкомолекулярного цито-кератина СК20, обладающего проинвазивными свойствами. Патологическая экспрессия СК20 связана с инвазивными свойствами опухоли. Типы экспрессии c-erbB-2, СК20 и интенсивность реакции с Р53 в уротелиальных опухолях обладают прогностической значимостью.

Shalavin I.A.

Expression features of the epidermal growth factor receptors and STAT1 protein in urothelial neoplasms of the urinary bladder

Epidermal growth factor receptors have been shown expressing upon the whole spectrum of urothelial neoplasms. C-erbB-2 receptors are primarily expressed in the non-invasive and T1 neoplasms of low grade. EGFR are expressed in T2 tumors. STAT1 transcription factors take part in c-erbB-2 downstream signaling of the non-invasive urothelial neoplasms. Non-invasive urothelial tumors and T1 carcinomas of low grade are mostly STAT1 - positive whereas T2 neoplasms and high grade bladder cancers are commonly STAT1 - negative. STAT factors promote proliferation and expression of the CK20 intermediate filament which is possessing of infiltrating features. Pathologic expression of the CK20 associates with infiltrating features of the urothelial neoplasms. Both c-erbB-2, CK20- expression types and P53 immunostaining intensity possess of prognostic significance.

Подписано в печать 26.03.2009 г. Заказ № 8912 Формат бумаги 60 х 84/18. Тираж 100 экз. Усл. п. л. 1,0

Типография ООО «Арт Людвиг» Москва, Б. Ордынка, д. 40, стр. 4