Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Иммуногистохимическая характеристика карциноидов легочной локализации

На правах рукописи

Сайнога Татьяна Владимировна

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КАРЦИНОИДОВ ЛЁГОЧНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ

14.03.02 - Патологическая анатомия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

12 СЕН 2013

Волгоград — 2013

005532802

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Славинский Александр Александрович Официальные оппоненты:

Туманова Елена Леонидовна, доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой патологической анатомии и клинической патологической анатомии №2 педиатрического факультета ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России

Даниленко Виталий Иванович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой патологической анатомии ГБОУ ВПО «Воронежская государственная медицинская академия им. H.H. Бурденко» Минздрава России

Ведущая организация: государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный медицинский университет имени В:И. Разумовского» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Диссертационного совета Д 208.008.01 государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 400131, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Автореферат разослан « 2013 года

Защита состоится

года в /¿7 часов на заседании

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Н.В.Григорьева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

Карциноид входит в группу нейроэндокринных опухолей (НЭО) лёгких, которые в зависимости от их морфологических и молекулярно-биологических характеристик делятся на 4 группы: мелкоклеточный рак, крупноклеточный рак, атипичный (АК) и типичный карциноиды (ТК). Решающую роль в определении тактики лечения пациентов с НЭО играет адекватная морфологическая интерпретация опухоли, позволяющая дифференцировать карциноид и нейроэндокринный рак, определить степень дифференцировки и злокачественности опухолевых клеток, их принадлежность к нейроэндокринному типу. Общепринятые на сегодняшний день дифференциально-диагностические критерии для этой группы опухолей разработаны для больших образцов тканей (операционный материал) и базируются исключительно на гистологических признаках (Travis W.D. et al., 2004). На практике первичная морфологическая диагностика нейроэндокринных опухолей лёгких выполняется на мелких фрагментах ткани, полученных при бронхобиопсии, и в таких случаях не всегда возможно правильно оценить признаки, выявляемые на более крупных образцах (Rekhtman N. et al., 2010; Demirci I. et al., 2012).

Разделение карциноидных опухолей на типичный и атипичный карциноид, по мнению некоторых исследователей, не всегда может характеризовать истинный злокачественный потенциал новообразования (Чекини А.К. с соавт., 2012; Novkovic D. et.al. 2013). Так, типичный карциноид - более благоприятная по своему течению опухоль, чем атипичный карциноид, может метастазировать в региональные лимфоузлы и иметь отдаленные метастазы в кости, печень, головной мозг, что ухудшает прогноз заболевания и повышает уровень летальности (Wang Y.H. et.al., 2012; Zhong С.Х. et.al., 2012). Для того, чтобы оценить агрессивность опухоли и судить о её прогнозе, недостаточно рутинного гистологического исследования. Особое значение имеет изучение экспрессии ряда клеточных маркеров, участвующих в механизмах канцерогенеза, таких как протеины, связанные с апоптозом, межклеточной адгезией и пролиферацией

(Павленко И.А. с соавт., 2012; Eichelberg С. et.al., 2012). Для лечения типичных карциноидов в практику внедряются органосохраняющие методы, такие как бронхоскопическая резекция, требующие более тщательного отбора пациентов (Пикин О.В. с соавт., 2011; Neyman К. et.al., 2012). С этих позиций исследование иммунофенотипа клеток карциноидных опухолей лёгкого имеет большое практическое значение, оно позволяет правильно поставить диагноз и более объективно судить о прогнозе заболевания.

Проведенное нами комплексное иммуногистохимическое исследование карциноидов и определение иммунофенотипа опухолевых клеток на разных клинических стадиях процесса направлено на совершенствование морфологической диагностики нейроэндокринных опухолей лёгкого, а также на уточнение прогноза заболевания, что может быть использовано при разработке оптимальной тактики лечения.

Цель исследования

Охарактеризовать иммунофенотип клеток карциноидных опухолей лёгких и на этой основе разработать новые критерии дифференциальной диагностики и прогноза заболевания.

Задачи исследования

1.Определить характер экспрессии эпителиальных маркеров (цитокератин АЕ1/3, цитокератин 18, эпителиальный мембранный антиген, эпителиальный антиген Вег-Ер4) и выделить наиболее информативные иммуногистохимические критерии эпителиальной дифференцировки карциноидов лёгкого.

2.Определить значимость нейроэндокринных маркеров (хромогранин А, синаптофизин, CD56, CD57 и нейрон-специфическая энолаза) для дифференциальной диагностики карциноидов лёгкого и эпителиальных опухолей неэндокринного генеза.

3.Определить особенности иммуноэкспрессии органоспецифических маркеров лёгочного эпителия (TTF-1 и цитокератин 7) в карциновдах лёгких и установить их роль в дифференциальной диагностике первичных и метастатических карциноидных опухолей.

4.Выявить взаимосвязь классических неблагоприятных прогностических факторов (размеры первичного очага, поражение лимфатических узлов) с иммунофенотипом опухоли.

5.Разработать критерии для дифференциальной диагностики нейроэндокринных опухолей различной степени злокачественности на основе их иммуногистохимического анализа.

Научная новизна исследования Получены новые данные об экспрессии карциноидами лёгких эпителиальных, нейроэндокринных и органоспецифических маркеров, необходимые для достоверной диагностики этих опухолей.

Определены новые иммунофенотипические признаки опухолевых клеток, связанные с большим размером опухоли и наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах, что позволяет выделить группу больных с высокой степенью риска прогрессирования заболевания.

Впервые проведено сравнительное исследование экспрессии метаболического фермента АМАСЯ в карциноидах лёгкого на разных стадиях опухолевого процесса. Обнаружено, что экспрессия этого маркера достоверно повышена в метастазирующих карциноидах и может быть использована как признак неблагоприятного прогноза.

Предложены новые иммуногистохимические критерии дифференциальной диагностики нейроэндокринных опухолей различной степени злокачественности.

Научно-практическая значимость работы Результаты работы могут быть использованы для дифференциальной диагностики и уточнения оценки инвазивного потенциала и прогноза течения карциноидов лёгких в практической деятельности патологоанатомических отделений, в работе отделений онкологии, для разработки новых способов лечения контингента больных с карциноидными опухолями лёгочной локализации, а также для научно-исследовательских разработок и в учебном процессе.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Карциноидные опухоли лёгких характеризуются выраженной экспрессией нейроэндокринных (главньм образом хромогранин А, синаптофизин) и эпителиальных маркеров (цитокератин АЕ1\3, цитокератин 18, эпителиальный мембранный антиген Вег-Ер4), а также низкой иммунореактивностью с органоспецифическими молекулами легочной ткани (ТТР-1, цитокератин 7). Характер экспрессии диагностических маркеров зависит от степени злокачественности опухоли.

2. Дифференциально-диагностические критерии, отличающие карциноидные опухоли от нейроэндокринных карцином - это выраженная экспрессия нейроэндокринных и эпителиальных маркеров, индекс пролиферации менее 20%, слабая экспрессия мутантного проапоптотического белка р53, ингибитора апоптоза Вс1-2, рецептора фактора роста С0117, маркера альвеолярного эпителия

там.

3. Способность карциноидных опухолей лёгких к росту и метастазированию определяется повышенной пролиферативной активностью клеток в сочетании со смещением экспрессии регуляторных белков в сторону ингибитора апоптоза, а также снижением экспрессии молекул межклеточной адгезии и гиперэкспрессией метаболического фермента альфа-метилацил-коэнзим А рацемазы.

Апробация работы и публикации

Основные положения диссертации изложены на международной научной конференции «Актуальные проблемы науки и образования» (Куба, Гавана 2010), 10-й научно-практической конференции молодых ученых и студентов юга России (Краснодар, 2011), международной научной конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине» (Сочи, 2011), международной научной конференции «Приоритетные направления развития науки, технологий и техники» (Египет, 2011), международной научной конференции «Диагностика, терапия, профилактика социально значимых заболеваний человека» (Турция, 2011), международной научной конференции «Практикующий врач» (Италия,

2011), международной научной конференции «Фундаментальные исследования» (Хорватия 2012).

По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 3 статьи в журналах из перечня рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации результатов кандидатских диссертаций.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 165 страницах печатного текста, состоит из оглавления, введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследования, 2 глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы. Иллюстративный материал представлен 49 таблицами, 19 рисунками. Список литературы включает 325 источников, в том числе - 33 отечественных и 292 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводили на биопсийном и операционном материале патологоанатомического отделения Краевой клинической больницы №1 им. проф. С.В. Очаповского г. Краснодара, полученном от 214 больных, находившихся на лечении в Центре грудной хирургии с 2007 по 2011 гг. Исследованный материал был разделен на 2 группы:

1 группа (основная) - операционный материал, полученный от 104 больных карциноидными опухолями лёгкого. Пациентам выполнены резекция сегмента, доли или всего легкого с лимфодиссекцией. Диагноз был морфологически верифицирован, опухоли поделены на типичный и атипичный карциноиды согласно рекомендациям ВОЗ (73 типичных карциноида и 31 атипичный). Все случаи стадированы по классификации ПЧМ. В зависимости от признаков прогрессирования заболевания (наличие метастазов, большой размер опухоли) данная группа больных разделена на подгруппы (табл.1). Следует отметить, что у пациентов участвующих в нашем исследовании, на стадии Т2 (опухоль более 3 см) отсутствовали такие дополнительные признаки, как прорастание висцеральной плевры и пневмония/ателектаз с вовлечением корня лёгкого, а

вовлечение главного бронха наблюдалось в 11% случаев. Таким образом, основными критериями неблагоприятного течения заболевания являлись размер опухоли (более 3 см) и наличие метастазов в лимфатических узлах. Какой либо зависимости между размером опухоли и наличием метастазов не было выявлено.

Таблица 1

Распределение больных с карциноидами лёгкого по группам в зависимости от

размера опухоли и наличия метастазов

Статус опухоли Количество пациентов, п

ТК АК всего

Т-статус Т1 54 13 67

Т2 19 18 37

Ы-статус N0 67 21 88

N1-2 6 10 16

2 группа (группа сравнения) - биопсийный и операционный материал, полученный от 60 больных с морфологически верифицированным нейроэндокринным раком лёгкого (45 случаев мелкоклеточного рака и 15 случаев крупноклеточного рака).

3 группа (контрольная) - операционный материал, полученный от 50 больных с морфологически верифицированным неэндокринным раком лёгкого (плоскоклеточный рак - 30 пациентов, аденокарцинома лёгкого - 20 пациентов).

Морфологическое исследование фрагментов ткани опухоли, фиксированных 10% забуференным формалином, включало в себя микроскопическое исследование серийных срезов окрашенных рутинным способом (гематоксилин-эозин) и с применением иммуногистохимического (ИГХ) метода. Для гистологического исследования материала использовали традиционный метод парафиновой заливки. Проводка материала осуществлялась в тканевом процессоре карусельного типа М1сгот 8ТР120.

Иммуногистохимическое исследование осуществляли на срезах с парафиновых блоков иммунопероксидазным методом по стандартной методике

(Buchwalow I. В. et al., 2010). Серийные срезы толщиной 3-4 мкм наносили на стекла с адгезивным покрытием (поли-Ь-лизин). Предварительную температурную демаскировку антигенов производили согласно инструкциям к антителам с помощью автоклава Pascal фирмы «DAKO». Процесс иммуногистохимического окрашивания производили в автостейнере Autostainer Plus фирмы «DAKO».

Использовали следующий набор маркеров: Ki-67 (клон MIB-1), Вс1-2, Вах, р53, Cytokeratin АЕ1/АЕЗ, Cytokeratin 7, Cytokeratin 18, Epithelial Antigen Ber-Ep4, EMA, Thyroid Transcription Factor, c-kit CD 117, S-100, CD68, Synaptophysin, Chromogranin A, CD56, CD57, NSE, E-Cadherin, CD44, AMACR (производство фирмы «DAKO»). В качестве вторичных антител применяли смесь биотинилированных антикроличьих и антимышиных иммуноглобулинов (EnVision™ FLEX System фирмы «DAKO»), для визуализации места связывания антигена с антителом использовали метку — фермент пероксидазу хрена в присутствии субстрата — пероксида водорода и колориметрического реактива 3,3-диаминобензидина (набор DAB+, «DAKO»),

Для оценки характера экспрессии ИГХ-маркеров разработана специальная шкала оценки, учитывающая как количество позитивных клеток, так и интенсивность окрашивания. При выявлении SlOO-позитивных поддерживающих клеток учитывали площадь покрытия ткани опухоли сетью поддерживающих клеток. Индекс пролиферации Ki67 вычисляли как среднее от числа окрашенных ядер на 100 учтенных ядер (при учете 10 полей зрения при увеличении х400 для операционного материала).

Чувствительность и специфичность маркеров нейроэндокринной дифференцировки рассчитывали как соотношение числа опухолей с положительной экспрессией маркера к количеству всех исследованных образцов (положительной расценивали экспрессию на 3-5 баллов). При сравнительной оценке экспрессии регуляторов апоптоза использован коэффициент апоптоза (КА), представляющий собой соотношение Bcl-2-позитивных клеток к Вах-позитивным клеткам.

Для оценки межгрупповых различий значений признаков применяли ранговый и-критерий Вилкоксона—Манна—Уитни. Анализ зависимости между признаками проводили с помощью критериев \ и Фишера. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы (об отсутствии значимых межгрупповых различий или факторных влияний) принимали равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Морфологическая характеристика карциноидов лёгкого. Средний возраст больных с карциноидными опухолями лёгких составил 51,8 года, причем средний возраст мужчин был несколько ниже, чем женщин (46 лет и 54,4 года соответственно). Соотношение мужчин и женщин - 1:2. Установлено, что для типичных карциноидов с центральной локализацией характерен преимущественно полипообразный эндобронхиальный рост опухоли (76%), а для атипичных карциноидов — смешанный рост, при котором опухоль частично погружалась в ткань лёгкого за пределы стенки бронха (64%). Средний размер опухолевого узла при типичном карциноиде - 2,66см, при атипичном- 3,55см. В типичных карциноидах митозы отсутствовали в 97% случаев, среднее количество митозов составило 0,16 на 2 мм2. В атипичных карциноидах средняя митотическая активность составила 1,76 на 2мм2, некрозы выявлены в 53% случаев.

Диагностическая эндоскопическая бронхобиопсия была выполнена у 79% больных с карциноидными опухолями. В большинстве случаев (80,5%) установлен диагноз карциноида без уточнения степени дифференцировки. В 8% случаев ошибочно диагностирован нейроэндокринный рак, в 2,5% - рак неэндокринной природы, в 4% - другая неэпителиальная опухоль. В 5% выставлен диагноз нейроэндокринной опухоли неопределенной степени злокачественности. Таким образом, при морфологической диагностике наибольшую трудность представляет определение степени злокачественности как карциноидов, так и НЭО в целом.

Экспрессия маркеров нейроэндокринной дифференцировки Экспрессию нейроэндокринных маркеров в карциноидах лёгких определяли с

использованием нескольких антител: синаптофизина, хромогранина А, нейрон-специфической энолазы (НСЭ), CD56 (NCAM) и CD57(Leu-7).

Самыми чувствительными маркерами нейроэндокринной дифференцировки применительно к карциноидам лёгкого оказались хромогранин А и синаптофизин, частота экспрессии НСЭ, CD56 и CD57 была несколько ниже. Отмечено резкое снижение чувствительности хромогранина и CD57 в нейроэндокринных карциномах, тогда как разница в характере экспрессии синаптофизина и НСЭ не столь значительна, а маркер CD56 имеет тенденцию к повышению иммунореактивности в более злокачественных НЭО (рис.1).

Хромогранин CD?7 Сннаптофшнн НСЭ CD 56

А

Рис. 1 .Чувствительность нейроэндокринных маркеров в НЭО различной степени

злокачественности, (%).

Установлено, что все изученные маркеры, кроме НСЭ, обладают достаточной специфичностью. В неэндокринных легочных карциномах интенсивная положительная реакция в большом количестве клеток опухоли наблюдалась только при использовании этого маркера. Специфичность НСЭ составила 66%, тогда как хромогранина 100%, синаптофизина 94%, CD56 и CD57 - 92%. При сравнении экспрессии нейромаркеров на различных клинических стадиях статистически значимых различий не выявлено.

Экспрессия нейроэктодермального маркера S100. Выраженная «параганглиоидная» сеть из SlOO-позитивных поддерживающих клеток выявлена только в типичных карциноидах, причем далеко не во всех опухолях (16% - 12 из 73). В большинстве случаев карциноиды демонстрировали лишь отдельные поддерживающие клетки (56% ТК и 29% АК), либо полное их отсутствие. Кроме

того, экспрессия SI00 определялась и в основных клетках опухоли: в 35% (26 из 73) типичных карциноидов и в 26% (8 из 31) атипичных выявлена положительная реакция с этим маркеров в большинстве или части опухолевых клеток. Зависимости между экспрессией S100 в различных опухолевых структурах и клинической стадией не установлено. В нейроэндокринном раке SlOO-позитивных поддерживающих клеток не выявлено, однако непосредственно в клетках опухоли экспрессия отмечалась в небольшом количестве случаев.

Присутствие поддерживающих клеток более характерно для типичных карциноидов лёгкого, нежели для атипичных. Также следует отметить, что экспрессия S100 может присутствовать не только в поддерживающих, но и в основных клетках карциноидных опухолей.

Экспрессия эпителиальных маркеров. Оценку экспрессии эпителиальных маркеров в карциноидах лёгких производили с использованием первичных антител к панцитокератину (пан ЦК), клон АЕ1\АЕЗ, цитокератину (ЦК) 18, эпителиальному мембранному антигену ЕМА, эпителиальному антигену Вег-Ер4.

Цитокератин АЕ1/3, цитокератин 18 и эпителиальный антиген Вег-Ер4 в отличие от ЕМА демонстрируют высокий уровень экспрессии в карциноидных опухолях. Выраженная экспрессия цитокератина АЕ1/3 выявлена в 78% карциноидов, цитокератина 18 - в 97%, Вег-Ер4 - в 76%. Следует отметить, что высокозлокачественные НЭО характеризуются снижением экспрессии панцитокератина, лишь 53% опухолей интенсивно экспрессируют этот маркер. Кроме того, выявлены различия в локализации экспрессии цитокератинов в карциноидах и нейроэндокринных карциномах. Нейроэндокринные опухоли часто демонстрируют перинуклеарную экспрессию ЦК в виде крупных гранул, что позволяет заподозрить их природу (Rodney Т. et al., 2004). По нашим данным, такая иммунореактивность часто встречается в нейроэндокринном раке, однако в карциноидах этот эффект выявлен в небольшом количестве случаев (рис.2). Какой-либо зависимости характера экспрессии эпителиальных маркеров от стадии процесса в карциноидных опухолях не установлено.

100% 90% 80% 70% 60% 50° о -40% 30% 20% 10° о 0%

—Ц Цк' 18

■*--ПГ ЦК 18

*— Ц панЦк

•♦•■ ПГ панЦк

Тк

Ак

карциномы

Примечание: ПГ-перинуклеарные гранулы, Ц-цитоплазматическая экспрессия.

Рис. 2. Зависимость характера экспрессии цитокератинов от степени злокачественности НЭО.

Небольшое количество (8%) всех карциноидов не экспрессировало АЕ1\3. В таких случаях для дифференциальной диагностики необходимо использовать дополнительные маркеры. Наиболее пригодными для этих целей являются цитокератин 18 и эпителиальный антиген Вег-Ер4.

Экспрессия органоспецифических маркеров. Для выявления первичного очага при метастазировании используются различные органоспецифические молекулы. Для лёгкого такими маркерами можно считать цитокератин 7 (ЦК 7) и тиреоидный фактор транскрипции (ТПМ).

Цитокератин 7. Экспрессия цитокератина 7 большинством клеток опухоли выявлена в 24,6 % (18 из 73) случаев типичного карциноида, 29% (9 из 31) атипичного карциноида. В 27% (20 из 73) ТК и 26% (8 из 31) АК выявлены отдельные позитивные клетки, а в 20,5% (15 из 73) и 16% (5 из 31) соответственно экспрессия ЦК 7 отсутствовала. В высокозлокачественных НЭО процент положительной экспрессии ЦК 7 также достаточно низок: в 21,6% наблюдалась реакция с большинством клеток, в 31,6% - с частью, в 15% - единичные позитивные клетки.

Тиреоидный фактор транскрипции (ТТР-1). Ядерная экспрессия ТТР-1 наблюдалась в 4 случаях (13%) атипичного карциноида, а при типичном карциноиде положительная реакция не выявлена ни в одной из исследованных

опухолей. Среди нейроэндокринных карцином лёгкого 63% опухолей демонстрировали интенсивную экспрессию ТП7-1 большинством клеток опухоли.

Таким образом, экспрессия ТТТЧ в большей степени характерна для низкодифференцированных нейроэндокринных опухолей лёгкого, нежели для карциноидов (р<0,001). При оценке экспрессии ЦК 7 и ТПМ в карциноидах на различных клинических стадиях значимых закономерностей не выявлено.

Экспрессия молекул межклеточной адгезии (Е-кадгерин и CD44). Экспрессия адгезивных молекул в типичных и атипичных карциноидах лёгкого существенно не различается — чаще всего отмечалась интенсивная мембранная реакция (рис.3). Среди нейроэндокринных карцином около половины случаев были негативными. Увеличение размеров опухоли и метастатического потенциала карциноидов сопровождается снижением экспрессии адгезивных молекул (табл.2).

. ■Е-кадгерин

4,6 4 49

■ 4,09 ищи

тт |Н з.о9

щШ ■ ыШ

ТК АК

Рис 3. Экспрессия адгезивных молекул в НЭО лёгкого в баллах, X.

Таблица 2

Экспрессия адгезивных молекул в карциноидах лёгкого в зависимости от размера

опухоли и наличия метастазов

Статус опухоли Е-кадгерин Р СБ44 Р

5 баллов <5 баллов 5 баллов <5 баллов

Т-статус Т1 64 3 <0,05 67 0 <0,05

Т2 28 9 29 8

статус N0 82 6 <0,05 87 1 <0,05

N1-2 10 6 9 7

□ со 44

1-^6 1,43

Рак

Эти данные подтверждают концепцию о влиянии снижения экспрессии адгезивных молекул на опухолевую прогрессию и метастазирование

Экспрессия маркера пролиферирующих клеток Ю67. Пролиферативную активность опухолевых клеток выявляли с помощью антитела к Кл67, экспрессирующегося в ядрах. В типичных карциноидах уровень пролиферативной активности составил 0-3%, при этом 11% всех опухолей (8 из 73) не экспрессировали Кл67. В атипичных карциноидах пролиферативный индекс колебался от 2 до 20%. Следует отметить, что среди типичных карциноидов только в 1 опухоли выявлено более 2% К167-позитивных клеток. В нейроэндокринных карциномах индекс пролиферации составил 40-65% в крупноклеточных раках и 70-98% в мелкоклеточных раках.

Таким образом, количество Кл67-позитивных клеток в карциноидах лёгкого намного ниже, чем в высокозлокачественных НЭО (р<0,001). В среднем индекс Кл67 в типичных карциноидах составил 0,54±0,06%, в атипичных 6,20±0,78%, в нейроэндокринных карциномах 72,9±2,05%. В большинстве исследованных карциноидов наблюдалась положительная корреляция между пролиферативным индексом и количеством митозов.

Пролиферативная активность в карциноидах повышается при увеличении стадии заболевания. В атипичных карциноидах выявлено статистически достоверное нарастание индекса ¥л61 как при увеличении размера опухоли, так и при наличии метастазов. При типичном карциноиде картина несколько иная: более высокая пролиферативная активность связана с большим размером опухоли, но не с наличием метастазов (табл.3)

Многими исследованиями подтверждено, что пролиферативная активность является важным прогностическим фактором НЭО и большинство классификаций полагаются именно на этот признак, чтобы разграничить опухоли разной степени дифференцировки (КПгт^га О. е^ а1., 2010). Классификация опухолей лёгких ВОЗ основывается только на митотическом индексе, однако для НЭО желудочно-кишечного тракта Европейская ассоциация по изучению нейроэндокринных опухолей (ЕМ^ТБ) предложила классификацию с использованием индекса К67

(Бегите С. Я. е! а1., 2007; ШпсИ в. й. а1., 2007). Полученные нами данные позволяют считать, что типичные карциноиды лёгкого соответствуют градации 01, а атипичные градации С}2 по классификации ЕЫЕТЯ.

Таблица 3

Экспрессия Ш67 в карциноидах в зависимости от размера опухоли и наличия

метастазов

Статус опухоли Индекс Ki67 %, -Vim

ТК Р АК Р

Т-статус Т1 0,35±0,05 <0,05 3,65±1,67 <0,05

Т2 0,90±0,76 7,02±1,21

N-статус N0 0,41±0,06 >0,05 3,85±0,46 <0,05

N1-2 0,51±0,07 9,10±1,73

Экспрессия белков, регулирующих апоптоз. Для определения роли белков, регулирующих апоптоз, в опухолевой прогрессии использовали антитела к Вс1-2 и Вах, выполняющих противоположную регуляторную функцию, а также выявляли экспрессию мутантного р53.

Белок Bcl-2. Экспрессия Вс1-2 возрастает по мере увеличения злокачественности как карциноидных опухолей, так и НЭО в целом (р<0,001). В типичных карциноидах уровень экспрессии составил 0,17±0,07 баллов, в атипичных 2,09±0,28 баллов, в нейроэндокринных карциномах - 4,35±0,14 баллов. При сравнении экспрессии Вс1-2 в карциноидах на разных клинических стадиях, статистически значимых отличий как при наличии\отсутствии метастазов, так и при увеличении размера опухоли не выявлено.

Белок Вах. При сравнении экспрессии Вах в типичных и атипичных карциноидах (экспрессия в баллах составила 3,95±0,16 и 3,79±0,26 соответственно), а также на разных клинических стадиях, статистически значимых отличий не установлено. В нейроэндокринных карциномах экспрессия маркера составила 2,38±0,16 балла.

Белок р53. Экспрессия р53 в типичных карциноидах составила 0,35±0,06 балла, в атипичных - 0,93±0,14 балла, что значительно ниже (4,23±0,10 балла) показателей в высокозлокачественных НЭО (р<0,001). Статистически значимых различий в характере экспрессии р53 от стадии карциноидной опухоли не выявлено. Однако, среди карциноидов с метастазами и размером более Зсм количество опухолей экспрессирующих и не экспрессирующих р53 примерно равное, в опухолях без метастазов и небольших размеров число р53-отрицательных опухолей было несколько больше.

Таким образом, мутация р53 не характерна для карциноидных опухолей лёгких. В низкодифференцированных НЭО экспрессия р53 выявлялась значительно чаще. Это предполагает, что р53 не играет ведущей роли в патогенезе карциноидов, как это наблюдается в нейроэндокринных карциномах. Следует отметить, что экспрессия р53 несколько чаще выявляется в атипичных карциноидах, нежели в типичных.

Для сравнительной оценки экспрессии протеинов-регуляторов апоптоза использован коэффициент апоптоза, представляющий собой соотношение Вс1-2/Вах. В группе типичных карциноидов случаев с коэффициентом апоптоза более 1 не выявлено, тогда как в атипичных карциноидах количество таких опухолей составило 1\3 от общего числа. Предполагается, что дикий тип р53 должен инициировать апоптоз путем активирования проапоптотического гена Вах и супрессии антиапоптотического гена Вс1-2. Таким образом, опухоли с мутантным р53 в большей степени подвергаются воздействию Вс1-2, подавляющего апоптоз, чем Вах. Так, в атипичных карциноидах с коэффициентом апоптоза более 1 в большинстве случаев (89%) выявлена экспрессия р53, а при коэффициенте менее 1 - только в половине случаев. При опухолевой прогрессии отмечены некоторые изменения в соотношении экспрессии Вс1-2\Вах (табл.4). Коэффициент апоптоза возрастает по мере увеличения размера опухоли, однако связи с метастазированием не выявлено.

Таким образом, баланс про- и антиапоптотических белков семейства Вс1-2 -важная детерминанта, определяющая предрасположенность клетки к апоптозу.

Таблица 4

Коэффициент апоптоза в карциноидах в зависимости от размера опухоли и

наличия метастазов

Статус опухоли Количество наблюдений в зависимости от коэффициента апоптоза, п (%)

<1 1 >1 Р

Т-статус Т1 59 (56) 5(5) 3(4) <0,05

Т2 26 (25) 5(5) 6(6)

N-статус N0 74 (74) 7(8) 7(8) >0,05

N1-2 11(10) 3(3) 2(2)

Выявлено, что при увеличении злокачественности карциноидных опухолей количество Bel-2- и р53-позитивных клеток в них возрастает. Коэффициент апоптоза в карциноидных опухолях также повышался по мере снижения дифференцировки. Однако, во всех случаях положительной экспрессии р53 и Bcl-2, она носила слабовыраженный характер и статистически достоверных данных о влиянии этих белков на более агрессивное течение карциноидных опухолей не получено. Эти результаты предполагают, что отсутствие мутации р53 и гиперэкспрессия антиапоптотического белка, низкая пролиферативная активность - факторы, определяющие относительно доброкачественное течение карциноидов лёгких. Установлено, что рост карциноидных опухолей в большей степени зависит от уровня пролиферативной активности, нежели от нарушений в процессе регуляции апоптоза. Высокий индекс Ю67 имеет большее прогностическое значение, чем экспрессия отдельных апоптотических маркеров.

Экспрессия рецептора фактора роста CD117 (c-kit). Уровень экспрессии с-kit в типичных карциноидах составил в среднем 0,71±0,13 баллов, в атипичных 1,32±0,31 балла, в нейроэвдокринных карциномах 3,08±0,24 балла. Таким образом, существенной разницы между экспрессией CD117 в типичных и атипичных карциноидах не выявлено (р>0,05), однако в НЭО высокой степени злокачественности наблюдалась значительно более выраженная иммунореактивность клеток с этим маркером (р<0,001). При сравнении

экспрессии CD117 в карциноидных опухолях на разных клинических стадиях не установлено статистически значимых отличий.

Экспрессия альфа метилацил коэнзим А рацемазы (AMACR). AMACR -митохондриальный и пероксисомный фермент, участвующий в окислении жирных кислот. AMACR играет важную роль в опухолевом генезе, однако молекулярные механизмы этого процесса остаются не изученными. Гиперэкспрессия AMACR выявлена во многих опухолях, а также в предопухолевых процессах (Noske A. et. al., 2011; Ouyang В. et. al., 2011; Gilani S. M. et. al., 2012; Schaik F. D. et. al., 2012). Экспрессия этого маркера в типичных карциноидах низка (0,87±0,17 баллов), а в атипичных карциноидах уровень экспрессии (2,00±0,31 балла) сходен с таковым в нейроэндокринных карциномах (1,88±0,26 балла).

Для типичных карциноидов выявлено статистически значимое различие в характере иммунореактивности опухолевых клеток с AMACR в зависимости от наличия метастазов и размера первичного очага (табл.5).

Таблица 5

Экспрессия AMACR в карциноидах в зависимости от размера опухоли и наличия

метастазов

Количество наблюдений по типам экспрессии, n

Статус опухоли ТК,1-5 ТК,0 Р АК, 1-5 АК, 0

баллов баллов баллов баллов Р

Т-статус Т1 11 43 <0,05 7 6 >0,05

Т2 10 9 14 4

N-статус N0 16 51 <0,05 12 9 >0,05

N1-2 5 1 9 1

В атипичных карциноидах такая тенденция не прослеживается, однако интенсивная экспрессия этого маркера большинством опухолевым клеток обнаружена только в случаях с метастазами (р<0,05). В целом, как в типичных, так

и в атипичных карциноидах интенсивная экспрессия (гиперэкспрессия) этого маркера выявлена только в опухолях с метастазами.

Результаты проведенного комплексного клинико-морфологического и иммуногистохимического исследования позволили установить, что ряд иммунофенотипических признаков (такие как высокий индекс Кл67, коэффициент апоптоза более 1, редукция экспрессии адгезивных молекул и гиперэкспрессия АМАСЯ) являются неблагоприятными прогностическими критериями, свидетельствующими о высоком риске прогрессирования опухолевого процесса при карциноидах лёгкого. Полученные нами данные необходимо учитывать наряду с классическими неблагоприятными признаками при выполнении органосохраняющих операций. Кроме того, применение

иммуногистохимического метода позволяет более достоверно определить степень злокачественности нейроэндокринных опухолей. Рекомендуемые дифференциально-диагностические маркеры представлены в таблице 6.

Таблица 6

Различия в иммунофенотипе НЭО лёгких в зависимости от степени

злокачественности

Тип опухоли Характер экспрессии иммуногистохимических маркеров

Хром панЦК СБ117 Вс1-2 Кл67,% АМ ПТ-1 р53

ТК + + -/+сл -/+сл 0-3 + -

АК + + -/+сл +/-СЛ 2-20 +

рак -/+сл +\-пг +ИНТ +ИНТ 40-98 -/+

Примечание: Хром - хромогранин А, панЦК - панцитокератин АЕ1\3, АМ - адгезивные молекулы, ПГ - перинуклеарные гранулы;

«+» экспрессия маркера в 90-100% случаев; «+/-» экспрессия маркера в 50-90% случаев; «-/+» экспрессия в менее чем 50% случаев; «-» отсутствие экспрессии; сл - слабоположительная реакция в части клеток опухоли; инт - интенсивная реакция в большинстве клеток.

ВЫВОДЫ

1.Наиболее информативные маркеры эпителиальной дифференцировки в

карциноидных опухолях лёгких - панцитокератин АЕ1/3, цитокератии 18 и эпителиальный антиген Вег-Ер4; их экспрессия в большинстве опухолевых клеток выявлена у 91%, 97% и 93% больных соответственно. Реакция с эпителиальным мембранным антигеном (ЕМА) у 76% пациентов была положительной лишь в отдельных клетках. Экспрессия цитокератинов в виде перинуклеарных гранул установлена в 14% случаев при использовании цитокератина АЕ1/3 и в 9% при использовании цитокератина 18.

2.Нейроэндокринные маркеры синаптофизин и хромогранин А имеют наиболее высокие показатели чувствительности и специфичности при диагностике карциноидных опухолей лёгкого. Чувствительность указанных маркеров составляет 92,4%, и 94%, специфичность 100% и 94% соответственно. Коэкспрессия этих маркеров повышает чувствительность до 100%. Чувствительность СБ56 и СБ57 несколько ниже и составляет 85% и 72%, специфичность обоих маркеров — 92%. Нейрон-специфическая энолаза при достаточно высокой чувствительности (86%) обладает низкой специфичностью (66%).

3.Отсутствие экспрессии органоспецифических маркеров лёгочного эпителия не является достоверным критерием внелёгочного происхождения карциноидных опухолей. В типичных карциноидах лёгкого экспрессии ТТР-1 не выявлено, а в атипичных она носит слабо выраженный характер (очаговая положительная реакция в 13% случаев). Для цитокератина 7 установлены более высокие значения частоты экспрессии, не зависящие от степени злокачественности опухоли: положительная реакция большинством клеток опухоли выявлена в 24,6% типичных и 29% атипичных карциноидов.

4.Иммуногистохимические признаки неблагоприятного прогноза, связанного с размером первичной опухоли (более 3 см) - увеличение пролиферативной активности опухолевых клеток и смещение экспрессии регуляторных белков в сторону ингибитора апоптоза Вс1-2 (коэффициент апоптоза >1), а также редукция экспрессии молекул межклеточной адгезии. Средний индекс пролиферации Ю67 для типичных карциноидов стадии Т1 составил 0,35%,

стадии Т2 - 0,90%, в то время как для атипичных - 3,65% и 7,02% соответственно.

5.Неблагоприятные иммунофенотипические признаки, указывающие на высокий риск метастазирования карциноидных опухолей легких - снижение числа клеток с интенсивной мембранной экспрессией молекул межклеточной адгезии и гиперэкспрессия метаболического фермента AMACR. В типичных карциноидах наличие любого количества клеток, иммунореактивных с AMACR связано с наличием метастазов (в 83% метастазирующих опухолей и 31% неметастазирующих выявлена экспрессия этого маркера). В атипичных карциноидах только гиперэкспрессия AMACR является признаком, указывающим на повышенный риск развития метастазов (60% метастазирующих опухолей и 5% неметастазирующих).

6.Иммунофенотип карциноидных опухолей лёгкого меняется в зависимости от степени их злокачественности. Атипичные карциноиды характеризуются более высоким индексом Ki67 (0-3% в типичных карциноидах, 2-20% в атипичных) и более выраженной экспрессией ингибитора апоптоза Вс1-2 (0,17 баллов в типичных карциноидах, 2,09 баллов в атипичных). Также признаками, указывающими на повышенную злокачественность, служат наличие TTF-1 позитивных клеток в опухоли (0% типичных и 19% атипичных), гиперэкспрессия AMACR (5% типичных и 13% атипичных) и отсутствие выраженной сети поддерживающих клеток (16% типичных и 0% атипичных карциноидов).

7.Иммунофенотипические критерии, позволяющие отличить высокозлокачественные нейроэндокринные опухоли лёгких от карциноидов -экспрессия цитокератинов в виде перинуклеарных гранул (40% карцином), слабая экспрессия нейроэндокринных маркеров хромогранина А и CD57, выраженная экспрессия TTF-1 (63% карцином), редукция экспрессии молекул межклеточной адгезии, индекс пролиферации Ki67 40-98%, интенсивная экспрессия большинством опухолевых клеток ингибитора апоптоза Вс1-2, мутантного проапоптотического белка р53 и рецептора фактора роста CD 117.

Подобный характер экспрессии Вс1-2, р53 и CD117 для карциноидных опухолей не характерен.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1.Для иммуногистохимического выявления нейроэндокринной дифференцировки в опухолях лёгких целесообразно применять как минимум 2 нейроэндокринных маркера. Наиболее оптимально сочетание маркеров хромогранин A- CD56, так как они охватывают весь спектр НЭО лёгких и обладают высокой специфичностью. Хромогранин А может быть и дифференциально-диагностическим маркером для карциноидов и нейроэндокринных карцином.

2.При иммуногистохимическом выявлении эпителиальной природы нейроэндокринных опухолей лёгких маркером выбора остается панцитокератин АЕ1\3, однако не все карциноиды его экспрессируют. В таких случаях целесообразно использование цитокератина 18 и эпителиального антигена Вег-Ер4.

3.При дифференциальной диагностике между типичными и атипичными карциноидами возможно использование только индекса Ki67 без подсчета количества митозов. Исключение составляют опухоли с индексом пролиферации 2-3%.

4.Для дифференциальной диагностики между нейроэндокринными опухолями различной степени злокачественности в дополнение к определению пролиферативной активности рекомендуется выявление экспрессии антиапоптотического белка Вс1-2, мутантного р53, рецептора CD 111, маркера альвеолярного эпителия TTF-1.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Сайнога Т.В. Экспрессия тиреоидного фактора транскрипции в нейроэндокринных опухолях лёгких / Т.В. Сайнога, A.A. Славинский // Успехи современного естествознания. — 2010. — №5. - С.66-67.

2. Сайнога Т.В. Синаптофизин в диагностике нейроэндокринных опухолей лёгких / Т.В. Сайнога, A.A. Славинский // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2011- №9. - С. 103-104.

3. Сайнога T.B. Хромогранин А в диагностике нейроэндокринных опухолей лёгких / Т.В. Сайнога, A.A. Славинский // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2011- №10 - С.48-49.

4. Сайнога Т.В. Возможность использования тиреоидного фактора транскрипции в дифференциальной диагностике нейроэндокринных опухолей лёгких различной степени злокачественности / Т.В. Сайнога // Медицинская наука и здравоохранение: Материалы IX научно-практической конференции молодых ученых и студентов юга России. - Краснодар. - 2011. - С.32-33.

5. Сайнога Т.В. Иммуногистохимические маркеры CD 56 и CD57 в диагностике нейроэндокринных опухолей лёгких / Т.В. Сайнога, A.A. Славинский // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2011-№10 - С.68-69.

6. Сайнога Т.В. Нейрон-специфическая энолаза в диагностике нейроэндокринных опухолей лёгких / Т.В. Сайнога, A.A. Славинский // Международный журнал экспериментального образования. - 2011. - №11. - С.45-46.

7. Сайнога Т.В. Белок S-100 в карциноидах лёгкого / Т.В. Сайнога, A.A. Славинский // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований,- 2012.-№7,- С.89-90.

8. Сайнога Т.В. Экспрессия иммуногистохимических маркеров нейроэндокринной дифференцировки в злокачественных опухолях лёгких / Т.В. Сайнога, A.A. Славинский // Кубанский научный медицинский вестник. - 2012. - № 2 (131). - С. 154-157.

9. Сайнога Т.В. Роль белков-регуляторов клеточного цикла в опухолевой прогрессии при карциноидах лёгкого / Т.В. Сайнога, A.A. Славинский // Кубанский научный медицинский вестник. - 2012. - № 3 (132). - С. 129-131.

10. Сайнога Т.В. Гинерэкспрессия альфа-метилацил-коэнзим А рацемазы в карциноидах лёгкого как независимый прогностический фактор / Т.В. Сайнога, A.A. Славинский // Фундаментальные исследования. - 2013. - № 7. -С. 390-393.

Отпечатано в ООО «Копи-лринт», г. Краснодар Подписано в печать 23.08.13 г. Объем 1,5 п.л. Бумага офсетная. Печать цифровая Заказ N9 675. Тираж 100 экз.