Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Оценка способов приготовления и использования стандартных реактивов антирезус
- Ученая степень
- кандидата биологических наук
- ВАК РФ
- 14.00.29
Оглавление диссертации Минеева, Наталья Витальевна :: 1984 :: Ленинград
1. ВВЕЩЕШЕ.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
4. СОБСТВЕННЫЕ ДАННЫЕ.
4.1. Сравнительный анализ эффективности способов приготовления и использования реактивов антирезус.
4.1.1. Сравнение способов приготовления реактивов антирезус по частным критериям.
4.1.2.'Определение значений показателя эффективности способов изготовления и использования реактивов антирезус
4.2. Разработка способа приготовления и применения сухих сывороток для экспресс-определения резус-принадлехности крови на плоскости без подогрева.
4.3. Применение различных методов фракционирования белков сыворотки крови для получения универсальных реактивов антирезус (лишенных анти-А и анти-В естественных изогемагглю-тининов).
4.4. Влияние способов хранения и консервирования на им^нологические и физико-химические свойства "сырья антирезус"
4.4.1. Влияние борной кислоты на иммунологические и физико-химические свойства сырья антирезус" при хранении
4.4.2. Влияние консервирования мертиолатом на иммунологические и физико-химические свойства "сырья антирезус" при хранении.
4.4.3. Влияние замораживания и лиофилизации на иммунологические и физико-химические свойства "сырья антирезус" при хранении.
4.4.4. Исследование "сырья антирезус", консервированного борной кислотой (3$), лиофилизированного в присутствии сорбита-Д (2$) или полиглюкина (2%). . 95 4.5. Использование растворов низкой ионной силы
РНИС) в реакции гемагглютинации
Заключение диссертационного исследования на тему "Оценка способов приготовления и использования стандартных реактивов антирезус"
БНВОДЫ
1. Разработана методика сравнительной оценки эффективности способов приготовления и использования реактивов антирезус по' обобщенному показателю (с учетом нескольких частных критериев), позволяющая выбрать рациональный вариант при унификации способов производства типирующих стандартов антирезус.
2. Применение предложенной оценки эффективности для анализа принятых в учреждениях службы крови способов изготовления и использования реактивов антирезус свидетельствует о целесообразности широкого внедрения экспресс-метода на плоскости без подогрева для массового определения резус-принадлежности крови.
3. Предложенный способ приготовления сухих реактивов антирезус для экспресс-определения резус-принадлежноети крови на плоскости без подогрева позволяет совершенствовать планирование производства типирующих реактивов антирезус за счет удлинения срока сохранности активности и специфичности антител до четырех лет, а также создать необходимые запасы реактивов антирезус.
4. Установлена целесообразность применения фракционирования белков групповых сывороток антирезус с целью устранения естественных изогемагглютининов анти-А и анти-В и концентрирования иммунных антирезус антител. Это открывает возможность осуществления массового выпуска универсальных реактивов антирезус и рационального использования для производства высокоактивных типирующих стандартов исходного "сырья" с низким титром антирезус антител.
5. Показано снижение специфической активности антител в процессе длительного хранения "сырья антирезус", что сопровождается изменением величины рН в сторону щелочных значений и изменением электрофоретической подвижности гамма^-глобулиновой фракции.
6. Консервирование "сырья антирезус" в лиофилизированном состоянии с добавлением полиглюкина или сорбита позволяет в 1,5 раза удлинить срок сохранности специфической активности "сырья" по сравнению с известными способами.
5; ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Увеличение масштабов гемотрансфузионной терапии и обязательное определение групповой и резус-принадлежности населения в нашей стране, требует увеличения объема выпуска высокоактивных изосерологических реактивов и совершенствования методов определения резус-принадлежности.
В настоящее время в практической работе на СПК и в лечебных учреждениях пользуются пятью способами определения резус-принадлежности. Каждый метод требует специально изготовленных для данного способа типирующих реактивов. При этом не одинакова чувствительность способов в выявлении антигенов системы Резус, различны затраты сырья и времени на приготовление этих реактивов, на определение резус-принадлежности, а также потребность в используемом оборудовании. В связи с этим необходима научно-обоснованная оценка эффективности различных методов приготовления стандартных типирующих реактивов антирезус и способов определения резус-принадлежности с целью их унификации на основе выбора оптимального варианта.
Вопросы повышения эффективности производства, разработок, исследований становятся все более актуальными во всех областях народного хозяйства. В изосерологии пока еще не используются существующие методы оценки эффективности разработок. Это вызвано, по-видимому, известными трудностями применения математических методов в биологии. Вместе с тем, подобные исследования могут способствовать унификации способов изготовления и использования типирующих реактивов антирезус.
Для повышения качества типирующих реактивов необходимо учитывать все звенья процесса изготовления сывороток. Процесс приготовления стандартных сывороток антирезус складывается из нескольких этапов: заготовки "иммунного сырья", хранения "сырья", лишения "иммунного сырья" групповых изогемагглютини-нов для получения универсальных типирующих реактивов и приготовления реактивов для данного способа определения резус-принадлежности. На каждом из них могут возникать непроизводительные потери, ведущие к ухудшению качества стандартов и снижающие возможность увеличения объема их, выпуска. В частности, в процессе создания панели типирующих стандартов на СПК приходится накапливать и хранить "сырье антирезус". При хранении происходит снижение специфической активности антител в "сырье", что ухудшает возможность получения максимального количества активных стандартов из единицы сырья. Вместе с тем, до настоящего времени не имеется нормативно-инструктивных материалов о допустимых сроках хранения и оптимальных способах консервирования "сырья антирезус", предназначенного для изготовления стандартных типирующих реактивов антирезус. Не был разработан также способ получения типирующих реактивов антирезус в высушенном состоянии. Срок годности изготовляемых в нашей стране в жидком виде стандартных сывороток антирезус составляет всего четыре месяца. С целью увеличения времени сохранности специфической активности сывороток антирезус, создания необходимых запасов сывороток и улучшения транспортировки, по нашему мнению, весьма перспективна их заготовка в сухом виде. При этом очевидна необходимость разработки простого способа изготовления лиофилизированных стандартных сывороток.
Использование так называемых "универсальных" реактивов антирезус, не содержащих анти-А и анти-В изогемагглютининов, сокращает возможность ошибок при определении резус-принадлежности, поэтому актуальным является усовершенствование методов изготовления универсальных реактивов из групповых сывороток для обеспечения их массового производства.
С целью получения более четких результатов при выявлении реакции антиген-антитело, в том числе и при постановке пробы на совместимость, за рубежом с успехом применяют растворы низкой ионной силы. Поскольку в отечественной литературе подобные сведения отсутствуют, мы считали рациональным провести исследование в этом направлении.
Цель настоящего исследования заключалась в разработке системы мероприятий для повышения эффективности и унификации способов изготовления и использования типирующих реактивов антирезус.
Для выполнения работы были поставлены следующие задачи.
1. Разработать систему оценки эффективности различных способов приготовления и использования реактивов антирезус.
2. Усовершенствовать методику изготовления и использования стандартных сывороток антирезус для экспресс-метода определения резус-принадлежности на плоскости без подогрева за счет упрощения технологии приготовления сывороток и удлинения срока годности реактивов.
3. Изучить возможность превращения групповых сывороток антирезус в универсальные различными методами фракционирования. Отработать способ приготовления универсальных реактивов антирезус из глобулиновых фракций сывороток антирезус.
4. Установить оптимальные сроки хранения "сырья" для приготовления высокоактивных стандартов антирезус на основе изучения изменений иммунологических и физико-химических свойств "сырья" при различных условиях консервирования.
5. Выявить целесообразность применения растворов низкой ионной силы для повышения чувствительности реакции агглютинации эритроцитов.
Унификация способов определения резус-принадлежности возможна только на основе сравнительного анализа эффективности методов приготовления и использования типирующих реактивов антирезус.
На станциях переливания крови РСФСР применяется несколько способов определения резус-принадлежности: экспресс-способы на плоскости и в пробирках без подогрева, а также в конглюти-национно-сывороточной среде; способы конглютинации на чашках Петри и с желатином; непрямая реакция Б^умбса.
Сравнительную оценку способов приготовления и использования стандартных сывороток антирезус невозможно провести по одному какому-то признаку, например по стоимости или точности определения резус-принадлежности, потому что при производстве сывороток большое значение имеет ряд факторов. В связи с этим для решения многокритериальной задачи мы применили рекомендуемый Государственным комитетом по науке и технике при Совете Министров СССР метод расстановки приоритетов.
Основные этапы сравнительного анализа эффективности способов приготовления и использования реактивов антирезус заключались в следующем.
1. Определение частных критериев (сравниваемых признаков). В нашем исследовании наиболее важными критериями являлись еледующие: точность определения резус-принадлежности (учитываемая по необходимости повторных перепроверок резус-принадлежности); время, затраченное на исследование резус-принадлежности крови; количество определений из единицы объема реактива; потребность в оборудовании; время, затраченное на приготовление реактива; стоимость. В связи с тем, что в литературе отсутствуют сведения по указанным параметрам, нами была проделана работа по анализу каждого способа приготовления и использования стандартных сывороток антирезус по частным критериям. В дальнейшем эти данные использовались для сравнения способов между собой.
2. Вторым этапом сравнительного анализа являлось вычисление приоритетов способов изготовления и использования реактивов антирезус по частным критериям.
3. Третьим этапом сравнения рассматриваемых способов являлось нахождение весовых коэффициентов, т.е. значимости каждого частного критерия в обобщенной оценке.
4. Последним этапом исследования являлось вычисление обобщенной оценки (показателя эффективности) различных способов приготовления и использования реактивов для диагностики резус-принадлежности. Показатель эффективности способа определяют как сумму произведений приоритетов по частным критериям на весовые коэффициенты частных критериев.
По данной системе оценки эффективности рассматриваемые способы изготовления и использования стандартов антирезус располагаются следующим образом: наибольшие и близкие между собой значения эффективности имеют экспресс-способы определения резус-принадлежности в пробирках и на плоскости без подогрева. На следующем месте по эффективности стоят методы изготовления и использования реактивов для определения резус-принадлежности с применением желатина и экспресс-способ с подогревом. Следующее за ними место занимает способ с использованием антиглобулиновой сыворотки (непрямая реакция Кумбса), и наименьшее значение показателя эффективности имеет способ изготовления стандартных реактивов для определения резус-принадлежности на чашках Петри.
Таким образом, предложенная методика оценки эффективности способов приготовления и использования стандартных сывороток антирезус позволяет объективно, с учетом многих факторов, выбрать оптимальный вариант и рекомендовать его для широкого практического использования.
Предлагаемая методика проста, нетрудоемка и может применяться для оценки эффективности разработок и в других областях медицины.
Экспресс-методы определения резус-принадлежности на плоскости и в пробирках без подогрева имели наибольшие значеЕЖя показателя эффективности по обобщенному критерию, по сравнению с другими рассматриваемыми методами. Однако, учитывая, что экспресс-способ на плоскости без подогрева более пригоден для массового определения резус-принадлежности (не требует дополнительного оборудования на проведение исследования - посуды), наши усилия были направлены на совершенствование этого метода изготовления реактивов антирезус путем упрощения методики изготовления реактивов и удлинения сроков их годности. В этом отношении перспективна заготовка сывороток в высушенном состоянии. До настоящего исследования в нашей стране не было предложено способа изготовления сухих реактивов антирезус, длительно сохраняющих свою активность и удобных для транспортировки.
Поэтому наш проведено исследование по разработке способа изготовления сухих сывороток для экспресс-метода определения резус-принадлежности на плоскости без подогрева. При этом было установлено, что исходное "сырье антирезус" должно иметь титр антител не ниже 1:64 при титровании желатиновым методом или непрямой реакцией^умбса. Разведение "сырья" до необходимого титра производили стандартным разводителем -смесью сывороток групп крови АВ(1Л от нескольких доноров по методу О.В.Успенской. Кроме того, было учтено, что возможно, полиглюкин - полимер глюкозы, как и глюкоза обладает защитным действием на белки плазмы крови при высушивании, а также усиливает реакцию агглютинации.
Наша модификация существующего способа получения реактивов антирезус для ускоренных методов определения резус-принадлежности заключалась в том, что вместо раствора был использован сухой полиглюкин для предотвращения разведения исходного "сырья антирезус" раствором полиглюкина. Конечная концентрация полиглюкина в реактивах составляла 6$. Стандартные сыворотки, приготовленные на сухом полиглюкине, до высушивания обладали высоким авидитетом.
Было апробировано два режима сушки при температуре 28 и 40° С. Предполагалось, что меньшая температура (28° С) обеспечит сохранение максимальной активности антител в высушенных сыворотках. Однако в процессе исследования установлено, что скорость наступления и характер агглютинации реактивов не различались при обоих режимах высушивания. Поэтому было решено проводить высушивание реактивов при температуре 40° С.
Использование такой температуры при высушивании сывороток антирезус целесообразно как для сокращения времени лиофилизации (по сравнению с использованием подогрева до 28°), так и для унификации способов лиофилизации биологических препаратов.
Полученные сухие стандартные сыворотки оставались активными 48 месяцев хранения, т.е. в 12 раз дольше по сравнению с жидкими. После растворения в дистиллированной воде активность и специфичность сывороток сохранялась в течение двух месяцев после восстановления.
В систему оптимизации производства изосерологических стандартов входит разработка способов преобразования групповых сывороток антирезус в универсальные для получения их в больших количествах и способов использования малоактивного сырья для изготовления типирующих реактивов.
В международной практике типирующие антиэритроцитарные сыворотки выпускают в виде универсальных, не содержащих анти-А и анти-В антител. Это связано с тем, что наличие групповой специфичности в реактивах антирезус создает технические неудобства при определении резус-принадлежности и может являться причиной ее ошибочной диагностики.
В нашей стране только 47% СПК РСФСР выпускают универсальные реактивы антирезус (данные Н00 ЛНИИ ГиПК, 1982). Регламентируемые инструкциями службы крови способы устранения естественных анти-А и анти-В антител из сывороток антирезус, технически трудоемки и не обеспечивают получение универсальных сывороток антирезус в 100% случаев. Поэтому мы стремились разработать более эффективный способ преобразования групповых сывороток антирезус в универсальные.
Методы фракционирования белков сыворотки крови широко используются при получении лечебных препаратов у нас в стране и за рубежом. Особенно распространен епиртовый метод фракционирования, в том числе и для получения иммуноглобулина антирезус. Известно, что активность групповых изогемагглютининов в иммуноглобулине антирезус значительно снижается по сравнению с активностью в исходном сырье. Однако в литературе не удалось встретить данных об использовании методов фракционирования для преобразования групповых сывороток антирезус в универсальные.
Естественные анти-А и анти-В антитела относятся к классу иммуноглобулинов Ы, а иммунные антирезус антитела - к классу G. Методы фракционирования позволяют разделять эти классы иммуноглобулинов, следовательно, применяя эти способы, можно разделить указанные антитела.
С целью выбора оптимального пути для отделения естественных анти-А и анти-В и иммунных антирезус антител было применено несколько способов фракционирования: на ДЭАЕ-сефадексе (1), с использованием риванола (2), этилового спирта (3) и сульфата натрия (4). Проведенное исследование показывает, что наиболее полно групповые антитела анти-А и анти-В устраняются при использовании 1-й 2 методов (ионообменная хроматография и риванольное фракционирование). При применении спиртового фракционирования (метод 3), большинство образцов содержало следы групповых изогемагглютининов в титре 1:2-1:4, что значительно меньше содержания указанных антител в коммерческих препаратах, выпускаемых за рубежом. Так, например, в США содержание анти-А антител в иммуноглобулиновых препаратах, изготовленных в 1980 году спиртовым методом, в среднем, составляло
- из
1:12, анти-В - 1:6 (Gordon et al., 1980).
В результате использования высаливания сульфатом натрия (4) только в 7С$ случаев удалось получить фракции, не содержащие групповых изогемагглютининов. В остальных случаях изо-гемагглютинины устраняли повторным высаливанием.
Фракционирование сывороток антирезус, помимо удаления или значительного снижения активности анти-А и анти-В изогемагглютининов, приводит к усилению специфической активности антирезус антител. По степени удельного обогащения глобу-линовых фракций антирезус антителами, способы фракционирования располагаются следующим образом:
- ионообменная хроматография;
- риванольное фракционирование;
- спиртовое фракционирование;
- высаливание.
Однако объем глобулиновых фракций, получаемых способами 1 и 2, в отличие от объема фракций, получаемых спиртовым способом, был всегда больше объема взятой для обработки сыворотки.
Широкое использование метода ионообменной хроматографии на станциях переливания крови нецелесообразно из-за трудоемкости методики и невозможности обработки больших объемов сывороток. Наиболее приемлемым методом удаления анти-А и анти-В из групповых сывороток антирезус в лабораторных условиях является риванольное фракционирование. Зтот способ технически простой, нетрудоемкий, позволяет обрабатывать объемы сывороток от 50 мл и выше.
Спиртовый способ разделения сывороточных белков может широко применяться в учреждениях службы крови, имеющих лаборатории или корпуса фракционирования. Тем более, что в ближайшее время этот метод по-прежнему будет основным в промышленном получении препаратов крови ( Einiayson, Friedli, 1981).
В связи с тем, что при использовании метода высаливания не всегда удается получить глобулиновые фракции с полностью удаленными изогемагглютининами, и в связи с длительностью процедуры удаления солей из полученных фракций, этот метод нецелесообразно использовать в широкой практике с целью преобразования групповых сывороток антирезус в универсальные.
Необходимо отметить, что белковые фракции, полученные методами фракционирования 1, 2, 3 (ионообмен, спиртовое и ри-ванольное фракционирование) всегда имеют титр антирезус антител выше, по сравнению с обрабатываемыми сыворотками. Это позволяет рекомендовать указанные методы для усиления активности антител. Согласно требованиям действующих инструкций, "исходное сырье" с титром антирезус антител ниже 1:32 непригодно для изготовления стандартных сывороток, а при фракционировании титр антител повышается в данном случае на 2-3 ступени. Таким образом открывается возможность для рационального использования малоактивного сырья Для изготовления типирующих реактивов антирезус.
Нами предложены методы приготовления стандартных универсальных реактивов антирезус из глобуликовых фракций, позволяющие получать типирующие стандарты для всех способов определения резус-принадлежности крови: экспресс-методов без подогрева, желатинового метода, непрямой реакции Кумбса, кон-глютинации на чашках Петри. Существенным звеном этого процесса являлась регуляция величины рН и добавление белковой среды до 2-3% концентрации. Приготовленные из глобулиновых фракций реактивы сохраняют агглютинабельные свойства в течение трех месяцев хранения в жидком виде и 24 месяца в лиофилизирован-ном состоянии. в повышении эффективности производства стандартных типирующих сывороток антирезус большое значение имеет качество используемого "исходного сырья антирезус". В связи с этим мы изучали влияние различных способов консервирования на иммунологические и физико-химические свойства "сырья антирезус".
Исследования показали, что через шесть месяцев хранения "сырья" наблюдалось достоверное снижение титра антирезус антител при консервировании сывороток борной кислотой и мертио-латом и хранившихся при 4° С, а также и в сыворотках, хранившихся без консервантов и добавок при -20° С или лиофильно-высушенных без консервантов и добавок и хранившихся при 18, 20° С. По степени сохранности титра антител в сыворотках антирезус в процессе хранения способы консервирования можно расположить в ряд:
- консервирование борной кислотой при 4° С (титр снизился менее всего);
- замораживание при -20° С;
- лиофильное высушивание без консервантов с последующим хранением при 18-20° С;
- консервирование мертиолатом при 4° С.
Таким образом, менее всего титр антирезус антител снизился в сыворотках, консервированных борной кислотой и хранившихся при 4° С, более всего - в сыворотках, консервированных мертиолатом, что совпадает с данными литературы об угнетающем действии мертиолата на активность антирезус антител ( bioliison, 1979).
Параллельно с изменением титра антител в исследуемых образцах сывороток происходило увеличение рН в сторону щелочных значений. Способы консервирования по степени выраженности изменений рН (в сторону повышения) можно расположить в следующем порядке:
- консервирование борной кислотой;
- замораживание при -20° С;
- лиофильное высушивание без консервантов;
- консервирование мертиолатом.
Возможно, добавление к исследуемым сывороткам борной кислоты предотвращало их защелачивание.
Концентрация белка, определяемая биуретовым методом, была без статистически достоверных изменений по сравнению с исходной в сыворотках антирезус, консервированных борной кислотой и замороженных при температуре -20° С, но увеличивалась в сыворотках, консервированных мертиолатом. Увеличение общего количества белка в сыворотках, консервированных мертиолатом, возможно было связано с выраженным распадом сывороточных белков в некоторых образцах сывороток, о чем свидетельствовало в этих случаях и нарастание небелкового азота, несмотря на заготовку сывороток с соблюдением правил асептики и отсутствие микробной флоры по данным бактериологических исследований.
Наши наблюдения не совпадают с указаниями некоторых авторов об увеличении количества небелкового азота при хранении антимикробных гамма-глобулиновых препаратов (Art, piniayson, 1969). Относительно подобных изменений в иммунных сыворотках, в частности, сыворотках антирезус, в литературе данных не имеется. Во всех исследованных нами образцах сывороток антирезус, за исключением консервированных мертиолатом, в различные сроки наблюдения достоверного увеличения количества небелкового азота выявить не удалось.
Электрофоретические исследования сывороток антирезус, консервированных борной кислотой, мертиолатом, лиофилизированных и замороженных при температуре -20° С, в процессе хранения показали значительные вариации в содержании альфа^, бета- и гамма-глобулиновых фракций по сравнению с исходными данными. Общим для этих изменений было исчезновение гамма^-глобулино-вой фракции уже на ранних сроках хранения. Это сопровождалось снижением специфической активности сывороток. Наши исследования показали корреляцию в изменении электрофоретических свойств и специфичности сывороток антирезус и свидетельствуют о дестабилизации иммуноглобулиневнх молекул в процессе хранения.
Снижение специфической активности iiho(D) антител в сыворотках антирезус, видимо, так же, как и антител в иммуно-глобулиновых препаратах, может быть обусловлено процессами фрагментации молекул иммуноглобулинов при хранении.
Фрагментация иммуноглобулинов обусловлена гидролитическими реакциями и распадом пептидов под действием протеолити-ческих ферментов, присутствующих всегда в препаратах. При кислых значениях рН проявляется действие на гамма-глобулин ферментов типа катепсина В. При щелочных значениях рН фрагментация обусловлена действием плазмина на гамма-глобулин (Sgo-uris, iviatz, 1S67). Показано, что наибольшая деградация наступает при щелочных значениях рН (7,2). Поэтому изменение рН в исследуемых образцах сывороток в сторону щелочных значений могло косвенным образом указывать на происходящую при хранении дестабилизацию белков за счет фрагментации. В последние годы установлено, что антитела системы Резус представлены, в основном, подклассом IgG-j- (szymanski et al., 1982), более подверженном воздействию плазмина ( Skvaril et al., 1976), по сравнению с иммуноглобулинам других подклассов.
Обнаруженное нами уменьшение количества иммуноглобулинаG в "сырье антирезус" при всех способах консервирования и стабилизации происходило в более поздние сроки относительно изменения титра антител и рН, по сравнению с исходными данными, оно наступало к 12-18 месяцам хранения.
По нашему мнению, использование метода радиальной иммуно-диффузии в агаровом геле для оценки качества "сырья антирезус" в процессе хранения нецелесообразно. С одной стороны, эталонные стандартные сыворотки, используемые для реакции Манчини, Горьковского НИИ эпидемиологии и микробиологии (по наблюдениям ст. научн. сотр. ИЭФиБ А.Е.Громова) содержали большое количество агрегатов. Агрегированные же белки имеют низкую скорость диффузии (Vadsworth, 1975; Jones, 1970), что выражается уменьшением зон преципитации стандартных сывороток и соответственно завышением содержания иммуноглобулинов в исследуемых сыворотках. С другой стороны, процесс фрагментации иммуноглобулинов в исследуемых сыворотках приводит к образованию низкомолекулярных фрагментов, имеющих большую скорость диффузии, чем целые молекулы иммуноглобулинов. Разница между размерами диаметров образующихся колец преципитации свежеза-готовленных и хранимых сывороток, в силу указанных причин, могла быть недостоверной.
Таким образом, проведенное исследование показало, что сырье антирезус", сохраняемое в жидком виде, консервированное борной кислотой и мертиолатом, а также в замороженном при температуре -20° С и лиофилизированном состоянии без добавок, необходимо использовать для приготовления стандартных сывороток в течение шести месяцев хранения. Использование сырья для этих целей в более поздние сроки возможно, но нецелесообразно из-за наступающих иммунологических и физико-химических изменений, что отражается отрицательным образом на титр антирезус антител. Количество выпускаемых при этом стандартных сывороток уменьшается.
В связи с тем, что указанные способы консервирования имели существенные недостатки, потребовалось разработать другой способ длительного сохранения "сырья антирезус".
Учитывая результаты проведенных в лаборатории изосероло-гии ЛШИГиПК исследований по получению сухих стандартных сывороток антирезус, показавших благоприятное влияние полиглюкина на сохранение иммунных свойств сывороток, а также учитывая данные литературы (Л.И.Краснопрошина, 1959; Г.Я.Гдалев-ский, 1978) | о стабилизирующем действии сорбита на молекулы иммуноглобулинов, нами предложен новый способ хранения сырья, предназначенного для изготовления типирующих стандартных сывороток антирезус. Способ заключается в лиофильном высушивании "сырья антирезус", консервированного до 3%-ного насыщения борной кислотой с добавкой сухого полиглюкина или 2% сорбита с последующим хранением сывороток при 18-20° с. Через шесть месяцев такого хранения "сырья антирезус" лиофильно высушенного в присутствии добавок, титр антирезус антител и величина рН оставались на тех же уровнях, что и в исходных образцах. При данном методе хранения сывороток, в отличие от всех ранее использованных способов хранения, гамма^-глобулиновая фракция неизменно присутствовала на электрофореграммах всех изученных образцов через три месяца и в большинстве - через шесть месяцев хранения.
Применение данного способа консервирования "сырья антирезус" позволяет удлинить срок его использования для приготовления стандартных сывороток до полутора лет без снижения специфической активности антител и существенных физико-химических изменений. Хранение "сырья антирезус" в лиофилизирован-ном состоянии с добавками полиглюкина или сорбита имеет еще одно преимущество. Сыворотки, консервированные указанным спо-.собом, сохраняли высокую авидность, что выражалось в наличии крупнодисперсной агглютинации антирезус антител с резус-положительными эритроцитами. Эти данные имеют важное значение при практическом использовании "сырья антирезус" для изготовления стандартных типирующих сывороток.
Сырье антирезус" используется для изготовления стандартных реактивов для различных методов определения резус-принадлежности, в том числе и для непрямой реакции Кумбса. До настоящего времени эта реакция считается наиболее чувствительной при выявлении "слабых" вариантов аллоантигенов эритроцитов, например "Da " и слабоафинных антител (П.Проданов, Г.Дражев, 1980) и широко используется в практике (М.А.Умнова, Р.А.Авдеева, 1959; Г.В.Головин с соавт., 1974).
За рубежом в последние годы широко используется для выявления антител и постановки пробы на совместимость метод с применением растворов низкой ионной силы (РШС) ( Hock et al.,
1978; bovra J. et al., 1979; Silvengleid, 1980). При НИЗКОЙ ионной силе эритроциты могут самопроизвольно агломерироваться в результате того, что и некоторые igG- молекулы осаждаются на поверхности эритроцитов и перекрестно их связывают. Применение РНИС с концентрацией 0,03 М исключает неспецифическую адсорбцию глобулинов на поверхности эритроцитов и ложноположительные реакции. Преимуществами метода с использованием РШС являются не только сокращение времени сенсибилизации эритроцитов непрямой пробы Нумбса, но и возможность определять малые концентрации антител с низкой афинностью ( Leikova J., Perkins, 1980; Masouredis, 1982).
В отечественной литературе метод применения РНИС для выявления реакции антиген-антитело не описан. В связи с этим мы провели параллельное исследование сывороток антирезус в методе конглютинации с желатином, обычной пробой Кумбса и в реакции ftyMO'ca с РНИС. Титры анти-Шю(Б) антител в исследуемых сыворотках при использовании указанных методов не отличались друг от друга. Анти-гь'(С) и анти- rh"(E) антитела в исследованных образцах всегда выявлялись при использовании обеих реакций Цумбса и не во всех случаях в пробе с желатином. При определении антител модифицированной реакцией Цумбса с РШС агглютинация была всегда более четкая по сравнению с другими примененными методами.
В противоположность данным зарубежных авторов, мы не получали более высокие значения титров антител при использовании модифицированной реакции ^умбса, по сравнению с исследованием обычным способом. Возможно, это объясняется свойствами антиглобулинового реактива. У нас в стране для проведения реакции Кумбса используют цельную антиглобулиновую сыворотку, а за рубежом, кроме того, применяют фракции иммуноглобулина G, выделенные методом ионообменной хроматографии из сывороток, что безусловно повышает чувствительность метода ( Leikova, Perkins, 1980). Тем не менее, проведенное исследование свидетельствует о целесообразности применения РНИС для ускоренного (в 2-3 раза по сравнению с обычной непрямой реакцией Цумбса) и точного выявления аллоантител и аллоанти-генов эритроцитов.
Таким образом, совершенствование методов хранения "иммунного сырья", применение лиофилизации стандартных сывороток, приготовление универсальных реактивов антирезус и использование математических методов оценки результатов исследования будут способствовать унификации способов приготовления и использования высокоактивных реактивов антирезус.
Список использованной литературы по медицине, диссертация 1984 года, Минеева, Наталья Витальевна
1. Альтнер Т.А., Горькавая Е.П. К вопросу о получении уни-версальной сыворотки антирезус методом смешивания сывороток антирезус по различным группам крови. Материалы Зональной научно-практ. конф. раб. службы крови и гематологии. Куйбышев, 1967, 33-37.
2. Андрианова И.Г. Высушивание плазмы и сыворотки вакуум-замораживающим методом. Труды Ленинградского института переливания крови. Том 8, 1949, 1S7-203.
3. Ашкенази А.Я. Опыт получения больших количеств универсальной сыворотки антирезус. Пробл. гематол., 1960, 5, 52-56.
4. Ашкенази А.Я. Лиофильная сушка антирезусной сыворотки.
5. Пробл. гематол., 1967, 3, 49-51.
6. Башлай А.Г. Изготовление сыворотки для идентификации изоантигенов эритроцитов крови человека и методы их использования.
7. Автореф. канд. дисс., М., 1978, 20 с.
8. Белозерова В.И. Получение иммуноглобулина антирезус иприменение его для профилактики сенсибилизации к резус фактору.
9. Автореф. дисс. канд. мед. наук, М., 1977, 23 с.
10. Блюмберг В.А., Глущенко В.Ф. Метод расстановки приоритетов.1. Лениздат, 1982, 160 с.
11. Богомолова Л.Г. Консервирование плазмы и сыворотки в высушенном состоянии.
12. Автореф. дисс. канд., JI-, 1943, 14 с. 9. Войд У. Основы иммунологии. ■ М., "Мир", 1969, 648 с.
13. Быкова Е.Я., Лопырева Л.М., Малкина JI.A., Мелдрая М.Я.,
14. Цесас А.В. Содержание иммуноглобулинов & , А, М в коммерческих препаратах "гамма-глобулин". В сб.: "Вопросы донорства плазмы крови и клиническое применение иммунных препаратов". J1., 1982, 58-59.
15. Зенцель Е.С. Исследование операций.
16. М., "Советское радио", IS72, 23-27.
17. Гавриленкова В.Ю., Рукова З.Ф., Минакова J1.B. Физико-химическая характеристика препаратов иммуноглобулинов человека. НЭИ, 1979, 7, 39-43.
18. Гдалевский Г.Я. Способ лиофильного высушивания иммуноглобулинов. Авт. свид-во а- 615933, в кн.: Открытия, изобретения, промышленные образцы, товарные знаки, 1978, £ 27.
19. Гдалевский Г.Я. Исследование стабильности иммуноглобулиновых препаратов и пути ее повышения. Автореф. канд. дисс., JI., 1980, 22 с.
20. Глинн Л -» Стьюард М. Структура и функции антител.1. М., "Мир", 1983, 199 с.
21. Глинн JI., Стьюард Н. Образование антител.1. М., "Мир", 1983, 195 с.
22. Головин Г.В., Дуткевич И.Г., Декстер Б.Г. Пособие по переливанию нрови и кровезаменителей. 2-е изд. Л., "Медицина", 1974, 188 с.
23. Горкина З.А., Горбацевич Г.С., Захарьевская Н.С. Свойстваи функции сывороточных белков. В кн.: "Гамма-глобулин и др. препараты крови". Горький, 1968, 5-11.
24. Грабар П., Буртэн П. Иммуноэлектрофоретический анализ.1. ИЛ, М., 1963, 106-135.
25. Губанов Н.М., Утепбергенов А.А. Медицинская биофизика.
26. М., "Медицина", 1978, 336 с.
27. Данилова Т.Н., Климова К.Н., Златина К.М. Применение
28. Е. Coll для абсорбции естественных изогемагглютининов сыворотки.
29. Лаб. дело, 1980, 8, 458-460.
30. Денисов В.М., Добротина Н.А. Изменение оптических свойствбелков плазмы донорской крови после замораживания и лиофилизации. В сб.: "Современные вопросы транс-фузиологии". Горький, 1981. (Тезисы доклада к научно-практической конференции).
31. Донсков С.И. Использование альбумина фибринолизной кровипри производстве сывороток для определения резус-фактора экспресс-методом. Пробл. гематол., 1S73, 8, 54-55.
32. Донсков С.И. Опыт определения разновидностей резус-фактора экспресс-методом на плоскости без подогрева. Лаб. дело, 1974, 3, 171-172.
33. Донсков С.И., Уринсон P.M., Зотиков Е.А. Экспресс-методопределения резус-фактора. Лаб. дело, 1968, 10, 607-611.
34. Ерофеев И.А. 0 высушивании плазмы донорской крови в вакууме из замороженного состояния. Автореф. канд. дисс., 1968, 18 с.
35. Забалуева И.й. Приготовление сыворотки антирезус с использованием полиглюкина в качестве разводителя. Пробл. гематол., 1964, 4, 49-50.
36. Закс Л- Статистическое оценивание.
37. М., "Статистика", 1976, 598 с.
38. Зильбер Л.А. Основы иммунологии.
39. Медгиз. М., 1958, 415-416.
40. Зотиков Е.А., Уринсон P.M., Донсков С.И. Применение амниотической жидкости для приготовления универсальныхсывороток антирезус.
41. Лаб. дело, 1971, 5, 276-278.
42. Зотиков Е.А., Уринсон P.M., Донсков С.И., Подольский М.В.
43. Применение высушенной амниотической жидкости для адсорбции групповых изогемагглютининов в сыворотках антирезус групп 0(1), А(П), В(Ш). Пробл. гематол., 1972, 6, 49-51.
44. Игнатович Г.П. Оптимизация методов заготовки изогемагглютинирующих и антирезусных сывороток. Автореф. канд. дисс., Jl., 1975, 14 с.
45. Качаровский Б.В., Дорошенко Л.Г. Применение универсальнойантирезус сыворотки, полученной адсорбцией желудочным соком, для различных методов определения резус-принадлежности . Лаб. дело, 1975, 4, 226-228.
46. Еирюхин И.Ф., Троицина Г.В., Завьялов В.П. Обратимые температурные переходы фракций faG- -глобулина с различными изоэлектрическими точками и их конформации при физиологических условиях. Молекул, биол., 1972, 6, 196-200.
47. Климова К.Н., Данилова Т.Н., Кочеткова Г.А., Минеева Н.З.,
48. Никитова И.С. Профилактика посттрансфузионных осложнений путем рационального выбора методов изосеро-логических исследований крови донора и реципиента. В сб.: "Современные средства трансфузионной терапии при травме и кровопотере". Л., 1978, 173-178.
49. Климова К.Н., Данилова Т.Н., Аваева Р.Н., Минеева Н.В.,
50. Головина Г.А., Недельский Г.Т., Елизарова А.И. Получение сухих сывороток антирезус для экспресс-метода определения резус-принадлежности. Лаб. дело, 1980, 8, 436-438.
51. Климова К.Н., Мельникова В.Н., Пьянкова И.Б., Ыуравикова Т.Б., Лебедева Е.С., Никитова И.С., Сверчкова Л.Д. Вопросы организации производства иммуноглобулина антирезус. Пробл. гелатол., 1979, 10, 54-56.
52. Козьминых Л.Ф., Ворончихина Л.Д., Крюкова М.Г. Изучениестабильности сывороточного полиглобулина. В сб.: "Вопросы донорства плазмы крови и клиническое применение иммунных препаратов". Л., 1982, 59-61.
53. Краснопрошина Л.И. О возможности выпуска специфическихгамма-глобулинов в сухом виде. В сб.: "Вопросы бактериологии, вирусологии, иммунологии". I., 1959, 301-306.
54. Кронберг А.Я. Опыт получения в больших количествах универсальных сывороток антирезус методом абсорбции. Пробл. гематол., 1967, 3, 30-31.
55. Кулеева М.Ф. К вопросу об изготовлении универсальныхсывороток антирезус для определения резус-фактора экспресс-методом на плоскости без подогрева. Пробл. гематол., 1978, 4, 54-55.
56. Лапшина А.С., Бурдиляк a.ji-, Брюхань В.Л. Приготовлениеи использование универсальных сывороток антирезус, полученных искусственным путем. Тез. докл. 1 Украинского съезда гематологов и трансфузиологов. Киев, 1980, 151-152.
57. Ларичева Н.И., Волошина М.С., Назарчук Л.В. Содержаниеклассов иммуноглобулинов G , А, М в препарате гамма-глобулин при хранении. В сб.: "Вопросы донорства плазмы крови и клиническое применение иммунных препаратов". Л., 1982, 57-58.
58. Левин Г.Я., Шереметьев Ю.А. Роль N -ацетилнейраминовойкислоты и отрицательного заряда эритроцитов в их агрегации.
59. Пробл. гематол., 1981, 26, 6, 6-8.
60. Ляхнович Г.В. Структурно-функциональные изменения в мембранах эритроцитов человека при действии нормальных групповых антител крови. Труды 1 Всесоюзного биофизического съезда, 1982, 3, 131-132.
61. Макарова Л.В., Столярова Г.А. Экспресс-метод определениярезус-фактора и дальнейшие возможности использования его принципа в практике переливания крови. В сб.: "Вопросы изосерологии и ишуногематологии". Л., 1972, 19-21.
62. Марванова Э.М., Скригин Е.Р. К вопросу о стабилизирующихсвойствах препаратов альбумина. Вопросы прикладной иммунологии. Уфа, 1973, 71-72.
63. Методические рекомендации. Приготовление стандартныхизогемагглютинирующих сывороток с применением полиглюкина для определения групп крови системы АВО в жарких климатических условиях. М., 1982, утв. 08.01.82, ^ 10-11/3.
64. Михайлова А.А. Экспресс-метод определения резус-факторав пробирке без подогрева. Пробл. гематол., 1S72, 6, 59-60.
65. Михайлова А.А., Емасева М.П. Использование амниотическойжидкости в производстве универсального реагента антирезус. Тр. 1 Всесоюзного съезда гематологов и трансфузиологов. М., 1979, 190.
66. Моисеев Н.Н. под ред. Современное состояние теории исследования операций. М., "Наука", 1S79, 464 с.
67. Нерсесян В.Н., Шамирханян С.Т. Получение больших количеств активных сывороток антирезус путем применения различных разводителей. В сб.: "Вопросы изосе-рологии и иммунологии". JI., 1970, 52-55.
68. Нерсесян З.Н., Щербакова Л.Н. Получение сухих иммунныхсывороток. Тезисы научн. работ ин-та гематол. и переливания крови им. проф. Еоляна. Ереван, 1972, «^9—31.
69. Никитина В.Д., Холчев Н.В., Колесникова Л.й., Кораблева З.И. Исследование фрагментации препаратов гамма-глобулина, выпускаемых в СССР. ЕМЭИ, 1975, 1, 44-48.
70. Никитин Е.Е., Звягин Н.В. Замораживание и высушиваниебиологических препаратов. И., "Колос", 1971, 343 с.
71. Орлюков К.И., Головина Г.А., Аваева Р.Н. Приготовлениесухих сывороток антирезус для определения резус-фактора экспресс-методом на плоскости без подогрева. В сб.: " Вопросы изосерологии и иммуногематологии". Л., 1972, 18-19.
72. Пискунова Т.М. Редкий фактор крови I)"*.
73. Пробл. гематол., 1973, 5, 3-9.
74. Погодаева Л.К- Изучение титров еио(б) антител в плазмеи иммуноглобулине антирезус. Тез. докл. 1 Украинского съезда гематологов и трансфузиологов. Киев, 1980,160161.
75. Поткин-Посадский В.А. Повышение титра антител сыворотокпутем замораживания-центрифугирования. Пробл. гематол., 1968, 2, 46-48.
76. Поткин-Посадский В.А. О повышении активности слабых анти-резусных сывороток. Лаб. дело, 1973, 5, 298-2SS. 63- Проданов П., Драаев Г. К вопросу об организации выявления и идентификации антител. Пробл. геыатол., 1980, 25, 4, 54-56.
77. Соловьева Т.Г., Дробншева н.С. Получение сывороток антирезус в больших количествах. В сб.: "Вопросы гематологии и консервирования крови и тканей". Л., 1961, 171-175.
78. Сорина Л.М., Косминкова Н.Г. Некоторые методы концентрации изогемагглютининов в стандартных сыворотках. В сб.: "Вопросы гематол. и переливания крови". Л., 1967, 6.
79. Стригин В.А., Терновой А.П. Неспецифические свойства препаратов иммуноглобулинов. "Медицина", 1979, 96 с.
80. Тальковская Л.С., Иванов Л.В., Будько Т.В., Толочко Г.В.
81. Способ устранения неспецифических реакций в гемаг-глютинирующих сыворотках. Тр. '1 Всесоюзного съезда гематологов и трансфузиологов. М., 1979, 193.
82. Тальковская Л.С., Иванов Л.В., Будько Т.В., Толочко Г.В.
83. Устранение неспецифической агглютинации при изготовлении изосерологических стандартов. Тез. 1 Украинского съезда гематологов и трансфузиологов. Киев, 1980, 161-162.
84. Тараева Г.А. Изучение стабильности гамма-глобулина прихранении. В кн.: "Эпидемиология, диагностика, профилактика респираторных природоочаговых инфекций". Л., 1S75, 25-36.
85. Терновой А.П. Некоторые физико-химические и биологическиесвойства препаратов человеческого гамма-глобулина. Автореф. канд. дисс., Свердловск, 1970, 22 с.
86. Траулько Ф.А. Возможность использования декстана, желатины, поливинилпирролидона для получения большого количества универсальных сывороток антирезус. Материалы IX Республик, конференции по переливанию крови. Минск, 1964, 38-39.
87. Траулько Ф.А. Использование декстрана, желатины, поливини лпирролидо на для получения большого количества универсальных сывороток антирезус. Здравоохранение Белоруссии, 1966, 5, 40-42.
88. Тукачинский С.Е., Богомолова Л.Г., Моисеева В.П., Елизарова А.И. Новый препарат сывороточный полиглобулин и его получение в полупроизводственных условиях. В сб.: "Вопросы гематологии, консервирования крови и тканей". Зып. 12. Л., 1961, 437-439.
89. Уильяме В., Уильяме X. Физическая химия для биологов.
90. М., "Мир", 1976, 595 с. 75- Умнова М.А., Авдеева Р.А. Проба Кумбса в лабораторной практике.
91. Лаб. дело, 1959, 3, 16-22.
92. Умнова М.А., Белозерова В.И. 0 расширении возможностиполучения сырья для иммуноглобулина антирезус. Пробл. гематол., 1S79, 10, 56-58.
93. Уринсон P.M. Изучение возможности повышения качестваиммунных сывороток антирезус. Лаб. дело, 1956, 1, 20-22.
94. Уринсон P.M., Ботиков Е.А., Донсков С.И., Егоров В.М.,
95. Чернышова Л.Ф. Опыт приготовления сывороток для экспресс-метода определения резус-фактора из плазмы иммунизированных доноров. Лаб. дело, 1972, 2, 116-117.
96. Успенская О-В. К вопросу о стандартном "разводителе" дляантирезус сывороток.
97. Пробл. гематол., 1966, 11, 49-52.
98. Успенская О-В-, Машукова В.П. Экспресс-метод определениярезус-фактора на плоскости при комнатной температуре с применением полиглюкина. В сб.: "Вопросы изо-серологии и иммуногематологии". Л., 1972, 22-24.
99. Черницкий Е.А., Воробей А.В. Структура и функции эритроцитарных мембран, шнек, "Наука и техника", 1981, 216 с.
100. Шамшина Н.М. Применение гелатиноля для приготовлениястандартных сывороток антирезус. Пробл. гематол., 1972, 7, 58-60.
101. Шкваряин Ф., Бруммелова В. 0 выделении расщепленных фрагментов гамма-глобулина и их свойствах. Пробл. гематол., 1965, 10, 3-10.
102. Эффендиев P.P. Повышение активности сыворотки антирезусс низким титром. Тез. докл. 1 Всесоюзного съезда гематологов и трансфузиологов. М., 1979, 189 с.
103. Abelson N., Rawson A. Studies of blood group antibodies.
104. Fractionation of anti-A and anti-B isohemaggluti-nins by anion-cation cellulose exchange chromatography.
105. J. Immunol,, 1959, 82, 5, 435-443.
106. Abelson К., Rawson A. Studies of blood group antibodies.
107. Fractionation of Eh antibodies by anion-cation cellulose exchange chromatography.
108. J. Immunol., 1959, 83, I, 49-56.
109. Art G., Finlayeon J. Stability of immune serum globulinduring storage: effects of prior heating. Vox. Sang., 1969, 17, 5, 419-433.
110. Bowman J., Chown В., Pollock J. bow protein Rh immuneglobulin (Eh Ig&), purity, activity and prophylactic value.
111. Vox Sang, 1973, 24, 4, 301-316.
112. Brown P., Evans J., Sinor L., Tilzer L., Plapp E.1. The rhesus D antigen.
113. Am. j. Pathol. 1983, 110, 2, 127-134.
114. Caren L., Bellavance R., Grumet P. Demonstration of genedosage effects on antigen in the Duffy, Ss and Eh system using an enzyme-linked immunosorbent assay. Transfusion, 1982, 22, 6, 475-478.
115. Case J. Albumin autoagglutinating phenomenon as a factorcontributing to false positive reactions when typing with rapid slide test reagents. Vox Sang., 1976, 30, 6, 441-444.
116. Oonnell Painter R. Fragmentation of immunoglobulinduring storage.
117. Canad. J. Biochem., 1966, 44, 3, 371-381.
118. Dorrington K., Tanford C. Molecular size and conformationof immunoglobulins.
119. Adv. Immunol., 1970, 12, 333-381.
120. Drachman 0. Eh typing with albumin serum anti4D anddextran anti-D.
121. Danisch. Med. Bull., 1967, 14, 3, 55-59.
122. Eldon K. Experience with ABO and Eh-blood grouping cards.
123. Brit. Med. J., 1956, 5003, 2, I2I8-I220.
124. Elliot M., Bossom E., Dupuy M., Masouredis S.
125. Effect of ionic strength on the serologic behavior of red cell isoantibodies. Vox Sang., 1964, 9, 4, 396-414.
126. Evans J., Plapp P., Tilzer L. Rh(D) and LW antigencontent of Eh null erythrocytes, transfusion, 1980, 20, 5, 618.
127. Evans J., Sinor L., Broun P., Tilzer L., Plapp p.1.entification of Eho(D) antigen in polyacrilamide gels by an enzyme-linked immunoassay. Mol. Immunol., 1982, 19, 5, 671-675.
128. Faney J., Morrison E., Bethesda 3. Separation of 6,6Send I8S gamma-globulins with isohemagglutining activity.
129. J. of Lab. Clin. Med., I960, 55, 6, 912-916.
130. Finlayson J., Friedli E. International forum. Burne,
131. May 1980. Vox Sang., 198I, 40, I, 49-63.
132. Pischer R. Verhutung der Hitzekoagulation von Serumprotein durch zucker. Experentia, 1947, 3, 29-30.
133. Fitzsiromons J., Morel P. The effects of red blood cellssuspending media on hemagglutination and theantiglobulin test.
134. Transfusion, 1979, 19, I, 81-85.
135. Giessen M., Hart M., Weerdt 0. Practionation of seracontaining antibodies against red cells or platelets with special reference to anti-D sera. Vox. Sang., 1964, 9, I, 25-30.
136. Godman H., Masaitis L. Binding characteristics of Rhantibodies and their serologic properties. Vox. Sang., 1964, 9, I, 6-9.
137. Gordon J., Cohen P., Pinlayson J. Levels of anti-A andanti-B in commercial immune globulins. Transfusion, 1980, 20, I, 90-92.
138. Howard P. Principles of antibody elution.
139. Transfusion, 1981, 21, 5, 477-482.
140. Hughes-Jones N., Gardner B., Lincoln P. Observations ofthe nmber of available C, D and E antigen sites on red cells.
141. Vox. Sang., 1971, 21, 3, 210-216.
142. Hughes-Jones K., Gardner В., Telford R. The effect of pHand ionic strength on the reaction between anti-Dand erythrocytes.1.munology, 1964, 7, I, 72-81.
143. James K., Henney 0. Structural changes occurring in 7Sgamma-globulins.
144. Nature, 1964, 202, 4932, 563-566.
145. Jones D. bow molecular weight as a pitfull in immunoglobulin quantitation by radial diffusion. Clin. Chem. Acta, I9TO, 29, 3, 551-557.
146. Jones R. Dextran as a diluent for univalent antibodies.
147. Nature, 1980, 165, 4186, II8-II9.
148. Jorgensen J., Nielsen M., Nielsen C., Normark J. Theinfluence of ionic strength, albumin and incubation time on the sensitivity of the indirect Coombs test.
149. Vox. Sang., 1979, 36, 3, I86-I9I.
150. Kabat E. Basic principles ob antigen-antibody reactions.
151. Methods in enzymology, 1981, 70, part A, 3-49.
152. Eauffmann R., Van E., Daha M. Aggregated human immunoglobulin G stabilized by albumin-standard for immune complex detection.
153. J. of Immunol., Methods, 1979, 31, I, 11-22.
154. Kekwick R. The serum protein in multiple myelomatosis.
155. Biochem. J., 1940, 34, 8, 1248-1257.
156. Kleinan H., Schneeweif 3., Tacke A., Hubrich W. Die Bedeutung einiger phisikochemischer Eactoren f ar die hemagglutination und hamagglutininabsprengung. Folia Haemat., 1973, 992, 3, 239-258.
157. Lalezari P., Jiang A. The manual polybrene test: asimple and rapid procedure for detection of red cell antibodies.
158. Transfusion, 1980, 20, 2, 138-144.
159. Lincoln P., Dodd B. The use of low ionic strength solution in elution experiments and in combination with papain-treated cells for the titration of various antibodies.
160. Vox. Sang., 1978, 34, 4, 221-226.
161. Low В., Messeter L. Antiglobulin test in low-ionicstrength salt solution for rapid antibody screeningand cross-matching.
162. Vox. Sang., 1974, 26, I, 53-61.
163. Lown J., Barr A., Davis E. Use of low ionic strengthsaline for crossmatching and antibody screening. J. Clin. Pathol., 1979, 32, I0I9-I024.
164. Mancini G., CarbonaraA., He remans J. Immunochemicalquantitation of antigens by single radial immunodiffusion.1.munochemistry, 1965, 2, 3, 235-255.
165. Marty M. A comparative study of antibody detectionemploying manual and aytomated method. International congress ISH-ISBI, 1982, Budapest, 319, Th-2I9.
166. Masouredis S., Sudora E.f Mahan L., Victoria,E. Antigensite densities and ultrastruetural distribution patterns of cell Eh antigens. Transfusion, 1976, 16, 2, 94-106.
167. Masouredis J., Victoria E. Exposure of the Eho(D) antigenon the surface and cytoplasmic domains of the red <t&*£. me-miico-nx. Jmmunoiocjy, /382,Z?-3Q<.
168. Matsukure J. Demonstration of ferritin-labelled antibodies bound to human erythrocytes fixed with glutaraldehyde.
169. Vox. Sang., 1972, 22, 6, 549-553.
170. Mollison P. Blood transfusion in clinical medicine.6th Edition, 1979. Blackwell Scientific Pablica-tions Osney Head, Oxford, 884, 418-419.
171. Mollison P. Summary of Reports Presented at the I6thcongress of the International society of blood transfusion. Montreal, 1980, Part I, Vox. Sang., 1981, 40, 4, 289-294.
172. Moore H., MOllison P. Use of low-ionic-strength mediumin manual tests for antibody detection. Transfusion, 1976, 16, 4, 291-296.
173. Moore S., Woodrow, McClelland. Blood-group antigen-antibody complexes haracterisation of antigen-associated components and use of complexes for monoclonal antibody production. Intern, congr. ISH-ISBT. Budapest, 1982, Tu-I42, 222.
174. Muller-Bberhard H., Hilsson U., Arronsson T. Isolationand characterization of two JS -gliсоргоteins of human serum.
175. J. Бар. Med., I960, III, 2, 201-215.
176. Natvig j., Kunkel H., Rosenfield R., Dalton J., Kochwa s.1.iotypic specificities on anti-Rh antibodies. J. Immunol., 1976, 116. 6. 1536-1538.
177. Hicolson G., Masouredis S., Singer S. Quantitative twodimensional ultrastruetural distribution of Rho(D) antigenic sites on human erythrocyte membranes. Proc. Hat. Acad. Sci.,I97I, 68, 7, I4I6-I420.
178. Oss С., Buenting Absorbed euglobulins as the case ofagglomeration of erythrocytes in the Huggis blood-thawing method.
179. Transfusion, 1967, 7, I, 77-79.
180. Oss C., Mohn J. Scanning electron microscopy of red cellagglutination.
181. Vox. Sang., 1970, 19, 4, 432-443.
182. Oss C., Mohn J., Cunningham E. Influence of various phisikochemical factors on hemagglutination. Vox. Sang., 1978, 34, 351-361.
183. Oyen E ., Colledge E., Marsh W., Wainfan P. Use of escherichia coli Qq6;s7 "blie adsorption of anti-A and anti-B from blood typing sera. Transfusion, 1972, 12, 2, 98-102.
184. Paluska E., Korinek J. Preparation of immune sera againsthuman and animal IgG globulins. Polia biologica, 1972, 18, 2, I27-I3I.
185. Plapp P., Evans J., Tilzer L. Detection of Eho(D) antigenon the inner surface or Eh negative erythrocyte membrane s.
186. Ped. Proc., 1981, 40, 208.
187. Plapp p., Kowalski ж., Evans J., Tilzer L., Chiga Ы.
188. The role of membrane phospholipid in expression oferythrocyte Rho(D) antigen activity. Pr0c.S0c.B2p. Biol. Med., 1980, 164, 4, 561-568.
189. Plapp F., Kowalski Ш., Tilzer L., Brown P., Chiga M.
190. Partial purification of Eho(D) antigen from Eh positive and negative erythrocytes. Proc. Nat. Acad. Sci., 1979, 76, 6, 2964-2968.
191. Plapp P., Kowafccki M., Tilzer L., Brown J., Chiga M.
192. Partial purificatiom of human erythrocyte Rho(D)antigen by affinity chromatography.
193. Fed.Proc. Am. Soc. Bxp. Biol., 1980, 37, 442.
194. Pollack W., Hager H., Reckel R., TorenD., Singher H.
195. A study of the forces involved in the second stage of hemagglutination. Transfusion, 1965, 5, 2, 158-183.
196. Putnam P. Immunoglobulin structure: variability and homology. j
197. Science, 1969, 163, 3868, 633-644.
198. RawsonA., Abelson N. Studies of blood group antibodies.
199. I. Observations on the physiкоchemical properties of isohemolysins and isohemagglutinins. J. Immunol., I960, 85, 6, 636-639.
200. ReardenA., Masouredis S. Protease modification enhancesanti-D binding to nucleated red blood cell precursors. "Vox. Sang., 1981, 41, 3, 160-164.
201. Reckel R., Harris J. The unique characteristics of covalently polimerized bovine serum albumin solution when used as antibody detections media. Transfusion, 1978, 18, 4, 397-406.
202. Robert В., Bookman R. Studies on the proteolitic activityof gammaglobulin preparations. Biochem. J., 1967, 102, 2, 554-562.•153. Rock G. bISS an effective way to increase blood utilization.
203. Transfusion, 1978, 18, 2, 228-232.
204. Romano E., Hughes^Tones jr., Stolimski C. Distributionand mobility of the A, D, С antigens on human red cell membranes: studies with a gold-labelled anti-globulin reagent. Br. J. Haemat., 1975, 30, 4, 507-516.
205. Bomano E., Mollison P. Mechanism of red cell agglutination by IgG antibodies.
206. Vox. Sang., 1973, 25, I, 28-31.
207. Sgouris J., Matz M. Observation on the fragmentation ofvenous and placental immune serum globulins. Vox. Sang., 1967, 13, I, 59-71.
208. Skvaril P., Radl J. The fragmentation of human IgGduring storage.
209. Clin. Chim. acta, 1967, 15, 3, 544-546.
210. Skvaril P., Theilkas b., Probst M., Morell A., Barandun S.
211. G subclass composition and immunochemical characteristics of plasmin-treated humanjgamma-globulin. Vox. Sang., 1976, 30, 5, 334-348.
212. Salisbury A., Clark J. Surface changes in red blood cells undergoing agglutination. Rev. franc. Bt. clin. biol., 1967, 12, 981-985.
213. Szymanski J., Eeegan M., Odgren P. Complement and lguptake by erythrocytes in low ionic strength solutions.
214. Vox. Sang., 1981, 41, 151-I59
215. Szymanski J., Huff S., Delsignore R. An autoanalyzertest to determine immunoglobulin class and IgG subclasse of blood group antibodies. Transfusion, 1982, 22, 2, 90-95.
216. Victoria E., Mahan L., Masouredis S. Anti-Rho(D) IgGbinds to band 3 glycoprotein of the human erythrocyte membrane.
217. Proc. Nat. Acad. Sci., 1981, 78, 5, 2898-2902.
218. Victoria E., Mahan L., Masouredis S. Anti Rho(D) IgGbinds to band 3 glycoprotein of the human erythrocyte membrane.proc. Natl. Acad. Sci., 1981, 78, 5, 2898-2902.
219. VoakD., Cawley J., Emmines J., Barker C. The role ofensymes and albumin in hemagglutination reaction. Vox. Sang., 1974, 27, 2, 156-170.
220. Wadsworth C. Estimation of aggregates of IgG and theireffect on quantitation of IgG.
221. Scand. J. Immunol., 1976, 5, 1-2, 97-105.
222. Webb A. A 30-minute preparative method for isolation of1.G fron human serum.
223. Vox. Sang., 1972, 23, 4, 279-290.
224. Werner Т.,James R.,Cathou R. The shape of immunoglobulin Gmolecules in solution.
225. Proc. Nat. Acad. Sci., 1972, 69, 795-799. 171. Wicker В., Wallas G. A comparison of a low ionic strength saline medium with routine methods for antibody detection.
226. Transfusion, 1976, 16, 5, 469-472.