Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Распространенность, физиологические и иммуносерологические особенности естественных и иммунных групповых антител системы АВО у жителей Среднего Приобья

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ.

Интенсивное промышленное освоение районов Среднего Приобья Ханты - Мансийского автономного округа привело к существенным изменениям структуры населения. Большинство жителей вновь возникших населенных пунктов представлено переселенцами из европейской части бывшего СССР, их детьми и внуками. Приспособление к новым, как правило, менее комфортным по сравнению с биологической родиной природным условиям вызывает в организме человека существенные морфологические, функциональные, биохимические и психологические изменения. Степень медико - биологических изменений и поддерживающих их условий настолько велика, что современное население северных территорий Западной Сибири определяется многими исследователями как новая популяция человека (Казначеев 1983, Хаснуллин 1992, Щедрина 1996).

Большинство исследований биолого - генетического и морфо-функционального содержания посвящено установлению общебиологической и общефизиологической закономерности адаптивных перестроек. Несмотря на неоднократно осуществленные в регионах новых освоений, исследования физиологии и морфологии системы крови (Раппопорт 1979, Койносов 1998.), часть важнейших гематологических разделов в настоящий момент изучены слабо. В частности, недостаточно исследованы физиологические и иммуносерологические особенности антител и антигенов системы ABO, Резус, Келл у жителей Среднего

Приобья, уровень аллосенсибилизации населения указанного региона, в первую

X . ' ' очередь среди женщин, имевших беременности.

Необходимость исследования иммуносерологических показателей крови у различных контингентов населения региона диктуется не только их общебиологической значимостью в аспекте формирования геногеографической адаптации, но и конкретным практическим использованием этих показателей для оцеьрси степени риска возможных пострансфузионных и акушерских осложнений.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Изучить распространенность, физиологические и иммуносерологические 7 особенности естественных и иммунных антител системы ABO у жителей Среднего ) ^ - 1

Приобья. С

T¿ ^ е> к.

V.Y U х^ЧлхяХ^^ ч*.

ЧЗАД71ЧИ. С г a i . V

Для достижения поставленной цели необходимо быпо решить следующие научные и организационные задачи:

1. Изучить частоту распределения антигенов системы ABO, Резус, Келл в регионе, создать регистр типированных доноров.

2. Исследовать физиологические и иммуносерологические особенности естественных и иммунных антител системы ABO, частоту их распределения у здоровых людей мужчин и женщин различного возраста, с учетом групповой принадлежности, в т.ч. у беременных женщин.

3. Разработать и внедрить более эффективную технологию приготовления универсальных сывороток для определения антигенов различных эритроцитарных систем.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

1. Получены новые данные о распространенности, физиологических и иммуносерологических особенностях естественных изогемагглютининов и иммунных антител системы ABO.

2. Показано, что унитиолустойчивые антитела системы ABO \ встречаются относительно с большей частотой у женщин, чему мужчин /54% и |

46% соответственной Отмечено повышение их частоты с увеличением возраста от /

18-29 лет до 50-59 лет, а также от числа беременностей. Унитиолустойчивые ) антитела являются не иммуными, как считалось ранее, а естественными агглютининами класса IgG системы ABO и имеют такую жеХ^йрод^ происхождения как изогемагглютинины класса IgM. ¡

3. Определена частота распределения антигенов системьг/ АВО, Резус, Келл у жителей Среднего Приобья, характеризующая многонациональность популяции.

4. Модифицирована технология получения универсальных сывороток антирезус путем двухэтапной нейтрализации естественных изогемагглютининов и адсорбции иммунных антител системы ABO в сыворотках.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

Полученные данные о частоте встречаемости, физиологических и иммуносерологических особенностях естественных и иммунных групповых антител могут быть использованы для:

- характеристики сенсибилизационного фона популяции;

- определения донороспособности региона;

- прогнозирования и предупреждения посттрансфузионных реакций и осложнений, ранней диагностики гемолитической болезни новорожденных;

- планирования лечебно - профилактических мероприятий в регионе.

Приготовленные по модифицированной нами технологии универсальные тестовые сыворотки используются для определения трансфузионно опасных антигенов в лечебно-профилактических учреждениях города, а также в отделениях и станциях переливания крови других городов Ханты - Мансийского автономного округа.

Созданный по различным эритроцитарным системам регистр типированных доноров, насчитывающий более 10 тысяч образцов эритроцитов, используется с целью подбора максимальна/ совместимой крови для сенсибилизированных больных, а также /для производства стандартных эритроцитов, выявления и изучения протившритроцитарных антител у доноров, больных, беременных. 7

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Результаты исследований внедрены в практику: используются в лекционном курсе "Клиническая иммуносерология" на кафедре гематологии и интенсивной терапии ГНЦ РАМН (1997), "Физиология человека и животных" на кафедре анатомии и физиологии человека и животных Тюменского Государственного университета (1998), на кафедре физиологии медицинского факультета Сургутского государственного университета (1998).

С целью профилактики посттрансфузионных осложнений гемолитического типа на станции переливания крови и других лечебно -профилактических учреждениях города проводится определение аллоиммунных антител.

В гг. Сургуте, Когалыме, Нижневартовске, Нефтеюганске внедрен скрининг антител в сыворотках крови доноров и больных.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Данные о распространенности, физиологических и иммуносерологических особенностях естественных и иммунных групповых антител системы ABO, частота распределения трансфузионно опасных антигенов у жителей Среднего Приобья.

2. Новое положение о том, что унитиолустойчивые антитела, обнаруживаемые у здоровых лиц, а также беременных, не являются иммунными антителами, как это считалось прежде, а относятся к естественным антителам системы ABO.

3. Технология приготовления универсальных сывороток для определения трансфузионно опасных антигенов, основанная на двухэтапной нейтрализации естественных, унитиолустойчивых и аллоиммунных антител системы ABO амниотической жидкостью и эритроцитами.

ПУБЛИКАЦИИ: По теме диссертации опубликовано 3 работы. 8

СТРУКТУРА И ОБЬЕМ РАБОТЫ.

Работа изложена на 73 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием методов исследования, трех глав с изложением результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Библиография включает 92 отечественных и 78 иностранных источников. Работа иллюстрирована 15 таблицами, 3 рисунками.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

•■¿i.J

К концу XIX в. определилось новое направление иммунологии -науки, об изоантигенах и изоантителах организма человека, начало которой положено *

L. Ландштейнером. Ее чаще называют наукой о группах крови. Изоантигенная дифференцировка организма не ограничивается лишь элементами крови, а распространяется и на другие клетки, например сперматозоиды, ткани органов, белки сыворотки крови, а также на секреты и экскреты - слюну, желудочный сок, желчь, амниотическую жидкость ит.д (Kabat 1956,1973).

За последние годы были открыты многие редко встречающиеся антигены, которые присущи не какой-либо группе лиц, а только отдельным индивидам, или встречаются лишь у весьма ограниченного круга лиц, например членов одной семьи. Существование внутривидовой биохимической антигенной дифференцировки присуща не только организму человека. Это явление носит общебиологический характер и присуще животным и растениям, бактериям и вирусам. Наибольшее сходство внутривидовой изоантигенной дифференцировки было обнаружено у человека и человекообразных обезьян по системе ABO, Резус, MN ( Белкина, 1994, Agre, Cartron, 1991, Arce, Thompson, Wagner, et. al., 1993 ). Едва ли есть основания сомневаться в том, что причиной возникновения и развития внутривидовых антигенных признаков являются факторы окружающей среды. Под их влиянием складывались различные биохимические антигенные структуры, закреплялись наследственно и передавались потомству ( Косяков 1974).

Антигены обладают двумя свойствами: способностью вызывать образование антител при поступлении в организм, минуя желудочно-кишечный тракт, и способностью образовывать комплексы, соединившись с антителами. Это полноценные антигены, которые по химической природе являются белками. Работами Landsteiner (1928) было установлено, что специфичность антигенов определяется не всей белковой молекулой, а лишь ее частью, называемой антигенной детерминантой. На строме каждого эритроцита находится огромное число различных антигенов. Здесь имеются гетерогенные антигены, т.е.антигены, общие для человека и животных; видоспецифические антигены, идентичные сывороточным белкам; внутривидовые группоспецифические изоантигены. Вещества, родственные антигенам человека, были найдены у животных, лошадей, крупного рогатого скота, собак, кошек, различных паразитов (аскариды, трихинеллы), некоторых рыб, насекомых, птиц, высших растений (тиссовые деревья, лавровые) и вирусов (гриппа А и В, истинная чума птиц) и др. Так, компоненты антигена А, помимо эритроцитов человека, были обнаружены в эритроцитах барана. Специфические полисахариды, определяющие принадлежность человека к группе А(П), выделены из тканей желудка свиней, коров, лошадей, также пневмококка Х1У типа (Kabat, 1968, Kabat, Maier, 1971). А парциальные антигены В2, ВЗ, входящие в состав антигена В человека, обнаружены в эритроцитах кролика, собаки, морской свинки и могут специфически взаимодействовать с b изогемагглютинином сыворотки человека; третий компонент - В1 - специфичен для человека и у животных не встречается (Косяков, 1974). Вещества, сходные с агглютининами альфа и бета, были обнаружены во многих растениях, у насекомых и птиц (Косяков, Лорие, 1964, Харрисон и соавт., 1979).

Исследованиями Бойда (1969) установлено, что семена многих семейств растений главным образом бобовых, содержат вещества, обладающие способностью давать специфическую агглютинацию эритроцитов, содержащих групповые антигены Al, А2, H и В. Гемагглютинины растительного происхождения, такие как, солевые экстракты из семян Vicia Gracca, Cytisus sessilifolius реагируют преимущественно с эритроцитами групп А2(П) и 0(1), а экстракты из семян Dolichos biflorus дают более сильную реакцию агглютинации с эритроцитами АЦП) и А1В(1У). В экстрактах из грибов Marasmius oreades найдены агглютинины анти - В , из семян Ulex europeus -агглютинины анти - Н.

В основе иммунной реакции организма лежит принцип чужеродности антигена. Организм может образовывать антитела при условии отсутствия у него антигенной детерминанты.

Иммуноглобулины класса IgG системы ABO играют важную роль в развитии посттрансфузионных осложнений и гемолитической болезни новорожденных (Wiener, 1951,1954). При контакте организма с чужеродными для него антигенами А или В, или антигеноподобными группоспецифическими субстанциями, подобными антигенам групп крови человека, могут синтезироваться специфические анти-А, анти-В антитела, относящиеся к классу Ig G. Поэтому для диагностики и профилактики названных патологических процессов необходимо направленное выявление именно иммуноглобулинов класса Ig G ABO системы. Выявление вышеназванных антител затрудняет одновременное генетически детерминированное присутствие в плазме естественных анти - А, анти - В изогемагглютининов. Существующие методы параллельного титрования сывороток в белковой и солевой среде, инактивирование естественных антител при температуре 70 С не позволяют выявлять иммунные антитела, если они содержатся в сыворотке в низких концентрациях, напротив, с использованием редуцента - унитиола (2,3 -димеркаптопропансульфонат Na) это возможно. По механизму действия унитиол сходен с аналогичными редуцентами 2 - меркаптоэтанолом и дитиотрейтолом, используемыми за рубежом (Матвеева, 1989).

ВЫВОДЫ

1.Получены данные о распространенности, физиологических и иммуносерологических особенностях естественных и иммунных антител системы ABO у жителей Среднего Приобья. Групповые антитела системы ABO разделены на 3 вида: естественные термолабильные изогемагглютинины, аллоиммунные термостабильные антитела, унитиолустойчивые агглютинины.

2. Частота унитиолустойчивых антител у людей составляет 50,06%;

- у женщин она выше 54,06%, чем у мужчин - 46,06%;

- наибольшая зарегистрирована у беременных - 83,78% и увеличивается с последующими беременностями.

Частота унитиолустойчивых антител зависит от групповой принадлежности крови, возраста, высоты титра естественных изогемагглютининов:

- у лиц 0(1) группы УУА встречаются чаще - 79,0%, чем у В(Ш) - 45,4% и А(П) - 25,8%;

- с увеличением возраста от 18 до 59 лет частота УУА повышается от 43,5% до 57,0%;

- у лиц, имеющих высокий титр естественных антител 1 : 64 - 1 : 128 данный вид антител встречается почти в 100%, в то время как у людей с низким титром 1 : 2 - 1 : 32 - они встречаются реже от 15 до 72%.

3. Сформулировано новое положение, что унитиолустойчивые антитела являются не иммунными, как считалось ранее, а естественными Ig G агглютининами ABO системы, имеют такую же природу, как изогемагглютинины Ig М. Естественные изогемагглютинины, аллоиммунные антитела и унитиолустойчивые агглютинины выполняют важную физиологическую функцию в организме человека, нейтрализуя группоспецифические субстанции, попадающие в организм из внешней среды.

4. Частота распределения групповых факторов системы ABO, Резус, Келл у жителей Среднего Приобья на примере доноров г. Сургута существенно не отличается от таковой по Европейским регионам Российской Федерации и характеризует достаточно полиморфную по национальному признаку популяцию. Вместе с тем, отмечено некоторое увеличение частоты резус - отрицательных лиц (17%).

5. Создан регистр типированных доноров по системе ABO, Резус, Келл в регионе, в том числе с редкими фенотипами, который используется для подбора совместимой крови сенсибилизированным больным, изучения геногеографии групп крови.

6. Модифицирована и внедрена технология приготовления универсальных сывороток антирезус для определения антигенов различных эритроцитарных систем, основанная на двухэтапной нейтрализации сопутствующих групповых антител, в том числе аллоиммунных и унитиолустойчивых, с помощью амниотической жидкости (1 этап) и эритроцитов (П этап).

7. Разработанные тестовые реактивы для выявления трансфузионно опасных антигенов внедрены в практику работы лечебно -профилактических учреждений города и курируемых отделений и станций переливания крови Ханты- Мансийского автономного округа.

61

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Имеющиеся литературные данные (Косяков, 1974, Умнова, 1989, Wiener, 1954, Бойд, 1969, Mollison, 1979, Dufour, 1980, Прокоп, Гелёр, 1991) указывают на полигенное происхождение антител системы ABO в организме человека.

Процесс аллосенсибилизации может иметь место не только в результате непосредственного контакта иммунной системы человека с эритроцитарными антигенами системы ABO при переливании иногруппной крови или гетероспецифической беременности, но также при профилактических вакцинациях, попадании антигенов с пищевыми продуктами. Нельзя исключить возможность скрытой, спонтанной иммунизации через продукты животного, растительного и бактериального происхождения.

Иммунные антитела системы ABO встречаются часто, но с таким постоянством, как естественные анти-А, анти-В антитела. У лиц группы А(П) и В(Ш) образуются преимущественно антитела класса Ig М, у лиц 0(1) -синтезируются как М, так и G групповые антитела. У женщин уже при первой беременности образуются антитела класса Ig G.

Считается доказанным принадлежность антител системы ABO к иммуноглобулинам класса Ig М и Ig G (Николаева, 1994, Wiener, 1951, Доссе, 1959, Economidon, 1967, Lincoln, 1969, Edelman, 1971, Месробяну, Берчану, 1977). Для их выявления разработаны различные методы диагностики: метод нейтрализации анти-А , анти-В антител унитиолом; с прогреванием сыворотки при 70° С. Для инактивации естественных антител за рубежом используются сульфидредуцирующие агенты (меркаптоэтанол, дитиотрейтол), которые разрывают аналогично унитиолу сульфидные связи , поддерживающие пентамерную структуру молекулы Ig М. Проведенные М.А. Матвеевой (1989) сравнительные исследования действия этих веществ на естественные изогемагглютинины показали сопоставимые результаты.

Целью нашего исследования было: изучить распространенность, физиологические и иммуносерологические особенности естественных и иммунных групповых антител системы ABO у жителей Среднего Приобья. ' я újк\<0й.,--%ЛЛР

S а ее с ( ' !/ ц -ам :

Для этого необходимо бьшо решить следующие задачи:

1. Изучить частоту распределения антигенов системы ABO, Резус, Келл в регионе, создать регистр типированных доноров.

2. Исследовать физиологические и иммуносерологические особенности естественных и иммунных антител системы ABO, частоту их распределения у здоровых людей мужчин и женщин различного возраста, с учетом групповой принадлежности, в т.ч. у беременных женщин.

3. Разработать и внедрить более эффективную технологию приготовления универсальных сывороток для определения антигенов различных эритроцитарных систем.

Материалом для исследования служили сыворотки и эритроциты крови доноров мужчин и женщин Сургутской СПК (более 31000), образцов, которые являются представителями многонациональной популяции, включая малые народности Севера.

Полученные данные по распределению антигенов системы ABO на примере доноров нашей станции (0-36,1%, А-31,4%, В - 23,3%, АВ-9,0%) существенно не отличаются в основном от имеющихся данных проф. М.А.Умновой (1979) и других исследований (33,5%, 37,8%, 20,6%, 8,1% соответственно) и характеризуют исследованную популяцию доноров как европеоидную.

По распределению антигена резус наблюдается увеличение частоты резус - отрицательных лиц до 17%, как мы полагаем, за счет миграции населения европейских территорий бывшего Союза, которые стали нашими донорами. При проведении фенотипирования эритроцитов выявлены некоторые различия по частоте встречаемости некоторых фенотипов с имеющимися литературными данными, которые мы склонны объяснить многонациональностью донорской популяции. Таким образом, проведенная работа по изучению частот групповых факторов у доноров СПК, позволила нам создать регистр типированных доноров, насчитывающий более 10 тысяч образцов эритроцитов, что дает возможность подбирать максимально совместимую кровь для сенсибилизированных больных, использовать для производства стандартных эритроцитов, а также для выявления и изучения противоэритроцитарных антител у доноров, больных и беременных.

Проводя изучение физиологических и иммуносерологических особенностей групповых антител системы ABO на примере доноров станции переливания крови г. Сургута и на основании данных литературы мы пришли к выводу о наличии 3 видов антител данной системы: естественных, аллоиммунных и унитиолустойчивых.

К первому относятся естественные изогемагглютинины, два других -относятся к иммунным. Термин - унитиолустойчивые антитела - введен нами в характеристику антител, которые остаются в сыворотке после разрушения естественных антител 2,3 димеркаптопропансульфонатом Na (унитиолом). Наибольший интерес представляет именно этот вид антител, свойства и значение которых в физиологии изучены далеко не в полной мере. В частности, как было сказано выше, унитиолустойчивые антитела относились к иммунным, что на наш взгляд не совсем правомерно. В отечественной литературе мы встретили одну работу М.А. Матвеевой (1989) исследования антител с применением унитиола.

В результате проведенных исследований нами установлено, что 50% людей из 3000 обследованных имеют унитиолустойчивые антитела, частота их выше у женщин, чем у мужчин и изменяется в зависимости от групповой принадлежности крови: существенно высокая частота у лиц 0(1) группы мужчин 76%., женщин-81%. У лиц группы В(Ш) частота колеблется от 41% у мужчин до 49% у женщин. Лица группы А(П) имеют наименьшую частоту встречаемости УУА - 20% и 31% соответственно. Нами установлено увеличение частоты унитиолустойчивых антител с изменением возраста обследуемых от 18 до 59 лет, особенно выраженная корреляция прослеживается у лиц группы 0(1) мужчин и женщин. Также установлена зависимость увеличения данного

57 вида антител системы ABO от титра естественных агглютининов: при титре 1:641: 128 она достигает 100% у доноров группы 0(1) самых молодых и самых старших мужчин и женщин. В группе А(П) и В(Ш) отмечается менее выраженная тенденция изменения частоты от указанного признака.

Особый акцент следует сделать на полученных данных унитиолустойчивых антител у беременных, так как частота у них наибольшая от 86% по нашим данным, до 95% по данным ГНЦ, которая (также как и у доноров) коррелирует с высоким титром естественных изогемагглютининов. Количество беременностей оказывает существенное влияние на выработку антител, устойчивых к унитиолу. Так, по нашим данным у женщин группы 0(1) при наличии одной беременности УУА встречаются в 83%, а при наличии четырех - в 93%. В группе В(Ш) изменения аналогичны таковым в предыдущей группе: при наличии одной беременности нами обнаружены УУА в 60%, при четырех - 100%. В группе А(П) изменения менее выражены. Таким образом, нами установлено, что количество беременностей оказывает влияние на частоту встречаемости унитиолустойчивых антител.

Термостабильные иммунные антитела обнаружены у доноров мужчин и женщин 0(1) группы, с одинаковой частотой 0.6%, хотя из литературных данных известно, что они встречаются чаще. Вряд ли обнаруженные антитела можно отнести к категории аллоиммунных, в то же время они не могут быть отнесены к естественным агглютининам.

Проводя параллельные исследования трех видов антител, мы установили между ними сходные характеристики и различия. На основе собственных и литературных данных предложена классификация антител, которая отражает иммуносерологические особенности естественных и иммунных антител системы ABO. Учитывая то обстоятельство, что унитиолустойчивые антитела встречаются у здоровых лиц мужчин и женщин, является достаточно веским основанием для того, чтобы отнести их по природе происхождения к естественным антителам системы ABO. Биологическая роль унитиолустойчивых антител по аналогии с естественными изогемагглютининами сводится к защите

58 от воздействия группоспецифических факторов окружающей среды, что имеет большое значение в поддержании постоянства внутренней среды организма.

Как видно из наших исследований, некоторые сыворотки содержат аллоиммунные антитела и 50% сывороток - УУА. Оба вида антител не реагируют с группоспецифическими субстанциями биологических жидкостей. Это чрезвычайно важное обстоятельство, которое необходимо учитывать при получении качественных универсальных сывороток антирезус, удаляя из сырья сопутствующие антитела.

С этой целью нами модифицирована описанную в литературе технология получения универсальных сывороток. Разработанная двухэтапная технология включала основные процессы: первый - подготовительный, при котором проводилась сортировка и контроль сывороток по наличию сопутствующих антител - естественных изогемагглютининов, унитиолустойчивых и аллоиммунных. Второй - технологический, состоящий из двух этапов: на первом этапе проводили нейтрализацию естественных антител амниотической жидкостью, во втором этапе - доадсорбцию УУА и аллоиммунных резус - отрицательными эритроцитами небольших сроков хранения (до 5 суток). Последующие контрольные проверки на чистоту адсорбции полученных образцов универсальных сывороток позволили нам сделать вывод, что предлагаемая нами двухэтапная технология нейтрализации групповых антител амниотической жидкостью и резус - отрицательными эритроцитами, позволяет надежно удалить из сывороток все три вида сопутствующих антител: естественные изогемагглютищшы, унитиолустойчивые и аллоиммунные антитела.