Автореферат и диссертация по медицине (14.00.07) на тему:Оценка риска загрязненности пищевых продуктов бактериями рода Campylobacter

На правах рукописи

ШУРЫШЕВА ЖАННА НИКОЛАЕВНА

ОЦЕНКА РИСКА ЗАГРЯЗНЕННОСТИ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ БАКТЕРИЯМИ РОДА CAMPYLOBACTER.

14.00.07.-Гигиена

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

а

"Ял

Москва - 2007

003056828

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательскнй институт питания Российской академии медицинских наук

Научные руководители:

Доктор биологических наук, профессор, Заслуженный деятель науки и техники РФ

Куваева Инна Борисовна

Кандидат медицинских наук

Шевелева Светлана Анатольевна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор,

Тартаковский Игорь Семенович

Доктор медицинских наук, профессор

Королев Алексей Анатольевич

Ведущая организация:

Федеральное Государственное учреждение науки «Федеральный Научный Центр гигиены им, Ф.Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора.

Защита состоится 16 апреля 2007г. В 1400 на заседании Диссертационного совета Д 001.002.01 в ГУ НИИ питания РАМН по адресу: 109240, г. Москва, Устьинский проезд, Д.2/14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ питания РАМН

Автореферат разослан 16 марта 2007г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

Доктор биологических наук, профессор

В.М. Коденцова

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ.

Обеспечение микробиологической безопасности пищевых продуктов в отношении новых и вновь возникших возбудителей кишечных инфекций, таких как бактерии рода Campylobacter, является актуальной проблемой гигиены питания. Это обусловлено значительным ростом заболеваемости кампилобактериозом, показатели которой в последние годы, в большинстве развитых стран, превысили таковые при сальмонеллезе [Kist M., 1985; Altekruse S.F. et al., 1999; Oberhelman R.A. et al., 2000; Coker A.O. et al., 2002; Rautelin H. et al., 2000; Friedman J. et al., 2000]. По оценкам некоторых исследователей, кампилобактериозом ежегодно поражается 1% населения разных стран [Altekruse S.F. et al., 1999; On S.L.W, et al., 1998; Ketley J.M. et al., 1997; Wheeler J.G. et al., 1999], a предполагаемый экономический ущерб от него.только в США составляет до 1,3 до 6,2 млрд.$ ежегодно [Fosthythe S.J., 2000].

В нашей стране, официально регистрируется незначительное число заболеваний кампилобактериозом однако, наблюдается рост кишечных инфекций с неустановленным возбудителем, число которых в 2005 г. достигло 66% [Роспотребнадзор, 1996-2006]. Значительную часть этих инфекций формируют термотолерантные, микроаэрофильные бактерии рода Campylobacter.

По данным зарубежных исследователей до 70% случаев кампилобактериоза связано с употреблением контаминированных пищевых продуктов и воды [Hunt Jan M. et al., 2001; Vellinga A. et al., 2002]. Многочисленные эпидемиологические исследования идентифицировали употребление мяса птицы в качестве основного фактора риска при кампилобактериозе [Deming M.S. et al., 1987; Effler P. et al., 2001; Friedman С. et al, 2000; Neal K.R. et al., 1995; Rodrigues L.C., et al., 2001; Neal K.R., et al., 1997; Eberhart-Phillips J. et al., 1997]. К потенциально опасным продуктам относят также сырое молоко, овощи, салаты [Rohrbach B.W. et al., 1992, Hudson P.J. et al., 1984; Evans M.R, 2003; Wanyenya I. et al., 2004]. Однако, точный вклад, который вносит употребление вышеуказанных продуктов, в заболеваемость кампилобактериозом не определен.

Недостаточно изученным остается влияние новых технологий упаковки (полимерная упаковка, модифицированная газовая среда) и различных факторов, оказывающих воздействие на продукт (охлаждение, замораживание) в процессе продвижения его к потребителю, на сохранность и биологические свойства возбудителя кампилобактериоза. Недостаточно изучена взаимосвязь отдельных видов Campylobacter spp. с различными видами пищевых продуктов, значительно варьируются данные об уровнях инфицирующих доз [Evans M.R., 2003; Eberhart-Phillips J. et al, 1997; Friedman C.R. et al, 2004; Blaser M.J. et al., 1986; Black R.E. et al., 1988; Butzler J.P. et al., 1984]

Работ, посвященных изучению загрязненности пищевых продуктов Campylobacter spp., в нашей стране крайне мало. [Минаева Н.З., 1992; Порин А.А., 1990; Алабугина Т.В.,1998]. Имеющиеся данные не пригодны для оценки микробиологического риска, по причине использования авторами разных методических подходов к культивированию Campylobacter spp., не учитывающих специфику выделения их из пищевых продуктов, к тому же, они не предусматривают количественного определения кампилобактерий, что является обязательным для современной оценки микробиологического риска.

Вместе с тем, модель оценки микробиологического риска (ОМР) на современном этапе, признана наиболее эффективным подходом к управлению рисками и разработке мер направленной профилактики. Для ОМР необходимо иметь данные о загрязненности пищевых продуктов конкретными видами микроорганизмов, особенности биологических свойств возбудителей, наличии у них факторов патогенности, характере их взаимодействия с макроорганизмом, что позволяет оценить степень наносимого ими вреда для здоровья человека [Buchanan R.L., 2000; Lammerding A.M., 2000; Tirado К., 2005].

Работ, посвященных оценке риска загрязненности пищевых продуктов бактериями рода Campylobacter, в нашей стране до сих пор не выполнялось.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Цель исследования: оценить риск загрязненности пищевых продуктов бактериями рода Campylobacter.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

1. Адаптировать имеющиеся в международной практике культуральные методы обнаружения бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах и разработать доступный для практических исследований метод выявления и количественного определения бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах.

2. Изучить распространенность и количественное содержание бактерий рода Campylobacter в мясе птицы и птицеиродуктах (сырых и готовых у употреблению), сыром коровьем молоке.

3. Изучить видовые характеристики выделенных из пищевых продуктов штаммов Campylobacter spp., наличие у них маркеров антибиотикорезистентности и факторов патогенности.

4. В экспериментах на животных с пероральным введением бактерий рода Campylobacter изучить степень их вредного воздействия на макроорганизм в зависимости от дозы и биологических свойств возбудителя.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ

Впервые в нашей стране получены данные по частоте загрязнения и количественному содержанию бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах массового потребления. Установлено широкое распространение Campylobacter spp. в птицепродуктах куриных сырых (37%) при невысоком количественном содержании (от 4 до 1100 КОЕ/ЮОг, медиана - 15 КОЕ/ЮОг, 90% - 240 КОЕ/ЮОг). Показано отсутствие кампилобактерий в пищевых продуктах, готовых к употреблению, в том числе, упакованных в пленочные оболочки и модифицированную газовую атмосферу, а также изготовленных в мелкорозничных предприятиях сети общественного питания быстрого обслуживания (салаты многокомпонентные с добавлением мяса птицы, куры - гриль, шаурма).

Установлено доминирование термофильного вида Campylobacter jejuni в птицепродуктах куриных сырых.

Впервые охарактеризованы биологические особенности Campylobacter jejuni, выделенных из пищевых продуктов. Установлено, что все штаммы обладали устойчивостью к антимикробному препарату группы фторхинолонов (ципрофлоксацину). Сочетанной устойчивостью к двум и более антибактериальным препаратам обладали 90% штаммов.

Впервые обнаружена способность штаммов Campylobacter jejuni, выделенных из замороженных птицепродуктов, чаще (в 74%) формировать при культивировании морфологически измененные формы колоний (R-формы).

Обнаружено существенное (в 10 раз) снижение количества жизнеспособных клеток Campylobacter spp. в процессе морозильного хранения в течение 3 недель и более. Установлено, что в пробах мяса и полуфабрикатов птицы, полученных из торговой сети и после манипуляций в быту (оттаивание, нарезка и повторное замораживание), частота обнаружения Campylobacter spp. была в 2-4 раза ниже, чем в пробах, отобранных после окончания технологического процесса.

Установлено, что штаммы Campylobacter jejuni, выделенные из пищевых продуктов, находящихся в обороте, способны при пероральном введении обусловливать развитие кишечной инфекции у здоровых взрослых лабораторных животных (белых мышей).

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ И ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Разработаны методические указания «Методы выявления и определения бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах». М: Роспотребнадзор, 2007 (в печати) Методические указания могут использоваться для исследования пищевых продуктов на соответствие требованиям безопасности, при расследовании вспышек пищевых отравлений и инфекций с пищевым путем передачи, а также при производственном контроле.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Результаты работы доложены на Восьмом всероссийском конгрессе «Оптимальное питание - здоровье нации» (Москва, 2005) и I Всероссийском съезде диетологов и нутрициологов «Диетология: проблемы и горизонты» (Москва, 2006), межлабораторной конференции ГУ НИИ питания РАМН (Москва, 2006).

ПУБЛИКАЦИИ

По результатам работы опубликовано 8 научных работ, в т.ч. 2 статьи в научном журнале, определенном ВАК Минобрнауки РФ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертационная работа изложена на 145 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц, 6 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 2-х глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, последний включает 285 источников, из них 242 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалами для исследования служили образцы сырых и готовых к употреблению пищевых продуктов, выбор которых был обоснован их ролью в заболеваемости кампилобактериозом по данным научной литературы.

Всего было исследовано 189 проб пищевых продуктов массового потребления, в том числе птицепродуктов куриных сырых, охлажденных и замороженных - 113, молока коровьего сырого сборного - 25, готовых к употреблению мясо - и птицепродуктов промышленного изготовления - 11 и блюд общественного питания из (или с добавлением) мяса птицы - 40. Образцы птицепродуктов сырых были получены из птицефабрик Центрального региона РФ, СНГ (Белоруссия) и из торговой сети г. Москвы. Образцы молока получены из фермерских хозяйств Московской, Тверской и Ярославской областей. Образцы готовых к употреблению мясо - и птицепродуктов промышленного изготовления получены из торговой сети г. Москвы. Блюда общественного питания были отобраны в мелкорозничных предприятиях сети общественного питания быстрого обслуживания г.Москвы ФГУЗ «Центром гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора.

Отбор проб осуществляли после окончания технологического процесса и на разных сроках хранения (в пределах сроков годности) в соответствии с установленными требованиями на отбор и подготовку проб для микробиологических исследований. Доставку образцов в лабораторию осуществляли в сумке-холодильнике. Время доставки не превышало 1ч.

Исследование проб на наличие бактерий рода Campylobacter проводили культуральным методом посева, основанном высеве определенных количеств продукта в жидкие среды, содержащие антибиотики, аэротолерантные добавки и баранью кровь, предварительной инкубации их при 32°С или 37°С в течение 4 или 5 ч в зависимости от физического состояния проб (замороженные, охлажденные) - (предварительное обогащение), с последующей инкубацией при 42°С в течение 24 ч - (обогащение), пересевом на поверхность твердых селективных сред с инкубацией при 42°С в течение 24-48 ч. Инкубацию осуществляли в микроаэробных условиях, которые создавали при помощи газогенераторных пакетов для кампилобактерий, которые после вскрытия помещали в микроанаэростат с посевами.

При росте типичных колоний проводили микроскопию мазков окрашенных по Граму и 5% карболовым фуксином Циля.

Чистую культуру идентифицировали по способности к росту при 25°С, продукции каталазы, оксидазы, гидролизу гиппурата, способности утилизировать углеводы и продуцировать сероводород и чувствительности к налидиксовой кислоте и цефалотину. Для идентификации также использовали тест - систему API CAMPY (ф. Биомерье), включающую 24 биохимических теста.

Определение количества Campylobacter spp. проводили по методу определения наиболее вероятного числа (НВЧ), описанному в ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96) «Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований».

В работе использованы готовые основы питательных сред, селективные добавки антибиотиков для кампилобактерий, ростовая (аэротолерантная) добавка промышленного производства и стерильная баранья дефибринированная кровь.

При выполнении работы были использованы эталонные штаммы Campylobacter jejuni № 9 (получен в ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора) и Campylobacter jejuni № 11168-1/NCTC (получен в ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии).

Для экспериментального заражения использовали суспензии С. jejuni шт.№9, стандартизованные по оптическому стандарту мутности на 10 ед. Контроль разведений осуществляли методом прямого посева: по 0,1 мл на поверхность агара Престон с добавлением 7% крови барана.

В качестве объекта заражения использовали стерильное мясное пюре, в которое вносили суспензии с расчетными концентрациями кампилобактерий, после чего пюре тщательно перемешивали с помощью стеклянной палочки, выдерживали в течение 0,5 ч при комнатной температуре и подвергали исследованию.

Гемолитические свойства культур Campylobacter spp. изучали на поверхности Колумбийского кровяного агара (с содержанием крови 7% по объему). Присутствие вокруг колоний зон полного и (или) неполного просветления среды с зеленоватым оттенком учитывалось как альфа-гемолиз.

Чувствительность к антибиотикам определяли диско - диффузионным методом с учетом рекомендаций по определению чувствительности кампилобактеров к антибактериальным препаратам [Пособие ЦНИИ эпидемиологии, 2001]. В работе использовали стандартные диски с антибиотиками 12 наименований (налидиксовая кислота, цефалотин, ципрофлоксацин, хлорамфеникол, тетрациклин, ампициллин, эритромицин, линкомицин, стрептомицин, гентамицин, имипинем), промышленного производства.

Способность Campylobacter spp. обуславливать кишечную инфекцию изучали на белых мышах линии BALB(C), массой 16-18 г. для заражения которых использовали двухсуточные агаровые культуры двух штаммов С. jejuni на физиологическом растворе. Взвесь, содержащую определенную дозу микробных клеток, в количестве 0,1 мл однократно вводили в пищевод мышей при помощи автоматической пипетки с длинным мягким наконечником (tip's).

За мышами осуществлялось ежесуточное наблюдение в течение 8 суток с ежедневным посевом фекалий на наличие Campylobacter spp. На 14-й день у мышей была взята сыворотка, в которой определяли титр противокампилобактериозных антител в реакции объемной агломерации при помощи Диагностикума кампилобактерного антигенного полимерного сухого, производства ФГУЗ «Ростовский-на-Дону государственный научно -исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора.

Полученные результаты обрабатывали методами вариационной и описательной статистики (среднее значение, стандартное отклонение, максимум, минимум, медиана, 90-й процентиль).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Разработка метода определения бактерий рода Campylobacter в пищевых

продуктах

Разработка метода выявления и количественного определения бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах проведена в 3 этапа.

На 1 этапе проведена сравнительная оценка эффективности двух культуральных методов, используемых в международной практике для выделения Campylobacter spp.: ИСО 10272 «Горизонтальный метод обнаружения термотолерантных кампилобактерий в пищевых продуктах и кормах для животных» и FDA* 2001 г. «Выделение бактерий рода Campylobacter из продовольствия и воды», при исследовании проб натурально контаминированных сырых птицепродуктов (мяса, полуфабрикатов и субпродуктов птицы) охлажденных и замороженных.

В целях адаптации методов были проведены следующие модификации в составе питательных сред: лошадиную кровь, рекомендуемую ИСО и FDA, заменили бараньей дефибринированной, которая также обладает ростовыми и редуцирующими свойствами, кровь добавляли в среды в количестве 7% (по объему). Питательные среды по FDA (бульон Болтона, Abeyta-Hunt-Bark агар) заменили средами, содержащими равноценные количества пептона, мясного экстракта, но приготовленными из коммерчески доступных или легко воспроизводимых из отдельных компонентов основ питательных сред по стандарту ИСО (бульон Престона, агар Престона). В состав сред также были введены аэротолерантные добавки по составу аналогичные рекомендованным FDA (пируват Na, метабисульфит Na, железо (II) сульфат).

Результаты посевов птицепродуктов сырых, охлажденных и замороженных, методами ИСО и FDA с вышеуказанными модификациями питательных сред представлены в табл. 1.

*Управление по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных препаратов (США)

Таблица 1

Результаты выявления Campylobacter spp. двумя методами (ИСО и FDA).

Образцы ИСО FDA

птицепродуктов Исследовано Обнаружено Исследовано Обнаружено

-охлажденные 15 3 30 6

-замороженные 8 0 5 2

ВСЕГО/% 23 3/13 35 8/23

Как видно из табл. 1, частота обнаружения Campylobacter spp при исследовании проб натурально контаминированных пищевых продуктов по методу FDA (23%) была в 1,8 раза выше, чем по методу ИСО (13%) за счет замороженных проб.

На 2-м этапе проведена оценка эффективности проведенных модификаций питательных сред и установление пределов чувствительности для каждого из таким образом

модифицированных методов, при исследовании проб экспериментально контаминированных Campylobacter jejuni пищевых продуктов. Результаты (для минимальных доз контаминации) представлены в табл. 2.

Таблица 2.

Результаты выявления низких уровней кампилобактерий двумя методами из экспериментально зараженных продуктов.

Заражающие дозы (КОЕ/г) Рост после 24 ч Рост после 48 ч

расчетная фактическая ИСО FDA ИСО FDA

0,1 0,17 — + + +

0,1 0,2 _ + + +

0,1 0,18 - + + +

1 0,4 _ + + +

1 1 + + +

1 0,8 + + +

10 11 ■ + + +

10 10 + + + +

10 12 + + + +

Сравниваемые методы показали одинаково хорошую чувствительность при исследовании проб экспериментально контаминированных пищевых продуктов и позволяли обнаруживать менее 1 КОЕ/г кампилобактерий в продукте. В то же время, метод FDA обладач преимуществом в скорости роста колоний при наименьших дозах заражения и позволял получать результаты в более короткие сроки.

Результаты обоих этапов позволили обосновать преимущества метода FDA и целесообразность использования его схемы, как основы для воспроизведения метода определения количества кампилобактерий.

На 3-м этапе проведена оценка эффективности методов количественного определения Campylobacter spp. в пищевых продуктах.

Из двух существующих культуральных методов определения количества микроорганизмов: метода серийных разведений и НВЧ предпочтение отдали последнему, как максимально соответствующему официальным методам выделения кампилобактерий. Так, он предусматривает обязательное предварительное обогащение исследуемых проб в жидких средах, кроме того, данные, полученные отдельными исследователями [Scherer К., 2006] подтверждают целесообразность использования метода НВЧ при низких уровнях обсеменения продукта Campylobacter spp. [Сакимбаева С.Д, 1985]. 10

Это подтвердилось при исследовании проб экспериментально контаминированных различными дозами Campylobacter jejuni пищевых продуктов (табл. 3).

Таблица 3

Результаты исследования модифицированным методом экспериментально контаминированных пищевых продуктов.

Кол-во Образцов (П) Внесенное количество (КОЕ/г) М+т Обнаруженное количество (КОЕ/г) М+т % открываемое™

7 0,15+0,41 0,16+0,06 106,6

7 0,92+0,17 0,97+0,3 105,4

7 9,8 5+1,57 10,0+4,45 101,5

Уровень открываемое™ проб при внесении Campylobacter jeiuni в концентрациях от 1,5x10"' КОЕ/г и до 0,98x10' составлял более 100%.

Таким образом, проведенная работа по адаптации методов с заменой отдельных компонентов питательных сред на основе тождественности состава и их сравнительному анализу, позволила нам предложить метод выявления и количественного определения Campylobacter spp. в пищевых продуктах включающий посев по схеме, представленной на рис. 1 с последующей внутривидовой идентификацией выделенных культур по совокупности биохимических тестов.

и

Рис. 1

Схема посева обнаружения и количественого определения Campylobacter spp в пищевых продуктах

Выявление (FDA 2001 г, в нашей модификации)

навеска 25г в 100 мл обогащающего бульона Престон с кровью, антибиотиками и аротолерантной добавкой

Определение количества по методу НВЧ (ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96)

1 : 10

\7

Предварительное обогащение

4 ч при 37°С или 3 ч при при 32°С, 2 ч при 37°С (для замороженных и хранившихся >10дн. продуктов

Обогащение 18-24ч при 42°С инкубация в микроаэробных условиях

Пересев

на поверхность агара Престон с кровью, антибиотиками и аротолерантной добавкой инкубация в микроаэробных условиях 24-72 ч при 42°С

из 25 г

JJ

Учет результатов.

из 1:10

из 1:100

Юг

в 100 мл обогащающего бульона(х 3)

0,1 мл 1:10

в 9,9 мл обогащающего бульона (х 3)

1:1000

0,1 мл 1:100 в 9,9 мл

обогащающего бульона (х 3)

Из 1:1000

Метод основан на селективном обогащении в жидких селективных питательных средах с последующим пересевом на поверхность твердых селективных сред, тождественных по составу питательным средам, используемым в международной практике (ИСО 10272), микроаэрофильном инкубировании посевов, определении количества по методу наиболее вероятного числа и последующей внутривидовой идентификации по совокупности биохимических тестов. Чувствительность метода составляет 0,04 КОЕ/1г продукта (отсутствие в 25 г).

2. Изучение видовой принадлежности и факторов патогенности штаммов Campylobacter spp., выделенных из пищевых продуктов

Видовая принадлежность Campylobacter spp

Из изученных пищевых продуктов, всего было выделено 42 штамма Campylobacter spp., расширенная идентификация которых показала, что все они принадлежат к термофильному виду jejuni.

Источником всех выделенных штаммов являлись птицепродукты куриные, сырые. Это подтвердило данные различных исследователей о преимущественной распространенности в птицепродуктах кампилобактерий именно этого вида [Geraldine D., 1997; Алабугина Т.В., 1998; Жакипбаева Б.Т., 1992].

У всех культур изучены характеристики, определяющие их устойчивость в пищевых продуктах и неблагоприятное поведение в организме.

Гемолитические свойства

Исследования показали, что 37 из 42 (88%) штаммов, выделенных из продуктов обладали способностью к альфа - гемолизу, который, как известно, обусловливает вирулентность в макроорганизме. По частоте встречаемости вышеуказанный признак у исследованных нами «пищевых» штаммов совпадал с таковым у «клинических» изолятов [Пособие ЦНИИ эпидемиологии, 2001].

Способность к полиморфюму

У 74% (14 из 19) штаммов, выделенных из замороженных птицепродуктов обнаружена способность формировать морфологически измененные формы колоний: R-формы (средние, до 2 мм в диаметре, неправильной формы, серые, полупрозрачные). Большая часть штаммов, выделенных из охлажденных проб - 83% (19 из 23) формировали колонии, характерные для S-форм (мелкие - до 1,5 мм в диаметре, округлые, полупрозрачные с сероватым оттенком, гладкие, влажные).

Данный факт свидетельствует о наличии у кампилобактерий механизмов изменчивости, способствующих их сохранению под воздействием факторов технологического стресса.

Антибиотикорезистентность

Установлено, что все штаммы С. jejuni, выделенные из пищевых продуктов, были устойчивы к антимикробному препарату фторхинолонового ряда - ципрофлоксацину: 95% (40 из 42) устойчивых и 5% (2 из 42) промежуточно-устойчивых. 90% (38 из 42) штаммов обладали устойчивостью к налидиксовой кислоте, 31% (13 из 42) к ампициллину и 5% (2 из 42) к тетрациклину. Сочетанной устойчивостью к двум и более антибактериальным препаратам обладали 90% (38 из 42) изученных штаммов, наиболее часто встречалась сочетанная устойчивость к налидиксовой кислоте и ципрофлоксацину - у 53% штаммов (22 из 42); налидиксовой кислоте, ципрофлоксацину и ампициллину - 33% (14 из 42). 3. Изучение распространенности и количественного содержания Campylobacter jejuni

в пищевых продуктах

Показатели контаминации кампилобактериями изученных пищевых продуктов отражены в табл.4

Таблица 4.

Частота обнаружения Campylobacter jejuni в пищевых продуктах.

с! S Наименование Исследовано проб абс. Частота обнаружения

Q3 абс. %

сырые j Птицепродукты куриные: - Мясо, полуфабрикаты натуральные - Мясо, полуфабрикаты рубленые, в т.ч. фарш - Субпродукты ВСЕГО 87 6 20 113 35 0 7 42 57 0 35 37

Молоко коровье, сборное 25 0 0

2 a s я и 8 3 ц а ю о <и Продукция промышленного изготовления (куры сырокопченые, колбасы с/к и п/к, в т.ч. с добавлением мяса птицы, в упаковке с МГА) 11 0 0

Ь F S—i О " в Продукция сети общепита (куры-гриль, шаурма, салаты многокомпонентные, с добавлением мяса птицы) 40 0 0

Распространенность и количество Campylobacter jejuni в пищевых продуктах варьировалось в зависимости от вида продуктов (сырые, готовые к употреблению), физического состояния (охлажденные, замороженные) и происхождения (птицеперерабатывающие предприятия, торговая сеть, быт).

Все штаммы Campylobacter jejuni были выделены из образцов птицепродуктов куриных, сырых, обсемененность которых в целом, составила 37% (42 из 113). Наиболее часто кампилобактерии обнаруживались в мясе, натуральных полуфабрикатах и субпродуктах птицы - 40% (35 из 87) и 35% (7 из 20) соответственно. Выявленная нами частота загрязненности птицепродуктов, в целом, согласуется с показателями, которые характеризуют аналогичную продукцию в США, странах Западной Европы, где частота обнаружения Campylobacter spp. варьируется от 17,5% до 96% [Nannapaneni R. et al.,2005; Geraldine D.,1997; Denis M. et al„ 2001; Annuale Report, 2002].

Кампилобактерии не были выделены из проб рубленых полуфабрикатов и фарша из мяса птицы. Campylobacter spp. также не обнаружены ни в одной из исследованных проб сырого коровьгго молока (25 проб). При этом, необходимо отметить, что все образцы исследованы в зимний период года, когда для термофильных кампилобактерий температурные условия окружающей среды неблагоприятны. Кроме того, в последние годы редко сообщается о положительных находках указанных бактерий в молоке [Демченко А.Г., 1995, GoakM., 2001].

В результате исследований кампилобактерии не были выделены из проб готовой продукции промышленного изготовления, в том числе упакованных в модифицированную газовую атмосферу, которая может способствовать сохранению микроаэрофильных бактерий. Готовые продукты и блюда общественного питания, в том числе салаты, в состав которых входило мясо птицы, также были свободны от вышеуказанных бактерий.

Полученные данные, подтверждают высокую чувствительность бактерий рода Campylobacter к технологическим приемам, используемым при промышленной и кулинарной обработке мяса птицы и соответственно их эффективность в отношении возбудителя кампилобактериоза [Moore J.E. et al., 2002; Elson R. et al., 2004; Evans M.R., 2003]. В то же время, учитывая сведения об обнаружении кампилобактерий в так называемых продуктах «фаст - фуда» и их роли как факторов передачи пищевых токсикоинфекций [Quinones-Ramirez E.I. et al., 2000; Cardinale E. et al, 2003], контроль продуктов и блюд, подверженных высокому риску перекрестного загрязнения следует признать целесообразным.

Таким образом, полученные данные, показавшие отсутствие Campylobacter spp. в пищевых продуктах, готовых к употреблению, оставляют открытым вопрос о том, какова же

реальная нагрузка указанными микроорганизмами на организм человека, что требует дальнейшего изучения показателей контаминации кампилобактериями таких продуктов.

Анализ частоты обнаружения кампилобактерий в птицепродуктах в различном физическом состоянии, представленный в табл. 5, показал, что обсемененность охлажденных проб составила 41% (23 из 56), замороженных была ниже - 33% (19 из 57), что соотносится с данными зарубежных исследователей о снижении распространенности кампилобактерий в продуктах под влиянием замораживания [Annual Report, 2003].

Таблица 5

Частота обнаружения Campylobacter jejuni в птицепродуктах охлажденных и замороженных.

§ Наименование Количество проб Частота обнаружения

абс. абс. %

1 охлажденные -мясо, и полуфабрикаты натуральные (голени, крылышки и т.п.) -Полуфабрикаты рубленые и фарш - Субпродукты ВСЕГО 46 2 8 56 16 0 7 23 35 0 88 41

замороженны е -мясо, и полуфабрикаты натуральные (голени, крылышки и т.п.) -Полуфабрикаты рубленые и фарш - Субпродукты ВСЕГО 41 4 12 57 19 0 0 19 46 0 0 33

ИТОГО: 113 42 37

На рис. 2 представлены результаты анализа загрязненности птицепродуктов Campylobacter jejuni, в зависимости от источника происхождения.

Наиболее высокий процент обнаружения данных бактерий был в мясе и натуральных полуфабрикатах, поступающих по импорту из СНГ (Белоруссия) - 93% (13 из 14). Обсемененность кампилобактериями аналогичных продуктов, производимых в Центральном регионе России была почти в 2 раза ниже - 46% (11/24). Данный факт может быть обусловлен различиями в технологиях послеубойной обработки птицы, применяемых на разных перерабатывающих предприятиях. В целом же, частота обнаружения Campylobacter jejuni в птицепродуктах (мясе, полуфабрикатах и субпродуктах) на птицефабриках СНГ и Центрального региона России, была примерно одинакова - 54% (13 из 24) и 58% (18 из 31) соответственно. В пробах мяса и полуфабрикатов птицы, полученных из торговой сети и после манипуляций в быту, таких как оттаивание, нарезка и повторное замораживание, частота обнаружения Campylobacter jejuni была в 2 - 4 раза ниже, чем в пробах отобранных 16

после окончания технологического процесса, и составляла уже 23% (11 из 49), а в пробах мяса, полуфабрикатов и субпродуктов птицы - 19% (11 из 58). Снижению обсемененности указанных проб могли способствовать колебания температур в процессе хранения, а также дополнительный контакт возбудителя с кислородом, к которому он чрезвычайно чувствителен.

Рис. 2

Частота обнаружения Campylobacter jejuni в птицепродуктах из разных источников.

100 90 80 70 60 50 40

зо и 20 10 0

" »О

_54 58

46

та

1Ы

Импорт (СНГ) п=24 Россия (Центральный Производитель

регион) п=31 неизвестен (из торговой сети, после манипуляций в быту) п=58

□

птицепродукты в целом (мясо, п/ф + субпродукты птицы)

□

мясо, n/ф птицы

Количественные характеристики загрязненности исследованных проб отображены в табл. 6.

Таблица 6.

Количественное содержание Campylobacter jejuni в образцах птицепродуктов, охлажденных и замороженных.

Наименование проб Кол-во проб Обнаруж. КОЕ/ЮОг

Мин. Мак. Мер. Me 90%

абс %

Охлажденные

Мясо, полуфабрикаты 10 5 50 15 1100 135 8 93

Субпродукты 7 7 100 23 210 102 93 93

ИТОГО: 17 12 70 15 1100 121 43 160

Замороженные

Мясо, полуфабрикаты 28 19 67,8 4 1100 161 23 460

Субпродукты 10 0 0 0 0 0 0 0

ИТОГО: 38 19 50 4 1100 119 9 460

Обнаруженные количества Campylobacter jejuni в целом, были невысоки и в охлажденных пробах находились в пределах 15-1100 КОЕ/ЮОг (медиана 43 КОЕ/ЮОг, 90% -160 КОЕ/ЮОг), в замороженных пробах были еще ниже и находились в пределах 4-1100 КОЕ/ЮОг (медиана 9 КОЕ/ЮОг и 90%-460 КОЕ/ЮОг. Кампилобактерии не были обнаружены ни в одной из проб замороженных субпродуктов. Невысокое количественное содержание Campylobacter spp. в доброкачественных сырых птицепродуктах (от 20 до 67 КОЕ/ЮОг) отмечено в работах многих зарубежных авторов [Stern N.J. et al., 2003; Northcut J.K. et al., 2003; Keener K.M. et al., 2004].

Изучена динамика количественного содержания кампилобактерии в замороженных образцах на разных сроках хранения (табл. 7).

Таблица 7.

Влияние фактора хранения на количество Campylobacter jejuni в мясе и полуфабрикатах, замороженных.

Срок от даты выработки Кол-во проб КОЕ/ЮОг

Мин. Мак. М ср. Me 90%

1 нед. 7 36 1100 376 240 460

4 нед. 5 9 430 28 23 43

Как видно, количество жизнеспособных клеток кампилобактерий, уменьшалось в 10 раз при увеличении сроков хранения от 1 до 4 недель.

Таким образом, полученные количественные данные о низких уровнях содержания Campylobacter jejuni, которые являются представителями постоянных и многочисленных популяций кишечной микрофлоры домашней птицы, свидетельствуют о достаточно высокой эффективности технологий производства и переработки птицы на птицеперерабатывающих предприятиях. Но в то же время, широкая распространенность кампилобактерий (до 93% исследованных проб), говорит о высокой степени частоты перекрестного обсеменения, которое, как правило, является следствием нарушения технологических и санитарных режимов при переработке птицы и характеризуется низкими уровнями микробной загрязненности [Lammerding A.M., 2000].

4. Воспроизведение кишечной инфекции, вызванной бактериями рода Campylobacter в эксперименте на белых мышах

Степень вредного воздействия на организм Campylobacter jejuni изучена в эксперименте in vivo на белых мышах при пероральном введении штаммов, не проявлявших признаков полиморфизма, имеющих различные характеристики антибиотикоустойчивости и гемолитической активности (С. jejuni № 53к из охлажденной печени птицы, устойчивый к

\

налидиксовой кислоте, ципрофлоксацину и ампициллину, гемолитический; С. jejuni № 11168-1/NCTC из организма птицы, чувствительный к антибиотикам, негемолитический).

Показана способность штаммов Campylobacter jejuni, переживших технологическую обработку при забое птицы (обработка острым паром, охлаждение), обусловливать кишечную инфекцию у здоровых, взрослых животных при пероральном поступлении.

Также выявлены достоверные различия в патогенности антибиотикоустойчивого и антибиотикочувствительного штамма, которые свидетельствовали о большей опасности в плане инфицирования, Campylobacter jejuni, обладающих множественной антибиотикорезистентностью. Повышенная патогенность проявлялась в большем количестве заболевших животных и животных с выраженной клиническими признаками (диареей), увеличении продолжительности диареи и кишечной колонизации, что отражено на рис. 3, 4, 5. Минимальная инфицирующая доза для взятых в опыт здоровых взрослых мышей, обусловившая развитие диареи, у антибиотикоустойчивого штамма была на порядок ниже, чем у антибиотикочувствительного и составила 1х106 КОЕ. Эти результаты подтвердились результатами иммунологических исследований, которые показали нарастание титра противокампилобактериозных антител в сыворотке крови зараженных мышей.

Рис 3 Частота возникновения заболеваний среди животных в зависимости от штамма и вводимой дозы.

140 120 100 80 60 40 20 0 -20 -40

т

/I

/ : /

; Я

/ /

г..... г ......V

«;1п3 -Дп4 1*п£

заражающие дозы {мкрб. кл.)

- штамм ГИбЗ-'ШСТС —в— штамм 53 к

Рис 4 Частота возникновения диареи среди животных _в зависимости от штамма и вводимой лозы.

140

120

100

•X ао

О]

о. ГС 60

ч 40

а

VI)

0

-20

-40

Т ■

1 1

4

/

т т

заражающие дозы (микр, кл.)

-штамм 11158-ШСТС штамм 53 к

Рис. 5 Продолжительность диареи у животных

в зависимости от штамма и вводимой дозы.

2.5 2 1.5

1

0.5 0

-0.5

/

I „г I , у ,

5x103 1Й0 4 1x10 5

1x10'

1x10

1x10е

1x10 '

заражающие дозы [мкрб. кл.)

-идамм 11163-1ЛЧСТС

штамм 53 к

Таким образом, высокая частота контаминации птицепродуктов, реализуемых населению, бактериями рода Campylobacter, наличие у них выраженных патогенных свойств, а также не до конца изученные механизмы инфицирования готовых к употреблению продуктов, обусловливающих пищевые токсикоинфекции кампилобактерной природы, подтверждает необходимость усовершенствования мер ветеринарного и гигиенического характера, направленных на предотвращение перекрестной контаминации кампилобактериями и снижение их распространенности в продуктах, а также на организацию контроля за их выполнением.

ВЫВОДЫ.

1. Разработан метод выявления и количественного определения Campylobacter spp. в пищевых продуктах, основанный на селективном обогащении в жидких питательных средах с последующим пересевом на поверхность селективных сред, гармонизированных по составу питательным средам, используемым в международной практике (ИСО 10272), микроаэрофильном инкубировании посевов, определении количества по методу наиболее вероятного числа и последующей внутривидовой идентификации. Чувствительность метода составляет 0,04 КОЕ/г продукта (отсутствие в 25 г).

2. Впервые проведен анализ частоты обнаружения и количественного содержания бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах массового потребления (птицепродукты куриные сырые; молоко коровье, сырое; готовые к употреблению мясо- и птицепродукты промышленного производства; блюда общественного питания). Кампилобактерии обнаружены в 37% проб птицепродуктов сырых с уровнем обсемененности от 4 КОЕ/1 ООг до 1100 КОЕ/1 ООг (медиана - 15 КОЕ/ЮОг, 90% - 240 КОЕ/ЮОг). В готовых к употреблению пищевых продуктах из (или с добавлением) мяса птицы, прошедших кулинарную или промышленную обработку, в том числе упакованных в модифицированную газовую атмосферу, бактерии рода Campylobacter не обнаружены.

3. Установлена высокая частота контаминации бактериями рода Campylobacter мяса и полуфабрикатов птицы, поступающих по импорту из стран СНГ (93% проб); обсемененность аналогичной продукции отечественного производства не превышала 46%. Распространенность Campylobacter spp. в птицепродуктах снижалась в 2 - 4 раза в процессе оборота в торговой сети и после манипуляций в быту (размораживание, нарезка).

Кампилобактерии чаще (в 41%) выделялись из птицепродуктов охлажденных, с уровнем обсемененности от 15 до 1100 КОЕ/ЮОг (медиана 43 КОЕ/ЮОг, 90% - 160 КОЕ/г), чем из замороженных (в 33%) с уровнем обсемененности от 4 до 1100 КОЕ/ЮОг (медиана 9 КОЕ/ЮОг, 90% - 460 КОЕ/г). Обнаружено существенное (в 10 раз) снижение количества жизнеспособных клеток Campylobacter spp. в процессе морозильного хранения в течение 3 недель.

4. Обнаружено, что все штаммы бактерий рода Campylobacter, выделенные из изученных птицепродуктов, принадлежали к термофильному виду Campylobacter jejuni.

5. Впервые изучены биологические особенности Campylobacter jejuni, выделенных из пищевых продуктов. Установлено, что 95% штаммов обладали устойчивостью к антимикробному препарату группы фторхинолонов (ципрофлоксацину). Сочетанной устойчивостью к двум и более антибактериальным препаратам обладали 90% штаммов. Обнаружено, что штаммы Campylobacter jejuni, выделенные из замороженных птицепродуктов, чаще (в 74%) формировали при культивировании морфологически измененные формы колоний (R-формы), что свидетельствует о популяционной изменчивости кампилобактерий.

6. Campylobacter jejuni, выделенные из пищевых продуктов, способны обусловливать развитие кишечной инфекции у лабораторных животных (белых мышей). Более выраженной патогенностью по сравнению с антибиотикочувствительным обладал антибиотикорезистентный штамм. Минимальные концентрации, обусловливающие развитие диарейного синдрома, для антибиотикоустойчивого штамма составляли 1x10й КОЕ (у 60% животных), для антибиотикочувствительного 1хЮ7 КОЕ (у 20% животных) при наличии достоверных различий в интенсивности иммуного ответа, продолжительности интоксикации, диареи и кишечной колонизации.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Разработанные методические указания «Методы выявления и определения бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах» М: Роспотребнадзор, 2007 (в печати) рекомендуются для использования в системе Роспотребнадзора, а также при проведении производственного контроля.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Шевелева С.А., Ефгшочкина HP., Шурышева ЖН Проблемы и задачи изучения пищевого кампилобактериоза в Российской Федерации.// Материалы Международной научно-практической конференции «Национальная политика здорового питания Республики Казахстан»,- Алматы, 2004.- с.259-260.

2. Шурышева Ж.Н Методические проблемы изучения загрязненности пищевых продуктов бактериями рода Campylobacter.// Материалы Пленума научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РАМН и Минздрава и соцразвития Российской Федерации.- М., 2004.- с.54-55.

3. Шурышева Ж.Н., Шевелева С.А. Мониторинг загрязненности пищевых продуктов бактериями рода Campylobacter.// Материалы конференции «Питание здорового и больного человека»,- Санкт-Петербург, 2005.- с.220-221.

4. Шурышева ЖН. Методические вопросы изучения загрязненности пищевых продуктов бактериями рода Campylobacter.// Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье»,- Суздаль, 2005,- с 309-310.

5. Шурышева ЖН. Оценка распространенности и количественного содержания бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах.// Материалы VII Всероссийского конгресса «Оптимальное питание-здоровье нации»,- М., 2005.- с. 297.

6. Шевелева С.А., Шурышева Ж.Н, Пискарева И.И. Загрязненность пищевых продуктов бактериями рода Campylobacter.// Вопросы питания.-2006.- №6,- с.38-44.

7. Шурышева ЖН., Шевелева С А. Методические подходы к изучению распространенности и количественного содержания бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах.// Вопросы питания.-2006,- №6.- с.44-51.

8. Шурышева Ж.Н. Антибиотикорезистентность Campylobacter jejuni, выделенных из пищевых продуктов.// Материалы I Всероссийского съезда диетологов и нутрициологов «Диетология - проблемы и горизонты»,- М., 2006,- с. 132.

Заказ № 96/03/07 Подписано в печать 14 03 2007 Тираж 120 экз Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 www.cfr.ru; е-тай:info@cfr.ru

По данным ВОЗ» в последние годы микроаэрофнльные и термотолерантные бактерии рода Campylobacter являются одним из основных причинных агентов диарейных заболеваний у людей во всем мире. Почти во всех развитых странах кампилобактериоз обуславливает большее количество случаев диареи с пищевым путем передачи, чем бактерии рода Salmonella, Shigella и E.coli [Rautelin Н. et al., 2000; Friedman J, el al„ 2000; Mead P.S„ Slutskcr L. el al. l999;Tauxe RV., 1992; Altekmse S,F„ Stem N.J, et al 1999], В развивающихся странах именно бактерии рода Campylobacter являются наиболее распространенной причиной кишечных заболеваний (64-96/100 тыс.нас. в год) н смертности от них у детей до 2-х лет жизни [Oberiiclman R.A,, Taylor D.N,, 2000; Cokcr О. A-. Isokpchi D R, 2002; Adctunji J-, 2000]В Российской Федерации официально регистрируется незначительное число заболеваний камшлобактериозом (0,27 на 100 тысяч населения) однако, наблюдается явный рост кишечных инфекций с не установленным возбудителем, число которых в 2005г. составило 66 % [Ииф. заб. В РФ, 2006]. При этих заболеваниях также, как в Европе, превалирует пищевой путь передачи, а спорадическая форма заболеваемости многократно превышает ьспышечную. В целом, это дает основания полагать, что за существенную долю нерасшифрованных пищевых инфекций и отравлений в нашей стране ответственны те бактериальные агенты, состояние диагностики которых до сих пор неудовлетворительно, а первую очередь ■ бактерии рода Campylobacter.

По данным зарубежных исследователей до 70% случаев кампилобактериоза связано с употреблением контаминированных пищевых продуктов и волы [FDA, 2001; Vellinga A, et al., 2002].

Многочисленные эпидемиологические исследованияидентифицировали употребление мяса тттниы в качестве основного фактора риска при кампклобзктсриозе [Deming M.S. et al., 1987; Efller P. et al., 2001;Friedman С. el al., 2000; Neal K.R. el al., 1995; Rodrigues L.C., et al., 2001; Neal K.R., el al., 1997; Eberhait-Phillips J, et al., 1997]. К потенциально опасным продуктам относят также сырое молоко, овощи, салаты [Rohrbach B.W. el al., 1992, Hudson P.J. et ai-, 1984; Evans M.R„ 2003; Wanyenya L ei al., 2004]. Однако, точный вклад, который вносит употребление вышеуказанных продуктов, а заболеваемость кампилабактернозом не определен.

Недостаточно изученным остается влиянне новых технологий упаковки (полимерная упаковка, модифицированная газовая среда) и различных факторов. оказывающих воздействие иа продукт (охлаждение, замораживание) в процессе продвижения его к потребителю, на сохраниость и биологические свойства возбудителя кампилобактериоза. Недостаточно изучена взаимосвязь отдельных видов Campylobacter spp. с различными видами пищевых продуктов, значительно варьируются данные об уровнях инфицирующих доз [Evans M.R, 2003; Eberhart-Phillips i. et al. 1997; Friedman C.R. et al. 2004; Blaser MJ. et al. 1986; Black R.E. et al., 1988; ButzIerJ.P. et al., 1984].

Работ, посвященных изучению загрязненности пищевых продуктов Campylobacter spp., в нашей стране крайне мало. [Минаева Н.З., 1992; Порин А.А., 1990; Ал а бутик а Т.В,»1998]. Имеющиеся данные не пригодны для оценки микробиологического риска, по причине использования авторами разных методических подходов к культивированию Campylobacter spp., не учитывающих специфику выделения их из пищевых продуктов, к тому же, они не предусматривают количественного определения кампилобактерий. что является обязательным для современной оценки микробиологического рискаТаким образом, учитывая возросшее в последние годы влияние кампилобактерий на возникновение острых кишечных инфекций у людей, особую важность приобретает не только усовершенствование диагностикиинфекции, но и оценка потенциального риска для потребителей загрязненноста пищи бактериями рода Campylobacter.

Необходимо отметить, что модель оценки микробиологического риска на современном этапе, признана наиболее эффективным подходом к управлению рисками и разработке мер направленной профилактики. Для О MP необходимо иметь данные о загрязнен ностн пищевых продуктов конкретными видами микроорганизмов, особенностях биологических свойств возбудителей, наличии у них факторов патогекности, характере их взаимодействия с макроорганизмом, что позволяет оценить степень наносимого ими вреда для здоровья человека [Buchanan R.L., 2000; Lammerding A.M., Fasil A., 2000J.

Исходя из вышеизложенного* была определена цель исследования: оценить риск загрязненности пищевых продуктов бактериями рода Campylobacter.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:1. Адаптировать имеющиеся в международной практике кулыуральиые методы обнаружения бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах и разработать доступный для практических исследований метод выявления и количественного определения бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах.

2. Изучить распространенность н количественное содержание бактерий рода Campylobacter в мясе птниы н птицепродуктах (сырых и готовых у употреблению), сыром коровьем молоке.

3. Изучить видовые характеристики выделенных из пищевых продуктов штаммов Campylobacter spp., наличие у них маркеров антибиотикорезнстектностн и факторов патогенности.

4. В экспериментах на животных с пероральным введением бактерий рола Campylobacter изучить степень их вредного воздействия на макроорганизм в зависимости от дозы и биологических свойств возбудителя.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫВпервые в нашей стране получены данные по частоте загрязнения и количественному содержанию бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах массового потребления. Установлено широкое распространение Campylobacter spp. в птицепродуктах куриных сырых (37%) прн невысоком количественном содержании (от4 до 1100 KOE/lOOr, медиана - 15 KOE/lOOr, 90% - 240 КОЕ/1 ООг), Показано отсутствие кампнлобактсрий в пищевых продуктах, готовых к употреблению, в той числе, упакованных в пленочные оболочки к модифицированную газовую атмосферу, а также изготовленных в мелкорозничных предприятиях сети общественного питании быстрого обслуживания (салаты многокомпонентные с добавлением мяса птицы, куры - гриль, шаурма).

Установлено доминирование термофильного вида Campylobacter jejuni в птице продуктах куриных сырых.

Впервые охарактеризованы биологические особенности Campylobacter jejuni, выделенных нз пищевых продуктов. Установлено, что все штаммы обладали устойчивостью к антимикробному препарату группы фторхинолоиов (цннрофлоксацнну). СочетанноЙ устойчивостью к двум и более антибактериальным препаратам обладали 90% штаммов.

Впервые обнаружена способность штаммов Campylobacter jejuni, выделенных из замороженных птицепродуктов, чаще (в 74%) формировать при культивировании морфологически измененные формы колоний (R-формы),Обнаружено существенное (а 10 раз) снижение количества жизнеспособных клеток Campylobacter spp. а процессе морозильного хранения в течение 3 недель и более. Установлено, что в пробах мяса и полуфабрикатов птицы, полученных из торговой сети и после манипуляций в быту (оттанванне, нарезка и повторное замораживание), частотаобнаружения Campylobacter spp. была а 2-4 раза ниже, чем в пробах, отобранных после окончания технологического процесса.

Установлено, что штаммы Campylobacter jejuni, выделенные hi пищевых продуктов, находящихся в обороте, способны при пероральном введении обусловливать развитие кишечной инфекции у здоровых взрослых лабораторных животных (белых мышей).

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ И ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВРазработаны методические указания «Методы выявления н определения бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах». М: Роспотрсбнадэор, 2007 (в печати) Методические указания могут использоваться для исследования пищевых продуктов на соответствие требованиям безопасности, при расследовании вспышек пищевых отравлений и инфекций с пищевым путем передачи, а также при производственном контроле.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫРезультаты работы доложены на Восьмом всероссийском конгрессе «Оптимальное питание - здоровье нации»» (Москва, 2005) и I Всероссийском съезде диетологов и нутрицнологов «Диетология: проблемы и горизонты» (Москва, 2006), межлабораторной конференции ГУ НИИ питания РАМН (Москва, 2006).

ПУБЛИКАЦИИПо результатам работы опу бликовано 8 научных работ, вт,ч, 2 статьи в научном журнале, определенном ВАК Мннобрнаукн РФ,

4. ВЫВОДЫ.

1. Разработан метол выявления и количественного определения Campylobacter spp. в пищевых продуктах, основанный на селективном обогащении в жидких питательных средах с последующим пересевом на поверхность твердых селективных сред, гармонизированных по составу питательным средам, используемым в международной практике (ISO 10272), мнкроаэрофнльном инкубировании посевов н определении количества по методу наиболее вероятного числа Чувствительность метода составляет 0,04 КОЕ/г продукта (отсутствие в 25 г).

2. Впервые проведен анализ частоты обнаружения н количественного содержания бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах массового потребления (ггпшепродукты куриные сырые; молоко коровье, сырое; готовые к употреблению мясо- и птнцепродукты промышленного производства; блюда общественного питания). Кампилобактернй обнаружены в 37% проб птицепродуктов сырых с уровнем обсемененностн от 4 КОЕ/ЮОг до 1100 КОЕНООг (медиана - 15 КОЕ/ЮОг, 90% - 240 КОЕЛООг). В готовых к употреблению пищевых продуктах нз (или с добавлением) мяса птицы, прошедших кулинарную или промышленную обработку, в том числе упакованных в модифицированную газовую атмосферу, бактерии рода Campylobacter не обнаружены,

3. Установлена высокая частота контаминации бактериями рода Campylobacter мяса и полуфабрикатов птнцьт, поступающих по импорту нз стран СНГ (93% проб); обсемененность аналогичной продукции отечественного производства не превышала 46%. Распространенность Campylobacter spp. в птнцепродуктах снижалась в 2 - 4 раза в процессе оборота в торговой сети и после манипуляций в быту (размораживание, нарезка). Кампнлобактерин чаще (а 41%) выделялись из птицепродуктов охлажденных, с уровнем обсеменеиности от IS до 1J00 КОЕЛООг (медиана 43 KOE/lOOr, 90% - 160 КОЕ/г), чем из замороженных (в 33%) с уровнем обсемсненности от 4 до 1100 КОЕ/ЮОг (медиана 9 КОЕЛООг, 90% - 460 КОЕ/г), Обнаружено существенное (в 10 раз) снижение количества жизнеспособных клеток Campylobacter spp. в процессе морозильного хранения в течение 3 недель.

4. Обнаружено, что все штаммы бактерий рода Campylobacter, выделенные из изученных птнцепродуктов, принадлежали к термофильному виду Campylobacter jejuni.

5. Впервые изучены биологические особенности Campylobacter jejuni, выделенных из пищевых продуктов. Установлено, что 95% штаммов обладали устойчивостью к антимикробному препарату группы фторхннолонов (цкпрофлоксаинну). Сочетай ной устойчивостью к двум н более антибактериальным препаратам обладали 90% штаммов. Обнаружено, что штаммы Campylobacter jejuni, выделенные из замороженных птнцепродуктов. чаще (в 74%) формировали при культивировании морфологически измененные формы колоний (R-формы), что свидетельствуете поттуляннонной изменчивости кампилобактерий.

6. Campylobacter jejuni, выделенные нз пищевых продуктов, способны обусловливать развитие кишечной инфекции у лабораторных животных (белы* мышей). Более выраженной патогенностью по сравнению с антибиотикочувствнтельным обладал актнбнотнкорсзнстснтный штамм. Минимальные концентрации, обусловливающие развитие днарейного синдрома, для антибиотикоустойчнвого штамма составляли 1x10* КОЕ (у 60% животных), для антибиотнкочувствительного 1x10* КОЕ (у 20% животных) при наличии достоверных различий в интенсивности нммуного ответа, продолжительности интоксикации, диареи и кишечной колонизации.

IIS