Автореферат и диссертация по медицине (14.02.01) на тему:ПЦР-диагностика контаминации пищевых продуктов бактериями рода Campylobacter и кампилобактериоза у людей

На правах рукописи

005013807

БУЛАХОВ АНТОН ВАЛЕРЬЕВИЧ

ПЦР-ДИАГНОСТИКА КОНТАМИНАЦИИ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ БАКТЕРИЯМИ РОДА CAMPYLOBACTER И КАМПИЛОБАКТЕРИОЗА

У ЛЮДЕЙ

14.02.01 - Гигиена

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 ид? Ш

Москва-2012

Работа выполнена в лаборатории санитарно-пищевой микробиологии и микроэкологии ФГБУ «НИИ питания» Российской академии медицинских наук.

Научные руководители: Доктор медицинских наук

Шевелёва Светлана Анатольевна

Доктор медицинских наук, профессор

Исаков Василий Андреевич

Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ Кандидат биологических наук, доцент

Трухина Галина Михайловна Иванова Людмила Викторовна

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Защита состоится «22» марта 2012 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д.208.133.01 при ФГБУ «Научно-исследовательский институт экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина» Минздравсоцразвития России по адресу: ГСП-119992, г. Москва, ул. Погодинская, д. 10/15, строение 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научно-исследовательский институт экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина» Минздравсоцразвития России Автореферат разослан «20» февраля 2012 года

Учёный секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

Острую кишечную инфекцию кампилобактериоз, обусловленную термофильными представителями рода Campylobacter, сегодня повсеместно расценивают как одну из ведущих проблем здравоохранения со значительными социально-экономическими последствиями. Главными источниками причинного агента при ней являются пищевые продукты, получаемые от продуктивного скота и птицы, особенно от бройлерных кур, выращиваемых путём интенсивного откорма [Шурышева Ж.Н., 2007; Hara-Kudo Y„ et al. 2010, Wilson D.J., 2008; de Jong A.E., 2008]. В EC кампилобактериоз отнесен к самым распространённым заболеваниям среди зоонозов с числом случаев 45,6 на 100000 населения [EFSA, 2005,2009]. Подобная ситуация имеет место в США, где более чем в половине штатов показатели заболеваемости кампилобакте-риозом в 1,5-2 раза превышает таковые при сальмонеллёзе [CDC, 2005, 2008, 2010]. Повсеместный поступательный рост потребления мяса птицы в общем объёме потребляемых мясопродуктов соответственно всё более повышает и риск заражения потребителей ОКИ кампилобактериозной природы.

В нашей стране более чем за 20 лет с начала регистрации кампилобактериоза как самостоятельной нозологической формы число зафиксированных случаев в общей сумме ОКИ у населения остаётся минимальным (не более 0,3%). В то же время, доля ОКИ от неустановленных возбудителей на протяжении этих лет практически не снижалась, составляя 70-75% [Роспотребнадзор, 2006-2010], что свидетельствует о неотложности усовершенствования лабораторной диагностики.

Традиционные методы посева для определения трудно культивируемых по природе Campylobacter spp. не позволяют быстро осуществлять лабораторную диагностику инфекции, а также оценивать загрязнённость возбудителем пищевых продуктов при расследовании вспышек. В клинической практике, где стала весьма актуальной проблема дифференциальной лабораторной диагностики хронического кампилобактериоза от синдрома раздражённого кишечника, также резко возросла потребность в новых некультуральных методиках анализа Campylobacter spp. [Молочный В.П., Шипулин Г.А., 2007; Лучшев В.И., Жаров С.Н., 2007; Al Amri A., et al., 2007; Bessede Е., Delcamp А., 2011].

Кроме того, важнейшим условием предупреждения кампилобактериоза является надёжный лабораторный контроль эффективности мер биобезопасности в основном источнике данного патогена - на птицеперерабатывающих предприятиях, который должен базироваться на адекватных для его осуществления методах с высокой чувствительностью, воспроизводимостью, скоростью и минимальной трудоёмкостью [Кафтырева Л.А.,1999, Покровский В.И. и др., 2009, Гущин В.В.,2009, 2010, EFSA, 2010].

Основой таких методов должен служить современный молекулярно-генетический анализ, который позволяет максимально специфично проводить определение возбудителя в пище и клиническом материале, идентификацию видовой принадлежности, факторов патогенности, типирование изолятов по характеристике нуклеиновых кислот. Учитывая преимущества в плане доступности приборной базы, отечественных тест-систем, низкой себестоимости анализа, задачам практической микробиологии в наибольшей степени удовлетворяет технология ПЦР с гибридизацион-но-флюоресцентной детекцией в реальном времени (ПЦР-РВ). Этот формат, наряду с контаминационной безопасностью, имеет реальный потенциал для автоматизации и для оценки жизнеспособности анализируемых микробов [Тартаковский И.С., 2002; Josefsen М.Н., et al„ 2004; Pitkänen Т., et al., 2009; Lübeck M., et al., 2010; Шипулин Г.А., 2010; Jacobsen N.R, et al., 2011].

Внедрение методов ПЦР позволит наладить мониторинг загрязненности пищевых продуктов кампилобактериями, своевременно выявлять критические в плане контаминации этим патогеном этапы в пищевой цепи и в процессе технологии, повысить эффективность диагностики кампилобактериоза. В перспективе это даст возможность для реализации одной из задач ОМР - подтверждения связи между потреблением инфицированных Campylobacter spp. продуктов и степенью риска отдалённых отрицательных последствий инфекции для здоровья, в т.ч. в виде гастроэнтерологических и неврологических осложнений, разработке мер для их направленной профилактики и минимизации [Lindqvist R., Lindblad М., 2008; FAO/WHO, 2009].

В то же время, обеспечить воспроизводимость и эффективность методики без исследований по адаптации выбранных тест-систем к условиям практических лабораторий, разработки адекватных приёмов пробоподготовки пищевых продуктов и биоматериалов, экстракции ДНК, способов подтверждения жизнеспособности возбудителя, а также стандартизации всей процедуры по отношению к действующим методам бактериологического анализа невозможно.

Перечисленный круг нерешенных вопросов определил актуальность и составил цель и задачи настоящей работы.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящей работы являлось усовершенствование подходов к анализу загрязнённости пищевых продуктов бактериями рода Campylobacter и к лабораторной диагностике кампилобактериоза у больных кишечными инфекциями. Для реализации данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Адаптировать метод ПЦР в реальном времени с гибридизационно-флуоресцентной детекцией для определения термофильных кампилобактерий в пищевых продуктах и биоматериале от больных кампилобактериозом.

2. Изучить загрязнённость кампилобактериями различных пищевых продуктов методом ПЦР-РВ.

3. При использовании метода ПЦР-РВ оценить влияние на показатели загрязнённости птицепродуктов кампилобактериями различных технологических факторов.

4. Провести лабораторную диагностику с использованием метода ПЦР-РВ наличия возбудителей кампилобактериоза в биоматериале от больных острым кам-пилобактериозом и от лиц с синдромом раздражённого кишечника.

5. Изучить генетические детерминанты факторов патогенности у штаммов кам-пилобактерий, выделенных из пищевых продуктов и от больных кампилобак-териозом.

НАУЧНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Оптимизация процедур пробоподготовки и обогащения материала позволит использовать метод ПЦР в режиме реального времени с гибридизационно-флуоресцентной детекцией с тест-системами, предназначенными для анализа изолированных штаммов Campylobacter spp., для прямого определения возбудителя в пищевых продуктах и биоматериале без потерь чувствительности, специфичности и скорости выполнения.

2. Методика парных проб исследуемых образцов (подвергнутого и неподвергнутого обогащению) обеспечивает подтверждение жизнеспособности искомых Campylobacter spp. в режиме реального времени без выделения чистой культуры из пищевого продукта и биоматериала.

3. ПЦР-анализ в формате реального времени улучшает эффективность контроля контаминации птицепродуктов трудно культивируемым возбудителем кампилобактериоза по сравнению с бактериологическим посевом.

4. Использование ПЦР в реальном времени и предложенного алгоритма отбора и подготовки биоматериала повышает раскрываемость острого кампилобактериоза при острых кишечных инфекциях.

5. Метод ПЦР в режиме реального времени увеличивает возможности дифференциальной лабораторной диагностики хронического кампилобактериоза у больных СРК и глубокими нарушениями кишечной микрофлоры.

6. Сопоставление генетических детерминант патогенности у Campylobacter spp., выделенных от больных ОКИ и из пищевых продуктов, может рассматриваться как подход для оценки потенциальной патогенности штаммов, контаминирующих пищу.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Впервые в России проведена адаптация метода ПЦР в реальном времени с гиб-ридизационно-флуоресцентной детекцией для целей выявления возбудителя кампи-

лобактериоза в пищевых продуктах и в фекалиях от больных и его стандартизация относительно утверждённого метода бакпосева. Установлен предел обнаружения на уровне 1 КОЕ/25г.

В экспериментах с чистыми культурами и искусственно контаминнрованными образцами птицепродуктов оценена чувствительность и специфичность экспресс-методов определения бактерий рода Campylobacter основанных на технологии ПЦР и ИФА. Показана большая чувствительность метода ПЦР в реальном времени с использованием тест-систем «.Aummctuo-Campylobacter spp.» в сравнении с другими методами.

Экспериментально обоснован новый подход для подтверждения жизнеспособности обнаруженных в ПЦР кампилобактерий с использованием формата ПЦР-РВ с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в процессе амплификации, основанный на различиях в достижении порога детекции ДНК-мишени в парных пробах, подвергнутых и не подвернутых обогащению, и не требующий изоляции чистой культуры.

Впервые изучено влияние технологических факторов на выживаемость кампилобактерий в контаминированных птицепродуктах. Установлено, что замораживание не обеспечивает деконтаминацию мяса птицы от возбудителя кампилобактериоза, а использование погружного способа охлаждения тушек кур способствует повышению частоты обнаружения кампилобактерий в среднем 2,7 раза по сравнению с другими способами.

Предложенный алгоритм пробоподготовки и анализа путём ПЦР в реальном времени с гибридизационно-флуоресцентной детекцией с использованием тест-системы «Амплисенс-Campylobacter spp.» позволил повысить результативность лабораторной диагностики острого кампилобактериоза у больных с ОКИ в 2,5 раза по сравнению с бакпосевом.

Впервые в России обнаружено наличие Campylobacter spp. у больных синдромом раздраженного кишечника с диареей, установлено носительство возбудителя кампилобактериоза у лиц, не имеющих манифестаций острой кишечной инфекции.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Разработаны алгоритмы и методики прямого определения Campylobacter spp. в пищевых продуктах и биоматериале от больных, на основе метода ПЦР в реальном времени с гибридизационно-флуоресцентной детекцией, с использованием отечественных тест-систем и доступных в практике приборов, позволившие повысить точность и результативность обнаружения возбудителей кампилобактериоза в указанных объектах. Утверждены методические рекомендации MP № 02.036-08 «Идентификация патогенных бактерий, выделенных при контроле пищевых продуктов, с применением

системы ВАХ® System Q7», Методические указания МУК 4.2.2872-11 «Методы выявления и идентификации патогенных бактерий-возбудителей инфекционных заболеваний с пищевым путём передачи в продуктах питания на основе ПЦР с гибридиза-ционно - флуоресцентной детекцией», Санитарно-эпидемиологические правила СП 3.1.7.2816 - 2010 «Профилактика кампилобактериоза среди людей», Методические указания МУК 4.2.2878-11 «Дополнения и изменения №1 к Методическим указаниям МУК 4.2.2321-08 «Методы определения бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах».

Результаты исследования позволяют усовершенствовать анализ пищевых продуктов и биоматериала на наличие возбудителя кампилобактериоза и проводить адекватную оценку загрязнённости кампилобактериями пищевых продуктов, экспресс-диагностику кампилобактериоза у людей и мониторинг последствий перенесённого кампилобактериоза.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на 7-й всероссийской конференции «Молекулярная диагностика-2010» (Москва, 2010 г), Ежегодной конференции молодых ученых ФГБУ «НИИ питания» РАМН» (Москва, 2009 г.), XII и XIII Всероссийских конгрессах диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье» (Москва, 2010 г.) и «Персонифицированная диетология: настоящее и будущее» (Москва, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 4 в ведущих рецензируемых журналах, определенных высшей аттестационной комиссией Минобрнауки РФ, 4 методических указания, санитарные правила и нормы.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, обоснования цели и выбора метода исследования, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, включает 20 таблиц и 8 рисунков и диаграмм. Список литературы содержит 38 отечественных и 239 зарубежных источников.

Личный вклад диссертанта.

Основная часть исследований выполнена лично автором.

Теоретические и экспериментальные исследования выполнялись автором в ФГБУ «НИИ питания» РАМН в рамках программ и планов НИР №№ 095, 115. При выполнении разделов по адаптации метода ПЦР-РВ для прямого определения Сат-

pylobacter spp. в пищевых продуктах, идентификации генов патогенности у штаммов, изолированных из пищевых продуктов и из фекалий больных ОКИ, изучению влияния технологий охлаждения птицы на контаминацию Campylobacter spp. автор пользовался консультациями к.б.н. А.Т. Подколзина (ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора РФ), д.б.н., проф. С.А.Ермолаевой (ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалея Минздравсоцразвития России), к.в.н. Козака С.С. (ГНУ ВНИИПП РАСХН). Первичную подготовку биоматериалов от больных, а также анализ данных анамнеза автор проводил совместно с Бурляевой Е.А. (Клиника лечебного питания ФГБУ «НИИ питания» РАМН), к.м.н. Литвиновой О.С, д.м.н., проф. Лучшевым В.И. (ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н. И. Пирогова Минздравсоцразвития России).

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследований

Работа проводилась в лаборатории санитарно-пищевой микробиологии и микроэкологии ФГБУ «НИИ питания» РАМН (зав.лаб., д.м.н. С.А.Шевелёва). Для исследования использовали:

1. Пищевые продукты с наибольшим риском контаминации Campylobacter spp., в т.ч.: птицепродукты (мясо куриное охлажденное и замороженное, печень куриная охлаждённая и замороженная), мясо и полуфабрикаты куриные, говяжьи, свиные охлажденные, рыба филе охлаждённая, молоко сырое, готовые блюда (салаты с добавлением куриного мяса). Исследовано 146 образцов пищевых продуктов, полученных из торговой сети г. Москвы, птицефабрик Центрального региона России, фермерских хозяйств Московской области.

2. Искусственно контаминированные C.jejuni образцы куриного мяса, предварительно проанализированные на отсутствие ТКБ. Исследовано 20 образцов.

3. Материал от больных ОКИ и синдромом раздражённого кишечника (СРК), в т.ч. фекалии и ректальные мазки1. Исследовано 154 образца биоматериала, полученного от больных из Клиники лечебного питания ФГБУ «НИИ питания» РАМН и инфекционной клинической больницы №3 г. Москвы.

Перед исследованием образцы пищевых продуктов измельчали в перистальтическом гомогенизаторе.

Фекалии и ректальные мазки больных ОКИ и СРК отбирали после поступления в клинику до приёма антимикробных препаратов, в контейнеры со средой Керри-Блэр, доставку производили в сумке-холодильнике. Материал исследовали в течение 2 ч после доставки в лабораторию.

Суспензии с известными концентрациями клеток C.jejuni готовили из суточных агаровых культур по оптическому стандарту мутности. Использовали штаммы

1 Согласно разрешению этического комитета НИИ питания РАМН.

8

C.jejuni ssp. jejuni 1 (№77, K40, K41), Cjejuni ssp. jejuni 2 (№38, K53), С jejuni ssp. doyley (№63), полученные в ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора и ФГУ ВГНКИ, а также из коллекции лаборатории. Исследовано 61 образец в трёхкратной повторно-сти.

Определение бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах проводили куль-туральным, иммунологическим и молекулярно-генетическим методом с использованием ПНР; в материале от больных - культуральным методом и методом ПЦР.

Определение культуральным методом осуществляли по МУК 4.2.2321-08 путём посева навески продукта в 10-кратный объём бульона обогащения Престон и инкубации в микроаэробной атмосфере при температуре 42°С, с последующим высевом на агаризованные среды и идентификацией выросших колоний по физиолого-биохимическим признакам, в т.ч. с тест-панелями API Campy (BioMerieux, Франция).

Определение ТКБ в пищевых продуктах с помощью фермент-связанного им-мунофлуоресцентного анализа (ФС-ИФА) проводили после обогащения в бульоне Престон при описанном выше режиме. Для анализа отбирали 1-2 мл бульона и исследовали на приборе MiniVidas® с тест-системой «VIDAS®Cam» (BioMerieux, Франция). Анализ и интерпретация результатов выполняется прибором автоматически.

Экстракцию ДНК из культуральных жидкостей, микробных суспензий, копро-фильтратов проводили методами нуклеосорбции (набор для экстракции «ДНК-сорб Б» ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, экстрактор "EasyMag", BioMerieux, Франция) и преципитации (набор для экстракции «ДНК-преп», ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзо-ра).

Определение ТКБ путём ПЦР в реальном времени проводили с использованием 2-х форматов: с флуоресцентно-мечеными зондами и с интеркалирующими красителями. Амплификация и детекция в формате ПЦР-ИК проводили на приборе BAX®Q7 Qualicon (DuPont, США) с использованием наборов реагентов «BAX®System Campylobacter» (DuPont), анализ и интерпретация результатов - с помощью программного обеспечения BAX®Q7.

Амплификацию и детекцию в формате ПЦР-ФЗ осуществляли с помощью ДНК-амплификатора Rotor-Gene 6000 (CorbettResearch, Австралия), с использованием тест-систем «АмплиСенс® Campylobacter spp.-FL» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Мишенями в ПЦР-ФЗ служили последовательность 23S РНК, для определения Campylobacter spp. и искусственно синтезированная последовательность ДНК, используемая для контроля этапов экстракции и амплификации.

При анализе Campylobacter spp. в фекалиях больных культуральным методом производили как непосредственный высев материала на плотные среды, так и предварительное обогащение в бульоне Престон с последующим высевом на агаризованные среды. Для ПЦР-анализа использовали копрофильтраты и бульоны обогащения, из которых выделяли общую ДНК.

Копрофильтраты получали путём ресуспендирования фекалии в ЗФР с последующим осаждением центрифугированием при максимальных оборотах (10-12 тыс. об./мин). После осаждения отбирали верхнюю часть осадка (бактериальную фракцию) и ресуспендировали в ЗФР.

Для исследования генетических детерминант патогенности были отобраны штаммы Campylobacter из пищевых продуктов и от больных ОКИ. Экстракцию ДНК осуществляли в автоматическом экстракторе из суспензии суточных культур в ЗФР плотностью 105 КОЕ/г по оптическому стандарту мутности.

ПЦР смесь содержала 0,8 мкМ каждого праймера, 1 ед. TaqF ДНК-полимеразы, 5х ПЦР-буфера Blue (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) и деионизированной воды. Общий объём реакционной смеси составлял 25 мкл, в том числе 1 мкл экстракта ДНК образца. Состав ПЦР праймеров и условия амплификации представлен в табл 1 [по Talukder et al., 2008; Fearnley et al., 2008; Bang, et al., 2003].

Таблица 1.

Состав ПЦР праймеров и условия амплификации для обнаружения факторов

патогенности у ТКБ

Праймер Последовательность 5' —» 3' Целевой ген Условия амплификации

VirBF GAACAGGAAGTGGAAAAACTAGC VirBll 94C -4", 51С-4", 72C-4"

VirBR TTCCGCATTGGGCTATATG

VirB8 FWD GCCATTACTTTTCTTGCCCC VirB8 94C- 4", 50C - 4", 72C -4"

VirB8 REV CGCTCCTTTCGTTTGTTGTG

virB9 FWD GTTCCTAACCCTAATGCAAAC VirB9 94C-4",58C-4",72C-4"

virB9 REV CTACACATACATAACTATCTCC

GNW GGAAATTGGATTTGGGGCTATACT CdtA 94C -2", 51C-2", 72C-2"

IVH ATCACAAGGATAATGGACAAT

VAT2 GTTAAAATCCCCTGCTATCAACCA CdtB 94C-2", 51C -2", 72C-2"

WMI-R GTTGGCACTTGGAATTTGCAAGGC

WMI-F TGGATGATAGCAGGGGATTTTAAC CdtC 94C- 2", 51C- 2", 72C-2"

LPF-X TTGCACATAACCAAAAGGAAG

Денатурацию проводили при 95°С 15 мин, далее следовало 30 циклов амплификации на амплификаторе Терцик (ДНК-Технология, Россия) при указанных в табл.1 условиях. По окончании - 1-минутный этап элонгации при 72°С. Разделение продуктов амплификации проводили в 0,1% агарозном геле с ТБЕ-буфером и этидием бромидом. Условия фореза - 120 В, 80-100 мА в течение 25-30 мин. Для учёта результатов амплификации использовали камеру для документирования электрофореза (ДНК-Технология, Россия) с программным обеспечением «Gel Imager».

Для статистической обработки были использованы методы описательной статистики (среднее значение, стандартное отклонение, стандартная ошибка среднего, медиана, максимум, минимум). Значимость расхождения результатов оценивали по критерию Стьюдента.

Результаты исследований

Выбор и адаптация экспресс-метода для определения термофильных кам-пилобактерий в пищевых продуктах и биоматериале от больных кампилобакте-риозом. Для выбора наиболее эффективного метода определения труднокультиви-руемых ТКБ альтернативного бактериологическому посеву, протестирован ряд экспресс-методик, основанных на различных технологиях ПЦР и ИФА. В экспериментах с заданными концентрациями от 1 до Ю9КОЕ/см3 чистых культур С jejuni ssp jejuni и С jejuni ssp. doiley, выделенных из пищевых продуктов, сравнены показатели селективности (специфичности), открываемости (чувствительности) фермент-связанного флуоресцентного анализа (с использованием тест-систем и автоматического анализатора VIDAS) и 2-х форматов ПЦР в реальном времени с гибридизационно-флюоресцентной детекцией: с использованием интеркалирующих красителей (с тест-системами BAX®Q7) и флуоресцентно-меченых зондов (с тест-системами «Ампли-Сенс®Campylobacter spp.-FL»), Обобщённые данные представлены в табл.2. Показано, что при плотности культур 105 КОЕ/см3 и более все три испытанных метода характеризовались 100%-й родовой специфичностью и 100%-й открываемостью. Со снижением уровней ТКБ открываемость убывала в ряду ПЦР-ФЗ > ПЦР-ИК > ФС-ИФА.

Присутствие посторонних грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов (8 штаммов, относящихся к 5 родам) в концентрациях 107 КОЕ/мл на специфичность анализа не влияло (не было получено ни одного ложноположительного результата), но чувствительность обнаружения ТКБ при этом снижалась до 104 и 105 и более КОЕ/см3 в ПЦР-ФЗ и ФС-ИФА, соответственно.

Специфичность видового анализа в ПЦР, оцененная по способности открывать вид С jejuni, в формате ПЦР-ФЗ была 100%-й при всех дозах заражения, а в ПЦР-ИК в 2-х случаях из 25 культура С jejuni была неверно идентифицирована как С.coli.

Таким образом, ПЦР-ФЗ показала наиболее приемлемые результаты по всем изучаемым параметрам и была выбрана для дальнейшей работы в качестве основного метода. Поскольку стабильная детекция в ПЦР имела место при количестве ТКБ 105 и более КОЕ в 1 см3, признано необходимым подращивание образцов в бульонах, содержащих неблагоприятные для посторонней микрофлоры селективные агенты.

Таблица 2.

Частота обнаружения С/'е/иш' в суспензиях чистых культур тремя методами

Вид детекции Уровень С/е/ыя/, КОЕ/см3 ПЦР-ФЗ ПЦР-ИК ФС-ИФА

Число проб % положительных Число проб % положительных Число проб % положительных

Родовая идентификация ДоЮ3 17 94,1 7 14,2 5 0

104 20 100 9 66,7 9 11,1

105 и более 60 100 18 100 20 100

В том числе на фоне посторонней микробной контаминации ДоЮ3 6 0 нд нд 0 0

104 6 100 нд нд 3 0

105 и более 6 100 нд нд 9 66,7

Всего 115 93,9 34 73,5 46 58,7

Видовая идентификация До 103 16 100 1 0 * *

104 20 100 6 100 * *

105 и более 60 100 18 94,4 * *

Всего 96 100 25 92 * *

*) методикой не предусмотрена, НД) исследование не проводилось.

Изучение влияние субстрата и способа экстракции ДНК на выявление ТКБ. Для оценки вероятного ингибирования формата ПЦР-ФЗ компонентами субстратов при определении ТКБ сопоставлены результаты анализа образцов ДНК С/е/кш, предварительно вносимой в среду обогащения Престон, в бактериальные суспензии на основе ЗФР, нативные фекалии от больных. Установлено, что селективные компоненты бульона не ингибируют ПЦР, поскольку среднее значение цикла, на котором интенсивность флуоресценции превышала пороговое значение (СО, для экстрактов из бульона была достоверно ниже, чем для не содержащей ингибиторов суспензии ТКБ (29,1±0,2 уб. 30±0,2), и также для фекалий. В то же время, О контрольного образца было значимо меньшим, чем у всех испытанных субстратов (Р < 0,05), что свидетельствует о потерях ДНК во время экстракции и указывает на целесообразность предобо-гащения всех типов анализируемых образцов для повышения эффективности ПЦР.

Оценка жизнеспособности культуры при помощи ПЦР-РВ. Для ускорения выдачи ответа и ухода от культуральных процедур подтверждения жизнеспособности ТКБ при ДНК-анализе предложен подход с использованием для этой цели формата ПЦР-РВ с гибридизационно-флуоресцентной детекцией, позволяющего проводить количественную оценку ДНК-мишени в процессе амплификации. Выбор такого подхода был обоснован возможностью установить разницу в уровнях накопления ампли-конов при исследовании обогащаемых проб, содержащих живые и неживые бактерии.

1д[К0Е/мл]

Рисунок 1. Влияние количества С.jejuni в пробах на значение Ct.

Из рис.1 видно, что в диапазоне положительных значений Ct меняется в среднем на 2,3±0,2 ед. при нарастании числа клеток в суспензии С jejuni на 1 lg-порядок. Значит, изменение Ct до и после обогащения патогена в бульоне и более быстрое достижение порога детекции может быть связано только с его размножением, присущим лишь живым клеткам. Соответственно, бактерии, не способные к размножению, после этапа обогащения будут достигать порога детекции при одинаковых значениях Ct. Для подтверждения исследованы образцы мяса птицы, искусственно контаминиро-ванные известными количествами С jejuni, каждый из которых разделяли на парные пробы одинакового размера после инокуляции в среду Престон и помещали в разные условия перед проведением ПЦР: пробу №1 в инкубатор с оптимальными для роста ТКБ параметрами (í=42°C в микроаэробной атмосфере 24 ч), а пробу №2 - в морозильник, где биологическое накопление искомых бактерий невозможно (t =-20±2°С, хранение также 24 ч). По окончании

инкубации экстракцию ДНК из парных проб проводили одновременно. Из табл.3 видно, что среднее значение ACt между парными образцами при всех уровнях заражения живыми ТКБ составляло 11,7±1,6 цикла, минимальная разница (2,1 цикла) зафиксирована при уровне ТКБ 109 КОЕ/г.

Очевидно, что данное наименьшее значение в ряду полученных величин ACt обусловлено замедлением размножения при максимально достижимой в естественных условиях плотности клеток в жидкой среде (109 КОЕ/г). Так как наибольшая ACt между образцами, где ТКБ не размножались совсем (фон - замороженные), составило близкую величину 1,7 цикла, за ACt, подтверждающую наличие жизнеспособного возбудителя, принята разница в 3 и более пороговых цикла, установленная в парных пробах с контаминацией 108 и меньше КОЕ/г.

Таблица 3.

Значения О в образцах, исследованных методом парных проб, при

контаминации различными количествами кампилобактерий

Кол-во ТКБ в образце, КОЕ/г Число образцов Фоновое значение а Значение О в ПЦР-РВ (М±т)

Инкубированный образец ДО инку-бир.- фон Замороженный образец Да замор.- фон ДСЧ замор. -инкубир

<1 3 >33 20,8±0,5 12,2±0,5 >33 0 >12,2*

1 3 31,8±0,5 18,8±0,5 13,0±1,0 32,7±0,3 -0,9±0,8 -13,9±0,8*

10 3 29,1 ±0,5 15,3±0,4 13,8±0,9 30,3±0,4 -1,2±0,9 -15,0±0,8*

10* 3 28,2±0,4 13,1±0,3 15,1 ±0,7 28,1±0,4 0,1±0,8 -15,0±0,7*

103 3 27,1±0,6 12,3±0,6 14,8±1,2 28,3±0,3 -1,2±0,9 -16,0±0,9*

104 3 26±0,2 10,0±0,4 16,0±0,6 25,9±0,2 0,1 ±0,4 -15,9±0,6*

105 3 25±0,4 11,4±0,3 13,6±0,7 25,4±0,3 -0,4±0,7 -14,0±0,6*

10" 3 22,7±0,3 10,3±0,4 12,4±0,7 23,2±0,2 -0,5±0,5 -12,9±0,6*

10' 3 19,6±0,8 12,9±0,6 6,7±1,2 20,0±0,6 -0,40±1,4 -7,1±1,2*

108 3 12,4±0,9 9,5±1,5 2,9±2,4 14,1 ±0,7 -1,7±1,6 -4,6±2,1*

10» 3 12±0,9 11,1±0,8 0,9±1,7 13,2±0,7 -1,2±1,6 -2,1±1,5

Мер 12±1,4 ±0,65±0,2 -11,7±1,6

ок 3 >33 >33 >33 >33 >33 >33

*) - различия ДО замор./инкубир. достоверны.

Оценка эффективности метода ПЦР-ФЗ в сравнении с традиционным методом бактериологического посева

Для характеристики предела обнаружения ТКБ в пищевых продуктах в выбранном формате ПЦР-РВ проведено его сопоставление с официально утверждённым методом бактериологического посева на экспериментально зараженных низкими дозами С.]е]ит и на естественно контаминированных образцах мяса птицы после обогащения. Из табл.4 видно, что при заражении мяса единичными клетками частота обнаружения ТКБ обоими методами одинакова, достигая 85%. Но далее в диапазоне уровней от 10 до 103 КОЕ/г эффективность ПЦР была выше, чем у традиционного метода и составляла 100%.

Таблица 4.

Частота обнаружения С/е/нш в экспериментально контаминированных образцах пищевых продуктов методом ПЦР и бакпосева

Заражающая доза, КОЕ/г Исследовано проб Баклосев ПЦР-РВ

Число проб с обнаруженными С/е/ии; %% Число проб с обнаруженными С/е/иш' %%

1-9 7 6 85,7 6 85,7

10-99 7 6 85,7 7 100

102-103 6 5 83,3 6 100

В мясе птицы из торговой сети определяли количество ТКБ, подвергая образцы обогащению по методу НВЧ (табл.5). Хотя выявленные уровни ТКБ были невысокими (что вполне отражает реальную повсеместную ситуацию с загрязнённостью данным патогеном), показатели КОЕ/г и доля контаминированных тушек в выборке при определении путём ПЦР были выше, чем в бакпосеве, подтверждая большую эффективность некультурального метода ПЦР-ФЗ по сравнению с традиционным. Таким образом, нижний предел для прямого определения бактерий рода Campylobacter установлен на уровне 1-10 КОЕ/г. Помимо этого метод ПЦР-РВ обеспечивает в 5 раз более высокую скорость определения, чем бакпосев.

Таблица 5.

Показатели загрязнённости естественно контаминированных образцов, КОЕ/г

продукта

Методика Число об- % обнару- Min - Мах Мер Me

разцов жения

Бакпосев 61 50,8 0-550 15 0,5

ПЦР 61 59 0-550 45 5

Оптимизация способа пробоподготовки фекалий к анализу методом ПЦР

Оптимизирована пробоподготовка биоматериала от больных для определения ТКБ путём использования ректальных мазков для забора материала, среды со сниженным ЕЬ для транспортировки, подращивания в бульоне Престон для накопления возбудителя.

В результате данного этапа работы предложена схема экспресс-метода ПЦР-РВ для определения возбудителей кампилобактериоза в пищевых продуктах и биоматериале от больных, включающая в себя возможность одновременного подтверждения их жизнеспособности, общей продолжительностью 21-28 час, как при качественном, так и при количественном формате (рис. 2).

Фекалии в контейнере с Транспортной Средой

п

Ректальный мазок в транспортной среде Керри-Блэр

1

1

Гомогенизация в стомайкере

Посев пробы 1:9 в бульон обогащения Престон

I

Качественный вариант

1

Количественный вариант (НВЧ)

Замораживание без инкубации при -20°С (для оценки жизнеспособности микробов)

Инкубация при 42°С 20-24 ч в микроаэробных условиях

Экстракция ДНК

- о

>,1 ( ,1

Подготовка к амплиф икации :

смешивание экстрактов с компонентами тест-системы Амплисенс Campy lo bac te rspp.-FL, праймерами, специфичными для 23 S гРНК термофильных кам п ил оба ктери й_

±

Амплификация и флюоресцентная детекция по программируемому режиму циклера-детектора

(РоторДжин 6000 или аналогичного типа) - -

Интерпрег, по уровне продукт! парных образца,!

ация результатов м флюоресценции амплификации ДНК об анализируемого ÈKO и контролей

Продолжительность анализа -27-29 часов

Рисунок 2. Схема выявления кампилобактерий в пищевых продуктах и биоматериале от больных с возможностью исследования жизнеспособности при посеве парных проб

методом ПЦР-РВ.

Оценка загрязнённости кампилобактериями различных пищевых продуктов методом ПЦР-ФЗ

Исследовано 146 образцов пищевых продуктов отечественного производства, относимых к категории наибольшего риска передачи кампилобактериоза, из торговой сети и птицеперерабатывающих предприятий Москвы, Московской области и центрального региона. В исследованиях применяли методы бакпосева и ПЦР-ФЗ в реальном времени, частота загрязнённости показана в табл. 6. Так, наличие ТКБ было обнаружено в 50 образцах из 146 изученных (34%), при этом все находки приходились только на птицепродукты. Причём, метод ПЦР реально позволял выявлять в них ТКБ на 7-8% чаще, чем посев.

Таблица 6.

Частота обнаружения кампилобактерий в пищевых продуктах, полученная

двумя методами

Продукт Число образцов Бакпосев ПЦР-ФЗ

Обнаружено ТКБ, абс. % Обнаружено ТКБ, абс. %

Мясо куриное 61 31 50,8 36 59

Субпродукты птицы (печень куриная) 14 14 100 14 100

Всего птицепродуктов 75 45 60 50 67

Мясо и полуфабрикаты из свинины сырые 6 0 0 0 0

Мясо и полуфабрикаты из говядины сырые 10 0 0 0 0

Рыба разделанная сырая 10 0 0 0 0

Молоко сырое 25 0 0 0 0

Готовые блюда (салаты с мясом птицы) 20 0 0 0 0

Всего других продуктов 71 0 0 0 0

Субпродукты (печень кур охлаждённая и замороженная) были в 100% случаев контаминированы ТКБ, что вероятнее всего связано с прижизненным заражением птицы до начала переработки из-за нарушений ветеринарно-санитарного режима и технологий выращивания и/или предубойного содержания.

Установленная нами методом ПЦР частота обнаружения ТКБ в образцах мяса кур из центрального региона страны достигала 59%. Причём, как этот уровень, так и тенденция к превалированию ТКБ в птицепродукгах сырых над продуктами других групп, соответствовали среднемировым показателям распространённости ТКБ (Мср 58%, медиана 59,3%), обобщённым Suzuki Н. и Yamamoto S., 2009, по данным из 32 стран.

Анализ обоими методами других продуктов, расцениваемых как потенциально опасные в плане кампилобактериоза, свидетельствовал об отсутствии ТКБ. Это и подтверждает результаты, полученные ранее в нашей лаборатории только посевом (Шу-

рышева Ж.Н., 2007), и служит в поддержку правомерности гипотезы эпидемиологов ЕС о том, что все не «птичьи» продукты, через которые происходит заражение, загрязняются перекрёстно в местах, где одновременно обрабатывается сырая птица, и чаще в быту СЕРБА, 2005).

ПЦР-идентификация с видоспецифическими праймерами показала, что во всех случаях продукты были загрязнены С.]е]ит. Это подтвердило данные о превалировании С/'е/иш, полученные фенотипическими методами при изучении изолированных из отечественных птицепродуктов ТКБ, на самом специфичном уровне (Шурышевой Ж.Н.,2007; Алабугина Т.В., 1998).

Таблица 7.

Уровни обсемененности птицепродуктов куриных Campylobacter spp., КОЕ/г

Объекты исследования Исследовано образцов Частота обнаружения % Содержание в выборке, КОЕ/г

min шах М±т Me 75% 90%

Мясо тушки 61 59 0 549,5 25±12,6 0,5 5,5 54,5

Смыв с тушки 13 23 0 54,5 5Д±4,2 0 0 5,5

Печень 14 100 0 549,5 132±60,6 5,5 54,5 550

Количественная характеристика загрязнения птицепродуктов куриных ТКБ, полученная путём ПЦР-ФЗ, представлена в табл. 7. Как видно, численность ТКБ во всех видах птицепродуктов была невысокой, в пределах 0,5-550 КОЕ/г, хотя в печени и среднее, и медианное значения контаминации были значимо большими, чем в мясе. Полученная нами картина обсемененности мяса птицы (высокая частота ТКБ при низких уровнях содержания) была характерной для фекальной контаминации тушек на этапах убоя и послеубойной переработки. Однако, при исследовании смывов с тушек ТКБ выявлялись в 2,5 раза реже, чем в мясе, и с более низкой численностью. Возможно, на это повлияла неспособность данного патогена переходить в жидкую фазу из-за адгезии к трещинам в коже птицы и к перьевым фолликулам (Jang K.I., et al., 2007), поэтому для повышения информативности контроля поверхностного загрязнения тушек необходима разработка нового подхода пробоподготовки для анализа, например, путём соскоба.

Оценка влияния па показатели загрязнённости птицепродуктов кампило-бактериями различных технологических факторов. В свете оценки безопасности технологий и эффективности ветеринарных и гигиенических мер на производстве, важна информация о наличии возбудителей кампилобактериоза в толще и на поверхности тушек птицы на критическом в плане перекрестной контаминации этапе охлаждения после убоя, а также при наличии-отсутствии замораживания. Последнее важно ещё потому, что широко предлагается сегодня как способ деконтаминации от мик-

робов, способный повысить гарантию безопасности для потребителей птицепродук-тов (EFSA, 2010; Humphrey, 2007).

Для оценки влияния процесса замораживания на контаминацию птицепродук-тов ТКБ, показатели загрязнения были обобщены и проанализированы раздельно по группам образцов в зависимости от термического состояния продукции (рис. 3).

) ■ % обнаружения в Мер, lg[KOE/r]) ^qq ^qq

мясо охл. мясо смыв с смыв с печень печень замор. охл. зам. охл. замор, тушки тушки

Рисунок 3. Показатели загрязнённости ТКБ охлаждённых и замороженных

птицепродуктов.

Установлено, что частота контаминации в замороженных тушках кур снижалась по сравнению с охлаждёнными в 1,3 раза, но при этом уровни содержания в 90% выборки достоверных различий не имели (Мср 1,48 и 1,34 lg КОЕ/г, соответственно). В смывах с замороженных тушек уровни обсеменённости были меньше (0,15 против 1,03 lg КОЕ/г у охлаждённых), а процент обнаружения чаще (25% vs. 20%, соответственно), хотя и незначимо. Статистически значимых различий в величинах обсеменения охлаждённой и замороженной печени кур также не установлено. Более того, после замораживания частота обнаружения ТКБ сохранялась на уровне 100%.

Таким образом, несмотря на определённую тенденцию к снижению загрязнённости, полного отмирания ТКБ в замороженных птицепродуктах не происходит, и риск размножения патогенов при дефростации не устраняется. Принимая во внимание низкую инфицирующую дозу возбудителя при кампилобактериозе, устойчивость к факторам технологического стресса наиболее вирулентных биотипов и то, что большая часть штаммов ТКБ, выделенных из замороженной птицы, способна к изменчивости (Humphrey, 2001; ACMSF 2005, Шевелева С.А., 2006, Шурышева Ж.Н., 2007), полученные данные не могут служить в пользу замораживания, как способа деконтаминации от патогенов. Предложения использовать низкотемпературную обработку как дополнительную специальную меру профилактики кампилобактериоза должны интерпретироваться с осторожностью.

Частота обнаружения патогенов в мясе и смывах с тушек в зависимости от примененного способа охлаждения при переработке птицы после убоя показана на рис. 4.

i

S 50 £

С% Метод посева И% Метод ПЦР

£1

14.3

Л = О

0,0 0.0

Мясо I Смыв Мясо I Смыв

ВВОиВИО ИО

Рисунок 4. Частота обнаружения Campylobacter spp. в мясе и смывах с тушек кур, при различных типах охлаждения (ВВО - водно-воздушное, ВИО - водно-испарительное, ИО - испарительное, ПО - погружное охлаждение).

Как видно, Campylobacter spp. сохранялись в смывах и в мясе при комбинированном охлаждении (водно-воздушном - использование переохлаждённой воды и воздуха или водно-испарительном - воды и гидроаэрозоля), а также после погружного охлаждения (воздействие переохлаждённой воды), но совсем не были обнаружены в образцах кур, подвергнутых испарительному охлаждению (воздействие гидроаэрозоля). Частота обнаружения ТКБ в мясе была наибольшей при использовании погружного способа (83,3% образцов в методе ПЦР и 67% в бакпосеве), что более чем в 2 раза превышало встречаемость при других типах охлаждения. Показатели, полученные путём ПЦР, здесь полностью совпадали с данными бакпосева, благодаря которым значимость различий между способами повышалась.

Данные о влиянии способов охлаждения птицы на контаминацию патогенами, безусловно, требуют более широкой оценки, но, тем не менее, демонстрируют преимущества испарительной технологии в отношении кампилобактерий.

Лабораторная диагностика наличия ТКБ в биоматериале от больных острым кампилобактериозом и синдромом раздраженного кишечника с использованием метода ПЦР-РВ. Исследовано 111 образцов биоматериала от взрослых больных, поступавших в инфекционную клинику с диагнозом «Пищевая токсикоинфек-ция» на протяжении года. Результаты, полученные параллельно двумя методами после обогащения образца: бакпосевом и ПЦР-РВ, приведены на рис.5.

Тёплый период Холодный период Весь год

Рисунок 5. Частота обнаружения бактерий рода Campylobabcter в материале от

больных ОКИ.

Частота обнаружения возбудителя методом ПЦР составила 8,1% (в теплый период года 12,8%), тогда как при использовании усовершенствованной бактериологической методики с обогащением фекалий, не превысила 4,5% и не показала сезонности инфекции. Во всех случаях жизнеспособность возбудителя подтверждена значимыми различиями Ct, а также выделением культур того же вида, которые были изолированы при посеве - С. jejuni. Использование ПЦР сократило время анализа в 3 раза (2 сут vs., 6 в баканализе). Полученные показатели, более адекватно отражая реальную долю кампилобактериоза в структуре ОКИ, приближаются к показателям в странах с налаженной лабораторной диагностикой трудно культивируемых патогенов и указывают на необходимость внедрения метода ПЦР-РВ в рутинную практику.

От больных СРК, которые не имели признаков ОКИ на момент обследования, проанализировано 39 образцов методами ПЦР, ИФА-ФС и бакпосева (табл.8).

Таблица 8.

Наличие ОКИ в анамнезе и результаты выявления ТКБ у больных СРК

Клиническая форма СРК Число больных Число больных, у которых установлено наличие, абс. (%%)

ОКИ в анамнезе кампилобактерий в стуле

Диарейная (СРКд) 16 7 (43,8) 1 (6,25)

С запорами (СРКз) 23 0 (0) 1 (4,3)

Всего 39 7 (17,9) 2 (5,1)

Наличие ТКБ в стуле при СРК зафиксировано в 2 сл. (5,1%), в т.ч. у больной С. с диарейной формой, имевшей перенесенную ОКИ в анамнезе, и у больной 3. с СРКз. У С. возбудитель С. был обнаружен всеми методами, в т.ч. изолирован в культуру, в то время как у 3. - транзиторно только методом ПЦР.

У всех больных были отмечены высокие частота и уровни посторонней флоры, устойчивой к селективным факторам в средах обогащения. Отражая глубокие нарушения кишечной микробиоты при СРК, это влияет на чувствительность определения ТКБ и требует дальнейшей работы по концентрации ТКБ в биоматериале от таких больных. В то же время, ПЦР-РВ даёт возможность открывать кампилобактерии у

хронических больных, для обоснования дифференциального диагноза с хроническим кампилобактериозом, и, соответственно, адекватного лечения.

Изучение генетических детерминант факторов патогенности у штаммов кам-пилобактерий, выделенных из пищевых продуктов и от больных кампилобактериозом. У штаммов С. jejuni, выделенных из птицепродуктов и от больных кампилобактериозом, изучено наличие генов, ответственных за продукцию цитолетального раздувающего токсина (ЦРТ) cdtA, cdtB, cdtC и за инвазию virB8, \irB9 и virBll. Поскольку активность ЦРТ проявляется при наличии в геноме всех 3-х субъединиц, кодируемых cdtA, cdtB, cdtC, штаммы, не имеющие полного комплекта, могут быть признаны потенциально не ответственными за диарею (Lara-Tejero, Galaon, 2001). Продукты амплификации указанных генов, полученные в ПЦР, сравнивали с характеристиками, известными из литературных данных (Bang, et al. 2003, Pickett, et al., 1996). Изоля-ты из птицепродуктов в значительной степени различались по частоте образования субъединиц ЦРТ: гены, кодирующие субъединицы А и С имелись у всех штаммов, тогда как ген cdtB обнаружен лишь в 8 сл. из 19 (42%) (табл. 9). Наибольшее число токсиногенных штаммов было выделено из охлаждённого мяса кур (66%). Этот показатель в 2 и более раза был ниже у штаммов из замороженного мяса и куриной печени. Вероятно, это может обусловливать большую значимость охлаждённого мяса, как фактора риска инфекции. В целом же эти данные свидетельствуют о потенциальной патогенности не менее 30% штаммов ТКБ, контаминирующих птицепродукты, находящиеся в реализации.

Таблица 9.

Распространённость генов инвазии и ЦРТ у штаммов С. jejuni, выделенных из

птицепродуктов

Источник Число Частота обнаружения, %

штамма штаммов cdtA cdtB cdtC Vir В8 VirB9 VirBll

Печень кур 10 100 30 100 0 0 0

Мясо кур за- 3 100 33 100 0 0 0

мороженное

Мясо кур ох- 6 100 66 100 0 0 0

лажденное

Всего 19 100 42 100 0 0 0

Показано также (табл.10), что структура кодируемых субъединиц ЦРТ штаммами от больных очень близка к штаммам из птицепродуктов: гены cdtA и cdtC так же присутствуют в 100% сл., а cdtB - в 40%, при полном отсутствии генов инвазии. Важно отметить, что у всех больных, от кого были выделены изучавшиеся штаммы, болезнь протекала в форме гастрита, и никому не был поставлен диагноз энтерит, за который ответственны инвазивные возбудители. Кроме того, по данным эпиданам-неза, накануне болезни употребляли или приготавливали в пищу птицепродукты 70% лиц с подтверждённым лабораторно кампилобактериозом. Установленное генетиче-

ское подобие выбранных факторов патогенности у штаммов из птицепродуктов и от больных людей указывает на потенциальную эпидемиологическую связь возбудителя с пищевым источником и должна приниматься во внимание при разработке мер профилактики кампилобактериоза.

Таблица 10.

Сравнение генов инвазии и ЦРТ у штаммов С. jejuni из пищевых продуктов и

от больных

Источник Число Частота обнаружения, %

штамма штаммов cdtA cdtB cdtC Vir В 8 Vir B9 VirBlI

Пищевые 19 100 42 100 0 0 0

продукты

Больные 5 100 40 100 0 0 0

ОКИ

Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что использование новых высокоспецифичных методических технологий ПЦР впервые за период с начала регистрации данного заболевания в РФ обеспечило получение данных о реальной распространенности этих микробов у заболевших ОКИ и о загрязнённости ими пищевых продуктов, расцениваемых как потенциально опасные в плане кампилобактериоза. Это позволило убедиться, что основной риск для потребителей представляют сырые куриные птицепродукты, и что предлагаемая мера для их деконтаминации от патогена замораживанием не надёжна.

Продемонстрированное в работе сходство кодируемых факторов патогенности у штаммов из птицы и организма заболевших подтверждает первоочередность мер технологического характера, направленных против перекрёстной контаминации на предприятиях и опирающихся на эффективный контроль на базе современного молекулярно - генетического анализа. Внедрение этих подходов повысит права потребителей на безопасное продовольствие.

выводы

1. Метод ПНР, основанный на выявлении специфических ДНК-фрагментов патогенных бактерий рода Campylobacter, их амплификации и флюоресцентно-гибридизационной детекции ампликонов в режиме реального времени с использованием тест-систем AMnmcenc-Campylobacter-¥L для анализа изолированных штаммов, адаптирован для прямого определения возбудителя в пищевых продуктах и биоматериале путём оптимизации пробоподготовки, применения процедуры предварительной инкубации образцов в селективной среде и некульту-рального способа подтверждения жизнеспособности.

2. Установлены характеристики открываемое™ и предела определения метода ПЦР для выявления бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах и биоматериале (85% при 1-9 КОЕ/г, 100% при 10 КОЕ и выше в 1 г). Показана более высокая эффективность выбранного формата ПЦР и тест-систем при сравнении с бакпосевом по чувствительности, скорости выполнения, специфичности.

3. При ПЦР-анализе параллельно с бакпосевом 146 образов пищевых продуктов (мясные и рыбные полуфабрикаты сырые, птицепродукты куриные сырые, молоко сырое, готовые к употреблению продукты и блюда с птицей) установлено, что кампилобактериями контаминированы исключительно сырые птицепродукты, а уровни их загрязнённости (частота обнаружения в мясе и печени кур 59 и 100%, соответственно, содержание от 0,5 до 550 КОЕ/г, Me 0,5 КОЕ/г, 90% - 55 КОЕ/г) сопоставимы с зарубежными данными.

4. Установлено, что замораживание тушек кур не обеспечивает их полной деконта-минации от кампилобактерий: снижая уровни загрязнённости в среднем на 1 lg КОЕ/г, незначительно влияет на частоту обнаружения (обсемененность печени и мяса сохраняется на уровнях 100 и 51%, соответственно). В свою очередь это может обусловливать риск размножения данных патогенов при дефростации и перекрёстную контаминацию. Использование технологии испарительного охлаждения тушек способствует снижению частоты обнаружения Campylobacter spp. по сравнению с погружением в воду.

5. Выбранный алгоритм пробоподготовки биоматериала и методика ПЦР позволили повысить результативность лабораторной диагностики острого кампилобак-териоза у больных с ОКИ в 2,5 раза по сравнению с бакпосевом.

6. Впервые в РФ для изучения этиопатогенетической связи Campylobacter spp. с постинфекционной формой синдрома раздраженного кишечника охарактеризован состав микроаэрофильной флоры кишечника у больных с диарейной и запорной формами заболевания. C.jejimi обнаружены при диарейной форме СРК и наличии ОКИ в анамнезе, культуральными и некультуральными методами в динамике. У больных группы с запорами имело место лишь транзиторное обнаружение генов ТКБ без выделения патогена в культуре.

7. Показано наличие идентичных генов, детерминирующих факторы патогенности у штаммов, изолированных из пищевых продуктов и от больных острым кампи-лобактериозом, что может служить подтверждением потенциальной эпидемиологической связи заболеваний кампилобактериозом и потребления контамини-рованных кампилобактериями птицепродуктов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Минобрнауки Российской Федерации:

1. Булахов А. В.. Ефимочкина Н. Р., Шевелёва С. А. Обнаружение бактерий рода Campylobacter в птицепродукгах с помощью метода ПЦР // Вопросы питания

2010.- т.79. - № 3. с.24-29.

2. Булахов А. В., Ананьева А. В., Быкова И. Б., Козак С. С., Шевелёва С. А. Контроль патогенных микробных контаминантов птицы в тушках цыплят бройлеров с использованием современных методических подходов // Птица и птице-продукты 2010,- № 6. с. 45-49.

3. Бурляева Е.А., Булахов А. В.. Пилипенко В. И., Исаков В. А., Шевелева С. А. Кампилобактерии в стуле больных с синдромом раздраженного кишечника // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология 2010,- т.9. - № 11. с.53-57.

4. Литвинова О.С., Соколова Л.В., Булахов А.В.. Шевелева С.А., Шахмарданов М.З., Удалов Г.Г. Клинико-лабораторное выявление кампилобактериоза у больных с острыми кишечными инфекциями. // Российский медицинский журнал

2011.-№4 с.13-15

Другие издания:

5. Быкова И. Б., Булахов А. В., Шевелёва С. А. Ускоренные методы контроля биологической безопасности. // Переработка молока 2009. - №8. с.6-8.

Материалы научных конференций:

6. Шевелева С. А., Исаков В. А. Булахов А. В. Новые аспекты пищевого кампилобактериоза. // Материалы X Всероссийского конгресса диетологов и нутрицито-логов «Питание и здоровье». - с.122-123. - Москва 2008.

7. Булахов А. В. Апробация и стандартизация метода ПЦР в реальном времени для идентификации Campylobacter spp. и Salmonella spp. // Материалы научно-практической конференции «Теоретические и практические аспекты современной эпидемиологии». - с. 25-26. - Москва 2009

8. Булахов А. В. Использование ПЦР метода для определения бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах и материалах от больных острыми и хроническими инфекциями с пищевым путём передачи (Материалы ежегодной конференции молодых ученых ФГБУ «НИИ питания» РАМН (14 мая 2009 г.)// Вопросы детской диетологии, 2009.- т. 7.- № 4, с. 51-79.

9. Булахов А. В. Обнаружение бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах. // Материалы конференции «Современные технологии обеспечения биологической безопасности». - с.153-154. - Оболенск 2010.

10. Булахов А. В.. Ананьева А. В., Шевелёва С. А Апробация метода ИФА для определения термофильных бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах. // Материалы XII Всероссийского конгресса диетологов и нутрицитологов «Питание и здоровье». - с.16-17. - Москва 2010.

11. Булахов А. В. Использовании метода ПЦР при оценке загрязненности птице-продуктов кампилобактериями. // Материалы конференции «Молекулярная диагностика» т. 2. - с.9-10. - Москва 2010.

12. Булахов А. В., Литвинова О. С., Лучшев В. И., Шевелёва С. А. Совершенствование лабораторной диагностики кампилобактериоза с использованием ПЦР. //

Материалы конференции «Молекулярная диагностика» т. 2. - с.320-322. - Москва 2010.

Внедрения в практику

- Методические рекомендации MP № 02.036-08 «Идентификация патогенных бактерий, выделенных при контроле пищевых продуктов, с применением системы ВАХ® System Q7»

- Методические указания МУК 4.2.2872-11 «Методы выявления и идентификации патогенных бактерий-возбудителей инфекционных заболеваний с пищевым путём передачи в продуктах питания на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией»

- Методические указания МУК 4.2.2878-11 Дополнения и изменения №1 к Методическим указаниям МУК 4.2.2321-08 «Методы определения бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах»

- Санитарно-эпидемиологические правила СП 3.1.7.2816-10 «Профилактика кампилобактериоза среди людей»

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВКО - внутренний контрольный образец ЗФР - забуференный физиологический раствор НВЧ - метод наиболее вероятного числа ОКИ - острые кишечные инфекции ОМР - оценка микробиологического риска ПЦР - полимеразная цепная реакция ПЦР-ИК - ПЦР с интеркалирующим красителем ПЦР-РВ - ПЦР в реальном времени (количественная ПЦР) ПЦР-ФЗ - ПЦР с флуоресцентно-меченными зондами СРК - синдром раздражённого кишечника ТКБ - термофильные кампилобактерии ФС-ИФА - фермент-связанный иммунофлуоресцентный анализ Ct - номер цикла ПЦР-РВ, на котором интенсивность флуоресценции превышает порог диапазона положительных значений

Заказ №69-а/02/2012 Подписано в печать 19.01.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-maihzak@cfr.ru