Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Оценка реакции иммунной системы при воздействии факторов сыворотки крови на модели первичного иммунного ответа in vitro

РГб од

Российская Академия медицинских наук

Научно-исследовательский ордена' Трудового Красного Знамени институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи

На правах рукописи

РАБА Геннадий Павлович

ОЦЕНКА РЕАКЦИИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ФАКТОРОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ НА МОДЕЛИ ПЕРВИЧНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА IN VITRO.

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации па соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1993

Работа выполнена в Московском ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте педиатрии и детской хирургии МР РФ.

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

доктор медицинских наук, профессор Д.В. СТЕФАНИ

доктор медицинских наук В.В. ХОРОБРЫХ,

доктор медицинских наук, профессор Б.В. ПИНЕГИН

Российский Государственный медицинский Университет им. Н.И. Лирогова

Защита диссертации состоится " ^^_ 1993 г.

в п час на заседании специализированного ученого совета К 001.07.01 в научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи (123098 Москва, ул. Гамалея, д. 18).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института НИИЭМ ям. Н.Ф. Гамалеи.

Автореферат разослан " && 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор медицинских наук

ЕИ. Коптелова

- 1 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность рррблемы. Определение функционального состояния иммунной системы актуально для современной клинической иммунологии. В процессе реализации иммунного ответа взаимодействия лимфоидных клеток осуществляются, в основном, не за счет прямых (мембранных) контактов, а посредством продуктов оинтетической деятельностя клеточных элементов. Лимфоидные клетки являются объектом, воспринимающим одновременно различную информацию либо при их взаимодействии между собой или при участии цитокинов (Ellzalde de Бгассо Maria M. et al. I960; Muslani Plero et al. 1984 ), при воздействии на лимфоидные и кроветворные клетки опиоидных факторов (Каремян А.И. и др. 1989; Корнеева Е.А. 1983; Хмельницкий O.K. и др. 1989; Jankovlc Branlslav D. 1989 ), гормонйв (Acero R. et al. 1984? Forts Gabrlellaet al. 1985; James Keith et al. 1984) и т.д. Мононуклеарные клетки могут воспринимать информацию о состоянии печени (Алексеева И.Н. и др. 1989), о концентрации специфических антител (Andru3 L. et al. 1981).

Для оценки состояния клеточного иммунитета в лабораторной практике используют, в основном, количественные методы, основанные на выявлении различных поверхностных маркеров. Однако, количественные показатели не всегда соответствуют функциональной активности лимфоцитарных субпопуляций. Основными причинами этого являются, во-первых, морфологическая неоднородность лимфоцитарных субпопуляций (Velardi A. et al. 1988), то есть, одна и та же субпопуляция лимфоцитов мохэт включать клетки с различными функциями. Так, лимфоциты CD4+ содержат собственно хелперы и индукторы.супрессии, а лимфоциты CD8+ - супрессоры, контрасупрессоры и цитотоксические клетки (Dohlsten M. et al. 1988; Fletcher M.A. et al.1989). Во-вторых, в онтогенезе существуют периоды, когда, например,- на фоне количественного преобладания хелперов наблюдается высокая функциональная активность супрессоров (Вельтизев Ю.Е. 1989; Bradley L.U. et al. 1989). В-третьих, в периоде новороаденности в крови циркулирует значительное количество клеток с "двойной маркировкой" хелперов и супрессоров (Shortœan К. et al. 1990, т.е. наличие поверхностного маркера не является гарантией функциональной полноценности-клетки. Поскольку наиболее часто такие "аномалии"

- г -

встречаются при обследовании детей (Вельтищев Ю.Е. 1989), это особенно важно учитывать в педиатрии при интерпретации количественных показателей.

Следовательно, при оценке иммунного статуса нельзя ограничиваться данными количественного иммунологического анализа, их необходимо дополнять исследованиями функциональной активности клеток лимфо- и гемопоэза. К сожалению, известные в настоящее время методы определения состояния регуляторных механизмов основаны на использовании клеточных элементов, что требует значительного количества материала и немедленного проведения Исследования, поэтому с практической точки зрения перспективным является поиск методов, позволявших использовать в качестве объекта исследования не клеточную взвесь, а сыворотку крови как субстрат, содержащий продукты синтетической активности клеток лимфо- и гемопозза.

Цель jl задачи исследования. "Целью настоящей работы являлся поиск путей для разработки нового подхода к оценке регуляторных механизмов иммунной системы на основании эффекта сывороточных факторов крови на иммунный ответ спленоцитов мыши in vitro. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучение динамики первичного иммунного ответа спленоцитов мыши при их культивировании in vitro.

2. Подбор оптимального варианта стандартной модели первичного иммунного ответа спленоцитов мыши для оценки суммарного эффекта сывороточных факторов крови человека.

3. Определение показателей воздействия суммарного эффекта сывороточных факторов крови здоровых доноров, беременных женщин и больных с атопическим синдромом.

4. Проведение сравнительного анализа количественных показателей субпопуляций Т-лимфоцитов и формирования первичного иммунного ответа в культуре спленоцитов мыши под воздействием сывороточных факторов крови человека.

Научная новизна. Впервые разработана стандартная модель культуры спленоцитов мыши, позволяющая оценить состояние регуляторных механизмов иммунитета на основании оценки суммарного воздействия сывороточных факторов крови человека на ксеноген-чые лимфоидные клетки. Впервые ° представлено теоретическое обоснование возможности использования сыворотки крови как сум-

марной иммунорегулирующей субстанции, которую' можно использовать в качестве материала для определения регулирующих механизмов иммунитета. Впервые проведен сравнительный анализ между количеством лимфоцитов регуляторных субпопуляций человека и показателями состояния регуляторных механизмов иммунитета с использованием сыворотки крови как суммарного фактора, отражающего функционирование клеток лимфо- и гемопоээа.

Практическая значимость. Разработан новый способ определения состояния регуляторных механизмов иммунной системы, что может быть использовано для совершенствования иммунодиагностики и иммунокоррекции. Предложенный способ'ке имеет аналогов, отличается экономичностью, тробуат малого количества материала для исследования, что важно для клинической, в особенности, педиатрической практики, позволяет заменить клеточную взвесь . сывороткой крови, что открывает дополнительные резервы хранения и транспортировки, дает возможность проводить сбор материала в 'экстремальных условиях.

Внедрение. Результаты диссертационной работы внедрены в клиническую практику и находят применение в клинико-диагностическом отделении и пульмонологическом отделении МНИИ педиатрии и детской хирургии МЗ РФ, а также в женской консультации городской поликлиники N 154 г.Москвы.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы,, сделано 1 рационализаторское предложение, получена приоритетная справка на изобретение N 92-009291/14 от 8 февраля 1993 г.

Апробация. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на методическом совещании сотрудников лаборатории иммунологии и иммунохимии МНИИП и ДХ МЗ РФ 15.12.92 г. Результаты диссертационной работы доложены на I съезде иммунологов Азербайджана; на итоговой научно-практической конференции сотрудников, Кишиневского медицинского университета им. H.A. Тестемицану {18.05.93 г.).

Структура и объём диосертации. Работа изложена на 147 страницах машинописного текста и состоит из введения,. обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав результатов собственных исследований, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 51 отечествен-нг* и 136 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 23

рисунками и 7 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы исследования. Диссертационная работа проведена в 2 этапа: 1-й - разработка и апробирование метода культуры клеток спленоцитов линейных животных для решения научно-практических споров по части вопросов регуляции иммунитета человека н 2-й - в основу которого положены результаты исследования крови 21 адоровых доноров, 14 беременных Женщин и 23 больных с атомическим синдромом (поллинозом) (Таблица 1.).

Таблица 1.

Группа Количество обследованных лиц Пол Возраст

муж. жен.

1.Здоровые доноры 21 15 6 27-36 лет

2.Беременные жен- 17-32 года

щины 14 14

3.Больные с полли-

Н03ЙМЯ 23 11 12 6-14 лет

Основная исследовательская работа по диссертации выполнялась на базе лаборатории иммунологии и иммунохимии МНИИП и ДХ МЗ РФ (зав. д.м.н. профессор Д.В. Стефани). Исследования по первому этапу проведенной работы частично выполнялись на базе лаборатории эффекторов и медиаторов иммунитета НИИЭ и М им Н.Ф. Гамалеи (зав. д.м.н. Суслов А.П.).

Выбор групп обследованных лиц был обусловлен необходимостью исследования клинических моделей с различными состояниями регуляторных механизмов иммунной системы.

Здоровых доноров до начала обследования тестировали с целью оценки состояния клеточного иммунитета посредством набора антигенов для кожных реакций "Иммуноскинтест". (метод, разработанный на кафедре иммунологии Института усовершенствования врачей, г. Москва, 1992 г.) (Кашкин К.П. и др. 1992). Значения показателей, полученные у обследованных доноров, свидетельствовали об отсутствии признаков иммунодефицитного состояния.

Было обследовано 14 беременных женщин (забор крови осу-

иествлялся в женской консультации при поликлинике H 154 г. Москвы) со сроками беременности от 10 до 35 недель, протекающей без выраженных патологических осложнений. Кроме того, исследовали состояние иммунорегулирующих механизмов у 23 детей с атопическим синдромом в возрасте 6-14 лет до и после лечения методом специфической гипосенсибилизации. Этот фрагмент выполнен совместно с научным сотрудником клинико-диагностического отдела Московского НИИ педиатрии и детской хирургии МЗ РФ Ю.С. Хмолкиным.

Для решения задач и достижения цели, поставленной в работе, использовали методы, адекватные требованиям:

I. Метод индукции первичного иммунного ответа спленоцитов мыши в культуре in vitro (Dutton R.U., Mishell R.I., 196?, в модификации Click R.E. et al, 1972).

Для получения культуры спленоцитов мыши, которая наиболее соответствовала бы задачам исследования, определили следующие критерии:

1. Получение в активированном состоянии сплоноцитов мыши, которые выступали в роли ксеногенных клеток-мишеней для регу-ляторных факторов сыворотки крови обследованных индивидуумов.

2. Получение максимального количества антителопродуцентов в культуре в наиболее ранние сроки от начала культивирования.

3. Характер кривой должен в наибольшей степени соответствовать "нормальному" развитии индуцированного шшунного ответа in vitro.

Предварительную иммунизацию, мышей линии С57В1/6, самок, проводили за 96 часов до начала эксперимента. Для сенсибилизации животных использовали взвесь ЭБ, а концентрациях 2x10*кл/мл, в обьёме 0,1 мл в/в каждому.

При подготовки для инкубации клеточных культур, в ячейках 96-и луночного планшета для культивирования ("Hunc, Flo* laboratory") помещали по 100 мкл подготовленной суспензки спленоцитов мыши в концентрации 5х10*кл/мл. Количество заполненных ячеек расчитывали по'формула х - 2х(п*1), где "я"-'число исследуемых сывороток.

Для исследования суммарного эффекта сывороточных факторов крови человека использозалп 4 варианта клеточных культур (Таблица 2).

Таблица 2.

Варианты клеточ- Суспензия ли- ЭБ Сыворотка "Полная Окончательный

ных культур мфоцитов крови среда объем ячейки

I-вариант (контроль-А) 100 мкл 120 мкл 220 мкл

II-вариант (контроль-В) 100 мкл 100 мкл _ 20 мкл 220 мкл

III-вариант (опыт-А) 100 мкл 100 мкл 20 мкл 220 мкл

П-ва$)иант (опыт- В) 100 мкл 20 мкл 100 мкл 220 мкл

Ячейки с контрольными вариантами (контроль "А" и контроль "В") заполняли по одной на каждом планшете, а с вариантами "(опыт А" я опыт "В") по одной для каждой исследуемой сыворотки. Количество планшетов (5), которых помещали в СО - инкубатор (CNOTT Elektronik, Германия) и хронометрировали время экспозиции, соответствовало числу дней культивирования. Такое сочетание вариантов культур позволяло исследовать суммарный эффект сыворотки крови как в присутствии антигена ОБ), так и без него. При этом состав культур различался только наличием воздействующего фактора (сыворотки) в вариантах I и IV, II и III.

П. Метод определения количества АОК по Ерне (lerne, Hordin, 1963) (107).

В каждой культуре количество бляшек определяли для нескольких исходных концентраций лимфоцитов: цельная суспензия, разведение 1:10, а при необходимости, разведение 1:100.

Результат выражали в виде следующих показателей:

а) абсолютного количества АОК на каждой чашке;

б) десятичного логарифма количества АОК (lgK.) на 10* живых клеток

в) разности количества АОК (Д) в опытном и контрольном вариантах в расчете на 10* живых клеток.

III. Метод определения количества лимфоцитов различных суб- »

популяций посредством непрямой иммунофлуоресценции с использованием моноклонельных антител (Инструкция ьо применению антител моноклональных для выявления антигенов поверхности клеток иммунной системы человека, сухих. Минздрав РФ. Предприятие по производству бактерийных препаратов ГННИИЭМ).

Статистический анализ полученных данных провели с использованием программы вычисления вариационных статистик, разработанной в НИВЦ МНИИ педиатрии и детской хирургии. Определяли величину среднего арифметического, ошибки среднего и коэффициентов корреляции, используя критерий Стьюдента (Рокицкий П.Ф. 1978).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проведено культивирование сплеяоцитов мышей, примирован-ных за 96 часов до выделения клеток в присутствии сыворотки крови здоровых доноров.

Предварительно был сделан подбор оптимальной дозы сыворотки, добавляемой в культуру. Анализ показал,что оптимальной является доза 20 икл.

Состав культур соответствовал IV варианту, т.е. опытная культура содержала спленоцпты ыыан, полную спаду и сыворотку обследуемого. В качестве контроля использовали культуру, содержащую спленоциты и полную среду культивирования (I вариант).

На основании полученных данных проводили построение кривых зависимости разности количества АОК (Д) в опытной я контрольной культурах от времени инкубации.

Индивидуальный анализ полученных кривых проводили по следующим параметрам:

1). Значение (д) в начальной точке отсчета, получаемой в течение первых суток культивирования ("начальный эффект").

2). Тангенс угла наклона кривой Ц,) через 24 часа от начала инкубации.

3). Абсолютная величина д в экстремальной точке кривой во временном интервале 24-72 часа ("ранний" эффект).

4). Тангенс угла наклона кривой Ц,) во временном интервале 72-96 часов.

5). Абсолютная величине д через 96 часов от начала ик-

- 8 -

кубаЦии ("отсроченный" эффект).

Эффект сывороточных факторов расценивался как "стимулирующий", если во временном диапазоне до 72 часоз кривая располагается выше оси абсцисс, как "ингибирующий" - при расположении кривой ниже оси абсцисс.

Анализ кривых разности АОК в контрольной и опытной культурах спленоцитов мыши позволил выявить три основных типа суммарного эффекта сывороточных факторов крови здоровых доноров.

Кривые I типа имели параметры, указывающие на стимулирующий эффект сыворотки крови. Кривые этого типа имелп особенности, позволившие разделить их на два подтипа. К подтипу "а" относили крквые с выраженным "отсроченным" стимулирующим эффектом. Подтип "б" включал кривые со слабым исходным супрессорным аффектом и рано наступающим устойчивым, но слабым стимулирующим действием.

И тип кривых указывал на отсутствие выраженного эффекта. Характеризовался слабым "начальным" супрессорным эффектом, но уае со 2-х суток кривая достигала оси абсцисс и в дальнейшим практически с нею совпадала.

III тип кривых, полученных при обследовании 4 доноров,, характеризовался выраженным супрессорным эффектом, как в 1-ые сутки, так и в интервале 2-ые - 4-ые сутки. Другой характерной чертой кривых этого типа являлась слабо выраженный кратковременный стимулируюший эффект через 24 и 96 часов.

При распределении индивидуумов по группам в соответствии с типом эффекта сыворотки крови, мы учитывали основные характерные черты кривой:

а) "Печальный" эффект;

б) интегральную характеристику на "положительных" и "отрицательных" отрезках кривой, располагающихся соответственно выше'-или ниже оси абсцисс;

в) координаты экстремальных точек в период до 72 часов от начала культивирования - "ранний" эффект;

г) значение показателя числа АОК {д) через 96 часов от начала инкубации - "отсроченный" эффект.

Для оценки влияния постоянного присутствия антигена на эффект сывороточных факторов крови культивировали спленоциты мышей, примированных .за 96 часов до начала инкубации в присутствии ЭБ и сыворотки крови доноров (вариант III

"опыт-А") сравнивая результат с контролем, содержащим только ЭБ (вариант II "контроль-В").

Анализ кривых иммунного ответа показал, что так же, как и при использовании состава культур в варианте IV "опыт-B", эффект сывороточных факторов соответствует трём основным типам. Процесс развития первичного иммунного ответа имел те же закономерности, что и в случее варианта IV. Наблюдалось сходство характера кривых, полученнчх при обследовании одного и того же донора. Однако, принципиальным отличием в попарных параметрических характеристиках кривых являлась более выраженная инги-биция первичного иммунного ответа в случае использования состава культуры, соответствуиией варианту III. Возможно этот феномен объясняется том, что постоянное присутствие антигена, ускоряет развитие первичного иммунного ответа (Корукова A.A. 1976), и происходит смещение максимума синтетической активности антителообразующих клеток к началу периода наблюдения. С нашей точки зрения, вариант IV следует считать более приемлемым для оценки суммарного сывороточного эффекта, чем вариант III, и при обследовании мы использовали эту модель культуры.

Согласно литературным данным, беременчость, протекающая без осложнений, сопровождается преобладанием Ts (фенотип CD8+) (Вельтищев Ю.Е. 1989; Чередзев А.И. 1989).

Проведено культивирование спленоцитов мышей, примирован-пых за 96 часов до начала инкубации, в присутствии сыворотки крови от 14 женщин с физиологически протекающей беременностью со сроками от 10 до 35 недель. На основании индивидуального анализа параметров полученных кривых выделили 4 условных типа:

К I типу отнесли кривые (3 беременных), отражающие преобладание стимулирующего воздействия во временном интервале 24-120 часов. На кривой наблюдались две экстремальные точки через 2 и 4 суток инкубации. Однако, следует подчеркнуть, что "начальный" эффект был ингибирующим. Эту группу обследованных составили женщины со сроками беременности 18-24 недели.

II типур(4 беременных ' женщины) соответствовали кривые, характер котоых указывал на "ранний" (2-4 сутки) умеренный стимулирующий эффект. В первые сутки эффекта сывороточных факторов крови не наблюдалось, и кривая практически совпадала с осью абсцисс Такой характер кривой наблюдался в 23-28 недель берjMeHHocTH.

III тип кривой (3 беременные женщины) практически совпадал с осью абсцисс в течение всего срока наблюдения, что, по-видимому, соответствовал равновесному состоянию иммунорегу-лируюшпс механизмов в момент забора крови. В основном этот тип кривых коррегировал со сроком 30-32 неделям беременности. IV тип кривых был получен при обследовании 4 беременных и характеризовался выраженным супрессорным эффектом в первые сутки культивирования. В дальнейшем (от 24 до 120 часов) эффект носил устойчивый, слабЬ выраженный ингибирующий характер у трех женщин и резко выраженный у одной.

' Таким образом, прослеживалась тенденция уменьшения интенсивности стимулирующего воздействия сывороточных факторов от первого триместра беременности к третьему. Выраженный ингибирующий эффект (около 30% случаев) может наблюдаться в любом периоде беременности. Следует еще раз подчеркнуть, что результаты исследований, полученные на основании нового подхода к оценке состояния регулирующих механизмов, не противоречили данным литературы.

Клиническую модель, сопровождающуюся повышением уровня хелперов и умеренным снижением числа супрессоров, представляют собой аллергические заболевания.

Нами обследовано 23 ребенка в возрасте 5-14 лет (13 мальчиков и 10 девочек) с поллинозами, подтвержденными положительными скарификационными пробами. У всех больных в периоды обострения заболевания наблюдали высокие уровни сывороточного IgE, что указывало на участие в развитии процесса иммунопатологических реакций I типа.

При оценке суммарного эффекта сывороточных факторов крови на первичный иммунный ответ спленоцнтов мыши в стандартной культуре in vitro выявляли 3 типа кривых.

Кривые I типа (9 детей) характеризовались стимулирующим "начальным" и "отсроченным" эффектом. Дети этой группы составили 2 подтипа: подтип "а" - 4 ребенка с преобладанием "начального" стимулирующего эффекта над "отсроченным"; подтип "б" (5 детей) характеризовался противоположными признаками: величина максимального стимулирующего эффекта через 96 часов от начала инкубации выше, чем стимуляция, наблюдавшаяся в первые сутки.

Для II типа характерны "ранний" и "отсроченный" стимули-

- и -

рувдие эффекты. У 2-х больных этой группы более выраженный стимулирующий эффект наблюдали в поздний пер.год инкубации, а у одного больного во временном интервале до 72 часов.

Основным признаком отбора кривых по III типу (11 детей) являлся ингибирующий "начальный" эффект сывороточных факторов крови, который мог сменяться либо выраженным стимулирующим эффектом, либо слабым стимулирующим пли ингибируюиим эффектом. В последнем случае кривая в интервале 24-120 часов располагалась вблизи оси абсцисс. Таким образом, показано, что у большинства больных с поллинозом сывороточные факторы крови оказывали преимущественно стимулирующее воздействие на процессы антителоге-кэза в культуре спленоцитов мызи In vitro, проявляющееся в различные сроки от начала культивирования, т.е. результаты оценки состояния регуляторних механизмов иммунной системы не прстнворечили полученным ранее сведениям о количественном преобладании хелперного звена регуляции антителогенвза.

Для сравнительного анализа суммарного эффекта сывороточных факторов крови на первичный пммулный ответ у детей с атоническим синдромом до и после лечения методом специфической гилосенсибилизации использовали стандартную модель культуры спленоцитов. Всех детей обследовали в стадии ремиссии. Основным компонентом патогенетического лечения являлось проведение предсезонной гипосенснбклизации причинно-значимыми аллергенами, для чего детям либо назначали перорально в течение 30 дней возрастающие дозы аллергена в виде растворов с концентрациями от 1:1x10 PNU до 1:10 PNU, либо раствор аллергена вводили п/к 2 раза в день, начиная с разведения 1:100 PNU с дальнейшим увеличением концентрации до предельно допустимой под "прикрытием" антигистаминовых препаратов. Клинлко-лабораторную картину состояния детей оценивали, условно выделив три типа, характеризующиеся различным соотношением иммунологических и клинических показателей.

При попарном сравнении кривых суммарного эффекта сывороточных факторов крови на первичный иммунный ответ в культуре in vitro, полученных у одного н того же ребенка до и после лечения, определено несколько типичных сочетаний.

При обследовании первой группы, которую в основном (в 7В% случаев) составили дети с Г типом клинико-лабораторной картины, получены кривые со соизмепнмыми значениями интегральной

характеристики до и после лечения. Группа подразделялась на 2 подгруппы: подгруппа "а" характеризовалась преобладанием "начального" и "отсроченного" стимулирующего эффекта до лечения. После лечения наблюдался стимулирующий "отсроченный" эффект Подгруппа "б" характеризовалась общей тенденцией развития характера кривых, при этом выявлялась "начальная" и "ранняя" супрессия с "отсроченной" стимуляцией до и после лечения. В целом для этой группы характерен был "отсроченный" стимулирующий эффект до и после,лечения.

Вторую группу в 80% случаев составляли больные дети II клинико-лабораторного типа. Кривые, полученные при обследовании этой группы больных, характеризовались слабо выраженным эффектом сывороточных факторов крови до и после лечения. Точки кривых на всем протяжении располагались вблизи оси абсцисс

В третью группу в 60% случаев вошли больные с III типом клинико-лабораторной характеристики! В 40% случаев эту группу составили дети с I и II типами. Для данной группы характерно преобладание стимулирующего эффекта (у 80% детей) в "ранний" период исследования и у 100% в "отсроченный" период до лечения. После лечения у 80% детей наблюдался супрессорный "начальный" эффект и резко выраженный "отсроченный" стимулирующий эффект у 100% детей. При этом стимулирующий эффект после лечения во много раз выше, чем до лечения.

Четвертую группу составили 3 ребенка ( 2 больных с I кли-нико-лабораторным типом и один со II клинико-лабораторным типом). У детей с I типом наблюдался сходство характера кривых до лечения, заключающееся в проявлении значительного "отсроченного" стимулирующего эффекта. Прослеживалось общие закономерности и в характере кривых, полученных после лечения. Кривая у 3-го ребенка, составляющего эту группу, отличалась резко выраженным подъёмом в "ранний" период культивирования и умеренным "отсроченным" стимулирующим эффектом до лечения. Эффект сывороточных факторов крови, взятый после лечения, соответствовал тому, что наблюдался у других детей этой группы.

Следует подчеркнуть, что для большинства больных с полли-нозом наиболее характерным признаком является "начальный" стимулирующий эффект, что практически не наблюдалось при обследовании здоровых доноров. Это согласуется с концепцией "иммунологического компаса", согласно которому при аллергии наблюда-

ется количественное преобладание Th. Еще одним подтверждением этой точки зрения являлось высокие показатели "отсроченного" стимулирующего эффекта, то есть у большинства больных выявлялись признаки преобладания стимулирующего эффекта как в раннем, так и в поздкем периодах наблюдения. Важно отметить, что у всех обследованных больных до лечения не отмечалось ни одного случая признаков ингибирувщего эффекта в форме экстремальной точки, располагающейся ниже оси абсцисс.

Таким образом, при анализе кривых, отражающих характер суммарного эффекта иммунорегулирующях факторов сыворотки крови здоровых доноров, беременных женщин и больных с атопкей па первичный иммунный ответ спленоцитов в культуре in vitro выявлялись особенности, характерные для каждой из обследованных групп. При исследовании суммарного сывороточного эффекта у здоровых доноров можно выделить три основных типа кривых, отражающих "ингибирующий" пли "стимулирующий" эффект, или "равновесное" состояние !Шмунорегулирупщпх механизмов. При обследовании беременных генщии наблюдается зависимость функционального состояния кммудорегуляторных механизмов от сроков беременности, проявляющаяся в уменъазнЕП тпеисивности стимулирующего воздействия от начала беременности к предродовому периоду у подавляющего большинства обследованных женщин. Для эффекта, оказываемого сывороткой крови больных с поллияозом, наиболее характерным является преобладание стимулирующего "начального" и "отсроченного" эффекта. Эти особенности могут служить основанием для определения дифференциалыю-гдяагностическими критериями состояния иммунорегуляторкых ме.чанизмчв при различных патологических состояниях.

При сравнительном анализе динамики первичного иммунного ответа спленоцитов мыши в культуре in vitro п количественных показателей регуляторных субпопуляцпй лимфоцитов нами определено не столько зависимость процесса аптитологенеза от влияния регуляторных субпопуляций, сколько оценка интегрального эффекта воздействия факторов, содержащихся в сыворотке креза, па изменения числа антитзлопродуцентов.

При определении суммарного эффекта сывороточных факторов крови условно било Еыделено несколько периодов их действия: "начальный" эффект, который проявлялся в течение первых суток от момента забора крови, "ранний" эффект со сроком действия до

72 часоз и "отсроченный" аффект, который оценивали через 36 часов от начала инкубации

Для сопоставления значений количественных показателей регуляторных субпопуляций и "начального" эффекта сывороточных факторов было определено индивидуальное положение точки для каждого обследованного лица в системе координат "л АОК - соотношение (Th/Ts)" (Рис. 1.). При этом использовали стандартную модель культуры сшюноцитов in vitro. Поле графика разделено на 4 квадранта, каждый из которых отражает следующие соотношения исследуемых показателей: I - стимулирующий эффект сывороточных факторов, сочетающийся с количественным преобладанием -Т-хелперов; II - стимулирующий эффект сывороточных факторов в сочетании с преобладанием числа Т-супрессоров; III - сочетание ингибирующего эффекта сывороточных факторов и количественного преобладания Т-супрессоров; IV - ингибируюцее воздействие сыворотки и преобладание числа Т-хелперов. Как следует из полученных данных, точки, отражающие показатели соотношения Th/Ts и прироста или уменьшения количества антителообразующих клеток в культуре распределились в I-IV квадрантах неравномерно: в группе здоровых доноров распределение точек в I, II, III я IV квадрантах составило 14.3% : 0,0% : 14,37» : 71,4% соответственно. Т.е. у здоровых доноров суммарный эффект сывороточных факторов в первые сутки после забора крови выражался преимущественно в ингибирующеы действии па первичный ответ спленоцитов в культуре in vitro. Это сочеталось с умеренным количественным преобладанием Th (большая часть точек располагается в IV квадранте).

При обследовании беременных женшин большинство точек расположено в III квадранте (распределение по квадрантам -0,0% : 14,4% : 64,4% : 21,2% соответственно), что соответствует сочетанию ингибирующего эффекта сывороточных факторов с количественным преобладанием Ts и согласуется с данники литературы.

У больных с поллинозом распределение точек по квадрантам соответствовало соотношению 38,0% : 28,6% : 28,6% : 4,8%, т.е. у больных с атопичзскиы синдромом точки распределены во всех квадрантах, но преимущественно a I ( сочетание стимулирующего аффекта сыворотки с количественным преобладанием Т-хелперов), II .(сочетание стимулирующего эффекта' с преобладанием "исла

Рисунок ■ 1. Распределение в системе координат прироста или убыли числа АОК и соотнесения количества ТЬ и Тэ точек, соответствующих значениям зтих показателей, полученных у обследованных лиц.

Т-супрессоров) и III (сочетание ингибирующего эффекта сыворотки с количественным преобладанием Т-супрессоров). В IV квадранте располагается одна точка, т.е. сочетание ингибирующего эффекта сыворотки с количественным преобладанием Т-хелперов не характерно для этой группы обследованных. Полученные данные свидетельствуют о том, что группа больных с поллинозами неоднородна, и при обследовании этих больных может наблюдаться как выраженпое количественное преобладание Т-хелперов, так и Т-супрессоров.

Соотношение внутри квадрантов точек, отражающих сочетание количественных и функциональных показателей в обследованных группах, также неравномерно ( Таблица 3.).

Таблица 3.

Распределение точек по типу сочетания "начального" эффекта сывороточных факторов и соотношения Т-хелперов/Т-супрессоров в группах обследованных лиц (%).

N квад- Здоровые Беременные Больные

ранта ' доноры .женщины поллинозами

I 25,0 0,0 75,0

II 0,0 33,0 67,0

III 17,4 44,6 38,0

IV 70,6 23,5 5,9

Значительное различие в распределении точек наблюдается для сочетания "стимулирующий эффект сыворотки - количественное преобладание Th": в этом квадранте преобладают точки, полученные при обследовании больных поллинозом. В квадранте "стимулирующий эффект сыворотки - количественное преобладание Ts"- также преобладали точки, полученные при обследовании больных поллинозом. Это соответствует данным литературы, свидетельствующим о преимущественно хелперном характере регуляции при данной патологии (Чередеев А.Н. 1989; Zacl.jtny C.B. et al. 1985). Кроме того, скопление точ^к во II квадранте может свидетельствовать о несостоятельности Ts у больных поллинозом, т.е. ситуации, когда, несмотря 'на накопление значительного количества клеток с функциональной недостаточностью, имеющийся дефе :т не

компенсируется. В III квадранте (сочетание "кнгибирущего эффекта" сывороточных факторов с количественным преобладанием Т-супрессоров) большее число точек получено при обследовании беременных, что также согласуется с данными литературы (Бесе-дин В.Н. и др. 1990; Валецкий В. Л. и др. 1989; СгоБятапСЬ. .1. 1985). В IV квадранте большая 'тасть точек получена при обследовании здоровых доноров.

Б каждом квадранте можно выделить "независимые" зоны, в которых располагаются точки только одной группы обследованных лиц, и зоны "пересечения", в которых располагаются точки, полученные при обследования двух и даже трех групп (Рис. 1). Площади "независимых" зон значительно больше, чем площади зон пересечения, что подтверждает наличке взаимосвязи сочетания количественных показателей регуляторных субпопуляций ц суммарного эффекта сывороточных факторов, проявляющегося в течение первых суток при различных типах состояния регуляторных механизмов ("сбалансированном", преобладании "хелперного" или "супрессорного" звеньев).

Для сравнительной оценки количественных показателей регуляторных субпопуляций и функционального состояния иммунорегу-лирующих механизмов на основании определения суммарного эффекта сывороточных факторов крови проводили корреляционный анализ отношения числа Т11 и Те и показателя прироста или убыли количества АОК в культуре (ДАОК) в сроки, соответствующие "раннему" и "отсроченному" эффектам. Данные представлены в таблице 4. Значения коэффициентов свидетельствуют об отсутствии корреляции между исследованными показателями во всех обследованных группах, т.е. не существует прямой связи между количеством ТЪ и Тб и эффектом сывороточных факторов, действие которых реализуется в периоды инкубации 24-72 часа н через 96 часов от начала инкубации. Основной причиной этого по-виднкому, является то обстоятельство, что нами оценивается интегральный эффект сывороточных факторов, а количественные показатели регуляторных субпопуляций отражают состояние одного из звеньев иммуно-регулирущих механизмов.

Оценка состояния регуляторных механизмов по эффекту сывороточных факторов крови, может быть косЕенным свидетельством большей адекватности предлагаемого, подхода по сравнению с количественной оценкой регуляторных субпопуляций лимфоцитов.

Таблица 4.

Значения коэффициентов корреляции для соотношения Т-хелперов и Т-супрессоров и показателей "раннего" и "отсроченного" эффекта сывороточных факторов в группах обследованных лиц

Коэффициенты корреляции

Эффект Здоровые Беременные Больные

доноры женщины поллинозом

"Ранний" 0,170 0,155 0,090

"Отсрочен-

ный" 0,290 0,124 0,680

Прямым доказательством этой точки зрения являются результаты обследования некоторых больных, включающие данные'оценки суммарного эффекта сывороточных факторов крови.

Проведенные исследования выявили противоречие между количественными показателями субпопуляций лимфоцитов и состоянием регуляторных механизмов иммунитета в момент забора крови: о одной стороны, наблюдается количественное преобладание ТЬ, а о другой - снижение числе В-лимфоцитов и низкие концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови. Параметры кривой, отражающей суммарный аффект сывороточных факторов крови свидетельствовал о преобладании ннгибирующего воздействия в течение 72 часов от начала исследования с выраженным ингибирувдям эффектом в пер* выэ сутки, что свидетельствовало о более объективном отражении состояния иммунорегуляторных механизмов в момент обследования больного. В ряде случаев оценка состояния регуляторных "механизмов представляется более реальной, чем значения количественных показателей: так, суммарный эффект сыворотки крюви большинства больных с ьтопическим синдромом в течение первых суток проявляется как стимулирующий, даже в тех случаях, когда оценка количественных показателей свидетельствует о преобладании числа Те; точки, полученные при обследовании большинства беременных . женщин соответствуют. ингибирующему "начальному" эффекту сывороточных факторов, что еще раз подтверждает наличие при беременности супрессорного'фона, обеспечивающего развитие толерантности иммунной системы матери по отношению к ан-

тигенам плода. При дополнительно проведенном обследовании больных выявлены варианты, когда предлагаемый нами подход был более адекватным, чем значения количественных показателей регуляторных субпопуляций.

При практическом применении предлагаемого подхода в ряде случаев может наблюдаться несовпадение параметров состояния регуляторных механизмов и количественных показателей регуля-торных субпопуляций, что, возможно, вызвано следующими причинами:

1. Предлагаемый подход предполагает оценку воздействия на процесс антителогенеза всех факторов сыворотки крови, а не ка-кого-лнбо отдельного звена системы иммунорегуляцни.

2. Доказана морфологическая неоднородность лимфоцитарных субпопуляций, т.е. в одной и той же субцопуляции лимфоцитов содержатся клетки с различным функцногальным предназначением, например, CD4+ лимфоциты содержат собственно хелперы и индукторы супрессии (Dohlsten М. et al. 1988).

3. В онтогенезе существуют периоды, когда на-фоне количественного преобладания хелперов наблюдается высокая функциональная активность супрессоров (Вельтищев Ю.Е. 1989; Bradley L.M. 1989) или, как в период новорожденное™, в крови циркулирует существенное количество клеток с "двойной маркировкой" -"хелперов-супрессоров".

Результаты собственных исследований, посвященные изучению воздействия сывороточных факторов крови человека на первичный иммунный ответ спленоцитов мыши In vitro, позволили определить условия создания культуры, максимально отвечающей цели работы. В процессе исследования были выделены основные параметры кривых, отражающих воздействие сывороточных факторов при различных вариантах состояния регуляторных механизмов: равновесном -у здоровых доноров, преобладании супрессорного воздействия - у беременных и преобладании хелперного звена регуляции - при атопическом синдроме. Для каждой группы обследованных лец выявлены несколько основных типов воздействия сывороточных факторов-. Показана взаимозависимость соотношения Th/Ts и эффекта сывороточных факторов на процессы антителогенеза в. культуре in vitro, оказываемого в течение первых суток. В основание предлагаемого подхода оценки состояния регуляторных механизмов положена замена взвеси клеток, обычно используемой для определе-

вия функциональной активности лимфоцитов, сывороткой, что дает определенные преимущества для широкого использования его в лабораторной практике. В ряде случаев используемый способ оценки состояния регуляторных механизмов является более адекватным по сравнению с количественной оценкой регуляторных субпопуляцнй лимфоцитов.

ВЫВОДЫ

1. Для определения суммарного эффекта сывороточных факторов крови оптимальной является модель культуры спленоцитов мыши, в которой возможен учет антителообразующих клеток, способствующая получению максимального количества антителопро-дуцентов в культуре в наиболее ранние сроки от начала культивирования и обеспечивающая "нормальный" характер кривой развития индуцированного иммунного ответа in vitro в минимальный срок культивирования, достаточный для оценки нескольких периодов действия экзогенных иммунорегулирующих факторов.

2. При обследования здоровых доноров можно выделить три основных типа кривых,. отражающих суммарный эффект сывороточных факторов крови в системе первичного иммунного ответа in vitro: кривыэ I типа соответствуют стимулирующему эффекту сыворотки крови; кривые II тип«— "равновесному" состоянию иммунорегулирующих механизмов; III типа - ингибирующему эффекту сывоточных факторов. . ■ • ■

3. Выявлена взаимосвязь между характером кривой, отражающей суммарный эффект сывороточных факторов, и сроками беременности. Наблюдается тенденция уменьшения интенсивности стимулирующего воздействия сывороточных факторов от начала беременности к концу.

4. При обследовании большинства Сольных с атопией выявлен стимулиругздий "начальный" эффект, практически не наблюдающийся у здоровых доноров. При этой патологии наблюдаются высокие показатели "отсроченного" стимулирующего эффекта, . в некоторых случаях многократно превосходящие соответствующие показатели, полученные при обследовании други.: групп.

5. Сравнительный анализ показателей состояния регулятор-кал механизмов и количества лимфоцитов регуляторных субпопуля-. цнй показал, что для здоровых доноров характерно гочетание ингибирующего "начального"-эффекта сывороточных факторов г уме-

ронным преобладанием числа Т-хёлперов, для женщин с физиоли-чески протекающей беременностью - сочетание ингибирующего эффекта сывороточных факторов с количественным преобладанием Т-супресооров, а для больных с атопией сочетание стимулирующего эффекта сыворотки с количественным преобладанием Т-хелперов или Т-супрессоров.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Особенности суммарного эффекта сывороточных факторов крови здоровых доноров, беременных и больных с атопией могут служить основой для разработки дифференциально-диагностических критериев при оценке состояния иммунорегуляторных механизмов при различных вариантах "несбалансированного" состояния механизмов иммунологической регуляции, однако для практического применения, более-информативной является параметрическая оценка каждой кривой, поскольку она позволяет судить о соотношении регулирующих механизмов у каждого обследуемого индивидуума, и, в случае выявленных отклонений, решать вопрос о назначении средств иммунокоррекции или иммунопрофилактики.

2. При обследовании больных с аллергическими заболеваниями необходимо определение не только количества Т-лимфоцитов регуляторных .субпопуляций, но и оценка функционального состояния регуляторных механизмов, поскольку последняя в ряде случаев более адекватна, чем количественные показатели Т-клеток.

3. Рекомендуется к практическому:применению разработанный, апробированный и внедренный в клиническую практику новый метод оценки функционального состояния регуляторных механизмов иммунной системы, основанный на определении суммарного эффекта сывороточных факторов крови на первичный иммунный ответ спле-ноцитоз мыши in vitro. При этом для получения культуралыюй модели, оптимальной для оценки суммарного эффекта сывороточных факторов крови необходимо соблюдать следующие условия получения спленоцитов: примирование животных за 96 часов до начала культивирования внутривенным введением 0,1 мл взвеси эритроцитов барана в концентрации 200 млн кл/мл; длительность культивирования - 5 суток. Индивидуальный анализ кривых разности числа антителопродуцентов в контрольной и . опытной культурах должен включать определение нескольких параметров, по значени-

ям которых можно оценить следующие показатели суммарного аффекта сывороточных факторов крови: а) "начальный" эффект; б) интегральную характеристику отрезков кривой, располагающихся выше или ниже оси абсцисс; в) "ранний" эффект; г) "отсроченный" эффект.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Иммунологические реакции у детей в различные периоды онтогенеза. Стефани Д.В., Ружицкая Е.А,, Раба Г.П. // Депон. рукоп. sa N Д-22652 от 21.07.92. ГЦНБ, с. 41,

2. Регуляторные субпопуляции Т-лимфоцитов (теоретические -и клинико-прикладные аспекты). Стефани Д.В., Ружицкая Е.Д., Раба Г. П. //Депон. рукоп. за N Д-22651 от 21.07.92 ГЦНВ, с.37.

3. Новый подход к оценке функциональной активности регу-ляторных субпопуляций Т-лимфоцитов, Раба Г.П., Ружицкая Е.А., Стефани Д.В. // Tes. докл. на I Республиканском съезде аллергологов и иммунологов Азербайджана, Баку, 1992 г. с. 197-198.

.4. Сыворотка крови, как отражение продуктивности регуля-торных механизмов иммуккой системы. Айабий И.И., Раба Г.П., Царан H.A. // Тоз< "дохл, итоговой аеучно-практической конференции Кишиневского медицинского университета им H.A. Тествми-цану, 1993 г.

Изобретение

1, Способ оценки функционального состояния регуляторных механизмов иммунной системы. Стефани Д.В., Раба Г.П., Ружицкая Е.А.» // Положительное решение ВНИИГПЭ от 0 февраля 1993 г. N 92-009291/14.

Рационализаторское ' предложение

1. Способ оценки функционального состояния иммунокомпе-тентных клеток на основании сравнительного субпопуляциоиного анализа. Стефани Д.В,, Раба Т.П., "ужицкая Е.А. // Удостоверение N 900 от 16.06.92.