Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Оценка бактерицидной активности биологических жидкостей в норме и при патологии с помощью лазерной проточной цитометрии

и

На правах рукописи

БУДИХИНА АННА СЕРГЕЕВНА

1

ОЦЕНКА БАКТЕРИЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ С ПОМОЩЬЮ ЛАЗЕРНОЙ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ

14 00 36 - Аллергология и иммунология

Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ииаов 1247"

Москва, 2007 г

003061247

Работа выполнена в ГП ГНЦ «Институт иммунологии Федерального Медико-биологического агентства России»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Пинегин Б В.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Филатов А.С

доктор медицинских наук, профессор Винницкий Л.И.

Ведущая организация* ГУ Российский онкологический научный центр имени Н Н Блохина РАМН

Защита состоится " aucJ^sí}^ 2007 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 208 017 01 в ГП ГНЦ «Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства России» по адресу 115478, Москва, Каширское шоссе, дом 24, корп 2 Факс (095)117-10-27

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГП ГНЦ «Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства России» Автореферат разослан " имхгq_2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета, <_ ¿ <- <•" ^ -- —-

доктор медицинских наук Л С Сеславина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Оценка иммунного статуса человека - одна из главнейших задач клинической иммунологии, которая заключается в определении состояния гуморальных и клеточных звеньев иммунитета, а так же местного иммунитета Поэтому для получения наиболее полной картины о патологическом процессе, о динамике его течения необходимо разрабатывать и внедрять в клиническую лабораторную практику новые простые в исполнении методы исследования, а так же усовершенствовать уже имеющиеся

Бактерицидные свойства крови и других биологических жидкостей организма играют важную роль в защите организма от инфекции Бактерицидные свойства сыворотки крови обусловлены как иммунными так и не иммунными механизмами К первым относится бактериолитический эффект антител и комплемента, ко вторым - различные бактерицидные белки и антибактериальные пептиды [Caccavo D , et ai, 2002, Ginsburg I, 2002, Li Y M , et al, 1998] Способность организма убивать микробы является важным параметром в оценке иммунного статуса человека в норме и при патологии Ослабление бактерицидное™ сыворотки способствует повышению чувствительности к инфекциям [Jankowski S , 1995]

Ротовая полость является входными воротами инфекции Слизистая оболочка ротовой полости является важным барьером на пути проникновения микробов Слюна играет важную роль в обеспечении гомеостаза ротовой полости Слюна содержит большое число протеинов (лизоцим, лактоферрин, лактопероксидаза, иммуноглобулины, муцины, агглютинины и др) и пептидов (гистатины, дефензины, кателицидины), обладающих антимикробными свойствами По данным Andoh А, Fujiyama Y и сотр в слюне содержатся и активные компоненты системы комплемента, которые так же могут участвовать в местных иммунных и воспалительных ответах в ротовой полости [Andoh А, Fujiyama Y, et al, 1997]

Использование проточной лазерной цитометрии на сегодняшний день является идеальным методическим подходом для оценки бактерицидных свойств биологических жидкостей. По сравнению с другими методами (бактериологическим, спектрофотометрическим, радиобиологическим), позволяющими оценить этот показатель, цитометрия имеет существенные преимущества высокая скорость и точность измерения, объективность, простота постановки реакции и быстрое получение результата

Цель работы. Целью работы явилось оценить бактерицидную активность биологических жидкостей in vitro с помощью цитометрического метода в норме и при различных патологиях

Задачи исследования:

1 Разработать цитофлюориметрический метод определения бактерицидной активности биологических жидкостей

2 Исследовать бактерицидную активность сыворотки периферической крови и слюны здоровых доноров in vitro для определения интервалов нормальных значений показателей.

3 Оценить влияние времени инкубации на бактерицидную активность биологических жидкостей in vitro

4. Оценить вклад комплемента в бакгерицидность биологических жидкостей in vitro

5 Исследовать бактерицидную активность сыворотки крови у больных с нарушениями в иммунной системе и бактерицидную активность слюны у больных с воспалительными заболеваниями ротовой полости

Научная новизна. Впервые предложена и внедрена в клиническую практику модифицированная цитометрическая методика для оценки киллинга St aureus Cowan I биологическими жидкостями человека с использованием двойной метки флюоресцеин-изотиоцианат-пропидиум иодид (ФИТЦ+/ПИ+)

С помощью предложенного нового метода исследована бактерицидная активность сыворотки крови и слюны в норме и при патологиях, а так же количественно оценен вклад системы комплемента и

4

антител в процесс бактериолиза, индуцированного биологическими жидкостями

Продемонстрировано, что при нарушениях в гуморальном звене (при агаммаглобулинемии, при дефиците компонентов системы комплемента, при множественной миеломе) происходит уменьшение бактерицидное™ Кроме того, показано, что уменьшение бактерицидности сыворотки крови зависит от иммунохимического варианта множественной миеломы

Впервые показано, что у детей с хронической гранулематозной болезнью (ХГБ) и у пациентов с хроническим рецидивирующим фурункулезом (ХРФ) в стадии обострения бактерицидная активность сыворотки крови увеличена Увеличение бактерицидное™ сыворотки крови у детей с ХГБ, возможно, связано с увеличением в крови а-дефензинов

Впервые использован цитометрический подход для оценки местного иммунитета при воспалительных заболеваниях ротовой полости Было показано, что бактерицидная активность слюны увеличивается у больных с хроническим афтозным стоматитом и уменьшается при прогрессировании заболевания (при появлении эрозий и язв), а так же, на примере больных с красным плоским лишаем, отмечено, что бактерицидность слюны зависит от формы заболевания

Практическая значимость работы. Разработанный метод оценки бактерицидного действия биологических жидкостей подтвержден другими методами исследований Тесты просты в исполнении, поэтому их можно использовать для поточных исследований в лаборатории клинической иммунологии Набраны нормативные показатели бактерицидное™ биологических жидкостей (сыворотки крови и слюны)

На примере различных патологий показана возможность исследования бактерицидное™ биологических жидкостей с помощью проточной цитофлюориметрии Цитометрический метод оценки бактерицидное™ биологических жидкостей является перспективным в комплексе методов оценки иммунной системы человека

Определение бактерицидной активности биологических жидкостей может быть полезным для диагностики состояния иммунной защиты организма, для мониторинга течения инфекционных и воспалительных заболеваний, для оценки эффективности проводимой терапии. А так же возможно использование этого метода для отбора высоко эффективных сывороток и плазм на станциях переливания крови

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 3 научных работы Материалы исследований были представлены на конкурсе работ молодых ученых ГП ГНЦ «Институт Иммунологии ФМБА России» (Москва, 2004) и VI Съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Москва, 2006)

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 102 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения исследований, выводов, списка литературы, включающего 109 источников Работа содержит 14 таблиц и 21 рисунок

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика обследованных групп населения В процессе работы обследовано 259 человек Среди них

1) Доноры крови - 70 здоровых добровольцев (42 женщин и 28 мужчин) в возрасте от 18 до 60 лет (М±о, 28±6)

2) Доноры слюны - 78 некурящих человек (43 женщин и 35 мужчин) в возрасте от 18 до 60 лет (М±о, 28±6) с санированной ротовой полостью

3) Исследовали сыворотку крови, полученную от 27 здоровых доноров в возрасте от 18 до 50 лет, на 28-й день после иммунизации вакциной Пиопол (производство НПО «Петровакс Фарм»)

4) Больные с хроническим рецидивирующим фурункулезом - 17 человек (11 женщин и 6 мужчин) в возрасте от 19 до 56 лет (М+ст, 28±6)

5) Дети, больные ХГБ - 6 детей (1 девочка и 5 мальчиков) в возрасте от 5 мес до 18 лет.

6) Больные множественной миеломой - 35 человек, (21, 10 и 4 пациента с иммунохимическим вариантом IgG, IgM и IgA, соответственно) в возрасте от 49 до 83 лет

7) Больные агаммаглобулинемией - 5 детей в возрасте от 2 до 12 лет

8) Больные с дефицитом системы комплемента - 2 пациента

9) Больные хроническим рецидивирующим стоматитом, эрозиями и красным плоским лишаем - 9, 8 и 5 человек, соответственно

Приготовление образцов биологических жидкостей

Пробирки с кровью, полученной из кубитальной вены доноров натощак, ставили в термостат при +37° С на 30 мин После ретракции сгустка пробирки ставили в холодильник при +4° С на 30 мин Для получения плазмы кровь брали с гепарином 20 ЕД/мл Пробирки с сывороткой или плазмой центрифугировали 2Q0g 15 мин

Цельная слюна была собрана у здоровых некурящих доноров утром через 2 часа после еды и ополаскивания рта водой Далее образцы центрифугировали при 10000 g 15 мин для удаления дебриза

Оценка бактерицидного действия биологических жидкостей методом проточной лазерной цитометрии

Бактерии (St aureus штамм Cowan I) для оценки бактерицидное™ биологических жидкостей метили ФИТЦ Суточную культуру St aureus смывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ), дезинтегрировали колонии с помощью ультразвука на УЗ-бане (51 кГц, 90W) 2 часа, осаждали при ЮООд 25 мин и отмывали 10 мл ФСБ Второй раз отмывку проводили 0,01 М карбонатно-бикарбонатным буфером (рН=9,5) Ресуспендировали в этом же буфере и по стандарту мутности концентрацию бактерий доводили до 1х108/мл К суспензии добавляли свежеприготовленный раствор ФИТЦ из расчета 1мг/мл и выдерживали в течение 16 часов при +4°С в темноте (St aureus-ФИТЦ*) После инкубации St aureus-ФИТЦ* триады отмывали ФСБ (ЮООд 25 мин), ресуспендировали в ФСБ с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки и 5% диметилсульфоксиде (ДМСО) Концентрацию St aureus-ФИТЦ* доводили до 5х108/мл с помощью Tru

Count пробирок с известным количеством микробусинок Аликвоты хранили при -70°С

Для этого инкубировали 90 мкл биологической жидкости и 90 мкл St аигеиз-ФИТЦ+ (1х106/мл) в течение 1, 3 и 24 часов в 96-луночном круглодонном планшете при +37°С Контролем реакции была спонтанная гибель St аигеиз-ФИТЦ+ (бактерии с ФСБ, находящиеся в тех же условиях) Для оценки вклада комплемента в бактериолиз биологические жидкости предварительно прогревали на водяной бане при +56° С 30 мин После бактерии осаждали центрифугированием 1000 g 10 мин и ресуспендировали в 200 мкл ПИ (2,5 мкг/мл) на ФСБ Через 10 мин образцы анализировали на проточном цитофлюориметре FACS Calibur («Becton Dickinson») в программе CellQuest Оценивали процент двойных позитивных бактерий (ФИТЦ+/ПИ+) среди St aureus-ФИТЦ* Процент киллинга стафилококка биологическими жидкостями вычисляли путем вычитания значения, полученного в контрольной пробе, из значения опытной пробы

Оценка бактерицидной активности биологических жидкостей бактериологическим методом

St aureus штамм Cowan I (1х104/мл) в равных объемах смешивали с биологической жидкостью и инкубировали в 96-луночном круглодонном планшете в течение 3-х часов при 37°С После содержимое лунок высевали на мясопептонный агар в чашках Петри Результаты учитывали по числу выросших колоний (КОЕ) Расчет процента киллинга производили по формуле

% киллинга =(КОЕ к - КОЕ „)/ КОЕ о*100 КОЕ к- количество колоний, выросших в контрольной чашке Петри КОЕ о - количество колоний, выросших в опытной чашке Петри

Фотометрический метод оценки ингибирующей рост бактериальной культуры активности сыворотки крови

Исследуемую сыворотку в соотношении 1 3 добавляли к жидкой питательной среды Mueller-Hinton, инокулированной стандартным штаммом Staphylococcus aureus АТСС 29213 в концентрации 1x106/мл В контроле

использовали чистую культуру микроорганизмов в аналогичной концентрации Кинетику их роста регистрировали с помощью фотометра в течение 18 часов при 37°С и при встряхивании планшета каждые 5 мин в условиях автоматического микробиологического анализатора Оценка в динамике концентрации клеток в бактериальной суспензии осуществлялась компьютерной программой «Микроб-автомат» с гюмощью «Автоматизированного рабочего места врача-микробиолога, химиотерапевта и эпидемиолога» [Скала Л 3 и др , 2001] Ингибирующую активность сыворотки выражали в проценте подавления роста бактериальной культуры [Михайлова Н А и др , 2005].

Выделение лейкоцитов на желатине

Лейкоцитарную суспензию получали из гепаринизированной крови после спонтанной седиментации эритроцитов в 3% растворе желатины на ФСБ с рН=7,4 Затем лейкоциты двукратно отмывали в ФСБ

Оценка внутриклеточного содержания а-дефензинов в лейкоцитарной суспензии

Лейкоцитарной суспензии (ЮОтыс клеток/мл) обрабатывали фиксирующим-пермеабилизирующим раствором в течение 20 мин при +4С° Затем вносили мышиные моноклональные анти-HNP антитела (10мкг/мл) и инкубировали в течение 20 мин при +4С° Далее клетки окрашивали козьими-антимышиными-РЕ антителами в течение 20 мин при +4С° Пробы анализировались на проточном лазерном цитометре FACSCalibur (Beckton Dickinson) в программе CellQuest Оценивали Geo Mean

Определение содержания дефензинов в плазме крови

Количественное содержание дефензинов в плазме крови определяли твердофазным иммуноферментным анализом, применяя коммерческую тест-систему фирмы «Ну Cult biotechnology b v »

Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку результатов выполняли с помощью программы «Statistics 6 0» Достоверность уровня различия сравниваемых

9

величин оценивали с помощью t-критерия Стьюдента, критериев Вилкоксона и Манна-Уитни Взаимосвязь изучаемых параметров оценивали с помощью коэффициента корреляции (г) при уровне значимости р<0,05 [Гланц С , 1999]

Обработку данных, полученных с помощью проточного цитометра FACSCalibur, осуществляли в операционной системе Windows-98 с помощью прикладной программы Win MDI 2 8 фирмы Microsoft

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка бактерицидной активности биологических жидкостей с помощью проточной цитофлюориметрии

Для оценки бактерицидных свойств сыворотки крови ранее был предложен микробиологический метод, который предполагал высев смеси сыворотки крови и микробов после инкубации на чашки Петри с плотной питательной средой Учет результата производили через сутки по числу колоний [Taylor P. W , 1983] По сравнению с микробиологическим методом проточная цитометрия имеет очевидные существенные преимущества малая трудоемкость, быстрота (несколько часов, а не сутки), объективность и точность измерения (анализ 2000 событий и автоматическое вычисление процента погибших микроорганизмов)

В 1956 Muschel и Treffers был предложен автоматизированный фотометрический метод Исследователи измеряли изменение оптической плотности взвеси бактерий после инкубации с сывороткой крови Недостатком метода было завышение результата из-за осаждения взвеси бактерий в кювете [Muschel L Н , Treffers Н Р., 1956]

А в 1974 году для оценки бактерицидности сыворотки крови Fierer и сотрудниками был предложен радиометрический метод Бактерицидный эффект оценивали по высвобождению Cr51 и Сг^-меченных бактерий, недостаток этого метода очевиден [Fierer J , Finley F , Braude A 1,1974]

В данной работе предложено оценивать бактерицидность биологических жидкостей при помощи цитометрического метода, используя

для этого St aureus-ФИТЦ* [Saresella М , et al, 1997] В основе метода лежит двойное окрашивание бактерий флюорохромами ФИТЦ и ПИ, позволяющее визуально отделить убитые микроорганизмы от живых и оценить их количество

Бактерицидная активность биологических жидкостей доноров

Используя двойное окрашивание флюорохромами бактерий, проточная цитометрия позволяет оценить способность биологических жидкостей убивать St aureus На рис 1 представлен типичный пример цитофлюорограммы действия сыворотки крови здорового донора на St aureus-ФИТЦ"

Из рисунка 1 видно, что сыворотка крови этого донора убивает за Зчаса 20,9% St аигеиз-ФИТЦ\ а спонтанная гибель St aureus-ФИТЦ*, находящегося в тех же условиях, что и исследуемые образцы, составила 3,4% Подобная активность сыворотки крови наблюдалась и у остальных здоровых доноров (N=43)

Ранее исследователями было показано, что в процессе коагуляции крови может происходить высвобождение бактерицидных веществ из нейтрофилов [Sorensen О, Borregaard N, 1999], поэтому в работе был сопоставлен бактерицидный эффект сыворотки и плазмы

На примере 11 доноров установили, что гибель St аигеиз-ФИТЦ+ под влиянием сыворотки и плазмы крови равнялась 22,7±13,8% и 20,8±14% (М±ст), соответственно Так как различие числа убитых микробов этими жидкостям не превышало 2%, то можно считать, что бактерицидные активности сыворотки и плазмы крови практически не отличаются (методика «бережного» приготовления сыворотки крови)

При изучении слюны здоровых доноров (N=58) было показано, что за Зчаса инкубации она убивает 24,4±9,0% St aureus, те степень бактериолиза у обследованных доноров была в пределах от 15,4% до 33,4%

10'

Я.Щ

А

w

'С1 ......1?

FLJ-H

io......:ii

s

С.

D.

Рис,1. Цитофлюорограмма киллинга St.aureus биологической жидкостью.

А. - Dot Plot FL1/FL3, отображающий облако убитых (верхний квадрант) и живых (нижний квадрант) St. aureus-ФИТЦ*. В. - гистограмма убитых St. aureus-ФИТЦ* сывороткой крови донора (опыт). С. - Dot Plot FL1/FL3, отображающий облако убитых (верхний квадрант) и живых (нижний квадрант) St. aureus-ФИТЦ* D. - гистограмма спонтанной гибели St aureus-ФИТЦ~ (контроль).

Влияние времени инкубации на бактерицидность биологических жидкостей

При изучении влияния длительности инкубации биологических жидкостей с микроорганизмом оказалось, что гибель St. aureus зависит от времени инкубации (Рис. 2).

При 1-, 3- и 24- часовой инкубации в опытных пробах {N=10) гибель St, sureus-OWTLf под влиянием сыворотки составила 1,2±1,2%, 16,8±6,6% и 19,8±10г5% (М±о), соответственно. В контрольных пробах гибель St. aureus-ФИТЦ+ составила 0,5±0,4%, 2,1±0,2% и 2,8±0,1 % (М±а), соответственно.

Вероятно, что в первый час инкубации происходит лишь инициация бактериолиза бактерий, который заканчивается к третьему часу инкубации. Увеличение инкубации с 3 до 24 часов существенно не меняло степени бактериолиза сывороткой. Таким образом, 3-часовая инкубация St. aureus-ФИТЦ+ с сывороткой крови является оптимальной.

Киллинг о1час

Рис. 2, Зависимость бактерицидной активности биологических жидкостей от времени инкубации.

*** - р<0,001 достоверное отличие по сравнению с 3- часовой инкубацией слюны доноров.

Бактерицидный эффект слюны имеет существенные отличия от такового сыеоротки крови. Слюна за 3 часа инкубации {N=23) убивает 21,3±9,4% бактерий, а за 24 часа - 43,3±21,2%, то есть, число убитых

слюной бактерий увеличилось примерно в 2 раза по сравнению с 3-часовой инкубацией (р<0,001) В контрольных пробах гибель аигеиэ-ФИТЦ* через 3 и 24 часа составила 1,7±0,6% и 2,4±1%, соответственно Исходя из опытов с сывороткой крови, 1 час инкубации слюны с бактериями не исследовали

Отличие бактерицидности слюны от сыворотки крови, вероятно, связано с особенностью действия пептидов семейства гистатинов, отсутствующих в сыворотке крови Таким образом, для сыворотки крови оптимальный срок инкубации - 3 часа, а для слюны - 24 часа

Влияние прогревания биологических жидкостей на их бактерицидную активность

Прогревание сыворотки при 56'С в течение 30 мин снижало бактерицидную активность на 44% Прогревание слюны в таких же условиях практически не изменяло бактерицидной активности (табл 1)

Таблица 1 Зависимость бактерицидной активности биологических жидкостей от прогревания

Биологическая жидкость N Киплинг биологическими жидкостями St aureus,% (М±о)

контроль нативная гретая

Сыворотка крови 43 2,5±1,1 20,9+6,2 10,6***±5,3

Слюна 14 1,7±0,8 22,9±7,4 20,4±7,6

*** - р<0,001 достоверное отличие по сравнению нативной сывороткой крови здоровых доноров

Вероятно, что бактерицидная активность сыворотки складывается из термолабильного бактериолитического эффекта комплемента и естественных антител (44%) и из термостабильного эффекта бактерицидных белков и пептидов (56%), таких как дефензины, кателицидины, лактоферрин, лизоцим, фосфолипаза А2 и др [Jankowski S , 1995, Gronroos J О , Laine Veil J О , 2002, Ginsburg 1, 2002, Caccavo D ,

Pellegrino N M , 2002] Бактерицидная активность слюны практически на 100% обусловлена термостабильными белками и пептидами [Ahmad М , Piludu М , 2004, Nieuw Amerongen А V, Veerman Е С 1, 2002, Nieuw Amerongen А V , Bolscher J G М , 2004]

По всей видимости, иммунные механизмы не играют существенной роли в бактерицидности слюны

Корреляционный анализ метода проточной лазерной цитометрии с бактериологическим методом оценки бактерицидности биологических жидкостей

Обязательным этапом разработки цитометрического метода оценки бактерицидного действия биологических жидкостей было его сравнение с классическим бактериологическим методом Иллюстрация по 11 опытным сывороткам крови здоровых доноров представлена на рис 3

Корреляция т- 0,84

Киплинг St aureus сывороткой крови, %_

(цитофшоориматрический МвТОД) | М, 954 confidence |

Рис 3 Корреляция между цитометрическим и микробиологическим методами оценки киллинга St aureus

Цитометрический метод оценки киллинга показал высокую корреляцию с классическим микробиологическим методом коэффициент корреляции г= 0,84 при значимости р< 0,05

Корреляционный анализ метода проточной лазерной цитометрии с фотометрическим методом оценки бактерицидности биологических жидкостей

В работе была показана высокая степень корреляции цитометрического и спектрометрического методов Был получен положительный коэффициент корреляции (г=0,92) двух методов при значимости р<0,05 (рис 4)

Корреляция г =0,92

Киплинг сыворотхой крови St aureus^_

(ЦИТОфЛЮОрИМеТрИЧеСХИЙ МетОЙconfidence!

Рис 4 Корреляция между цитометрическим и фотометрическим методами оценки киллинга St aureus

Оценка бактерицидной активности сыворотки крови у пациентов с агаммаглобулинемией

В бактерицидность сывороток крови у детей с агаммаглобулинемией составила 10,4+6,0%, что на 45,5% ниже бактерицидности сыворотки крови здоровых доноров Кроме того, после прогревания сыворотки при 37"С в течение 30 мин этот показатель у больных практически не изменился (снижение с 10,4% до 8,4%) (табл 2)

Хотя иммуноглобулины не обладают прямыми микробицидными свойствами, но они потенцируют бактериолитический эффект комплемента, который вносит существенный вклад в процесс бактериолиза Отсутствие

1д6 и 1дМ в сыворотке крови приводит к блоку активации системы комплемента по классическому пути, который является быстрым и наиболее эффективным Таким образом, бактерицидность сыворотки крови у больных с агаммаглобулинемией обусловлена лишь системой термостабильных бактерицидных белков и пептидов

Таблица 2 Определение бактерицидной активности сыворотки крови у больных с агаммаглобулинемией и с дефицитом С4 компонента комплемента.

Группы Киллинг сывороткой крови аигеиз,% (М±ст)

контроль нативная гретая

Пациенты с агаммаглобулинемией (N=5) 2,8±1,0 10,4**±6,0 8,4±6,7

Пациенты с дефицитом С4 компонента комплемента (N=2) 3,5±0,7 16,3±10,4 13,8±5,7

Здоровые доноры (N=65) 2,4±1,2 19,0±6,6 10,6±5,3

** _ р<0,01 достоверное отличие бактерицидной активности сывороток больных по сравнению с бактерицидностью сывороток крови здоровых доноров

Оценка бактерицидной активности сыворотки крови больных с дефицитом системы комплемента

У пациентов с дефицитом С4-компонента комплемента бактерицидная активность сывороток крови до и после прогревания при 56'С в течение 30 мин Практически не отличалась (табл 2)

Таким образом, бактерицидное действие сывороток крови у них обусловлено бактерицидными протеинами и пептидами

Оценка бактерицидной активности сыворотки крови больных хронической гранулематозной болезнью

При исследовании бактерицидной активности сывороток крови больных ХГБ было показано достоверное увеличение на 40% числа убитых бактерий по сравнению со здоровыми донорами (рис 5).

Киплинг St. aureus % 45 i iO 35 -30 25 20 15 10 5 0

31.3*

□ контроль ED наша а гретая

2,1

17,2"

19,0

I

Ш

9,4

ХГБ (N=6)

Здоровые доноры {N=10}

Рис. 5. Определение бактерицидной активности сывороток крови больных ХГБ.

*** - р<0,001 и ** - р<0,01 достоверное отличие бактерицидной активности сыворотки крови больных по сравнению с бактерицидностью сыворотки крови здоровых доноров.

Интересно, что а плазме крови этих детей было выявлено им.муноферментным анализом высокое содержание HNP1-3, в сотни раз большее, чем у здоровых доноров (р-^0,001). Концентрация HNP1-3 в плазме крови у больных ХГБ и у доноров равнялась HNP1-3 481,7±333,9 нг/мл и 3,5±7,7 нг/мл, соответственно.

Отметим, что параллельно с увеличением количества HNP1-3 в циркулирующей крови у больных отмечено достоверное снижение содержания внутриклеточных дефензинов в нейтрофилах по сравнению со здоровыми донорами (р<0,001). Так, Geo Mean нейтрофилов, обработанных анти-Н№Р1-3 Ат, у больных ХГБ и у доноров составила 502,1±100,0 и 680,0±67т8, соответственно.

Высокая бактерицидность сыворотки крови у этих пациентов, обусловленная повышенной дегрануляцией азурофильных гранул нейтрофилов (маркером которых являются HNP1-3), вероятно, -компенсаторна. Возможно, это попытка макроорганизма противостоять укрытию микроорганизмов в несостоятельных к килпингу фагоцитах и распространению бактерий а организме.

Высокое содержание антимикробных пептидов в циркулирующей крови уменьшает число тяжелых бактериальных инфекций и обеспечивает более легкое течение заболевания. Это предположение основано на ранее проведенных работах Zhang и его сотрудников Они показали, что высокий уровень HNP1-3 у ВИЧ-положительных пациентов предотвращал прогрессирование СПИДа, а при снижении этого показателя заболевание у них прогрессировало [Cole А М , 2005, Zhang L , et al, 2002]

Оценка бактерицидной активности сыворотки крови у больных хроническим рецидивирующим фурункулезом

При исследовании бактерицидности сывороток крови больных хроническим рецидивирующим фурункулезом (N=17) было выявлено достоверное повышение бактерицидной активности сыворотки крови на 34,8% по сравнению с донорами (рис 6) Повышение процента киллинга бактерий сывороткой крови ХРФ по сравнению со здоровыми донорами свидетельствует о наличии воспалительного процесса у этой группы

При воспалении отмечается увеличение концентрации в периферической крови как компонентов вторичных гранул нейтрофилов (лизоцим, лактоферрин, hCAP18//LL37 и др), так и первичных гранул нейтрофилов (HNP1-3, BPI, эластаза, протеиназа и др) [Conneely О М, 2001, Levy О, 2000] В норме большая часть первичных гранул высвобождается в фаголизосомы и лишь незначительная во внеклеточное пространство В результате этого бактерии внеклеточно подвергаются воздействию еще больших концентраций антимикробных протеинов и пептидов Это обеспечивает большую эффективность борьбы макроорганизма с инфекцией, что и было отражено в проведенном исследовании

Таким образом, по повышению бактерицидной активности сыворотки крови можно судить о степени развития воспалительного процесса у этих больных, а так же применять этот показатель для оценки эффективности проводимой терапии у этих пациентов

Киллинг

50 40 30 ■ 20 -10 -о -

29, Й*'

□ контр

□ натианэл н гретая

2,7

17,3"

22.1

2,9

12,7 ■

ХРФ (N=17)

Здоровые доноры (N=14)

Рис. 6 Определение бактерицидной активности сывороток крови больных ХРФ.

*** - р<0,001 и ** - р<0,01 достоверное отличие бактерицидной активности сыворотки крови больных по сравнению с бактерицидностью сыворотки крови здоровых доноров.

Оценка бактерицидной активности сыворотки крови у больных множественной миеломой

При исследовании бактерицидное™ сыворотки крови больных с множественной миеломой с иммунохимическим вариантом 1дО и 1дМ показано достоверное снижение бактерицид ноет и сыворотки крови на 57,9% и на 40%, соответственно. В группе с 1дА вариантом множественной миеломы снижение бактерицидное™ по сравнению со здоровыми донорами было не достоверно (табл. 3).

Бактерицидная активность сыворотки крови складывается из совместного действия антител и комплемента, а так же системы антибактериальных протеинов и пептидов. Продукция парапротеина приводит к более или менее выраженному нарушению секреции нормальных иммуноглобулинов. По мере прогрессирования заболевания снижается уровень нормальных иммуноглобулинов вплоть до полного их исчезновения. При лабораторной диагностике это состояние проявляется в снижении бактерицидной активности сыворотки крови.

Таблица 3 Определение бактерицидной активности сыворотки крови у групп больных при множественной миеломе

Исследуемая группа N Киллинг сывороткой крови St aureus,% (М±ст)

контроль нативная гретая

Миеломная болезнь вариант 1дв 21 2,5±0,9 8,0***±2,3 6,1±2,4

Миеломная болезнь вариант 1дМ 10 2,3±1,0 11,4**±3.2 7,6±3,6

Миеломная болезнь вариант 1дА 4 2,5±2,1 14,3±3,7 10,3±4,5

Здоровые доноры 65 2,4±1,2 19,0±6,6 10,6±5,3

*** - р<0,001 и ** - р<0,01 достоверное отличие бактерицидной активности сыворотки крови больных по сравнению со здоровыми донорами

Таким образом, бактерицидная активность сыворотки крови у больных множественной миеломой обусловлена не действием комплемента и антител, а - термостабильными бактерицидными белками и протеинами

Оценка бактерицидной активности слюны при хроническом рецидивирующем афтозном стоматите

При исследовании бакгерицидности слюны больных с хроническим рецидивирующим афтозным стоматитом (N=9) оказалось, что бактерицидность слюны у них выше на 40,2%, чем у здоровых доноров (табл 4)

Увеличение бактерицидной активности слюны свидетельствует о степени выраженности воспалительного процесса у этих больных Увеличение числа убитых бактерий, по всей видимости, связано с высвобождением содержимого гранул нейтрофилов, привлеченных в очаг воспаления и активированных микробами ротовой полости. Исследователи отмечают увеличение содержания миелопероксидазы, НИР 1-3 и других пептидов в слюне у людей с воспалительными заболеваниями ротовой полости [М|гика\ма N , 1999] Эти вещества являются маркерами

воспаления Таким образом, увеличение НЫР 1-3 и миелопероксидазы связано с защитно-приспособительной реакцией организма

Таблица 4 Оценка бактерицидной активности слюны у больных с воспалительными заболеваниями рта и здоровых доноров

Группа Киллинг слюной St. aureus, %

Больные афтозным стоматитом(Ы=9) 34,6**±11,9

Больные с эрозиями слизистой (N=8) 9,3***±5,7

Доноры (N=75) 24,4±9,0

***** — р<0,001 и р<0,01 достоверное отличие бактерицидной активности слюны больных по сравнению с бактерицидностью слюны доноров

Антимикробные пептиды и протеины нейтрофипов и других клеток обеспечивают не только внеклеточный механизм киллинга, но так же влияют и на функционирование других клеток Важно отметить, что при высоких концентрациях (более 50 мкг/мл) HNP 1-3 и hCAP-18/LL37 проявляют цитотоксическое действие по отношению к клеткам собственного организма Кроме того, в этих концентрациях они индуцируют высвобождение IL8 и нейтрофил - активирующий белок-78 из эпителиальных клеток, что приводит к рекрутированию дополнительного числа нейтрофилов в очаг воспаления [Van Wetering S , Tjabringa S , et al, 2005] Из привлеченных в очаг воспаления нейтрофилов высвобождаются продукты окислительного взрыва нейтрофилов, а системы каталазы и супероксид дисмутазы не способны минимизировать их повреждающее действие на собственные ткани организма [Antinyazar H. С , et al, 2006] Так же из активированных нейтрофилов высвобождаются и эластаза, коллагеназа, желатиназа и др, которые так же вносят свой вклад в повреждение тканей [Kaufman Е, Lamster ( В , 2000] Прогрессирование воспаления приводит к подавлению процессов репарации в слизистой и появлению эрозий и язв на ней

При оценке бактерицидности слюны у больных с эрозиями слизистой оболочки рта (N=8) отметали статистически достоверное снижение

процента убитых микробов у этих больных на 61,9% и 76,2%, по сравнению с донорами и больными хроническим афтозным стоматитом (табл 4)

При сравнении показателей бактерицидной активности слюны между этими двумя группами было получено достоверное отличие (р<0,001)

Снижение бактерицидное™ слюны в этой группе, вероятно, обусловлено истощением защитных функций нейтрофилов слюны Lukac J и соавторами было показано, что у таких больных снижен фагоцитоз и бактерицидность нейтрофилов слюны [Lukac J , et al, 2003] Поврежденный эпителий рта уже так же не способен к продукции антимикробных протеинов и пептидов Кроме того, при длительном хроническом рецидивирующем течении заболевания происходит диерегуляция защитных механизмов организма, что приводит к сниженной выработке защитных факторов организма [West N Р, Pyne D В, et al, 2006] Такая ситуация благоприятствует инвазии микроорганизмов и осложнению состояния больного

Оценка бактерицидной активности слюны при красном плоском лишае

У больных с красным плоским лишаем (N=5) в среднем в группе отметили снижение процента убитых микробов у этих больных по сравнению с донорами (табл 5)

Таблица 5 Оценка бактерицидной активности слюны больных красным плоским лишаем

Исследуемая группа Киллинг слюной St aureus, %

Больные КПП (N=5) 14,9*±9,4

Доноры (N=75) 24,4±9,0

* - р<0,05 достоверное отличие бактерицидной активности слюны больных по сравнению с бактерицидностью слюны здоровых доноров

Таким образом, чем ниже был процент убитых микроорганизмов слюной, тем хуже состояние местной защиты

выводы

1 Предложен новый метод для оценки бактерицидное™ биологических жидкостей с помощью проточной лазерной цитометрии, заключающийся в двойном окрашивании флюорохромами бактерий, удобный для поточных исследований в практике лабораторий клинической иммунологии Результаты цитометрического метода высоко коррелировали с результатами бактериологического метода (г = 0,84, при р< 0,05) и фотометрического метода (г = 0,92, при р< 0,05).

2 При исследовании группы здоровых доноров определены норматавные значения показателя бактерицидное™ сыворотки крови и слюны 21,0+6,0% и 23,8+9,0%, соответственно

3 Имеются отличия в бактерицидном действии сыворотки крови и слюны в первом случае максимальный эффект достигается через 3 часа, во втором - через 24 часа

4 Бактерицидная активность сыворотки крови складывается из эффекта термолабильных (44%) и из термостабильных (56%) компонентов, а бактерицидность слюны определяется только термостабильными компонентами

5 У больных с агаммаглобулинемией, с дефектом системы комплемента и с 1дО- и !дМ-вариантами множественной миеломы наблюдается снижение бактерицидной активности сыворотки крови, тогда как, у больных с хроническим рецидивирующим фурункулезом и хронической гранулематозной болезнью - существенное повышение

6 У больных хроническим афтозным стоматитом наблюдается увеличение бактерицидной актавности слюны, у пациентов с эрозиями слизистой рта и с красным плоским лишаем - снижение

7. Оценка бактерицидных свойств крови доноров может использоваться на станциях переливания крови для отбора сывороток, обладающих максимальными протективными свойствами

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1 Будихина А С , Олиферук Н С , Пинегин Б В Новый метод определения бактерицидной активности биологических жидкостей с помощью лазерной проточной цитофлюориметрии Иммунология, 2006, т 27, №4, с 249-252

2 Будихина А С , Олиферук Н С , Пинегин Б В Оценка бактерицидной активности сыворотки крови с помощью лазерной проточной цитофлюориметрии Клиническая лабораторная диагностика, 2006, №10, с 48-51

3 Будихина А С, Михайлова Н А, Биткова Е Е, Хватов В Б, Пинегин Б В Изучение бактерицидной и ингибирующей активности сыворотки крови с помощью проточной цитометрии и фотометрического метода ЖМЭИ, 2007, №2, с 54-57

Подписано в печать G4 О ¿.0?' г. Формат 60x84/16 Тираж 100 эю. Заказ Отпечатано в службе множительной тсхаюш ГУ РОЩ РАМН им. H.H. Блохина РАМН 115478, Мосгаа, Каширское ш., 24