Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Оценка реактивности лейкоцитов при аденокарциномах желудочно-кишечного тракта

084603916 На правах рукописи

СОСНИНА Анастасия Викторовна

ОЦЕНКА РЕАКТИВНОСТИ ЛЕЙКОЦИТОВ ПРИ АДЕНОКАРЦИНОМАХ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- 2 СЕН 2010

Новосибирск - 2010

004608916

Работа выполнена в Учреждении Российской академий медицинских наук Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики Сибирского отделения РАМН (г. Новосибирск)

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Аутеншлюс Александр Исаевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Зубахин Александр Анатольевич

доктор медицинских наук, профессор

Сидоров Сергей Васильевич

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт региональной патологии и патоморфопогии Сибирского отделения РАМН (г. Новосибирск)

Защита состоится «28» сентября 2010 г. в 12:00 часов на заседании диссертационного совета Д 001.048.01 в Учреждении Российской академии медицинских наук Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН по адресу: ул. Тимакова, 2, Новосибирск, 630117. Тел/факс 8 (383) 333-64-56

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научного центра клинической и экспериментальной медицины СО РАМН

Автореферат разослан « ЛЬ ао7. 2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, д.б.н.

Пальчикова Н.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В России рак желудка и колоректалышй рак занимают одно из ведущих мест в структуре онкологической заболеваемости и относятся к злокачественным новообразованиям с неблагоприятным прогнозом (Давыдов М.И., Аксель Е.М, 2009). Согласно современным представлениям о взаимодействии злокачественного новообразования с факторами, обеспечивающими гомеостаз организма, антигены опухолевых клеток, хотя и распознаются иммунной системой (Crimeen-Irwin В. et al., 2005; Casiano С.А. et al, 2006; Ostrand-Rosenberg S, 2008), однако элиминация трансформированных клеток происходит далеко не всегда, так как реакции, направленные на уничтожение неоплазмы, играют противоположную роль, способствуя сохранению опухоли и ее прогрессии (Абелев Г.И, Эрайзер Т.Л., 2008). Важнейшим препятствием дня развития противоопухолевого иммунитета, который бы приводил к полному уничтожению трансформированных клеток, служит то обстоятельство, что опухоль, особенно на ранних стадиях развития, не является для организма чужеродной, и большинство опухолеассоциированных антигенов - это аутоантигены, по отношению к которым в организме существует относительная толерантность (Гранов A.M., Молчанов О.Е, 2008; Кадагидзе З.Г. и др, 2009). Растущая опухоль и ее микроокружение способны продуцировать ряд факторов, запускающих различные механизмы ускользания неоплазмы от иммунного надзора. К ним относятся сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), IL-10, TGFJ3, простагландин Е2, растворимый фосфатидилсерин, растворимые Fas, FasL и MICA. Они оказывают иммуносупрессивное действие и способствуют инвазии и метастазированию (Kim R. et al., 2007; Jain S. et al, 2008; Solberg T.D. et al., 2008; Lima L.G. et al, 2009).

Медиаторы воспаления, продуцируемые инфильтрирующими опухоль лейкоцитами, такие как TNFa, IL-ip, IL-6, IL-8 и т. п., взаимодействуя с рецепторами на клетках-мишенях, в частности на опухолевых клетках и клетках микроокружения, также вовлекаются в реализацию процессов, обеспечивающих жизнедеятельность злокачественного новообразования (Elaraj D.M. et al, 2006; Kulbe H. et al, 2007; Millar H.J. et al, 2008; Studebaker A.W. et al, 2008). Эффекты цитокинов во многом зависят от того, какие рецепторы и их сочетания окажутся в тот момент на клетках-мишенях, а также от присутствия регуляторов их активности, к которым относятся рецепторные антагонисты, связывающие белки и антитела (McFarlane S.M. et al, 2002; Zhu W. et al, 2004; Dudler J. et al, 2007; Szczesny T.J. et al, 2007). Последние, связывая цитокины, могут либо нейтрализовать их действие, либо, выполняя функцию переносчиков, обеспечивать их транспортировку к клеткам-мишеням, то есть, им принадлежит важная роль в регуляции развития злокачественного новообразования, однако характер этой регуляции опухолевой прогрессии не ясен и требует дальнейшего изучения (Абелев Г.И, 2003; Finkelman F.D. et al, 1993; Bakhiet M. et al, 1999).

Следовательно, реактивность лейкоцитов, в норме направленная на поддержание генетического постоянства организма, в условиях развития злокачественного новообразования способна обеспечивать либо выживание опухоли, либо торможение ее прогрессирования (Савина Н.П, 2009). Поэтому оценка свойств этих клеток является актуальной, так как позволит понять их роль в процессах адаптации опухоли в организме и поможет в дальнейшем разработать новые подходы к диагностике и созданию препаратов, изменяющих вектор механизмов гомеостаза, направляя его на предотвращение развития злокачественного новообразования.

Цель исследовании: изучить реактивность лейкоцитов по отношению к опухолеассоциировалным антигенам по экспрессии поверхностных молекул, продукции медиаторов воспаления и регуляторов их биологических эффектов у больных аденокарциномами желудка и толстой кишки.

Задачи исследования:

1. Определить содержание в периферической крови клеток, экспрессирующих маркеры CD3, CD4, CD8, CD20, CD25, CD38, CD71 и HLA-DR, и изучить реакцию in vitro мононуклеаров на опухолеассоциированные антигены - комплекс в составе раковоэмбрионального антигена, хорионического гонадотропина человека, нейроспецифической энолазы, углеводных антигенов - СА 19-9 и СА 125, альфафетопротеина и микроглобулина человека, у больных аденокарциномами желудка.

2. Определить содержание в периферической крови клеток, экспрессирующих маркеры CD3, CD4, CD8, CD20, CD25, CD38, CD71 и HLA-DR, и изучить реакцию in vitro мононуклеаров на опухолеассоциированные антигены - комплекс в составе раковоэмбрионального антигена, хорионического гонадотропина человека, нейроспецифической энолазы, углеводных антигенов - СА 19-9 и С А 125, альфафетопротеина и микроглобулина человека, у больных аденокарциномами толстой кишки.

3. Определить в сыворотке крови и в супернатантах цельной крови содержание цитокинов: IL-ip, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, IL-18, IFNa, IFNy, TNFa и связывающего IL-18 белка (IL-18BP) у больных аденокарциномами желудка.

4. Определить в сыворотке крови и в супернатантах цельной крови содержание цитокинов: IL-10, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, IL-18, IFNa, IFNy, TNFa и связывающего IL-18 белка (IL-18BP) у больных аденокарциномами толстой кишки.

5. Определить в сыворотке крови уровни аутоантител к TNFa, IFNa, IFNy, к фактору дифференцировки HLDF, а также содержание рецепторного антагониста IL-1 (IL-IRa) у больных аденокарциномами желудка.

6. Определить в сыворотке крови уровни аутоантител к TNFa, IFNa, IFNy, к фактору дифференцировки HLDF, а также содержание рецепторного антагониста IL-1 (IL-IRa) у больных аденокарциномами толстой кишки.

7. Изучить характер взаимосвязи между содержанием клеток с маркерами активации CD25, CD38, CD71 и HLA-DR, показателями реакции in vitro мононуклеаров на опухолеассоциированные антигены, уровнями цитокинов, связывающего IL-18 белка (IL-18ВР), аутоантител к TNFa, IFNa, IFNy, к фактору дифференцировки HLDF и патогистологическими параметрами опухолей у больных аденокарциномами желудка.

8. Изучить характер взаимосвязи между содержанием клеток с маркерами активации CD25, CD38, CD71 и HLA-DR, показателями реакции in vitro мононуклеаров на опухолеассоциированные антигены, уровнями цитокинов, связывающего IL-18 белка (IL-18ВР), аутоантител к TNFa, IFNa, IFN-y, к фактору дифференцировки HLDF и патогистологическими параметрами опухолей у больных аденокарциномами толстой кишки.

Научная новизна. Впервые в сыворотке крови больных аденокарциномами желудка и толстой кишки были обнаружены аутоантитела к фактору дифференцировки Human Leukemia Differentiation Factor - HLDF классов G, M, А и субклассов Gi, G2, G3, G4. У больных аденокарциномами желудка по сравнению со здоровыми лицами были повышены только уровни аутоантител субкласса G4 к фактору дифференцировки HLDF. Впервые на основании статистически значимой обратной корреляционной связи между уровнем аутоантител класса G4 к HLDF и глубиной инвазии аденокарцином желудка и толстой кишки показана сопряженность повышенных уровней аутоантител к HLDF с меньшей степенью тяжести опухолевой прогрессии.

Впервые у больных аденокарциномами желудка и толстой кишки выявлена позитивная реакция мононуклеарных клеток с фенотипом CD8+ на опухолеассоциированные антигены in vitro, которая свидетельствует о наличии в организме мононуклеаров, обладающих потенциальной способностью приобретать после контакта с опухолеассоциированными антигенами фенотип CD8+, присущий цитотоксическим клеткам, и которая сопровождается повышением содержания в периферической крови клеток с маркерами активации: CD25, CD38, CD71 и HLA-DR и включением механизма гуморальной

регуляции биологических эффектов медиаторов воспаления и фактора дифференцировки HLDF, показателями чего являются повышенные уровни аутоантител к TNFa и HLDF в сыворотке крови, а также повышенная продукция клетками крови IL-18BP в ответ на стимуляцию митогеном.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные при выполнении диссертационного исследования данные о реактивности лейкоцитов при аденокарциномах желудка и толстой кишки позволили выявить новое в патогенезе этих заболеваний -двойственную роль механизма гуморальной регуляции биологических эффектов медиаторов воспаления и фактора дифференцировки: с одной стороны, аутоантитела к фактору дифференцировки, супрессируя его эффекты, способствуют созданию оптимальных условий для сохранения опухоли и ее функционирования, а с другой - IL-18BP — белок, блокирующий активность цитокина IL-18, стимулирующего пролиферацию опухолевых клеток, оказывает сдерживающее влияние на опухолевую прогрессию. Эти факты создают основу для разработки новых подходов к лечению аденокарцином желудка и толстой кишки, в частности, с использованием фактора дифференцировки HLDF для блокирования антител, препятствующих дифференцировке опухолевых клеток и IL-18BP для ограничения активности провоспалительного цитокина IL-18, стимулирующего опухолевую прогрессию.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. У больных аденокарциномами желудка и толстой кишки выявлена реакция мононуклеарных клеток на опухолеассоциированные антигены, оцениваемая как позитивная при повышении содержания клеток с фенотипом CD8+ не менее, чем на 15% после их инкубации in vitro с этими антигенами по сравнению с контрольной пробой, не содержащей опухолеассоциированных антигенов, что свидетельствует о наличии в организме мононуклеаров, обладающих потенциальной способностью приобретать фенотип CD8+, присущий цитотоксическим клеткам, в ответ на контакт с опухолеассоциированными антигенами.

2. У больных аденокарциномами желудка и толстой кишки позитивная реакция мононуклеарных клеток на опухолеассоциированные антигены сопровождается повышением в периферической крови содержания клеток с маркерами СЮ5, CD38, CD71 и HLA-DR. и активацией механизма гуморальной регуляции биологических эффектов медиаторов воспаления и фактора дифференцировки Human Leukemia Differentiation Factor - HLDF, о чем свидетельствуют повышенные уровни аутоантител класса А к TNFa и субклассов G3 и G4 к HLDF в сыворотке крови, а также повышенная продукция лейкоцитами связывающего IL-18 белка - IL-18ВР в ответ на стимуляцию митогеном.

3. При аденокарциномах желудка и толстой кишки активируются функции мононуклеаров и гранулоцитов, о чем свидетельствует повышенное содержание в сыворотке крови больных аденокарциномами желудка IL-6 и IL-IRa, ay больных аденокарциномами толстой кишки, кроме повышенного содержания вышеуказанных цитокинов, и 1L-8. При раке желудка содержание провоспалительного цитокина IL-б находится в прямой корреляционной связи с количеством регионарных лимфоузлов, пораженных метастазами, а при колоректальном раке - со степенью васкуляризации опухоли, что свидетельствует о том, что при раке желудка IL-6 вовлечен в процесс метастазирования, а при колоректальном раке он преимущественно стимулирует анпюгенез.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены и обсуждены на межрегиональной научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» 26 - 28 сентября 2007 года в г. Омске; национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология - междисциплинарные проблемы» 26 - 27 февраля 2008 года в г. Москве; научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири - 2008» 16 -19 сентября 2008 года в г. Томске; Российской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 30-летию НИИ онкологии СО РАМН «Современная онкология: достижения и перспективы развития» 10-11 сентября 2009 года в г. Томске.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них 4 в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 3 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитированной литературы. Работа иллюстрирована 6 рисунками и 25 таблицами, указатель использованной литературы содержит 359 источников, из которых 42 отечественных и 317 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования

Объектом исследования служила периферическая кровь 157 человек: 93 больных аденокарциномами желудка и толстой кишки - 54 (58%) мужчин и 39 (42%) женщин; в возрасте от 40 до 80 лет (60,6 ± 1,0), из которых у 55 человек (59%) были диагностированы И, а у 38 человек (41%) - Ш стадии. Среди 52 больных раком желудка - 32 (61%) мужчин и 20 (39%) женщин; в возрасте от 42 до 74 лет (58,2 ± 1,3) у одной половины была II стадия, а у другой - III стадия заболевания. Среди 41 больного колоректальным раком - 22 (54%) мужчин и 19 (46%) женщин; в возрасте от 40 до 80 лет (63,8 ± 1,5) у 28 человек (68%) была II, а у 14 человек (32%) - III стадия. Группу сравнения для больных аденокарциномами желудка составили 13 человек с неонкологической патологией желудка - 7 (54%) мужчин и 6 (46%) женщин; в возрасте от 41 до 77 лет (57,6 ± 3,9): с язвенной болезнью желудка - 7 человек (54%) и с хроническим гастритом - 6 человек (46%), у которых диагнозы были подтверждены результатами биопсии, которая не выявила наличия предраковых изменений. Основанием выбора этих больных в качестве группы сравнения для больных аденокарциномами желудка явилось отсутствие клеточной атипии на фоне воспалительного процесса. Число здоровых лиц, не имевших в анамнезе указаний на онкологические заболевания и без обострения очагов хронической инфекции, при определении ряда показателей доходило до 51 человека: 53% мужчин и 47% женщин; в возрасте от 40 до 67 лет (57,2 ± 1,5). Перед взятием крови у всех пациентов было получено информированное согласие на проведение исследования.

Больные и здоровые лица составили следующие группы: 1 группа - больные аденокарциномами желудка и толстой кишки, разделенная, в свою очередь, на подгруппы, в зависимости от локализации злокачественного новообразования, - 1.1 - РЖ, 1.2 - КРР; 2 группа - больные с неонкологической патологией желудка и 3 группа - здоровые лица. Обследованные больные находились на лечении в МУЗ Городской клинической больнице № 1 г. Новосибирска и в Новосибирском областном онкологическом диспансере.

Определение CD3+-, CD4+-, CD8\ CD20+-, CD25+-, CD38+-, CD71+- и HLA-DR+-мононуклеаров осуществляли методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием мояокяоналышх антител серии ИКО, произведенных НПЦ «Медбиоспектр» (г. Москва), согласно прилагаемым рекомендациям. Определяли также иммунорегуляторный индекс (HPH=CD4/CD8). Исходя из абсолютного содержания лейкоцитов и процента лимфоцитов в периферической крови, вычисляли абсолютное содержание МНК с вышеуказанными маркерами.

В качестве ОАА применяли фетальные протеины в изотоническом растворе хлорида натрия, содержащие раковоэмбриональный антиген - 84 МЕ/мл, хорионический гонадотропин человека - 170 МЕ/мл, нейроспецифическую энолазу - 1,35 МЕ/мл, углеводные антигены - СА 19-9 - 144 МЕ/мл и СА 125 - 512 МЕ/мл, альфафетопротеин -172 МЕ/мл и микроглобулин человека - 4 МЕ/мл. Оценку реакции лимфоцитов на ОАА проводили в соответствии с технологией, разработанной сотрудниками лаборатории физико-химической индикации иммунных процессов НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, по изменению относительного содержания С08+-клеток после инкубации МНК с

ОАА (100 мкл, исходная концентрация белка 2,5 мг/мл) in vitro в течение 1 часа по сравнению с контрольной пробой, содержащей вместо ОАА 100 мкл раствора хлорида натрия. Для подтверждения специфичности реакции МНК на ОАА методом слепой выборки, в каждой группе пациентов, клетки параллельно инкубировали с раствором бычьего сывороточного альбумина по указанной выше методике и в той же концентрации по белку, и ни в одном случае не было отмечено подобной реакции. Во всех случаях использовался одинаковый состав ОАА. Разработанная технология позволяет выявлять антигенреактивные мононуклеары с фенотипом CD8+. Когда отрабатывалась технология, то были сканированы МНК и по другим маркерам. Оказалось, что только по CDS отмечалась реакция, которая была присуща только высокодифференцированным вариантам и более низкой степени злокачественности опухолей. Позитивной считалась реакция, при которой относительное содержание CD8+-лимфоцитов повышалось после инкубации МНК с ОАА на 15% и более по сравнению с соответствующей контрольной пробой. Во всех остальных случаях реакция считалась негативной (Аутеншлюс А.И. и др., 1999, 2002, 2003). Установленная пороговая величина в 15%, превышает, согласно требованиям статистического анализа, сумму среднего арифметического и двойного стандартного отклонения, то есть превышает 95% показателей этой реакции в группе здоровых лиц, что свидетельствует о низкой ошибке, не превышающей 5% при используемом методе исследования (Леонова Т.Я, Степанова Е.Г, 1993; Гланц С, 1999).

В зависимости от характера реакции МНК на ОАА больные адекокарциномами желудка и толстой кишки были разделены на следующие подгруппы: 1п - больные с позитивной реакцией и 1н - больные с негативной реакцией.

Содержание TNFa, IL-lß, IL-lRa, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, IL-18, IFNa и IFNy определяли с помощью иммуноферментного анализа, используя наборы реагентов для количественного определения цитокинов производства ЗАО «Вектор-Бест» (п. Кольцово, Новосибирской области). Определение IL-18В Р проводили с помощью набора фирмы R&D Systems.

Определение аутоантител классов G, M, А и субклассов Gi, G2, G3, G4 к TNFa и к синтетическому HLDF; класса G и субклассов Gj, G2, G3, G4 к IFNa; классов G и M к IFNy проводили по технологии, разработанной в лаборатории физико-химической индикации иммунных процессов НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, с соблюдением всех необходимых технологических приемов. Цитокины и HLDF в концентрации 40 мкг/мл в забуференном изотоническом растворе хлорида натрия иммобилизовали пассивной сорбцией в лунках планшета для иммуноферментного анализа, который помещали на 2 часа в термостат при 37°С, а затем - в холодильник при 4°С. После иммобилизации цитокинов лунки планшета обрабатывали 1,5% раствором бычьего сывороточного альбумина для предотвращения неспецифической сорбции. Использовали моноклональные антитела, меченные пероксидазой хрена, производства ООО «Полигност», Санкт-Петербург.

Уровни аутоантител определяли по коэффициенту (К), который представлял собой отношение оптической плотности продукта реакции в лунках с опытной сывороткой к оптической плотности продукта реакции в лунках с серонегативной сывороткой, последняя представляла собой лабораторный пул образцов здоровых лиц (Аутеншлюс А.И. и др., 2003).

Для определения содержания цитокинов в супернатаятах клеток крови, цельную кровь разводили 1:5 полной посадочной средой (среда RPMI 1640, с добавлением 10% фетапьной телячьей сыворотки, 0,3 мг/мл L-глутамина, ЗмМ Hepes-буфера и 100 мкг/мл гентамицина). Клетки инкубировали в СОг-инкубаторе при температуре 37°С, в течение 24 часов в присутствии ФГА в дозе 20 мкг/мл и ОАА в дозе 300 мкг/мл и без митогена и антигенов - спонтанная продукция (Селихова Ю.Б. и др, 2007). Временной интервал инкубации клеток цельной крови устанавливался согласно результатам исследований ряда авторов (Останин A.A., Черных Е.Р, 2005).

Индекс влияния (ИВ) при стимуляции клеток ФГА и ОАА высчитывали по формуле (Ермолович Е.Ю. и др., 1996): ИВ = Б/А; где А - уровень спонтанной продукции цитокина; Б - уровень стимулированной продукции цитокина.

После хирургического вмешательства проводилось патогистологическое исследование препаратов опухоли, окрашенных по стандартной методике гематоксилином и эозином. Патогистологическая картина характеризовалась следующими признаками, которым была дана балльная оценка: количеством опухолевых клеток в сосудах, выраженностью инфильтрации опухоли лимфоцитами и макрофагами, количеством митозов и патологических митозов в поле зрения, содержанием клеточных элементов различной степени дифференцировки, для чего с помощью морфометрической сетки с 121 рабочими точками-узлами, вставленной в окуляр микроскопа, при увеличении 20 х 1,5 х 10 = ЗООх методом случайного наложения сетки на опухолевую ткань определяли количество точек, попавших на высоко-, умеренно- и низкодифференцированные опухолевые клетки, подсчитывая в каждом случае 10 полей зрения и для каждой категории клеток определяя среднее арифметическое значение, выраженное в процентах (Автандилов Г.Г., 1990), вариантом гистологической дифференцировки опухоли (низко-, умеренно- и высокодифференцированная аденокарцинома), глубиной инвазии, степенью васкуляризации и количеством регионарных лимфоузлов, пораженных метастазами.

Балльная оценка патогистологической картины позволила выявить корреляционные связи между изучаемыми показателями реактивности лейкоцитов и патогистологическими параметрами опухолей. Последние устанавливались врачом-патологоанатомом к.м.н. Д.В. Морозовым, которому автор выражает свою искреннюю признательность.

Статистическую обработку данных выполняли с использованием методов непараметрического анализа. Сравнение изучаемых показателей проводили с помощью критерия Манна-Уитни для двух независимых выборок и критериев Крускалла-Уоллиса и Данна для более, чем двух, независимых выборок. Результаты, в том числе и количество наблюдений (п), представлены в таблицах. Показатели выражены в виде медиан - Me и процентилей - 25 и 75. Различия между группами считались статистически значимыми при р<0,05 (Реброва О.Ю., 2002). Для выявления взаимосвязи переменных проводили расчет коэффициента ранговой корреляции по Спирмену (г). Для статистической обработки, данных, применяли программу Statistica 6.0. Критерий Даша вычисляли по соответствующей формуле (Гланц С., 1999) с использованием программы Microsoft Office Excel.

Результаты исследования и их обсуждение

Фенотип моионуклеарных клеток и их реакция in vitro на опухолеассоциированные антигены у больных аденокарциномами желудка н толстой кишки

При сравнении показателей фенотипа МНК, в зависимости от локализации аденокарцином, были выявлены различия как между больными РЖ и КРР, так и между больными и здоровыми лицами (таблица 1). В частности, различия отмечались между больными РЖ и КРР только по относительному и абсолютному содержанию МНК с фенотипом CD25+. У последних они были более низкими по сравнению с первыми.

Что же касается различий между больными и здоровыми, то у больных РЖ было более высокое относительное и абсолютное содержание МНК с фенотипом CD25+ и более высокий ИРИ, при более низком относительном содержании CD3+- и СШ+-кпеток. У больных КРР, также как и у больных РЖ, ИРИ был повышен, а относительное содержание CD3 - и С08+-клеток - снижено по сравнению со здоровыми.

Исследование показало, что содержание клеток с маркерами активации имело статистически значимые как прямые, так и обратные корреляционные связи с различными патогистологическими параметрами при РЖ и КРР.

Так при РЖ относительное и абсолютное содержание С071+-лимфоцитов находилось в прямой корреляционной связи со степенью васкуляризации (г = 0,358; р = 0,023 и г = 0,428;

р = 0,006 соответственно) и в обратной - с количеством опухолевых клеток в сосудах (г = -0,326; р = 0,040 и г = - 0,323; р = 0,042 соответственно), количеством митозов (г = - 0,323; р = 0,042 и г = - 0,441; р = 0,004 соответственно) и относительным содержанием НД клеток в опухоли (г = - 0,423; р = 0,007 и г = - 0,406; р = 0,009 соответственно). Кроме того, абсолютное содержание С071+-лимфоцитов находилось в прямой корреляционной связи с вариантом гистологической дифференцировки (г = 0,345; р = 0,029) и в обратной - с глубиной инвазии (г = - 0,361; р = 0,022).

Таблица 1

Относительное (в %) и абсолютное (109/л) содержание популяций и субпопуляций мононуклеарных клеток и иммунорегуляторный индекс у больных раком желудка, колоректальным раком и у здоровых лиц___

Показатели 1.1 подгруппа п= 52 1.2 подгруппа п = 41 3 группа п= 19 Р

Ме (25; 75 процентили)

СБЗ отн. 48,00 (42,00; 48,00) 46,00 (46,00; 50,00) 53,00 (50,00; 56,00) 1.1-3<0,01 1.2-3<0,01

СЭЗ абс. 0,92 (0,72; 1,33) 0,93 (0,85; 1,20) 0,94 (0,72; 1,57)

С04 отн. 34,00 (30,00; 36,00) 36,00 (34,00; 38,00) 34,00 (32,00; 36,00)

СЭ4 абс. 0,64 (0,49; 0,97) 0,72 (0,58; 0,89) 0,64 (0,45; 0,98)

С08 отн. 13,00 (11,00; 18,00) 13,00 (10,00; 18,00) 20,00 (18,00; 20,00) 1.1-3<0,01 1.2-3<0,01

СО8 абс. 0,30 (0,23; 0,45) 0,32 (0,23; 0,48) 0,36 (0,26; 0,58)

ИРИ 2,69 (2,14; 3,27) 3,00 (2,00; 3,60) 1,70 (1,60; 1,89) 1.1-3<0,01 1.2-3<0,01

С020отн. 8,00 (6,00; 13,00) 10,00 (8,00; 10,00) 10,00 (8,00; 12,00)

СБ20 абс. 0,18 (0,13; 0,27) 0,19 (0,15; 0,21) 0,20 (0,12; 0,25)

СШ5 отн. 6,00 (4,00; 8,00) 4,00 (2,00; 6,00) 4,00 (3,00; 4,00) 1.1-и<0,01 1.1-3<0,05

С025 абс. 0,12 (0,08; 0,21) 0,07 (0,04; 0,14) 0,06 (0,05; 0,12) 1.1-1.2<0,05 1.1-3<0,05

СШ8 отн. 8,00 (8,00; 12,00) 8,00 (6,00; 10,00) 8,00 (4,00; 10,00)

СТО 8 абс. 0,18 (0,15; 0,25) 0,16 (0,13; 0,24) 0,14 (0,08; 0,20)

С1Э71 отн. 4,00 (2,00; 6,00) 3,00 (2,00; 4,00) 4,00 (2,00; 4,00)

С071 абс. 0,08 (0,05; 0,14) 0,07 (0,05; 0,11) 0,07 (0,04; 0,12)

НЬА-ОК отн. 10,00 (7,50; 14,00) 8,00 (6,00; 11,00) 8,00 (7,00; 9,00)

ША-БЯ абс. 0,24 (0,15; 0,35) 0,19 (0,13; 0,32) 0,18 (0,12; 0,23)

Абсолютное содержание СЭ25+- и СВЗ 8+-лимфоцитов находилось в обратной корреляционной связи с глубиной инвазии (г = -0,336; р = 0,034 и г = -0,488; р = 0,016 соответственно), а кроме того, абсолютное содержание С038+-лимфоцитов также

находилось в обратной корреляционной связи с количеством патологических митозов (г = - 0,425; р = 0,039). Относительное содержание МНК с фенотипом HLA-DR1" находилось в обратной корреляционной связи с относительным содержанием НД клеток в опухоли (г = - 0,412; р = 0,008), а абсолютное - с количеством патологических митозов (г = - 0,327; р = 0,039) и глубиной инвазии (г = - 0,392; р = 0,012).

Таким образом, наибольшее количество корреляционных связей, независимо от их направления, было выявлено между патогистологическими параметрами и содержанием МНК с фенотипом CD71+ - клеток, несущих рецептор к трансферрину, который экспрессируется на активно пролиферирующих клетках (Jones D.T. et al., 2006; Dukovski D. et al., 2009).

При KPP прямые корреляционные связи были получены между относительным и абсолютным содержанием МНК с фенотипом CD25+ и количеством патологических митозов (г= 0,371; р = 0,040 и r = 0,367; р = 0,042 соответственно), а также между относительным содержанием этих клеток и количеством пораженных метастазами лимфоузлов (г = 0,444; р = 0,023), а обратная корреляционная связь - между относительным содержанием CD25+-клеток и относительным содержанием ВД клеток в опухоли (г = - 0,421; р = 0,021).

Следовательно, характер сопряженности содержания клеток с маркерами активации и патогистологическими параметрами опухоли зависит от локализации злокачественного образования. Не исключено, что при КРР основными клетками, экспрессирующими маркер CD25, являются регуляторные Т-клетки, которые обладают выраженной иммуносупрессивной активностью и способностью стимулировать опухолевую прогрессию (Clarke S.L. et al., 2006), а при РЖ превалируют активированные эффекторные клетки, либо, как считают некоторые исследователи, наличие регуляторных клеток при новообразованиях желудка играет позитивную роль, за счет ограничения воспаления в очаге опухолевого роста (Haas М. et al., 2009).

Изучение реакции МНК на ОАА показало, что среди больных аденокарциномами желудка и толстой кишки встречаются лица с позитивной и с негативной реакцией, поэтому было проведено сравнение содержания популяций и сублолуляций МНК и ИРИ между этими группами и здоровыми, что позволило выявить особенности этих групп по показателям популяций и субпопуляций иммунокомпетентных клеток (таблица 2).

Так больные с позитивной реакцией характеризовались повышенным относительным содержанием CD3+-, относительным и абсолютным содержанием CD20*-лимфоцитов, а также клеток с маркерами активации: CD25, CD38, CD71 и относительным содержанием HLA-DR+-KiieTOK по сравнению с группой больных с негативной реакцией МНК на ОАА. При анализе показателей больных и здоровых статистически значимые различия были выявлены между группой больных с позитивной реакцией и здоровыми лицами, а также между группой больных с негативной реакцией и здоровыми лицами. У больных аденокарциномами желудка и толстой кишки с позитивной реакцией отмечалось снижение относительного содержания С08+-клеток, а также повышение относительного и абсолютного содержания МНК с маркерами CD25, CD38, и HLA-DR, относительного содержания CD20+-лимфоцитов и абсолютного содержания С071+-лимфоцитов. У больных с негативной реакцией было снижено относительное содержание CD3+- и CD8+-лимфоцитов и повышен ИРИ.

Следовательно, только при наличии у больных антигенреахтивных по отношению к ОАА мононуклеарных клеток с фенотипом CD&+, наблюдается активация иммунокомпетентных клеток, которая, в свою очередь, сопряжена с различными патогистологическими параметрами, характеризующими тяжесть опухолевой прогрессии. Так при РЖ повышение содержания МНК с маркерами активации преимущественно характерно для меньшей степени тяжести, а при КРР - для большей степени тяжести опухолевой прогрессии.

Кроме этого, было выявлено, что процент прироста клеток с фенотипом CD8+ после инкубации МНК с ОАА находился в прямой корреляционной связи со степенью

васкуляризации (г = 0,340; р = 0,004), то есть, присутствие в организме реактивных по отношению к опухоли клеток в итоге приводит к реализации механизмов ангиогенеза, который создает оптимальные условия для функционирования злокачественного новообразования (ШЬаШ О., Уасса А., 2008).

Таблица 2

Относительное (в %) и абсолютное (Ю'/л) содержание популяций и субпопуляций мононухлеарных клеток и иммунорегуляторный индекс у больных аденокарциномами желудка и толстой кишки, в зависимости от характера реакции мононуклеаров на

Показатели 1п подгруппа п= 17 1н подгруппа п = 76 3 группа п= 19 Р

Me (25; 75 процентили)

CD3 отн. 50,00 (48,00; 50,00) 46,00 (42,00; 48,00) 53,00 (50,00; 56,00) 1п-1н<0,05 1н-3<0,01

CD3 абс. 1,07 (0,74; 1,39) 0,89 (0,72; 1,22) 0,94 (0,72; 1,57)

CD4 отн. 36,00 (32,00; 38,00) 34,00 (32,00; 36,00) 34,00 (32,00; 36,00)

CD4 абс. 0,79 (0,48; 1,10) 0,67 (0,55; 0,96) 0,64 (0,45; 0,98)

CD8 отн. 16,00 (12,00; 18,00) 13,00 (10,00; 18,00) 20,00 (18,00; 20,00) 1п-3<0,05 1н-3<0,01

CD8 абс. 0,29 (0,26; 0,45) 0,32 (0,23; 0,47) 0,36 (0,26; 0,58)

ИРИ 2,25 (1,88; 3,17) 2,92 (2,38; 3,45) 1,70 (1,60; 1,89) 1н-3<0,01

CD20 отн. 14,00 (14,00; 16,00) 8,00 (6,00; 10,00) 10,00 (8,00; 12,00) 1п-1н<0,01 1п-3<0,01

CD20 абс. 0,39 (0,21; 0,49) 0,16 (0,12; 0,20) 0,20 (0,12; 0,25) 1п-1н<0,01

CD25 отн. 8,00 (6,00; 14,00) 4,00 (2,00; 6,00) 4,00 (3,00; 4,00) 1п-1н<0,01 1п-3<0,01

CD25 абс. 0,24 (0,18; 0,30) 0,09 (0,05; 0,14) 0,06 (0,05; 0,12) 1п-1н<0,01 1п-3<0,01

CD38 отн. 14,00 (14,00; 16,00) 8,00 (6,00; 10,00) 8,00 (4,00; 10,00) 1п-1н<0,01 1п-3<0,01

CD38 абс. 0,30 (0,24; 0,41) 0,17 (0,13; 0,21) 0,14 (0,08; 0,20) 1п-1н<0,05 1п-3<0,01

CD71 отн. 8,00 (4,00; 10,00) 3,50 (2,00; 4,00) 4,00 (2,00; 4,00) 1п-1н<0,01

CD71 абс. 0,14 (0,07; 0,30) 0,07 (0,05; 0,10) 0,07 (0,04; 0,12) 1п-1н<0,01 1п-3<0,05

HLA-DR отн. 16,00 (10,00; 18,00) 8,00 (6,00; 10,50) 8,00 (7,00; 9,00) 1п-1н<0,01 1п-3<0,01

HLA-DR абс. 0,34 (0,20; 0,41) 0,20 (0,13; 0,31) 0,18 (0,12; 0,23) 1н-3 <0,01

Не исключено, что активация гуморального звена, оцениваемая по увеличению содержания МШС с маркером CD20, характерным для В-лимфоцитов (Carter R.H., 2006; Waubant Е., 2008), а также по повышению экспрессии CD38 - молекулы, присущей, кроме Т-клеток, активированным В-клеткам (Moreno-Garcia М.Е. et al., 2005; Sandoval-Montes С., Santos-Argumedo L., 2005), при позитивной реакции МНК на ОАА может выполнять

протективное по отношению к опухоли действие, блокируя антигенные детерминанты клеток неоплазмы антителами к ним, и этим предотвращать их распознавание иммунокомпетентными клетками (Родионов С.Ю. и др., 2007).

При сравнении содержания МНК с маркерами активации у больных с неонкологической патологией желудка (2 группа) с группами больных РЖ (1.1 подгруппа) и здоровых лиц (3 группа), было установлено, что больные 2 группы отличались только от 3 группы повышенным содержанием СБ25+- и НЬА-БК+-клеток (таблица 3).

Таблица 3

Относительное (в %) и абсолютное (109/л) содержание мононухлеаряых клеток с маркерами активации у больных раком желудка, неонкологической патологией желудка и у здоровых лиц_ _ _

Показатели 1.1 подгруппа п= 52 2 группа п=13 3 группа п= 19 Р

Ме (25; 75 процентили)

С025 отн. 6,00 (4,00; 8,00) 6,00 (6,00; 7,00) 4,00 (3,00; 4,00) 1.1-3 <0,05 2-3<0,01

СБ25 абс. 0,12 (0,08; 0,21) 0,16 (0,14; 0,22) 0,06 (0,05; 0,12) 1.1-3 <0,05 2-3<0,01

С071 отн. 4,00 (2,00; 6,00) 4,00 (2,00; 4,00) 4,00 (2,00; 4,00)

СШ1 абс. 0,08 (0,05; 0,14) 0,07 (0,05; 0,14) 0,07 (0,04; 0,12)

НЬА-ОЯ отн. 10,00 (7,50; 14,00) 10,00 (10,00; 14,00) 8,00 (7,00; 9,00) 2-30,05

НЬЛ-ПЛабс. 0,24 (0,15; 0,35) 0,31 (0,25; 0,46) 0,18 (0,12; 0,23) 2-3<0,01

Несмотря на повышение содержания МНК с вышеуказанными маркерами активации, у больных 2 группы ни в одном случае не было выявлено позитивной реакции МНК на ОАА, то есть больные с неонкологический патологией желудка характеризовались сочетанием активации МНК с их негативной реакцией на ОАА, что, с учетом результатов биопсий этих больных, явилось критерием отсутствия злокачественного процесса.

Содержание цитокинов в сыворотке крови и в супернатантах клеток цельной крови у больных с онкологической и неонкологическоб патологией желудочно-кишечного

тракта

Изучение содержания цитокинов в сыворотке крови больных и здоровых лиц показало, что уровни некоторых из них, в частности Т№а, 1Ь-1р, 1Ь-2,1Ь-4,1Ь-10,1Ь-17 и №N7, хотя и были довольно низкими, но, тем не менее, в ряде случаев различались между сравниваемьми группами (таблица 4).

При РЖ (1.1 подгруппа) и КРР (1.2 подгруппа) уровни 1Ы> были повышены по сравнению со здоровыми лицами (3 группа). У больных 1.1 подгруппы содержание ЮТа было более высоким по сравнению с аналогичным показателем здоровых лиц. У больных 1.2 подгруппы уровни 1Ь-8 и 1Ь-17 также были повышены по сравнению со здоровыми лицами. Больные РЖ отличались более низкими уровнями 1Ь-2 и 1Ь-17 от больных неонкологической патологией желудка (группа сравнения для больных РЖ - 2 группа). У последних уровни этих цитокинов, а также уровень 1И0, были более высокими по сравнению со здоровыми лицами. Содержание и рецепторного антагониста 1Ь-1 - 1Ь-1Яа во всех группах больных было более высоким по сравнению со здоровыми лицами.

Уровни цитокинов 1Ь-6, 1Ь-8, 1Шу и И-111а в сыворотке крови больных аденокарциномами желудка и толстой кишки не зависели от характера реакции МНК на ОАА, но превышали соответствующие показатели здоровых лиц как в группе больных с

позитивной, так и в группе больных с негативной реакцией. Кроме того, больные с позитивной реакцией МНК на ОАА отличались от здоровых лиц более высоким содержанием 1Ир, а больные с негативной реакцией - более высоким содержанием ТЫРа и 1И7 (таблица 5).

Таблица 4

Содержание цитокинов в сыворотке крови (пг/мл) больных раком желудка, колоректальным раком, неонкологической патологией желудка и у здоровых лиц_______

Цитокины 1.1 подгруппа п = 45 1.2 подгруппа п=39 2 группа п= 13 3 группа п = 33

Ме (25; 75 процента ли)

ТОРа 0,20 (0,10; 16,98) Рм-з<0,05 0,33 (0,10; 10,52) 0,10 (0,10; 0,70) 0,10 (0,10; 0,25)

1Ь-1Р 1,00 (0,16; 2,00) 0,64 (0,10; 1,88) 0,19 (0,17; 1,58) 0,17 (0,10; 0,42)

1Ь-1Яа 673,42 (312,32; 881,00) Р1.1-з<0,01 1180,10 (458,36; 1628,61) Р1>э<0,01 569,67 (294,23; 819,17) Р2-з<0,01 247,12 (208,08; 299,86)

11,-2 0,10 (0,10; 2,00) РМ-2<0,05 0,10 (0,10; 1,80) 3,97 (2,33; 9,07) Р2-3<0,01 0,10 (0,10; 0,10)

11,-4 0,10 (0,10; 0,30) 0,10 (0,10; 0,10) 0,10 (0,10; 0,66) 0,10 (0,10; 0,20)

11,-6 6,17 (4,43; 10,66) Ри-з<0,01 10,52 (5,60; 29,63) Ри-э<0,01 3,91 (0,88; 4,83) 1,33 (0,25; 3,25)

11-8 42,41 (5,50; 139,00) 61,56 (21,00; 119,81) Р<з-з<0,05 21,06 (12,19; 46,19) 22,84 (6,00; 41,98)

1Ь-10 2,15 (0,16; 4,49) 0,94 (0,10; 7,54) 3,11 (0,81; 6,61) Р2-з<0,05 0,10 (0,10; 1,16)

17 1,04 (0,22; 2,23) РМ-2<0,05 3,16 (0,61; 4,52) Р1.2-з<0,05 4,68 (4,02; 7,18) Р2-3<0,01 0,10 (0,10; 0,12)

11,-18 167,23 (107,45; 302,00) 145,60 (97,00; 207,40) 146,51 (127,99; 198,94) 160,51 (102,00; 215,92)

5,21 (0,20; 16,00) 3,29 (0,20; 10,67) 2 85 (0,10; 13,69) 12,68 (2,62; 26,00)

1Шт 0,90 (0,15; 8,00) Pi.i-3C0.01 1,40 (0,21; 6,00) Р).2-3<0,01 2,29 (1,20; 5,50) рз-з<0,01 0,10 (0,10; 0,10)

Изучение сопряженности между содержанием цитокинов в сыворотке крови и патогистологическими параметрами опухолей у больных РЖ показало, что повышение содержания провоспалительных цитокинов, за исключением было характерно для

большей степени тяжести опухолевой прогрессии. Так содержание ТКРа находилось в прямой корреляционной связи с количеством опухолевых клеток в сосудах (г = 0,330; р = 0,037), степенью васкуляризации (г= 0,387; р = 0,014) и в обратной - с относительным содержанием ВД клеток в опухоли (г = -0,332; р = 0,037) и вариантом гистологической дифференцировки (г=- 0,322; р = 0,043). Содержание 11.-6 находилось в прямой

корреляционной связи с количеством регионарных лимфоузлов, пораженных метастазами (г = 0,433; р = 0,024), а содержание - в обратной корреляционной связи с содержанием ВД клеток в опухоли (г = - 0,317; р = 0,049) и вариантом гистологической дифференцировки (г = - 0,482; р = 0,002). В отличие от 1Шу, содержание ПТ^а находилось в прямой корреляционной связи с содержанием ВД клеток в опухоли (г = 0,349; р - 0,027). Содержание противовоспалительного цитокина 1Ь-4 было сопряжено с относительным содержанием НД клеток. Между этими показателями была получена обратная корреляционная связь (г = -0,433; р = 0,024).

Таблица 5

Содержание цитокинов в сыворотке крови (пг/мл) больных аденокарциномами желудка и толстой кишки, в зависимости от характера реакции мононуклеарных клеток на опухолеассоциированные антигены, и у здоровых лиц __

Показатели In подгруппа n — 16 1н подгруппа n = 68 3 группа n = 27 P

Me (25; 75 процентили)

TNFa 0,40 0,23 0,10 1н-3<0,05

(0,10; 9,90) (0,10; 17,99) (0,10; 0,25)

IL-lß 1,50 (0,40; 2,83) 0,75 (0,10; 1,60) 0,17 (0,10; 0,42) ln-3<0,01

IL-lRa 583,9 810,0 247,1 ln-3<0,01

(296,1; 1181,7) (368,8; 1303,7) (208,1; 299,9) 1н-3<0,01

IL-2 1,50 0,10 0,10

(0,10; 3,29) (0,10; 1,47) (0,10; 0,10)

IL-4 0,10 0,10 0,10

(0,10; 0,30) (0,10; 0,30) (0,10; 0,20)

IL-6 8,80 7,50 1,33 1h-3<0,01

(5,02; 34,25) (4,80; 13,00) (0,25; 3,25) 1h-3<0,01

IL-8 61,6 44,0 22,8 ln-3<0,01

(13,0; 369,0) (8,0; 132,2) (6,0; 42,0) 1h-3<0,01

IL-10 3,31 1,21 0,10

(0,31; 5,17) (0,10; 4,90) (0,10; 1,16)

IL-17 1,39 (0,22; 4,08) 1,76 (0,18; 3,75) 0,10 (0,10; 0,12) !h-3<0,01

IL-18 172,5 155,0 160,5

(111,7; 311,5) (96,7; 222,0) (102,0; 215,9)

IFNa 3,00 5,26 12,68

(0,10; 8,60) (0,20; 16,00) (2,62; 26,00)

IFNy 3,60 0,90 0,10 Jn-3<0,01

(0,23; 11,50) (0,14; 4,00) (0,10; 0,10) 1h-3<0,01

При КРР содержание провоспалительных цитокинов TNFa и IL-6 было взаимосвязано с патогистологическими параметрами, присущими большей степени тяжести опухолевой прогрессии и с фактором, обеспечивающим развитие опухоли (васкуляризация): первый из них находился в прямой корреляционной связи с количеством пораженных метастазами лимфоузлов (г = 0,456; р = 0,019), а второй - со степенью васкуляризации (г = 0,474; р = 0,009), в то время как уровень IL-Iß находился в прямой корреляционной связи с содержанием ВД клеток (г = 0,441; р = 0,017) и в обратной - с количеством опухолевых клеток в сосудах (г = - 0,577; р = 0,001). Содержание противовоспалительного цитокина ILIO находилось в обратной корреляционной связи с содержанием НД клеток в опухоли (г = -0,506; р = 0,038).

Изучение влияния ФГА и ОАА на продукцию клетками крови цитокинов позволило вьивить статистически значимые различия между показателями следующих групп больных:

1) больные РЖ отличались от больных КРР более высохим ИВ ФГА на продукцию 11,-17: Ме= 1,23 (1,11; 1,31) иМе = 0,98(0,79; 1,08)соответственно,?<0,01;

2) больные КРР отличались от больных РЖ более высоким ИВ ОАА на продукцию ГШу: Ме = 1,70 (1,00; 3,10) и Ме = 0,74 (0,31; 1,36) соответственно, р < 0,01;

3) у больных РЖ по сравнению с больными неонкологической патологией желудка отмечался более высокий ИВ ОАА на продукцию 11,-4: Ме= 1,40 (1,00; 2,00) и Ме = 0,88 (0,56;1,07) соответственно, р <0,05. В скобках указаны процентили.

При РЖ ИВ ОАА на продукцию клетками крови Н-ТЧу находился в прямой корреляционной связи с количеством опухолевых клеток в сосудах (г = 0,615; р = 0,011) и в обратной - со степенью васкуляризации (г = - 0,519; р = 0,040), фактором, обеспечивающим необходимые условия для функционирования опухоли.

Гуморальные факторы регуляции биологических эффектов цитокинов и ШЛ)К у больных с онкологической и неонкололической патологией желудочно-кишечного

тракта

Изучение гуморальных факторов регуляции биологических эффектов цитокинов в сыворотке крови больных и здоровых лиц показало, что и в норме, и при патологии в организме присутствуют 11,-18ВР, относящийся к суперсемейству иммуноглобулинов (ОшагеНо С.А., 2001; КачлгазЫта М. е1 а1., 2005), и аутоантатела к 'ЮТа, 1КЫа и 1Шу (таблица б).

Из представленных в таблице 6 данных видно, что у больных с РЖ (1.1 подгруппа) по сравнению со здоровыми лицами (3 группа) снижены уровни аутоантитея класса Ми к ЮТа, в отличие от больных КРР (1.2 подгруппа), у которых снижен уровень аутоантител только класса М к Т№а. При неонкологической патологии желудка (2 группа) по сравнению со здоровыми лицами отмечалось повышение уровня аутоантител класса А к ТИРа.

Изучение уровней гуморальных факторов регуляции биологических эффектов цитокинов у больных аденокарцшгомами желудка и толстой кишки, в зависимости от характера реакции МНК на ОАА, позволило выявить, что при позитивной реакции у них повышен уровень аутоантител класса А к ЮТа, а при негативной реакции снижены уровни аутоантител класса М и субкласса к ТОРа, а также уровни аутоантител класса М к ИТ^у по сравнению со здоровыми лицами (таблица 7).

Изучение сопряженности уровней классов и субклассов аутоантител к цитокинам и 1И8ВР у больных аденокарцикомами желудка и толстой кишки с патогистологическими параметрами опухолей показало, что содержание 11,-18ВР находилось в обратной корреляционной связи с количеством лимфоузлов, пораженных метастазами (г = - 0,587; р = 0,035), уровни аутоантител субкласса йг к ТЫРа - в прямой корреляционной связи со степенью васкуляризации (г = 0,511; р = 0,021) и в обратной - с содержанием НД клеток в опухоли (г = - 0,637; р = 0,003). Уровни аутоантител субкласса вз к ЮТа также находились в обратной корреляционной связи с содержанием НД клеток в опухоли (г = -0,511; р = 0,025). Следовательно, меньшая степень тяжести опухолевой прогрессии характеризуется более высоким уровнем гуморальных факторов регуляции медиаторов воспаления, хотя, судя по прямой корреляционной связи между уровнем аутоантител субкласса Ог к ЮТа и степенью васкуляризации, при этом одновременно создаются условия для обеспечения жизнедеятельности опухоли.

При анализе корреляционных связей между регуляторами биологических эффектов цитокинов и патогистологическими параметрами опухолей, в зависимости от локализации аденокарцином, было установлено, что при РЖ уровни аутоантител класса А к ЮТа находились в обратной корреляционной связи с количеством опухолевых клеток в сосудах (г = - 0,613; р = 0,020) и содержанием НД клеток в опухоли (г = - 0,676; р = 0,008), а уровни аутоантител класса в к Т№а находились также в обратной корреляционной связи, но только с количеством митозов (г = -0,669; р = 0,005). и глубиной инвазии (г = -0,584; р = 0,018). Уровни аутоантител субкласса вг к 1Ша находились в обратной корреляционной связи с

содержанием НД клеток в опухоли (г= — 0,751; р = 0,012). Особенностью аутоиммунного компонента больных РЖ является сопряженность уровней ^О к Т№а и ^А к Т№а с меньшей степенью тяжести опухолевой прогрессии.

Таблица 6

Содержание 1Ь-18ВР (пг/мл) и уровни аутоантител к цитокинам (в условных единицах) в сыворотке крови больных и здоровья лиц___

Показатели 1.1 подгруппа (л = 43) 1.2 подгруппа (и = 35) 2 группа (л = 13) 3 группа (п = 51)

Ме (25; 75 процентили)

1Ь-18ВР 550 (250; 3300) 1850 (800; 2900) 1775 (500; 2550) 3500 (1300; 5750)

^М к ТЫ Ра 1,04 (0,74; 1,56) Р1.1-Э <0,05 0,74 (0,48; 1,70) Ри-з <0,01 1,21 (0,97; 1,73) 1,51 (1,04; 2,03)

^кЮТа 1,87 (0,96; 4,37) 1,81 (1,41; 2,98) 3,91 (2,40; 5,87) Р2-3 <0,01 1,19 (0,85; 1,75)

{¿О к ТОРа 1,20 (0,92; 1,42) 1,29 (0,99; 1,85) 1,71 (0,74; 2,56) 1,34 (1,00; 1,90)

ДО, к ЮТа 0,57 (0,40; 0,69) Р1.1-3 <0,01 1,02 (0,69; 2,18) 0,87 (0,81; 4,27) 1,82 (0,98; 2,45)

ДОг к "ШРа 1,30 (0,84; 2,07) 1,53 (1,30; 2,63) 0,69 (0,59; 0,96) 1,30 (0,92; 2,08)

^кЮТа 0,66 (0,59; 1,15) 0,92 (0,64; 2,15) 0,99 (0,96; 1,01) 1,05 (0,87; 1,31)

к ЮТа 0,92 (0,34; 1,70) 2,21 (1,05; 7,56) 2,57 (1,16; 5,28) 1,07 (0,73; 1,59)

к 1Ша 1,65 (1,49; 1,80) 1,70 (1,50; 2,74) 1,88 (1,29; 9,63) 1,56 (1,41; 1,99)

^О, к 1Ша 1,29 (1,00; 1,58) 2,39 (1,42; 7,38) 1,71 (1,03; 4,24) 1,47 (0,89; 2,20)

к №N0 1,09 (0,35; 1,60) 1,29 (0,93; 1,65) 0,80 (0,75; 1,03) 1,34 (1,15; 1,98)

ДОзкНЫа 1,20 (0,90; 1,70) 1,16 (0,70; 2,93) 1,30 (1,10; 3,08) 2,07 (1,34; 3,13)

до4ктма 1,08 (0,76; 3,00) 1,95 (1,35; 2,47) 3,76 (1,76; 7,76) 1,13 (0,88; 2,06)

^м к 1,35 (0,97; 1,53) 1,21 (0,81; 1,60) 1,62 (1,45; 1,84) 1,69 (1,14; 2,16)

ДО к 1РЫ7 1,09 (0,89; 1,71) 1,22 (0,93; 1,65) 1,79 (0,82; 2,55) 1,32 (1,05; 1,69)

При КРР уровни аутоантител класса О к Т№а находились в прямой корреляционной связи с количеством митозов (г = 0,472; р = 0,031) и глубиной инвазии (г = 0,476; р = 0,034), уровни аутоантител субкласса йг к ЮТа - в обратной корреляционной связи с содержанием НД клеток в опухоли (г = -0,606; р = 0,028). Уровни аутоантител класса в к 1Ша находились в прямой корреляционной связи с количеством опухолевых клеток в сосудах (г = 0,483; р = 0,009) и патологических митозов (г = 0,441; р = 0,019), уровни аутоантител субкласса вг к 1КИа - в прямой корреляционной связи с количеством патологических митозов (г = 0,769; р = 0,002) и глубиной инвазии (г = 0,583; р = 0,047) и в обратной - с инфильтрацией опухоли макрофагами (г = -0,647; р = 0,017), вариантом гистологической

дифференцировки (г = - 0,679; р = 0,011) и степенью васкуляризации (г = - 0,566; р = 0,044), уровни аугоантител субкласса Сц х №N<1 - в прямой корреляционной связи с содержанием ВД клеток в опухоли (г = 0,565; р - 0,044). Уровни аугоантител класса в к 1Ш7 находились в прямой корреляционной связи с количеством патологических митозов (г = 0,393; р = 0,038) и содержанием НД клеток в опухоли (г = 0,413; р = 0,029).

Таблица 7

Содержание 1Ь-18ВР (пг/мл) и уровни аугоантител к цитокинам (в условных единицах) в сыворотке крови больных аденокарциномами желудка и толстой кишки, в зависимости от характера реакции мононуклеарных клеток на опухолеассоциированные антигены, и

Показатели 1п подгруппа (п = 17) 1н подгруппа (а = 62) 3 группа (л = 51)

Ме (25; 75 процентили)

1Ы8ВР 400 (250; 8250) 1425 (600; 2800) 3500 (1300; 5750)

^М к ТОРа 1,14 (0,70; 1,48) 0,86 (0,61; 1,70) Р)н-з <0,01 1,51 (1,04; 2,03)

^А к ТИРа 3,68 (1,60; 6,88) Рш-з < 0,01 1,71 (1,21; 2,93) 1,19 (0,85;1,75)

ДО к ТОРа 1,25 (1,02; 2,01) 1,24 (0,95; 1,56) 1,34 (1,00; 1,90)

ДО1 к ТЖа 0,57 (0,48; 1,38) 0,73 (0,48; 1,42) Ры-з <0,05 1,82 (0,98; 2,45)

ДО2 к ТОРа 2,06 (1,67; 2,31) 1,49 (0,97; 2,49) 1,30 (0,92; 2,08)

№ к ТЫРа 0,72 (0,61; 1,12) 0,80 (0,63; 2,13) 1,05 (0,87; 1,31)

ДО« к ТЫРа 4,11 (1,12; 15,55) 1,35 (0,74; 4,47) 1,07 (0,73; 1,59)

ДО к 1Р1Ча 1,64 (1,52; 1,88) 1,68 (1,49; 1,89) 1,56 (1,41; 1,99)

ДО1 к 1РЫа 1,68 (1,02; 2,60) 1,58 (1,09; 3,73) 1,47 (0,89; 2,20)

ДО2 к №N0 1,17 (0,64; 1,30) 1,25 (0,40; 1,69) 1,34 (1,15; 1,98)

ДОз к №N0 1,22 (0,97; 2,40) 1,20 (0,73; 2,22) 2,07 (1,34; 3,13)

ДО4 к 1ЕЫа 19,78 (0,88; 44,80) 1,41 (0,78; 2,10) 1,13 (0,88; 2,06)

^М к 1РМу 1,34 (0,91; 1,42) 1,26 (0,93; 1,54) Р.н-з <0,05 1,69 (1,14; 2,16)

ДО к ХШу 1,10 (0,89; 1,95) 1,17 (0,92; 1,61) 1,32 (1,05; 1,69)

В отличие от РЖ, при КРР более высокие уровни аугоантител класса б к провоспалительным цитокинам характеризуют большую степень тяжести опухолевой прогрессии, однако, если анализировать субклассы аутоантител, то антитела субклассов 62 к ТЫРа и к: 1Ша отражают меньшую степень тяжести опухолевой прогрессии.

Следовательно, субклассы IgG играют различную роль в качестве регуляторов активности медиаторов воспаления.

На основании полученных данных можно предположить, что активация гуморального звена у больных с позитивной реакцией МНК на ОАА приводила к повышенной выработке факторов, регулирующих активность медиаторов воспаления, в отличие от больных с негативной реакцией, у которых, несмотря на повышенные уровни провоспалительных цитокинов, синтез аутоантител к ним был супрессирован. Сопряженность повышенных уровней аутоантител класса А к TNFa с более низким содержанием НД клеток в опухоли и меньшим количеством опухолевых клеток в сосудах при РЖ, возможно, свидетельствует о сдерживающем влиянии на опухолевую прогрессию этих аутоанпггел, благодаря тому, что иммуноглобулины класса А обладают выраженной нейтрализующей активностью (Галактионов В.Г., 2004), что позволяет им в какой-то мере ингибировать проопухолевое действие TNFa (Sethi G. et al, 2008).

Изучение влияния ФГА и ОАА на продукцию клетками крови IL-18BP показало, что статистически значимые различия существуют только по ИВ ФГА между больными аденокарциномами желудка и толстой кишки с позитивной и негативной реакцией МНК на ОАА: Me = 1,92 (1,00; 2,54) и Me = 0,83 (0,71; 1,11), соответственно,р <0,05.

Было выявлено, что при РЖ ИВ ФГА на продукцию клетками крови IL-18BP находился в прямой корреляционной связи с вариантом гистологической дифференцировки опухоли (г = 0,659; р = 0,038) и в обратной - с количеством опухолевых клеток в сосудах (г = - 0,715; р = 0,020), а также с содержанием НД клеток в опухоли (г = - 0,773; р = 0,009), то есть способность клеток крови продуцировать IL-18BP под влиянием митогена была характерна для меньшей степени тяжести опухолевой прогрессии.

Таким образом, повышение продукции 1L-18BP в ответ на стимуляцию ФГА свидетельствует о способности клеток крови вырабатывать фактор, икгибирующий активность IL-18 - цитокина, усиливающего пролиферацию клеток неоплазмы и метастазирование опухоли (Kim J. et al., 2006; Kang J.S. et al., 2009), о чем свидетельствует и указанная выше обратная корреляционная связь между содержанием IL-18BP и количеством метастазов в регионарных лимфоузлах. Поэтому, можно предположить, что роль IL-18BP при аденокарциномах желудка и толстой кишки заключается в торможении опухолевой прогрессии.

Таблица 8

Уровни аутоантител к фактору дифференцировки НШР (в условных единицах) в сыворотке крови больных и здоровых лиц ______

Показатели 1.1 подгруппа (n=17) __ 1.2 подгруппа i? =15) 2 группа (n = 13) 3 группа (n=18)

Me (25; 75 процентили)

IgM к HLDF 1,06 (0,85; 1,16) 0,95 (0,80; 1,33) 1,23(1,02; 1,51) 1,02 (0,83; 1,30)

IgA к HLDF 0,95 (0,61; 1,26) 1,43 (1,24; 1,48) 1,17(0,67; 2,73) 0,92 (0,73; 1,55)

IgG к HLDF 1,22 (1,01; 1,60) 0,97 (0,75; 1,35) 1,56 (1,37; 1,84) 1,07(0,84; 1,38)

IgGi к HLDF 1,16 (0,70; 1,67) 0,77 (0,67; 1,00) 1,17(1,02; 1,30) 1,22(0,97; 1,67)

IgG2 к HLDF 0,66 (0,52; 0,85) 0,65 (0,46; 1,69) 0,54 (0,41; 0,84) 0,95 (0,76; 1,47)

IgG] к HLDF 1,49 (0,95; 1,76) 1,25 (0,95; 1,47) 1,18 (0,97; 1,62) 1,11 (0,88; 1,39)

IgGi к HLDF 2,04 (1,22; 3,96) Pi.из <0,05 1,39 (0,95; 2,74) 1,09 (0,63; 1,42) 1,09 (0,57; 1,51)

Изучение уровней аутоантител к Н1Х)Р в сыворотке крови показало, что и у здоровых, и у больных лиц присутствуют аутоантитела к этому фактору (таблица 8). При аденокарциномах желудка были выявлены повышенные уровни аутоантител субкласса Оа к НЫЛ1 по сравнению с контрольной группой.

Анализ уровней аутоантител к НЦЗР, в зависимости от характера реакции МНК на ОАА, позволил выявить, что только при позитивной реакции бьши повышены уровни аутоантител субклассов Оз и 0< по сравнению со здоровыми лицами (таблица 9).

Таблица 9

Уровни аутоантител к фактору дифференцировки Н1ХЖ (в условных единицах) в сыворотке крови больных аденокарциномами желудка и толстой кишки, в зависимости от характера реакции мононуклеарных клеток на опухолеассоциированные антигены, и здоровых лиц

Показатели

1п подгруппа

(п°8)

1н подгруппа (ц = 24)

Ме (25; 75 процентили)

3 группа (п = 18)

^МкШЛЭР

0,96 (0,90;1,13)

1,08 (0,75; 1,31)

1,02 (0,83; 1,30)

^АкНЮТ

1,20 (0,77; 1,48)

1,25 (0,92; 1,44)

0,92 (0,73; 1,55)

ДО к НЬОР

1,19 (1,00; 1,53)

1,03 (0,68; 1,39)

1,07 (0,84; 1,38)

1,17

(0,57; 2,22)

0,90 (0,67; 1,15)

1,22 (0,97; 1,67)

№ к НЮТ

0,68 (0,61; 0,92)

0,63 (0,46; 1,41)

0,95 (0,76; 1,47)

^вз к НЫ)Р

1,60 (1,38; 3,58) рщ-з<0,05

1,15 (0,80; 1,50)

(0,

1,11 1,39)

2,22. (1,61; 3,96)

Р1-з<0,01

1,22 (0,95; 2,96)

1,09 (0,57; 1,51)

Определение сопряженности между уровнями классов и субкпассов аутоантител к НЮТ и патогистологическими параметрами злокачественных новообразований показало, что в группе больных аденокарциномами желудка и толстой кишки прямые корреляционные связи отмечены между уровнем аутоантител субкласса в4 к и инфильтрацией опухоли лимфоцитами (г = 0,632; р = 0,002), а также между уровнем аутоантител класса М к Н1Л)Р и относительным содержанием ВД клеток в опухоли (г = 0,369; р = 0,045), а обратные корреляционные связи - между уровнем аутоантител субкласса к Н1Х>Р и инфильтрацией опухоли макрофагами (г = -0,423; р = 0,044), между уровнем аутоантител субкласса С4 к НЫ)Р и глубиной инвазии (г = - 0,582; р = 0,006).

У больных РЖ прямые корреляционные связи отмечались между уровнем аутоантител класса А к Н1Л)Р и инфильтрацией опухоли макрофагами (г = 0,646; р = 0,044), а также количеством митозов (г = 0,640; р = 0,046), между уровнем аутоантител субкласса бг к НЬИР и степенью васкуляризации (г = 0,711; р = 0,021). Обратные корреляционные связи были выявлены между уровнем аутоантител субкласса к НЬЭР и количеством опухолевых клеток в сосудах (г = - 0,658; р = 0,039), а также относительным содержанием НД клеток в опухоли (г = - 0,853; р = 0,002).

У больных КРР прямые корреляционные связи были получены между уровнем аутоантител класса й к Н1Х>Р и вариантом дифференцировки опухоли (г = 0,614; р = 0,039), между уровнями аутоантител субклассов вз и 04 к НЬБР и степенью васкуляризации (г = 0,642; р = 0,018 и г = 0,834; р = 0,0004 соответственно), между уровнем аутоантител субкласса к НЦЗР и инфильтрацией опухоли лимфоцитами (г =0,787; р = 0,001). Обратные корреляционные связи отмечались между уровнем аутоантител субкласса Оз к Н1ЛЭР и количеством опухолевых клеток в сосудах (г = -0,655; р = 0,015), относительным содержанием НД клеток в опухоли (г = -0,584; р = 0,036) и количеством лимфоузлов, пораженных метастазами (г = - 0,583; р = 0,047), между уровнем аутоантител субкласса С4 к

HLDF и количеством опухолевых клеток в сосудах (г = -0,581; р = 0,037), количеством патологических митозов (г = - 0,638; р = 0,019) и глубиной инвазии (г = - 0,713; р = 0,009).

Таким образом, аутоантитела субкласса G* к HLDF, уровни которых были повышены у больных РЖ по сравнению со здоровыми лицами, отражали меньшую степень тяжести опухолевой прогрессии. Что же касается аутоантител других субклассов, то их уровни, хотя и не отличались от показателей здоровых, но тем не менее, также были сопряжены с меньшей степенью тяжести опухолевой прогрессии, за исключением аутоантител класса А при РЖ.

Повышенные уровни аутоантител субклассов G3 и G4 к фактору дифференцировки HLDF при позитивной реакции МНК на ОАА, хотя и были характерны для меньшей степени тяжести опухолевой прогрессии, но, вместе с тем, находились в прямой корреляционной связи со степенью васкуляризации, как и процент прироста CD8+-лимфоцитов при инкубации МНК с ОАА. Объясняя эту взаимосвязь, следует принять во внимание еще несколько фактов: во-первых, повышенный уровень аутоантител субкласса G4 к HLDF также соответствовал большей выраженности инфильтрации опухоли лимфоцитами; во-вторых, HLDF может ингибировать эффекты провоспалительного цитокина IL-ip, препятствуя его взаимодействию с рецептором (Костанян И.А. и др., 2000), a IL-lp, в свою очередь, обладает способностью стимулировать ангиогенез (Carmi У. et al., 2009), и в-третьих, при позитивной реакции МНК на ОАА отмечалось повышенное содержание этого цитокина. На основании этих фактов можно прийти к заключению о том, что при наличии потенциально реактивных по отношению к ОАА лимфоцитов происходит миграция активированных клеток в очаг опухолевого роста, сопровождающаяся включением гуморального звена иммунитета и продукцией инфильтрирующими неоплазму лимфоцитами аутоантител, в том числе и к фактору дифференцировки HLDF, которые, возможно, блокируя его действие на IL-lp, могут обеспечивать реализацию ангиогенного эффекта этого цитокина. Следовательно, даже при невысокой степени тяжести опухолевой прогрессии блокада биологических эффектов HLDF, заключающихся в антипролиферативном и дифференцирующем действии, создает оптимальные условия для существования злокачественного новообразования в организме, в частности, за счет обеспечения васкуляризации опухоли. Помимо рассмотренного выше механизма, создающего благоприятные условия функционирования опухоли, необходимо остановиться и на известном факте о присутствии в опухолевом микроокружении, помимо прочего, незрелых миелоидных клеток, секретирующих TGFP, кислородные радикалы, пероксинитрит и другие факторы, которые обеспечивают толерантность организма к неоплазме и стимулируют опухолевую прогрессию (Kusmartsev S., Gabrilovich D.I., 2006; Ostrand-Rosenberg S., Sinha P., 2009). Поэтому, супрессия аутоантителами активности HLDF, очевидно, может препятствовать их созреванию и этим поддерживать их проопухолевое действие.

Таким образом, злокачественное новообразование, в силу своей генетической и фенотипической пластичности, обладает повышенной способностью приспосабливаться к тем или иным проявлениям реактивности лейкоцитов (Bindra R.S., Glazer P.M., 2005; Huang L.E. et al., 2007; Hudson L.G. et al., 2008). К тому же, оно может автономно обеспечивать свое существование, посредством секреции ряда медиаторов воспаления, способствующих его прогрессии (Fulcuyama Т. et al., 2007; Todaro М. et al., 2007). При наличии в организме потенциально реактивных по отношению к ОАА лейкоцитов реализуется механизм гуморальной регуляции биологических эффектов цитокинов и фактора дифференцировки, который, несмотря на некоторое сдерживающее влияние на опухолевую прогрессию, способен создавать условия для сохранения опухоли и ее оптимального функционирования.

Выводы

1. У больных аденокарциномами желудка и толстой кишки сочетание позитивной реакции мононуклеарных клеток на опухолеассоциированные антигены (повышение содержания клеток с маркером CD8 не менее, чем на 15% после их инкубации in vitro по

сравнению с контролем - без опухолеассоциированных антигенов), являющейся показателем наличия в организме мононуклеаров, приобретающих фенотип CD8+, присущий цитотоксическим клеткам, при контакте с опухолеассоциированными антигенами, с повышенным содержанием клеток с маркерами активации CD25, CD38, CD71 и HLA-DR по сравнению с больными с негативной реакцией мононуклеарных клеток на опухолеассоциированные антигены свидетельствует о потенциальной способности лейкоцитов реагировать на злокачественное новообразование.

2. При аденокарциномах желудка и толстой кишки активируются функции мононуклеаров и гранулоцитов, о чем свидетельствует повышенное содержание в сыворотке крови больных аденокарциномами желудка IL-6 и IL-IRa, а у больных аденокарциномами толстой кишки, кроме повышенного содержания вышеуказанных цитокинов, и IL-8 по сравнению со здоровыми лицами. При раке желудка содержание IL-6 находилось в прямой корреляционной связи с количеством регионарных лимфоузлов, пораженных метастазами, а при колоректальном раке - со степенью васкуляризации опухоли, что свидетельствует о том, что при раке желудка IL-6 вовлечен в процесс метастазирования, а при колоректальном раке он преимущественно стимулирует ангиогенез.

3. У больных аденокарциномами желудка и толстой кишки только в тех случаях, когда мононуклеарные клетка обладают потенциальной способностью приобретать фенотип CD8\ присущий цитотоксическим клеткам, в ответ на контакт с опухолеассоциированными антигенами, активируется механизм гуморальной регуляции биологических эффектов медиаторов воспаления и фактора дифференцировки, характеризующийся повышением продукции лейкоцитами связывающего IL-18 белка - IL-18ВР под влиянием митогена in vitro и уровней аутоантител класса А к TNFa и субклассов G3 и G4 к фактору дифференцировки Human Leukemia Differentiation. Factor - HLDF в сыворотке крови.

4. Повышенные уровни гуморальных регуляторов биологических эффектов TNFa и IL-18 характерны для аденокарцином желудка и толстой кишки с меньшей степенью тяжести опухолевой прогрессии, о чем свидетельствуют статистически значимые обратные корреляционные связи между уровнями аутоантител класса А к TNFa в сыворотке крови, способностью лейкоцитов продуцировать связывающий IL-18 белок - IL-18BP под влиянием митогена in vitro и количеством опухолевых клеток в сосудах, а также содержанием низкодифференцированных клеток в опухоли.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

!. Фенотипические особенности мононуклеаров периферической крови и их взаимосвязь с патогистологической картиной рака желудка / А.И. Аутеншлюс, A.B. Соснина, Д.В. Морозов, Р.В. Шорохов, А.П. Лыков, Д.Н. Егоров, Е.С. Михайлова, C.B. Мичурина, O.P. Тихолис // Омский научный вестник. - 2007. - Ks 3 (61), приложение 2: Материалы межрегиональной научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири». - С. 229-231.

2. Фенотип мононуклеарных клеток периферической крови у больных раком желудка / А.И. Аутеншлюс, A.B. Соснина, Е.С. Михайлова, А.П. Лыков, Д.В. Морозов, O.P. Тихолис, C.B. Мичурина, Р.В. Шорохов // Российский аллергологический журнал. - 2008. - №1, приложение 1: Труды Национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология - междисциплинарные проблемы». - С. 20-21.

3. О взаимосвязи ' фенотипа мононуклеарных клеток периферической крови с патогистологической картиной злокачественных новообразований желудочно-кишечного тракта / А.И. Аутеншлюс, A.B. Соснина, Е.С. Михайлова, А.П. Лыков, Д.В. Морозов, O.P. Тихолис, Р.В. Шорохов, C.B. Мичурина // Медицинская иммунология. - 2008. - Т. 10, Ks 2-3. - С. 181-186 (из списка ВАК).

4. Клеточные и гуморальные факторы иммунитета у больных раком желудочно-кишечного тракта / А.И. Аутеншлюс, A.B. Соснина, Е.С. Михайлова, Д.В. Морозов, H.A.

Вараксин, М.Ю. Рукавишников, C.B. Мичурина // Сибирский медицинский журнал - 2008. -№3, выпуск 1.-С. 82.

5. Цитокины и патогистологическая картина злокачественных новообразований при раке желудочно-кишечного тракта / А.И. Аутеншлюс, A.B. Соснина, Е.С. Михайлова, Д.В. Морозов, H.A. Вараксин, М.Ю. Рукавишников, Ю.Н. Козлова, A.B. Канынина И Медицинская иммунология. - 2009. - Т. 11, № 1. - С. 29-34 (из списка ВАК).

6. Провоспалительные цитокины и антитела к ним при раке желудочно-кишечного тракта ! А.И. Аутеншлюс, A.B. Соснина, Е.С. Михайлова, Д.В. Морозов // Сибирский онкологический журнал. - 2009. - Приложение № 2: Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием, посвиценной 30-летию НИИ онкологии СО РАМН «Современная онкология: достижения и перспективы развития». - С. 18-19.

7. Функциональная активность клеток периферической крови при раке желудочно-кишечного тракта / A.B. Соснина, А.П. Лыков, А.И. Аутеншлюс, Е.С. Михайлова, Н.В. Великая, С.А. Фурсов, H.A. Вараксин // Сибирский онкологический журнал. - 2009. -Приложение № 2: Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 30-летию НИИ онкологии СО РАМН «Современная онкология: достижения и перспективы развития». - С. I82-183.

8. Провоспалительные цитокины и регуляторы их активности у больных раком желудочно-кишечного тракта / А.И. Аутеншлюс, A.B. Соснина, Е.С. Михайлова, А.П. Лыков, Д.В. Морозов, Н.В. Великая, С.А. Фурсов, H.A. Вараксин // Цитокины и воспаление. - 2009. - Т. 8, Ks 4. - С. 18-22 (из списка ВАК).

9. Антитела к фактору дифференцировки HLDF у больных раком желудочно-кишечного тракта / А.И. Аутеншлюс, A.B. Соснина, Е.С. Михайлова, А.П. Лыков, Ю.В. Туманов, Е.В. Даниленко, B.C. Самуков, И.А. Костанян, Д.В. Морозов, М.М. Черепкова, Л.А. Хван, H.A. Вараксин // Медицинская иммунология. - 2010. - Т. 12, № 1-2. - С. 49-56 (из списка ВАК).

ВД - высокодифференцированные клетки

ИВ - индекс влияния

ИРИ - иммунорегуляторный индекс

КРР - колоректальный рак

МНК - мононуклеарные клетки

НД - ниэкодифференцированные клетки

ОАА - опухолеассоциированные антигены

РЖ - рак желудка

УД - умереннодифференцированные клетки ФГА- фитогемагглютинин

HLDF (Human Leukemia Differentiation Factor) - фактор дифференцировки IL-J8BP (IL-18 binding protein) - белок, связывающий интерлейкин-18 IL- IRa - рецепторный антагонист интерлейкина-1

Список сокращений

Соискатель

Соснина A.B.

Отпечатано в типографии Новосибирского государственного технического университета 630092, г. Новосибирск, пр. К. Маркса, 20,

тел./факс (383) 346-08-57 формат 60 X 84/16 объем 1.0 п.л. тираж 100 экз. заказ № 257 подписано в печать 29.07.2010 г

Актуальность темы. В России рак желудка и колоректальный рак занимают одно из ведущих мест в структуре онкологической заболеваемости и относятся к злокачественным новообразованиям с неблагоприятным прогнозом (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2009). Согласно современным представлениям о взаимодействии злокачественного новообразования с факторами, обеспечивающими гомеостаз организма, антигены опухолевых клеток, хотя и распознаются иммунной системой (Crimeen-Irwin В. et al., 2005; Casiano С.А. et al., 2006; Ostrand-Rosenberg S., 2008), однако элиминация трансформированных клеток происходит далеко не всегда, так как реакции, направленные на уничтожение неоплазмы, играют противоположную роль, способствуя сохранению опухоли и ее прогрессии (Абелев Г.И., Эрайзер Т.Л., 2008). Важнейшим препятствием для развития противоопухолевого иммунитета, который бы приводил к полному уничтожению трансформированных клеток, служит то обстоятельство, что опухоль, особенно на ранних стадиях развития, не является для организма чужеродной, и большинство опухолеассоциированных антигенов — это аутоантигены, по отношению к которым в организме существует относительная толерантность (Гранов A.M., Молчанов О.Е., 2008, Кадагидзе З.Г. и др., 2009). Растущая опухоль и ее микроокружение способны продуцировать ряд факторов, запускающих различные механизмы ускользания неоплазмы от иммунного надзора. К ним относятся сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), IL-10, TGFJ3, простагландин Е2, растворимый фосфатидилсерин, растворимые Fas, FasL и MICA. Они оказывают иммуносупрессивное действие и способствуют инвазии и метастазированию (Kim R. et al., 2007; Jain S. et al., 2008; Solberg T.D. et al., 2008; Lima L.G. et al., 2009).

Медиаторы воспаления, продуцируемые инфильтрирующими опухоль лейкоцитами, такие как TNFa, IL-1 (3, IL-6, IL-8 и т. п., взаимодействуя с рецепторами на клетках-мишенях, в частности на опухолевых клетках и клетках микроокружения, также вовлекаются в реализацию процессов, обеспечивающих жизнедеятельность злокачественного новообразования (Elaraj D.M. et al., 2006; Kulbe H. et al., 2007; Millar HJ. et al., 2008; Studebaker A.W. et al., 2008). Эффекты цитокинов во многом зависят от того, какие рецепторы и их сочетания окажутся в тот момент на клетках-мишенях, а также от присутствия регуляторов их активности, к которым относятся рецепторные антагонисты, связывающие белки и антитела (McFarlane S.M. et al., 2002; Zhu W. et al., 2004; Dudler J. et al., 2007; Szczesny T.J. et al., 2007). Последние, связывая цитокины, могут либо нейтрализовать их действие, либо, выполняя функцию переносчиков, обеспечивать их транспортировку к клеткам-мишеням, то есть, им принадлежит важная роль в регуляции развития злокачественного новообразования, однако характер этой регуляции опухолевой прогрессии не ясен и требует дальнейшего изучения (Абелев Г.И., 2003; Finkelman F.D. et al., 1993; Bakhiet M. et al., 1999).

Следовательно, реактивность лейкоцитов, в норме направленная на поддержание генетического постоянства организма, в условиях развития злокачественного новообразования способна обеспечивать либо выживание опухоли, либо торможение ее прогрессирования (Савина Н.П., 2009). Поэтому оценка свойств этих клеток является актуальной, так как позволит понять их роль в процессах адаптации опухоли в организме и поможет в дальнейшем разработать новые подходы к диагностике и созданию препаратов, изменяющих вектор механизмов гомеостаза, направляя его на предотвращение развития злокачественного новообразования.

Цель работы: изучить реактивность лейкоцитов по отношению к опухолеассоциированным антигенам по экспрессии поверхностных молекул, продукции медиаторов воспаления и регуляторов их биологических эффектов у больных аденокарциномами желудка и толстой кишки.

Задачи исследования:

1. Определить содержание в периферической крови клеток, экспрессирующих маркеры CD3, CD4, CD8, CD20, CD25, CD38, CD71 и

HLA-DR, и изучить реакцию in vitro мононуклеаров на опухолеассоциированные антигены - комплекс в составе раковоэмбрионального антигена, хорионического гонадотропина человека, нейроспецифической энолазы, углеводных антигенов - СА 19-9 и СА 125, альфафетопротеина и микроглобулина человека, у больных аденокарциномами желудка.

2. Определить содержание в периферической крови клеток, экспрессирующих маркеры CD3, CD4, CD8, CD20, CD25, CD38, CD71 и HLA-DR, и изучить реакцию in vitro мононуклеаров на опухолеассоциированные антигены - комплекс в составе раковоэмбрионального антигена, хорионического гонадотропина человека, нейроспецифической энолазы, углеводных антигенов - СА 19-9 и СА 125, альфафетопротеина и микроглобулина человека, у больных аденокарциномами толстой кишки.

3. Определить в сыворотке крови и в супернатантах цельной крови содержание цитокинов: IL-1(3, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, 1L-17, IL-18, IFNa, IFNy, TNFa и связывающего IL-18 белка (IL-18BP) у больных аденокарциномами желудка.

4. Определить в сыворотке крови и в супернатантах цельной крови содержание цитокинов: IL-ip, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, IL-18, IFNa, IFNy, TNFa и связывающего IL-18 белка (IL-18BP) у больных аденокарциномами толстой кишки.

5. Определить в сыворотке крови уровни аутоантител к TNFa, IFNa, IFNy, к фактору дифференцировки HLDF, а также содержание рецепторного антагониста IL-1 (IL-IRa) у больных аденокарциномами желудка.

6. Определить в сыворотке крови уровни аутоантител к TNFa, IFNa, IFNy, к фактору дифференцировки HLDF, а также содержание рецепторного антагониста IL-1 (IL-IRa) у больных аденокарциномами толстой кишки.

7. Изучить характер взаимосвязи между содержанием клеток с маркерами активации CD25, CD38, CD71 и HLA-DR, показателями реакции in vitro мононуклеаров на опухолеассоциированные антигены, уровняхми цитокинов, связывающего IL-18 белка (IL-18BP), аутоантител к TNFa, IFNa, IFNy, к фактору дифференцировки HLDF и патогистологическими параметрами опухолей у больных аденокарциномами желудка.

8. Изучить характер взаимосвязи между содержанием клеток с маркерами активации CD25, CD38, CD71 и HLA-DR, показателями реакции in vitro мононуклеаров на опухолеассоциированные антигены, уровнями цитокинов, связывающего IL-18 белка (IL-18ВР), аутоантител к TNFa, IFNa, IFNy, к фактору дифференцировки HLDF и патогистологическими параметрами опухолей у больных аденокарциномами толстой кишки.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые в сыворотке крови больных аденокарциномами желудка и толстой кишки были обнаружены аутоантитела к фактору дифференцировки Human Leukemia Differentiation Factor - HLDF классов G, M, А и субклассов Gi, G2, G3, G4. У больных аденокарциномами желудка по сравнению со здоровыми лицами были повышены только уровни аутоантител субкласса G4 к фактору дифференцировки HLDF. Впервые на основании статистически значимой обратной корреляционной связи между уровнем аутоантител класса G4 к HLDF и глубиной инвазии аденокарцином желудка и толстой кишки показана сопряженность повышенных уровней аутоантител к HLDF с меньшей степенью тяжести опухолевой прогрессии.

Впервые у больных аденокарциномами желудка и толстой кишки выявлена позитивная реакция мононуклеарных клеток с фенотипом CD8+ на опухолеассоциированные антигены in vitro, которая свидетельствует о наличии в организме мононуклеаров, обладающих потенциальной способностью приобретать после контакта с опухолеассоциированными антигенами фенотип CD8+, присущий цитотоксическим клеткам, и которая сопровождается повышением содержания в периферической крови клеток с маркерами активации: CD25, CD38, CD71 и HLA-DR и включением механизма гуморальной регуляции биологических эффектов медиаторов воспаления и фактора дифференцировки HLDF, показателями чего являются повышенные уровни аутоантител к TNFa и HLDF в сыворотке крови, а также повышенная продукция клетками крови IL-18BP в ответ на стимуляцию митогеном.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Полученные данные о реактивности лейкоцитов и роли гуморальной регуляции биологических эффектов медиаторов воспаления и фактора дифференцировки в прогрессии аденокарцином желудка и толстой кишки создают основу для разработки новых подходов к лечению аденокарцином желудка и толстой кишки, в частности, с использованием фактора дифференцировки HLDF для блокирования антител, препятствующих дифференцировке опухолевых клеток и IL-18BP для ограничения активности провоспалительного цитокина IL-18, стимулирующего опухолевую прогрессию.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ, ВЫНОСИМЫЕ НА

ЗАЩИТУ

1. У больных аденокарциномами желудка и толстой кишки выявлена реакция мононуклеарных клеток на опухолеассоциированные антигены, оцениваемая как позитивная при повышении содержания клеток с фенотипом CD8+ не менее, чем на 15% после их инкубации in vitro с этими антигенами по сравнению с контрольной пробой, не содержащей опухолеассоциированных антигенов, что свидетельствует о наличии в организме мононуклеаров, обладающих потенциальной способностью приобретать фенотип CD8+, присущий цитотоксическим клеткам, в ответ на контакт с опухолеассоциированными антигенами.

2. У больных аденокарциномами желудка и толстой кишки позитивная реакция мононуклеарных клеток на опухолеассоциированные антигены сопровождается повышением в периферической крови содержания клеток с маркерами CD25, CD38, CD71 и HLA-DR и активацией механизма гуморальной регуляции биологических эффектов медиаторов воспаления и фактора дифференцировки Human Leukemia Differentiation Factor - HLDF, о чем свидетельствуют повышенные уровни аутоантител класса А к TNFa и субклассов G3 и G4 к HLDF в сыворотке крови, а также повышенная продукция лейкоцитами связывающего IL-18 белка - IL-18BP в ответ на стимуляцию митогеном.

3. При аденокарциномах желудка и толстой кишки активируются функции мононуклеаров и гранулоцитов, о чем свидетельствует повышенное содержание в сыворотке крови больных аденокарциномами желудка IL-6 и IL-1 Ra, а у больных аденокарциномами толстой кишки, кроме повышенного содержания вышеуказанных цитокинов, и IL-8. При раке желудка содержание провоспалительного цитокина 1L-6 находится в прямой корреляционной связи с количеством регионарных лимфоузлов, пораженных метастазами, а при колоректальном раке - со степенью васкуляризации опухоли, что свидетельствует о том, что при раке желудка IL-6 вовлечен в процесс метастазирования, а при колоректальном раке он преимущественно стимулирует ангиогенез.

МАТЕРИАЛЫ ДИССЕРТАЦИИ ДОЛОЖЕНЫ И ОБСУЖДЕНЫ НА:

1) межрегиональной научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» 26 - 28 сентября 2007 года в г. Омске;

2) национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология - междисциплинарные проблемы» 26 — 27 февраля 2008 года в г. Москве;

3) научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири - 2008» 16-19 сентября 2008 года в г. Томске;

4) Российской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 30-летию НИИ онкологии СО РАМН «Современная онкология: достижения и перспективы развития» 10-11 сентября 2009 года в г. Томске.

ВЫВОДЫ

1. У больных аденокарциномами желудка и толстой кишки сочетание позитивной реакции мононуклеарных клеток на опухолеассоциированные антигены (повышение содержания клеток с маркером CD8 не менее, чем на 15% после их инкубации in vitro по сравнению с контролем - без опухолеассоциированных антигенов), являющейся показателем наличия в организме мононуклеаров, приобретающих фенотип CD8+, присущий цитотоксическим клеткам, при контакте с опухолеассоциированными антигенами, с повышенным содержанием клеток с маркерами активации CD25, CD38, CD71 и HLA-DR по сравнению с больными с негативной реакцией мононуклеарных клеток на опухолеассоциированные антигены свидетельствует о потенциальной способности лейкоцитов реагировать на злокачественное новообразование.

2. При аденокарциномах желудка и толстой кишки активируются функции мононуклеаров и гранулоцитов, о чем свидетельствует повышенное содержание в сыворотке крови больных аденокарциномами желудка IL-6 и IL-IRa, а у больных аденокарциномами толстой кишки, кроме повышенного содержания вышеуказанных цитокинов, и IL-8 по сравнению со здоровыми лицами. При раке желудка содержание IL-6 находилось в прямой корреляционной связи с количеством регионарных лимфоузлов, пораженных метастазами, а при колоректальном раке - со степенью васкуляризации опухоли, что свидетельствует о том, что при раке желудка IL-6 вовлечен в процесс метастазирования, а при колоректальном раке он преимущественно стимулирует ангиогенез.

3. У больных аденокарциномами желудка и толстой кишки только в тех случаях, когда мононуклеарные клетки обладают потенциальной способностью приобретать фенотип CD8+, присущий цитотоксическим клеткам, в ответ на контакт с опухолеассоциированными антигенами, активируется механизм гуморальной регуляции биологических эффектов медиаторов воспаления и фактора дифференцировки, характеризующийся повышением продукции лейкоцитами связывающего IL-18 белка - IL-18BP под влиянием митогена in vitro и уровней аутоантител класса А к TNFa и субклассов G3 и G4 к фактору дифференцировки Human Leukemia Differentiation Factor - HLDF в сыворотке крови.

4. Повышенные уровни гуморальных регуляторов биологических эффектов TNFa и IL-18 характерны для аденокарцином желудка и толстой кишки с меньшей степенью тяжести опухолевой прогрессии, о чем свидетельствуют статистически значимые обратные корреляционные связи между уровнями аутоантител класса А к TNFa в сыворотке крови, способностью лейкоцитов продуцировать связывающий IL-18 белок - IL-18ВР под влиянием митогена in vitro и количеством опухолевых клеток в сосудах, а также содержанием низкодифференцированных клеток в опухоли.

91