Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Оценка прогностических возможностей исследования полиморфных вариантов генов, регулирующих сосудистые реакции, в развитии синдрома гиперстимуляции яичников

На правах рукописи

Чермянинова Ольга Валерьевна

ОЦЕНКА ПРОГНОСТИЧЕСКИХ ВОЗМОЖНОСТЕЙ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНОВ, РЕГУЛИРУЮЩИХ СОСУДИСТЫЕ РЕАКЦИИ, В РАЗВИТИИ СИНДРОМА ГИПЕРСТИМУЛЯЦИИ ЯИЧНИКОВ

14.01.01 - Акушерство и гинекология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

13 МАЙ 2015

0065688^-5

Казань-2015

005568833

Работа выполнена на базе Федерального государственного бюджетного учреждения «Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Ковалев Владислав Викторович - доктор медицинских наук, профессор Официальные оппоненты:

Сандакова Елена Анатольевна - доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой акушерства и гинекологии ФДПО Пермского государственного медицинского университета имени академика Е.А. Вагнера, г. Пермь Дубровина Светлана Олеговна - доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Ростов-на-Дону Ведущая организация:

Государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии», г. Москва.

Защита состоится «_» _2015 г. в 10 часов на заседании

диссертационного совета Д 208.033.01 на базе государственного бюджетного образовательного учреждения дополнительного профессионального образования «Казанская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 420012, г. Казань, ул. Бутлерова, д. 36.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, сайт www. kgma.info

Автореферат разослан «_»_2015г.

Учёный секретарь диссертационного совета, доцент кандидат медицинских наук

Тухватуллина Лилия Мухаметзяновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Бесплодный брак остаётся одной из важнейших проблем человечества. По данным Министерства Здравоохранения Российской Федерации в стране зарегистрировано более пяти миллионов супружеских пар, из них более половины нуждаются в применении методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Основой для этих методов является процедура экстракорпорального оплодотворения преовуляторных фолликулов и перенос дробящихся эмбрионов в полость матки (ЭКО и ПЭ).

Серьезным и трудно предсказуемым осложнением является синдром гиперстимуляции яичников (СГЯ). СГЯ - ятрогенное состояние, в основе которого лежит гиперергический неконтролируемый ответ яичников на экзогенное введение индукторов овуляции. Заболевание протекает с различной степенью тяжести и может заканчиваться летальными исходами, в связи с развитием тромбоэмболических осложнений или респираторным-дистресс синдромом взрослых. Частота этой патологии варьирует от 0,5% до 33%, а уровень летальности составляет 1/450000-500000 женщин.

Профилактика развития синдрома гиперстимуляции яичников является неоспоримо чрезвычайно важной проблемой не только в связи с гибелью пациенток, но и по причине снижения эффективности процедуры ЭКО, формирования отдалённых последствий и ощутимыми экономическими потерями. До настоящего времени не предложено ни одного достаточно эффективного метода предупреждения этой патологии. Не существует абсолютно надежных способов, позволяющих полностью предотвратить развитие СГЯ у каждой конкретной пациентки, поэтому определение степени риска синдрома являются приоритетными направлениями для научных исследований.

Успехи молекулярной генетики, сделанные за последние десятилетия, открывают новые возможности для клинической медицины. В частности, с помощью молекулярно-генетических инструментов, можно по-новому взглянуть

не только на проблему бесплодия в целом, но и на роль фундаментальных генетических факторов в реализации программ ЭКО и ПЭ.

Роль генетического фактора в развитии СГЯ по настоящее время остаётся малоизученной. Особый интерес, с нашей точки зрения, представляют генетические полиморфизмы ренин-ангиотезин-альдостероновой системы (РААС) и метаболизма оксида азота, изменения в которых играют ведущую роль в патогенезе данного синдрома. Исследуя полиморфизм генов, как фактор генетической предрасположенности к СГЯ, открываются новые горизонты в выявлении групп риска по развитию данного синдрома и оптимизации программ экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов.

Цель исследования

Разработать метод прогнозирования синдрома гиперстимуляции яичников на основе изучения роли полиморфных вариантов генов ренин-ангиотензин-альдостероновой системы и метаболизма оксида азота для повышения эффективности и безопасности программ вспомогательных репродуктивных технологий.

Задачи исследования

1. Провести клинико-статистический анализ особенностей соматического и акушерско-гинекологического статуса пациенток исследуемых групп.

2. Изучить распространенность полиморфизмов генов ренин-ангиотензин-альдостероновой системы и эндотелиальной дисфункции у пациенток исследуемых групп.

3. Провести сравнительный анализ уровней ренина, ангиотензина II, альдостерона в плазме крови у пациенток исследуемых групп.

4. На основании полученных данных разработать метод прогнозирования развития синдрома гиперстимуляции яичников в программах экстракорпорального оплодотворения.

Научная новизна

Расширены знания о влиянии факторов риска, в том числе генетических предикторов, на риск развития синдрома гиперстимуляции яичников в

программах экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов. Выявлены наиболее значимые прогностические факторы в плане вероятного развития синдрома гиперстимуляции яичников в программах вспомогательных репродуктивных технологий. В работе впервые проведена оценка прогностических возможностей полиморфизмов генов, регулирующих сосудистые реакции, в развитии синдрома гиперстимуляции яичников. Обнаружена ассоциация гетерозиготного генотипа -344СТ гена апьдостеронсинтазы (СУР 11В2) с поздней формой СГЯ. В то же время выявлено, что носительство вариантного аллеля 1675 А гена АСТЯ2 (рецептора 2-го типа к ангиотензину II) в гетеро - или гомозиготном состоянии уменьшает риск развития тяжёлой формы синдрома гиперстимуляции яичников практически в два раза. У пациентов с синдромом гиперстимуляции яичников выявлено достоверное повышение уровня ангиотензина II по сравнению с группой контроля.

Практическая значимость Оценена роль полиморфизмов генов ренин-ангиотензин-альдостероновой системы и метаболизма оксида азота в развитии синдрома гиперстимуляции яичников, а также содержание ренина, ангиотензина II и альдостерона в плазме крови пациенток исследуемых групп. Разработан алгоритм прогнозирования синдрома гиперстимуляции яичников в программах экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов на основании решающего правила прогноза и предложены возможные пути его ранней профилактики.

Внедрение результатов исследования Результаты диссертационного исследования внедрены в работу отделений гинекологии и вспомогательных репродуктивных технологий Федерального государственного бюджетного учреждения «Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества» Министерства здравоохранения Российской Федерации, МГБУ «Клинико-диагностический центр охраны здоровья матери и ребенка» Минздрава Свердловской области. Материалы диссертации используются в преподавании данного раздела на

кафедре акушерства и гинекологии ФПК и ГТП ГБОУ ВПО «Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены на научно-практической конференции «Инновационные технологии в охране здоровья матери и ребёнка» (5-6 декабря 2012г, Екатеринбург); III международной научно-практической конференции ЭКО: неординарная клиническая практика (28 сентября 2013г, Екатеринбург); III конгрессе акушеров-гинекологов Уральского федерального округа, V Российско-Германский конгрессе акушеров-гинекологов «Репродуктивное здоровье в центре внимания медицинского сообщества» (14-16 октября 2013г, Екатеринбург); научно-практической конференции с международным участием «Нерешенные вопросы акушерства, гинекологии и перинатологии» (14-15 октября 2014г, Екатеринбург).

Получена премия Берлин-Бранденбургской академии наук «Sigrid und Heinz Hannse-Preis der Berlin-Brandenburgischen Academie der Wissenschaften» (28.11.2014, Германия, Потсдам). Оформлено заявления на патент «Способ прогнозирования синдрома гиперстимуляции яичников у пациенток программ экстракорпорального оплодотворения» (№ 2014124098/14, дата приоритета 11.06.2014).

Положения диссертации были представлены также на совместном заседании кафедр акушерства и гинекологии №1 ГБОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, акушерства и гинекологии №1 и №2 ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Казань, 2015).

Публикации

По теме диссертации опубликовано шесть печатных работ, из них три в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ, для публикации результатов диссертационных работ.

Объём и структура исследования

Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста, содержит 27 таблиц и 12 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Список литературы включает 141 источник, из которых 116 зарубежных и 25 отечественных.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Наличие генетических полиморфизмов ренин-ангиотензин-альдостероновой системы предрасполагает к развитию поздней формы синдрома гиперстимуляции яичников тяжёлой степени тяжести.

2. Учёт значимых факторов риска наряду с определением полиморфизмов генов альдостеронсинтазы, ангиотензиногена, рецепторов второго типа к ангиотензину II, способствует выявлению групп риска по развитию синдрома гиперстимуляции яичников в программах вспомогательных репродуктивных технологий.

3. У пациенток с синдромом гиперстимуляции яичников имеется повышение уровня ангиотензина II по сравнению с группой контроля (р=0,029).

4. Использование правила прогнозирования синдрома гиперстимуляции яичников в программах экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов позволяет предвидеть возникновение данного осложнения с чувствительностью - 66,17% и специфичностью - 77,89%.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы н методы исследования Работа выполнена на базе Федерального государственного бюджетного учреждения «Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества» Министерства Здравоохранения Российской Федерации в период с 2011 по 2014 гг.

С целью оценки роли полиморфизмов генов, регулирующих сосудистые реакции в развитии СГЯ, было проведено контролируемое ретроспективное

когортное исследование. Обследовано 105 женщин, которым выполнена программа ЭКО, ИКСИ (интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида в яйцеклетку). Основная группа представлена 49 женщинами, у которых программа ЭКО, ИКСИ осложнилась развитием СГЯ средней и тяжёлой степени тяжести. В дальнейшем, в ходе анализа, основная группа была разделена на четыре подгруппы: 1а - женщины с ранним началом СГЯ (17 человек), 16 - женщины с поздним началом СГЯ (32 женщины), 2а - пациентки со средней степенью тяжести СГЯ (38 человек) и 26 - с тяжёлой степенью СГЯ (11 пациенток). Для верификации диагноза и определения степени тяжести за основу была взята классификации СГЯ (Golan (1989 г.), Navot (1995 г.). Все пациентки с СГЯ были госпитализированы и проходили лечение в гинекологическом отделении ФГБУ «НИИ ОММ» МЗ РФ (г. Екатеринбург). Группа контроля представлена 56 женщинами, у которых программа ЭКО, ИКСИ и ПЭ завершилась наступлением клинической беременности без признаков СГЯ. Критерий включения в основную группу: наличие проявлений раннего или позднего СГЯ средней, тяжёлой или критической степени тяжести.

Обследование всех женщин проводилось согласно приказу Минздрава РФ №107 «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению» от 30.08.2012 г. Ведение пациентов с СГЯ проводилось согласно федеральным клиническим рекомендациям за 2013 г. «Диагностика и лечение синдрома гиперстимуляции яичников».

В ходе исследования всем женщинам проводилось молекулярно-генетическое исследование методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени шести полиморфных вариантов следующих пяти генов:

1. генов, ответственных за регуляцию компонентов РААС:

• полиморфизмы 704 Т>С и 521 ОТ в гене ангиотензиногена (AGT);

• полиморфизмы 1166 А>С в гене рецептора 1-го типа к ангиотензину II (AGTR1);

• полиморфизмы 1675 G>A в гене рецептора 2-го типа к ангиотензину II (AGTR2);

• полиморфизмы CYP 11В2 ОТ в гене альдостеронсинтазы;

2. генов метаболизма оксида азота:

• полиморфизмы 786 Т>С и 894 G>T в гене эндотелиальной синтазы окиси азота 3 (NOS3).

Образцы ДНК пациенток получали из буккального эпителия, используя коммерческие наборы реагентов и протоколы для выделения ДНК (ООО «ДНК-Технология», Россия). Генотипирование образцов по аллельным вариантам исследуемых генов проводили методом аллель-специфичной полимеразной цепной реакции в «режиме реального времени» со снятием кривых плавления

продуктов амплификации.

Определение уровней ренина, ангиотензина II и альдостерона в плазме крови выполнялось методом иммуноферментного анализа наборами реагентов RayBio Angiotensin II Enzyme Immunoassay (EIA), Aldosterone CAN-ALD-450N компании ЗАО «БиоХимМак» и ELISA Kit for Human Renin (REN) фирмы USCNK. Статистическую обработку материалов исследования проводили с использованием стандартных статистических программ Microsoft Excel 2007 для Windows 7 и Statistica 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Известные факторы риска СГЯ (молодой возраст, низкий индекс массы тела, СГЯ в анамнезе, высокий уровень эстрадиола, количество полученных фолликулов и яйцеклеток при пункции фолликулов) не обладают высокой достоверностью. Учитывая тяжесть патологии, наличие летальных исходов в ходе осложнений программ ВРТ, поиск методов прогнозирования и

профилактики СГЯ продолжается.

У женщин исследуемых групп мы оценивали соматический статус, наличие гинекологической патологии, оперативных вмешательств, длительность и генез бесплодия, использование в прошлом попыток ВРТ с целью его преодоления. Большое внимание было уделено применяемым протоколам стимуляции

суперовуляции в программах ЭКО, препаратам и дозам гонадотропинов, выбору триггера овуляции, количеству полученных фолликулов и яйцеклеток.

Принимая во внимание возраст, как один из факторов риска СГЯ, женщины исследуемых групп, были разделены на возрастные подгруппы. Статистически значимых различий между группами не выявлено. Возраст женщин варьировал от 25 до 42 лет. Средний возраст в основной группе составил 32,204±0,52, в контрольной - 32,375±0,57 (р=0,413).

При оценке индекса массы тела и наличия ожирения как фактора, снижающего риск развития СГЯ (Ыа\'о1 и др., 1998), мы также не получили достоверных отличий. Ожирение в основной группе отмечено у пяти человек (10,2%), в контрольной - у 10 (17,9%), р=0,134.

По частоте и спектру сопутствующей экстрагенитальной патологии (болезни органов кровообращения, мочевыделительной, нервной, эндокринной систем) исследуемые группы были сопоставимы (р>0,05). Исключение составляют болезни органов пищеварения. В основной группе они встречались с частотой 2% (п=1), в контрольной - 10,7% (п=6), р=0,038.

В ходе исследования выявлен интересный факт, что СГЯ развивался, как правило, у первобеременных пациенток (р=0,001).

Были анализированы особенности акушерского и гинекологического анамнеза. Основное внимание уделялось гинекологическим заболеваниям, предшествующим операциям, попыткам ЭКО в анамнезе. Гинекологический анамнез пациенток сравниваемых групп характеризовался различными заболеваниями. Пациентки основной группы практически не имели гинекологических заболеваний: миома матки наблюдалась у 1 пациентки (2%), р=0,022, эндометриоз половых органов у 2 (4,1%), р=0,015. Синдром поликистозных яичников (СПКЯ) у женщин основной группы встречалась достоверно чаще, 12 (24,5%) против 4 (7,1%), р-0,007, что закономерно, так как СПКЯ является фактором риска СГЯ. Исходя из частоты встречаемости гинекологических заболеваний у пациенток группы с СГЯ, среди оперативных вмешательств чаще наблюдались манипуляции на яичниках. Кистэктомия,

резекция яичников встречалась у 12 пациенток (24,5%) против 6 (10,7%), р=0,031. Не встречались в анамнезе у женщин с СГЯ миомэктомия, овариоэктомия (р<0,05), реже наблюдался спаечный процесс органов малого таза, 14- (28,6%) против 28 (50%), р=0,013. Однако с одинаковой частотой у женщин обеих групп выполнялись операции по поводу восстановления проходимости маточных труб (р=0,083).

Из представленных данных видно, что обследуемые группы женщин по возрастной характеристике, соматическому статусу, акушерской и гинекологической патологии были сопоставимы.

Выявлены различия между группами по генезу бесплодия. Для пациенток основной группы характерно бесплодие эндокринного генеза, (32,7% (п=16) против 10,7% (п=6), р=0,03), обусловленное, как правило, СПКЯ (27,8% (п=10) против 9,1%, (п=3), р=0,021). В контрольной группе преобладает бесплодие трубно-перитонеального генеза (75% (п=42) против 45% (п=29), р=0,043).

Мы акцентировали своё внимание на наличие СГЯ у женщин, планирующих программу ЭКО, при прошлых попытках, рассматривая СГЯ в анамнезе как один из факторов риска его развития. Однако данные анамнеза также не были решающими в правиле прогноза СГЯ. В основной группе СГЯ в анамнезе наблюдался у четьфёх (8,2%) пациенток, в контрольной - у двух - (3,6%), р=0,158.

Согласно федеральным клиническим рекомендациям, уровень АМГ выше 3,6 нг/мл является маркером избыточного ответа на КОС и, следовательно, развития СГЯ. Несмотря на высокий уровень доказательности (1а), в ходе данной научной работы, мы не получили статистически значимых различий в значениях АМГ между группами. Так, среднее значение АМГ в основной группе составило 1,716±0,63 нг/мл, в контрольной - 1,178±0,25 нг/мл.

Учитывая, что большая часть женщин исследуемых групп, выполняла программу ЭКО в отделение вспомогательных репродуктивных технологий ФГБУ «НИИ ОММ», у нас была возможность проанализировать протоколы программ ЭКО, дозы и препараты гонадотропинов, применяемых для контролируемой овариальной суперстимуляции (КОС). Чёткой взаимосвязи

между применяемым протоколом КОС и развитием СГЯ, мы не получили. СГЯ разной степени тяжести с одинаковой частотой развивался при назначении длинного, короткого («flash-up»), с применением антагониста гонадотропин-рилизинг гормона (АнтГнРг) и/или клостилбегита протоколов .стимуляции. Интересно, что наибольшее количество случаев СГЯ (27 (55,1%) наблюдалось при использовании протоколов с АнтГнРг. Это может объясняться выбором данного протокола ЭКО у пациенток высокого риска по развитию СГЯ.

Считается, что пусковым моментом развития СГЯ является введение овуляторной дозы хорионического гонадотропина человека (ХГЧ), то время как назначение агониста гонадотропин-рилизинг гормона (АгГнРг) вместо препаратов ХГЧ в качестве триггера овуляции в программах ЭКО полностью препятствует развитию данного осложнения. АгГнРг преимущественно назначался женщинам основной группы, 8 (16,3%) против 2 (3,6%) контрольной, р=0,013. Однако нами было описано восемь случаев развития СГЯ средней степени тяжести, причем один из них, поздний СГЯ, потребовал длительной инфузионной терапии и абдоминального парацентеза.

Проанализировано среднее количество фолликулов и яйцеклеток, полученных во время трансвагинальной пункции яичников, в обеих группах. В группе женщин, у которых развился СГЯ, среднее количество фолликулов составило 17,878±1,55, яйцеклеток - 13,857±0,98, в контрольной группе -фолликулов 11,304±0,90, яйцеклеток - 8,250±0,66.

Влияние генотипов на риск развития СГЯ оценивалось по общей и по доминантной модели наследования (наличие хотя бы одного вариантного аллеля по сравнению с нормальной гомозиготой). Для анализа особенностей генома у пациенток исследуемых групп была использована мультипликативная модель анализа частоты встречаемости генетических различий (сравнение частот аллелей). В результате анализа распределения частот аллелей по полиморфным маркерам генов AGT 704, AGT 521, AGTR1 1166, AGTR2 1675, CYP11B2 344, NOS3 786, NOS3 894 значимых различий между группами не получено. Распределение частот аллелей по полиморфным маркерам генов AGT 704, AGT

521, AGTR1 1166, AGTR2 1675, CYP11B2 344 в исследуемых группах соответствовало закону Харди - Вайнберга. При построении общей модели распределения частот генотипов по исследуемым полиморфным маркерам генов РААС значимых различий мы не выявили. Распределение частот генотипов по полиморфным маркерам генов AGT 704, AGT 521, AGTR1 1166, AGTR2 1675, CYP11В2 344 в исследуемых группах соответствовало закону Харди - Вайнберга.

Мы проанализировали частоту встречаемости различных вариантов генотипов оксида азота в группе пациентов с СГЯ и контрольной группе. Статистически значимых различий не выявлено. При использовании мультипликативной модели анализа частоты встречаемости аллелей гена оксида азота в исследуемых группах статистически значимых различий не получено. Таким образом, генетическая предрасположенность к роли оксида азота в

патогенезе СГЯ, не подтвердилась.

Сравнительный анализ распределения частот отдельных аллелей и генотипов исследуемых полиморфных маркеров генов, ответственных за регуляцию компонентов РААС и метаболизма оксида азота, не показал статистически значимых различий между группой женщин с СГЯ и группой контроля.

Учитывая различия в патогенезе спонтанного и ятрогенного СГЯ мы предположили, что в генезе ранней и поздней формы СГЯ могут играть роль разные полиморфные варианты изучаемых генов.

Для подтверждения или опровержения данной гипотезы мы разделили основную группу на две подгруппы: 1а подгруппа - пациентки с ранней формой СГЯ (17 пациенток); 16 подгруппа - пациентки с поздним СГЯ (32 пациентки), и провели сравнительный анализ частоты встречаемости аллелей и генотипов по полиморфным маркерам исследуемых генов в подгруппах пациенток с ранней и

поздней формами СГЯ.

При выполнении статистического анализа особенностей генома у пациенток с ранним и поздним СГЯ были выявлены достоверные отличия в частоте встречаемости гетерозиготного генотипа -344СТ гена CYP 11В2 у женщин с

поздней формой СГЯ по сравнению с женщинами с ранним началом этой патологии (Х2 = 6,7, р=0,035, СЖ 3,06, 95% С1 1,28-7,28), рис. 1.

Учитывая, что тяжёлые формы СГЯ представляют угрозу для жизни пациентки, с практической точки зрения, интересен риск возникновения данного осложнения у пациенток программ ВРТ, Поэтому основная группа женщин с СГЯ нами была разделена также на две подгруппы: 2а - пациентки со средней степенью СГЯ (38), 26 - с тяжёлым СГЯ (11).

Ассоциация генотипов гена СУР11В2 со сроком развития СГЯ

Рисунок 1. Распределение генотипов гена СУР11В2 у женщин основной группы в зависимости от срока развития синдрома гиперстимуляции яичников.

В ходе математического анализа внутри группы пациентов с СГЯ (среди пациентов с тяжёлой и средней степенью) была выявлена протективная роль аллеля 1675 А гена АСТИ2 (рецептора 2-го типа к ангиотензину И) в отношении тяжёлой формы СГЯ (у2 = 4,19, р=0,04, (Ж 2,79, 95% С1 1,03-7,56), рис.2 и 3. Носительство вариантного аллеля в гетеро - или гомозиготном состоянии уменьшает риск развития тяжёлой формы СГЯ практически в два раза.

Установленные нами особенности генетического статуса пациенток с СГЯ должны были иметь и соответствующие фенотипические проявления. Для характеристики функционального состояния РААС нам представлялось целесообразно определять активность ренина плазмы крови, содержание ангиотензина II и концентрацию альдостерона в плазме крови.

Ассоциация генотипов гена А6Т1?2 со степенью тяжести СГЯ

! Средняя степень СГЯ

Ш Тяжёлая степень : СГЯ

Частоты аллелей (п)

Автнг 1675 ее АСТИг 1675 СА АСТО21675М

Рисунок 2. Распространенность генотипов гена АОТК2 у пациенток со средней и тяжелой степенью синдрома гиперстимуляции яичников.

Ассоциация аллелей гена АСТ(*2 со степенью тяжести СГЯ

70 60 50

Частоты аллелей 40 (п) 30

20 10

0

АСТК2 1675 в А6ТГ!2 1675 А

□ Средняя степень СГЯ: В СГЯ тяжёлой стени

Рисунок 3. Распределение аллелей гена АСГГК2 среди пациентов со средней и тяжёлой степенью СГЯ.

В проведенном нами исследовании не установлено статистически значимых различий в содержании ренина и альдостерона у пациенток исследуемых групп. Тем не менее, обнаружено достоверное повышение уровня ангиотензина П у пациенток с СГЯ по сравнению с контрольной группой. Среднее значение ангиотензина П в группе женщин с СГЯ составило 152,342±45,62 пг/мл, в группе контроля -

63,104±17,25 (р=0,029). При изучении корреляций установлена сильная корреляционная зависимость между уровнем ангиотензина II и наличием СГЯ (-0,81).

Интересно было оценить уровни ангиотензина II и альдостерона у пациенток с разными формами СГЯ. Выявлено достоверное повышение содержания ангиотензина II (155,56 пг/мл) и альдостерона (703,17 пг/мл) у пациенток с поздними формами СГЯ по сравнению с ранним началом данного синдрома (р<0,05). В то же время изучение корреляций показало сильную корреляционную зависимость между уровнем альдостерона и ранним проявлением СГЯ (0,73).

Зная, что наличие Т- аллеля в промоторной области гена альдостеронсинтетазы сопровождается повышением базальной продукции альдостерона, целесообразным представлялось провести корреляционный анализ между уровнем альдостерона и наличием генотипа СУР11В2: -344СТ, являющегося маркером поздней формы СГЯ. При изучении корреляции выявлена невысокая положительная корреляционная зависимость между уровнем альдостерона и наличием гетерозиготного генотипа гена апьдостеронсинтазы (0,53).

В результате полученных в ходе исследования данных методом дискриминантного анализа выведено правило прогнозирования СГЯ у пациенток программ ЭКО и ПЭ на основании анамнестических данных и результатов молекулярно-генетического и иммунологического исследований.

В результате статистической обработки 98 признаков, оцениваемых нами, при помощи метода дискриминантного анализа были определены наиболее информативные показатели, прогнозирующие риск развития СГЯ в программах ЭКО.

На первом этапе выполняют сбор анамнестических данных (генез бесплодия, предшествующие беременности). Следующим этапом проводят молекулярно-генетическое тестирование пациентки для определения генотипов СУР11В2: -344СТ гена альдостеронсинтазы и АОГ: 521СС гена ангиотензиногена, определяют содержание уровня тромбоцитов, ангиотензина II у пациенток во время стимуляции суперовуляции и, учитывая количество ооцитов,

полученных во время трансвагинальной пункции, вычисляют прогностический индекс ПИ по формуле:

ПИ=0,78 - 0,33*Х1 - 0, 39хХ2-0,021хХЗ + 0,31*Х4хХ5+0,19хХ6 + 0,04^X7 Где:

XI- количество ооцитов, полученных во время трансвагинальной пункции; Х2- маточная беременность в анамнезе: наличие маточной беременности в анамнезе принимают за 1, отсутствие-принимают за 0; ХЗ- уровень ангиотензина II (нг/мл);

Х4- эндокринный генез бесплодия: наличие эндокринного генеза в анамнезе

принимают за 1, отсутствие - принимают за 0;

Х5- наличие генотипа -344СТ гена СУР11В2 принимают за 1, другие генотипы по данному полиморфизму принимают за 0;

Х6- наличие генотипа 521ТТ гена АСТ у пациентки принимают за 1, другие генотипы по данному полиморфизму принимают за 0;

Х7 - количество тромбоцитов, определяемое на пятый - восьмой день

стимуляции суперовуляции;

получив значение ПИ более 5 прогнозируют низкий риск развития синдрома гиперстимуляции яичников в программе экстракорпорального оплодотворения, при значении ПИ менее - 5,0 судят о высоком риске развития синдрома гиперстимуляции яичников, если же значение ПИ от 5 до - 5, то прогноз в данном

случае неопределенный.

Чувствительность решающего правила 66,17%. Специфичность 77,89%.

Эффективность 71,15%.

Высокий риск развития СГЯ в программе ЭКО.

Пациентки, страдающие первичным бесплодием эндокринной этиологии, наряду со стандартными обследованиями согласно приказу МЗ РФ № 107«0 порядке использования ВРТ, противопоказаниях и ограничению к их применению» от 30.08.2012, проходят медико-генетическое тестирование генов ренин-ангиотензин-апьдостероновой системы. В случае носительства гетерозиготного генотипа гена

альдостеронсинтазы (344 СУР11В2 СТ), данная категория пациенток имеет высокий риск развитая СГЯ и нуждается в применении ранних методов профилактики СГЯ. Именно: использования протокола стимуляции с антагонистами гонадотропин-рилизинг гормонов, подбора оптимальной стартовой дозы гонадотропинов (до 150200 МЕ/л), замены триггера овуляции на апзнист гонадотропин-рилизинг гормона При получении более 13 яйцеклеток во время трансвагинальной пункции яичников, рекомендуется: отмена переноса эмбрионов в стимулированном цикле, криоконсервация бластоцист с последующим переносом спустя 1-3 месяца. Такой подход к ведению пациентов с высоким риском СГЯ, позволяет достичь наибольшей безопасности и кумулятивной эффективности одной попытки ЭКО.

Риск развития СГЯ неопределенный.

В случае выявления гаплотипа 344 СУР11В2 СТ и 1675 АСТ1*2 А- в ходе молекулярно-генетического тестирования генов РААС, риск развития СГЯ оценивается как средний. В таких ситуациях протокол КОС выбирается исходя из гинекологического, соматического анамнеза, данных об овариального резерве и УЗИ органов малого таза. Если во время транвасвагинальной пункции фолликулов получено не более 15 ооцитов, то дальнейшая тактика определяется индивидуально. При появлении признаков раннего СГЯ - перенос эмбрионов в данном цикле отменяется, выполняется криоконсервация эмбрионов хорошего качества Пациентки, имеющие удовлетворительное состояние после пункции фолликулов, нуждаются в инструментальном и лабораторном мониторинге после переноса эмбрионов для своевременного выявления осложнений программы ЭКО.

Низкий риск развития СГЯ.

При выявлении аллеля А гена рецептора второго типа к ангиотензину II в ходе молекулярно-генетического исследования и наличия маточной беременности в анамнезе, риск развития СГЯ оценивается как низкий- Возможен любой протокол КОС, в том числе использование и высоких доз гонадотропинов. При получении менее восьми яйцеклеток, выполняется перенос эмбрионов в стимулированном цикле ЭКО (рис.4).

Пациентки, планирующие программу ЭКО, обследованные в соответствии с приказом МЗ № 107 «О порядке использования ВРТ, противопоказаниях и ограничению к их применению» от 30.08.2012 г.

Молекулярно-генегическое исследование полиморфизмов генов, регулирующих сосудистые реакции (генов альдосгсронсинтазы, 344 CYP11В2СТ, ангиотензикогена, 521AGT, рецепторов второго типа к ангиотензину II. 1675 AGTR2)_

Носители генотипа 344 CYP11B2CT

1 Г

• Женщины, страдающие первичным бесплодием эндокринного генеза

• Более 13 яйцеклеток, полученных во время ТПВ фолликулов

Протокол стимуляции суперовуляции с АнтГнРг

«мягкие» схемы КОС (стартовая доза препаратов гонадотропинов не более 150-200 МЕ/л)

Замена триггера овуляции

Отмена ПЭ в стимулированном цикле с криоконсервацией эмбрионов хорошего качества

344 CYP11В2 CT и/или 1675 AGTR2 А-

Наличие аллеля А геаа 1675 AGTR2

• Женщины с бесплодием любой этиологии

• Не более 15 оощггов, полученных во время ТВП фолликулов

• Женщины с бесплодием разного генеза

• Наличие маточной беременности в анамнезе

• Не более 8 яйцеклеток, полученных во время ТВП фолликулов

Выбор протокола КОС в зависимости от соматического и ахушгрско-гинекологического анамнеза, овариалыгого резерва и данных гинекологического УЗИ пациентки с использованием средних и высоких доз гонадотропинов

Есть риск развития СГЯ

Рисунок 4. Алгоритм прогнозирования синдрома гиперстимуляции яичников в программах экстракорпорального оплодотворения.

ВЫВОДЫ

1. Первичное бесплодие эндокринного генеза, наличие синдрома поликистозных яичников в сочетании с получением во время трансвагинальной пункции яичников более 13 яйцеклеток ассоциируется с риском развития синдрома гиперстимуляции яичников во время проведения программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов.

2. Наличие гетерозиготного генотипа -344СТ гена альдостеронсинтазы (СУР 11В2) ассоциируется с поздней формой синдрома гиперстимуляции яичников.

3. Носительство вариантного аллеля 1675 А гена АСга2 (рецептора 2-го типа к ангиотензину П) в гетеро - или гомозиготном состоянии уменьшает риск развития тяжёлой формы синдрома гиперстимуляции яичников практически в два раза.

4. Обнаружено достоверное повышение уровня ангиотензина П у пациенток с синдромом гиперстимуляции яичников по сравнению с контрольной группой (р=0,029).

5. Оригинальный способ прогнозирования позволяет формировать группы риска по развитию синдрома гиперстимуляции яичников, что даёт возможность своевременно предпринять меры ранней профилактики синдрома гиперстимуляции яичников тяжёлой степени тяжести.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Пациенткам высокого риска по развитию синдрома гиперстимуляции яичников, планирующим программу экстракорпорального оплодотворения, целесообразно проводить молекулярно-генетическое исследование генов, регулирующих сосудистые реакции, в плане возможного определения риска развития синдрома гиперстимуляции яичников.

2. С целью выбора протокола стимуляции суперовуляции в программе экстракорпорального оплодотворения для достижения наибольшей эффективности и безопасности программы в плане развития тяжёлой степени синдрома гиперстимуляции яичников, рекомендуется использовать предложенный алгоритм, основанный на решающем правиле прогноза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Чермянинова О.В. Изолированный гидроторакс как единственное проявление синдрома гиперстимуляции яичников (описание клинических случаев)//Материалы XXII международной конференции Российской Ассоциации Репродукции Человека. - Геленджик, 2012. - С. 92-93.

2. Чермянинова О.В. Современные представления о патогенезе синдрома гиперстимуляции яичников (обзор литературы)/ О.В. Чермянинова, В.В. Ковалёв // Уральский медицинский журнал.-2012.- № 11.-С.21-25.

3. Чермянинова О.В. Оценка роли полиморфизмов генов ренин-ангиотензин-альдостероновой системы и оксида азота среди факторов риска синдрома гиперстимуляции яичников//Материалы IV-ой ежегодной научной конференции молодых учёных и специалистов «Репродуктивная медицина: взгляд молодых». - Санкт-Петербург, 2013. - С. 101-105.

4. Чермянинова О.В. Значение генетических полимофизмов в развитии синдрома гиперстимуляции яичников//Материалы ХХП1 международной конференции Российской Ассоциации Репродукции Человека. - Волгоград, 2013. -С. 34-35.

5. Чермянинова О.В. Влияние генетических полиморфизмов на риск развития синдрома гиперстнмуляцнн яичников/ О.В. Чермянинова, В.В. Ковалёв, Н.В. Башмакова, Т.Б. Третьякова //Вестник уральской медицинской академической науки. - 2014. - №1 (47). - С.64-67;

6. Чермянинова О.В. Оценка роли полиморфизмов генов ренин-ангиотензин-альдостероновой системы и метаболизма оксида азота в развитии синдрома гиперстимуляцни яичников/ О.В. Чермянинова, В.В. Ковалев, Т.Б. Третьякова //Российский вестник акушера-гинеколога. - 2014. - №2. - С. 19-22.

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ

АгГнРг - агонист гонадотропин - рилизинг гормона

АМГ - антимюллеровый гормон

АнтГнРг - антагонист гонадотропин - рилизинг гормона

ВАК - Высшая аттестационная комиссия

ВОЗ - Всемирная Организация Здравоохранения

ВРТ - вспомогательные репродуктивные технологии

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИКСИ - интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида

ИФА - иммуноферментный анализ

КОС - контролируемая овариальная суперстимуляция

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЭ -перенос эмбрионов

РААС - ренин - ангиотензин - альдостероновая система

РАРЧ - Российская Ассоциация Репродукции Человека

РФ - Российская Федерация

СПКЯ - синдром поликистозных яичников

СЭФР - сосудисто-эндотелиальный фактор роста

УЗИ - ультразвуковое исследование

ФСГ - фолликулостимулирующий гормон

ХГЧ - хорионический гонадотропин человека

ЭКО - экстракорпоральное оплодотворение

АОТ - ген ангиотензиногена

АСТШ - ген рецептора 1 -го типа к ангиотензинуН

АСТЫ2 - ген рецептора 2-го типа к ангиотензинуН

СУР 11В2 - ген альдостеронсинтазы

N083 - ген эндотелиальной синтазы окиси азота

ПодпйганоТпёчать 03.04.2015 г. Ф^бО^^Усл. печ л 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 171. Отпечатано в типографии ГБОУ ВПО УГМУ Минздрава России, г. Екатеринбург, ул. Репина, 3.