Автореферат и диссертация по медицине (14.00.05) на тему:Оценка гормоночувствительности у больных гломерулонефритом

На правах рукописи

РГБ ОД 1 5 ДЕК 1995

ЕРОФЕЕВА Жаннета Александровна

ОЦЕНКА ГОРМОНОЧУВСТВНТЕЛЫГОСТИ У БОЛЬНЫХ IЛОМЕРУЛОНЕФРИТОМ

14.00.05- внутренние болезни

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1996

Работа выполнена на кафедре внутренних болезней № 3 II лечебного факультета Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова, в лаборатории регуляторов обмена веществ MHI1K "Биошки", в лаборатории иммуногенетики мелико-генечического научного центра РАМН.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТ'ЕЛЬ:

доктор медицинских наук, профессор Михайлов A.A.

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ:

доктор медицинских наук Комиссарова H.A.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Мухин H.A.

доктор медицинских наук, профессор Бршховецкий А.Г. ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Российская медицинская академия последипломного образования

Защита состоится "__"_________1996 г. в _ ч. на заседании

диссертационного совета (Д 106. Об. 01) в Военно-медицинском факультете при Российской медицинской академии последипломного образования по адресу: г.Москва, ул. Малая Черкизовская, д. 7

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Военно - медицинского факультета при РМАПО.

Автореферат разослан "_"___ 1996 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Белков С.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

Лечение гломерулонефрита - сложная и не решенная до настоящего времени проблема. Одно из центральных мест в лечении гломерулонефрита занимают кортикостероиды, оказывающие иммунодепрессивное и противовоспалительное действие. Их эффективность неодинакова и непостоянна у больных с одним и тем же вариантом гломерулонефрита. Прогнозирование результатов лечения в этой связи представляет большие трудности.

Необходимость изучения новых подходов к диагностике и лечению гломерулонефрита диктуется тяжестью болезни, особенно с непрерывным рецидивированием, инвалидизацией работоспособного населения и часто быстрым исходом в терминальную почечную недостаточность. Кроме того, применяемая цитостатическая и гормональная терапия не всегда эффективна и сопровождается частыми осложнениями.

Важным представляется вопрос об индивидуальной чувствительности больных к терапии глюкокортикоидными гормонами. Изучение механизмов индивидуальных различий чувствительности лейкоцитов периферической крови к действию глюкокортикоидов будет способствовать расширению наших представлений о теоретическом обосновании лечения гломерулонефрита и причинах неодинаковой эффективности стероидной терапии у отдельных больных.

Механизм формирования гормональной чувствительности клеток -важный вопрос, на который пытаются ответить многие исследователи. Проанализировав накопленный научный материал по данному вопросу в литературе, можно сделать следующие важные выводы:

1) Установлены основные этапы действия гормона в клетках: образование комплекса гормона со специфическим внутриклеточным рецептором, активация и транслокация образовавшегося гормон-рецепторного комплекса в ядро, связывание комплекса со специфическими последовательностями ДНК и индукция синтеза специфических м-РНК.

Если исходить из традиционной рецепторной модели действия стероидных гормонов, то снижение чувствительности клеток-мишеней к гормонам должно быть связано с нарушением одного из установленных звеньев на пути передачи гормонального сигнала (Govindan M.U., Spiess Е., Majors J., 1982; Anderson J.I., 1984, Miksicek R.et al., 1986).

2) Наиболее уязвимым участком в формировании гормоночувстви-тельности являются цитоплазматические рецепторы. Но и при сохранении рецепторного аппарата возможна потеря чувствительности клеток к КС.

Целый ряд экспериментальных фактов свидетельствует о том, что может происходить изменение чувствительности к гормонам отдельных ферментов. Вероятно, в этих случаях на первый план выходит регуляция гормональной чувствительности, основанная на перестройке внутриклеточных метаболических циклов, протекающих с участием гормонзависимых ферментов, сохраняющаяся определенное время после прекращения действия гормона и приводящая в итоге к изменению гормональной чувствительности клеток ( Красильников М.А. и соавт., 1987).

3) Гормоночувствительность регулируема. Возможен переход из резистентного состояния в чувствительное.

4) Наблюдения показали, что ответ на стероидную терапию имеет более важное практическое значение, чем гистологические изменения в биоп-тате. Поэтому в зависимости от ответа на КС могут быть описаны два типа нефритов: стероидчувствителышй нефрит, при котором протеинурия быстро исчезает, и стероидрезистеитный нефрит, при котором нефротический синдром (НС) персистирует, несмотря на лечение ( Niaudet Р., 1995).

Все выше изложенное определило цели и задачи нашего исследования.

Цель работы.

Изучение цитохимических показателей лейкоцитов крови как критериев оценки гормоночувствительности и антипролиферативного действия глюкокортикоидов на лимфоциты периферической крови больных гломеруло-нефритом.

Задачи исследования.

1. Установить особенности изменения активности альфа-ГФДГ, СДГ в лимфоцитах, ЩФ, МП в нейтрофилах периферической крови у больных гломерулонефритом под действием кортикостероидов in vitro.

2. Разработать цитохимические критерии определения степени чувствительности к кортикостероидам при гломерулонефрите.

3. Определить чувствительность лимфоцитов периферической крови к антипролиферативному действию кортикостероидов, алкилирующих препаратов.

4. Выявить характер клинико-лабораторных связей у больных гломе-рулонефритом чувствительных и устойчивых к гормонам.

Научная новизна и практическая значимость.

Впервые установлены изменения активности окислительно-восстановительных ферментов лимфоцитов периферической крови больных острым и хроническим гломерулонефритом под действием кортикостероидов in vitro в процессе лечения с учетом клинических форм, тяжести течения и прогноза. Повышение ферментативной активности расценивалось как гормоночувствительность, снижение активности - как гормонорезистентность. Показана тесная корреляция между клинико-лабораторными показателями активности гломерулонефрита и цитохимическими показателями ферментативной активности лимфоцитов и нейтрофилов. Определена чувствительность лимфоцитов периферической крови к антипролиферативному действию кортикостероидов, алкилирукчцих препаратов. Динамические изменения цитохимических показателей активности дегидрогеназ лимфоцитов у больных гломерулонефритом под влиянием глюкокортикоидов in vitro могут служить одним из критериев ориентировочной оценки гормоночувствительности и прогноза эффективности терапии.

В работе даны рекомендации для практического применения в клинике методики определения ферментативной активности лимфоцитов под действием преднизолона in vitro у больных гломерулонефритом с целью подбора терапии. Для правильной оценки цитохимических показателей исходных значений ферментативной активности при динамическом наблюдении больных следует учесть сезонные колебания активности альфа-ГФДГ, СДГ.

Публикация материалов и апробация работы.

Апробация работы состоялась на совместной клинической конференции кафедры внутренний болезней № 3 И-го лечебного факультета ММА им. И.М.Сеченова, кафедры клинической гематологии и интенсивной терапии ФППО ММА им.И.М.Сеченова и лаборатории регуляторов обмена веществ МНПК "Биотики" 28 сентября 1995 года; на межкафедральном заседании кафедры терапии, кафедры военно-полевой (военно-морской) терапии Военно-медицинского факультета при РМАПО, кафедры внутренних болезней № 3 П-го лечебного факультета ММА им. И.М.Сеченова 20 сентября 1996 года.

По теме диссертации опубликовано две печатные работы (список

прилагается).

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя, который содержит 62 отечественных и 94 иностранных источников. Работа изложена в одном томе, на 127 страницах машинописи, включая 45 таблиц и 26 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В нашей работе предполагалось, что кортикостероиды воздействуют на самые разные ферменты, участвующие в обмене веществ и энергии в клетке, и что гормоночувствительность можно объяснить метаболическим состоянием клетки. Для этого изучали активность альфа-ГФДГ, СДГ лимфоцитов, МП и ЩФ нейтрофилов под действием преднизолона (ПЗ) in vitro. Выбор этих ферментов определялся тем, что эти ферменты, находясь в разных клеточных органеллах и участвуя в различных обменных процессах, достаточно разносторонне характеризуют функциональное состояние клеток крови, и возможностью практического выявления с помощью цитохимических методов.

Глюкокортикостеровды можно считать веществами "тропными" к лизосомам, так как они изменяют стабильность лизосомальных мембран, а также локализацию и активность ферментов данных органелл (Сергеев П.В, 1993). Этим обосновано цитохимическое определение маркеров первичных и вторичных гранул нейтрофилов - МП и ЩФ. Кроме того, лимфоциты являются клетками - мишенями, на которые, главным образом, воздействуют стероиды, а глюкокортикоиды взаимодействуют с митохондриями клеток, ответственными за их энергообеспечение, следовательно, возможно исследование митохондриальных ферментов (Сергеев П.В., 1993). Доступными для определения являются альфа-ГФДГ, СДГ. Изучение ферментативной активности проводилось у 44 больных гломерулонефритом (см. Табл. 1).

Таблица I. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ БОЛЬНЫХ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ

ВЕДУЩЕГО КЛИНИЧЕСКОГО СИНДРОМА.

> . Ведущий кяишшесйшй синдром- .- Острый кзюмеруйонефркг Хронический = гяедеружадефрнг:; ■

НефрслнчлкиЙ «шдром Без нвфротнчйскйго синдрома Итого... человек 8 человек 24 чеждаекз 1? человек 3 человек 20 человек

Среди пациентов было 24 мужчины и 15 женщин в возрасте от 15 до 60 лет, 3 мужчины и 2 женщины в возрасте от 60 до 76 лет. Больные с НС принимали преднизолон - 40-60 мг в сутки в сочетании с дезагрегантами (трентал или агапурин в дозе 600 мг/сут) и антикоагулянтами ( гепарин по 2,5 тысяч ЕД под кожу живота 4 раза в день), из них трем больным проводилась цитостатическая терапия. Больные без НС получали симтоматическое лечение. У большинства больных имелась артериальная гипертензия , по поводу которой они регулярно принимали гипотензивные препараты.

Исследовались капиллярная и венозная кровь. К венозной крови в in vitro добавлялись малая концентрация (м.к.) преднизолона (ПЗ) - 0,03 мл в 100 мл физиологического раствора и большая концентрация (б.к.) ПЗ - 0,03 в 10 мл физиологического раствора, соответственно рассчитанные на объем крови и вес больного. Контроль включал в себя взаимодействие венозной крови с 0,9 % NaCl. Под действием ПЗ in vitro определялись: активность альфа - ГФДГ и СДГ (подсчет гранул формазана в 50 лимфоцитах по методу Нарциссова Р.П.). Активность миелопероксидазы (МП) определяли с помощью реакции окисления бензи-дина перекисью водорода по методу Graham Knoll (Лилли Р., 1969); при изучении активности ЩФ в клетках крови мы применяли метод азосочетания с нафтол-AS-Мх-фосфатом в качестве субстрата и диазотированным парарозанилином (Goldberg A., Barka Т., 1962). Для количественного выражения активности МП и ЩФ использовался метод Kaplow L., 1955.

Всего проведено 1428 исследований у 44 больных и 270 исследований у 18 здоровых лиц.

Для исключения влияния 0,9% NaCl на ферментативную активность определялся коэффициент отношения альфа-ГФДГ к СДГ, который вычислялся отношением: в числителе - разница между активностью альфа-ГФДГ в опытах с м.к. или б.к. ПЗ in vitro через 5 или 20 минут и активностью названного фермента в контрольных опытах с 0,9% NaCl через 5 или 20 минут, в знаменателе - разница между активностью СДГ в опытах с м.к. или б.к. ПЗ in vitro через 5 или 20 минут взаимодействия и активностью этого фермента в контрольных опытах с

0,9% NaCl через 5 или 20 минут.

Чувствительность лимфоцитов к антипролиферативному действию дек-саметазона ( 21 исследование ), хлорбутина и мафосфамида-метаболита цикло-фосфана (20 исследований) изучалась у 8 человек из 44. Отмытые клетки ресус-пендировали в среде RPMI=1640 с добавками, содержащей 10% инактивирован-ной лошадиной сыворотки одного пула, 2,ÎSxlO-6 M 2-меркаптоэтанола и 20 мкг/мл гентамицина. Культивирование осуществляли в плоскодонных 96-лупочных планшетах. В каждой лунке содержалось 200 мкл культуральной среды и 5х104 клеток. Мононуклеары периферической крови (МПК) стимулировали добавлением фитогемагглютинина (ФГА) в концентрации 5 мкг /мл. Для торможения пролиферативного ответа использовали дексамстазон (ДМ) в 6 различных концентрациях в диапазоне доз от 10-'° M до 106 М, по 100 мкл раствора хлорбутина (ХБ), мафосфамида (МФ) в следующих концентрациях: 0,1; 0,3; !; 3; 10 и 30 мкг /мл. В контрольные лунки дексаметазон, алкилирующие агенты не добавляли (они содержали культуральную среду с ФГА или без него). Клетки инкубировали в течение 72 ч при 37"С во влажной атмосфере, содержащей 5% СОг. За 4 ч до окончания культивирования вносили 3Н-тимидин в дозе 40 кБк на лунку. После остановки культивирования клетки переносили на фильтры с помощью автоматического сборщика клеток ("Flow labs", Великобритания). Радиоактивность фильтров оценивали в жидкостном сцинтилляционном счетчике "Mark III" ("Trakor Analitic", США). Интенсивность пролиферации выражали в импульсах в 1 мин. (за вычетом фона), а величину антипролиферативного ответа - в виде срединной активной дозы (ЕДзо).

При определении чувствительности мононуклеаров периферической крови к ДМ больных гломерулонефритом использовали линию регрессии, рассчитанную и проведенную для определения чувствительности мононуклеаров периферической крови 41 здорового донора (Калашникова Е.А., 1992). Уровень подавления пролиферации лимфоцитов ДМ существенно зависит от уровня самой пролиферации, что описывается уравнением линейной регрессии: Y'=0,447X - 4,399 (где X - десятичный логарифм высоты пролиферативного ответа, a Y'-десятичный логарифм ЕДзо, ожидаемый теоретически при данной высоте пролиферативного ответа). Отклонение величины ЕД50, полученной экспериментально для каждого больного (Y), от теоретически рассчитанной в сторону большего значения свидетельствует о резистентности мононуклеаров периферической крови больного к ДМ (Y-Y" > 0).

В нашей работе оценивалась ферментативная активность в зависимости от

проводимого лечения. Одним из видов терапии 14 из 44 больных гломерулонеф-ритом являлся плазмаферез (ПФ). Обменный дискретный плазмаферез заключался в последовательном заборе у пациента 300-600 мл крови в контейнер " Гема-кон " и последующего центрифугирования на рефрижераторной центрифуге К-70 при скорости 2000 оборотов в минуту в течение 10 минут. Отделенные от плазмы форменные элементы крови ресуспензировались в физиологическом растворе или растворе реополиглюкина и возвращались в сосудистое русло пациента. Плазмо-возмещение проводилось свежезамороженной плазмой в адекватной эксфузии объеме. За один сеанс удалялось 600-1000 мл плазмы.

Статистический анализ результатов.

Полученные данные обрабатывались методом вариационной статистики с вычислением средней арифметической активности фермента(М), среднего квадратичного отклонения ((7), средней ошибки средней величины (т). Достоверность различий сравниваемых групп определялась по критерию Стыодента (t) (Урбах В.Ю., 1964). Различие считалось достоверным при значении вероятности р < 0,05.

Для выявления взаимосвязи исследуемых цитохимических показателей с другими клинико-лабораторными данными использовался метод корреляционного анализа с вычислением коэффициентов корреляции (г) (Урбах В.Ю., 1964). Числовые значения коэффициента корреляции считались достоверными при значении р<0,05.

Кривые зависимости доза - эффект для антипролиферативного действия дексаметазона анализировали с помощью метода пробитов для вычисления ЕД» (дозы, дающей 50% от максимума уровень проявления эффекта) (Погожев, 1962; Gillis et al., 1978).

Основные результаты исследований.

Результаты проведенных нами исследований позволили установить, что кортикостероиды in vitro существенно изменяют ферментативный профиль лейкоцитов крови. Достоверные различия получены для дегидрогеназ лимфоцитов. Ферментный профиль нейтрофилов характеризовался в среднем умеренно повышенными значениями ЩФ и сниженными показателями МП в капиллярной и венозной крови, под действием ПЗ in vitro достоверных изменений не было получено.

Цитохимические показатели лимфоцитов периферической крови под действием ПЗ in vitro у лип контрольной группы.

В контрольную группу вошли 18 здоровых лиц - 10 женщин и В мужчин, средний возраст которых составил 27,8 лет. Проанализировав ферментативную активность дегидрогеназ у здоровых лиц, замечено, что предни-золон (ПЗ) in vitro по-разному изменяет

| Венозная кровь

NaCI

ПЗ через 5 мин.

(10 человек)

Ср.число гранул в лимфоците!

(5 человек)

-k *

1 1 II

Малая Большая Концсшрация Г13 in vitro

Малая Ьольшая Концентрация ПЗ in vitro

Венозная кровь Ц NaCI

ПЗ через 5 мин.

(10 человек)

(S человек)

УР°" а вень ферментов. У 10 человек под действием ПЗ увеличивается ак- 20 тивность альфа

ГФДГ и СДГ ( рис. 1 а,б ).

У 5-и человек, наоборот, происходит снижение активности названных ферментов с ПЗ in vitro и у 3-х человек этой подгруппы нет определенного ответа ферментативного уровня на кортикостеро-иды.

В ходе контрольных исследований наше внимание привлекло то, что в

определенные месяцы р^ л Активность ферментов лимфоцитов

осенне - весеннего пе- периферической крови под действием ПЗ in vitro у

риода: с 28. 03 по 28. 04 здоровых лиц. а-а-ГФДГ, б-СДГ.

* р < 0,05

и в октябре - отмечается снижение уже исходных показателей активности дегидрогеназ в капиллярной и венозной крови, особенно это относится к альфа -ГФДГ лимфоцитов.. Так, у 6 человек этой группы, уровень альфа -ГФДГ лимфоцитов варьирует от 0,9 до 4,7 среднего числа гранул формазана в лимфоците в капиллярной крови и от 2,2 до 5,4 в венозной крови. Уровень СДГ колеблется в капиллярной крови

Малая Большая Концентрация ИЗ in vitro

Малая Большая Концентрация ПЗ in vitro

от 7,3 до 18,5; в венозной крови - от 5,2 до 16,1. Динамическое наблюдение в другие месяцы показало, что ферментативная активность восстанавливается до нормальных значений ( рис, 2 ), Сезонные

колебания ферментативной Капиллярная Венозная Капиллярная Венозная активности в указанные Рис.2. Активность а - ГФДГ и СДГ месяцы определялись и у лимфоцитов в капиллярной и венозной крови больных гломерулонефри- У здоровых лиц в зависимости от сезона.

том.

Среди больных ГН изменение уровней альфа-ГФДГ и СДГ зависело от давности заболевания, наличия или отсутствия нефротического синдрома, длительности приема кортикостероидов пероралъно, а также от исходных значений этих ферментов в капиллярной и венозной крови.

Цитохимические показатели лимфоцитов периферической крови под действием ПЗ in vitro у больных ОГН В работе изучались цитохимические показатели под действием ПЗ in vitro у больных ОГН. Эта группа представлена 23 больными (средний возраст в группе 40,2 года) с давностью заболевания до 1 года. У 15 больных острый гломеруло-нефрит (ОГН) протекал с нефротическим синдромом (НС), у 8 человек - без НС.

Результаты цитохимических исследований показали, что при ОГН без НС характерны нормальные средние значения дегидрогеназ (сукцината и альфа-глицерофосфата) лимфоцитов, а под действием ПЗ in vitro - их возрастание. Такая же картина наблюдалась и у здоровых.

Особенно существенное влияние на ферментный профиль лимфоцитов оказывал НС, присоединение которого сопровождалось дальнейшим достоверным снижением (по сравнению с ОГН без НС) активности альфа-ГФДГ и менее выраженным снижением СДГ в капиллярной и венозной крови. Степень снижения исходных значений активности дегидрогеназ во многом зависела от степени выраженности НС. У больных с менее выраженным НС, которые лечились симптоматически, активность СДГ в среднем была в пределах нормы, а альфа-ГФДГ до-

а

Ср.число гранул в лимфоците |

Некий исхощмй уровень Нормальный исход ый уровень 25,-,25

20 15 10

51

0

Л

*

*

bchcqil мкПЗ бкГО NjQ кровь in vitro

•к

веноин. мкПЗбкШ №а КРСВЬ in vitro

Ср.число гранул в лимфоците]

Низкий исходный уровень I Ьрмапьиый исходный уровень

стоверно понижена. Под действием ПЗ in vitro активность альфа-ГФДГ росла, а СДГ наоборот снижалась.

У больных с более выраженным НС, как до начала гормонотерапии, так и в процессе лечения КС перорально, отмечалось значительное снижение исходных уровней альфа - ГФДГ и СДГ капиллярной и венозной крови и возрастание этих ферментов под действием ПЗ in vitro вне зависимости от клинической гормоно-чувствительности.

Особого внимания заслуживает тот факт, что исходно низкие значения де-гидрогеназ, вне зависимости от клинической гормоночувствителыюс ти, имели тенденцию к увеличению своих показателей, а исходно нормальные или умеренно повышенные - к неизменности либо снижению под действием ПЗ in vitro (рис.3 а, б). Подобный характер изменений может рассматриваться как признак гормональной регуляции, направленной на восстановление нормальных значений ферментативной активности.

16

12

о

* * *

и

в^д рл^ттт гт пт4т

16

12

«к

г"ч |И 1' I

веназн. мкПЗ бкШ NaCl кровь in vitro

веишн. мкШ бкШ NuCI кровь in vitro

Рис.3. Активность ферментов лимфоцитов

периферической крови у больных ОГН с НС. а - а-ГФДГ, б-СДГ. * р <0,05

Цитохимические показатели лимфоцитов периферической крови под действием ПЗ in vitro у больных ХГН

Цитохимические показатели лимфоцитов периферической крови под действием ПЗ in vitro изучались у 19 больных ХГН, из них у 16 человек наблюдался нефротичсский синдром.

У больных ХГН без нефротического синдрома (3 человека), лечившихся симптоматически, по сравнению с ОГН без НС, определялись повышенные уровни дегидрогеназ лимфоцитов периферической крови. Однако, как и у больных ОГН, альфа - ГФДГ возрастала под действием ПЗ, а СДГ вела себя по-другому, снижая свою ферментативную активность.

Среди 16 больных ХГН с НС, влечение которых входил ПЗ, выделились 2 группы, по -разному реагирующие на гормонотерапию. Уболь-шинства больных клиническое улучшение наступало через 1 месяц лечения кортикостероидами. Персистирование НС расценивалось как резистентность к стероидам. У клинически чувствительных больных ферментативная активность дегидрогеназ увеличивалась при взаимодействии с ПЗ in vitro до начала лечения (табл.2).

Таблица 2

АКТИВНОСТЬ АЛЬФА-ГФДГ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ПЗ IN VITRO У БОЛЬНЫХ ХГН ДО ЛЕЧЕНИЯ Г13.

Х4гт. кровь аеякм. Kf>C№ б.к- S М«Й !ЧаС!5 шш

м .8,59.. 7,51 ■ . V 10,39* 10.66* 9,38*

8,28 8,25 9.37 8,74 8,28

. йШ ■ 211 ■ 210 - 210 210 ... 210 :

* р < 0,05

На фоне гормонотерапии 40-60 мг/сутки активность альфа-ГФДГ в капиллярной и венозной крови увеличивалась и составляла 12,57 и 10,96 среднего числа гранул формазана в лимфоците - соответственно, под действием м.к. ПЗ in vitro отмечалось небольшое снижение активности с 10,96 до 9,41 (t=2,048, р<0,025), с б.к. ПЗ активность достоверно не отличалась (t=0,88, р> 0,05) (табл.3).

Таблица 3.

АКТИВНОСТЬ АЛЬФА-ГФДГ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ПЗ IN VITRO У БОЛЬНЫХ ХГН, ЛЕЧЕННЫХ ПЗ.

задает, кроз*. ; веааз, - креизь м.к. 5 ми» бх 5 мни JSfstCJ 5.ШШ

м s ' ' 12.57 10,96 " 9.41* 11.62 10,31

8,57 '. ..' . 7,95 7,98 •"■• 8,42

31JOI. 235 • ■■ 243 ...... : ' 235. ::.. . 260 ■ 235

* р < 0,05

СДГ также, как и в первом случае, осталась умеренно сниженной в капиллярной крови - 15,03 среднего числа гранул формазана в лимфоците, в венозной -14,13, под действием ПЗ in vitro СДГ достоверно возрастает ПЗ с 14,13 до 16,83 и б.к. с 14,13 до 18,44 (р<0,05) (табл.4).

Таблица 4.

АКТИВНОСТЬ СДГ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ПЗ IN VITRO У БОЛЬНЫХ ХГН, ЛЕЧЕННЫХ ПЗ.

кашд. кречзь вшоз. кровь М.К. $ МЙН - б.к. 5 мин - NaCt 5. '"ми и'

м . ■ 15,03 14,13 . 16,83* .18,44* 13,4

--------а.......... 9,81 9.3 10,1 ...11,76 • 8,25

ПЮ1. ' 222 220 /219 . 220 .. 220 . : :

* р < 0,05

У больных, резистентных к гормонотерапии, наблюдалась обратная реакция - активность ферментов снижалась (рис.4). Перечисленные изменения ферментативной активности сохранялись и в стадии ремиссии. Выявляемое повышение ферментативной активности, вероятно, указывает на увеличение числа ферментных комплексов под влиянием гормонов, что сопоставимо с современными

Ср. число гранул в лимфоците [

30 25 20 15 10 5

Малая Большая

Концентрация ПЗ in vitro

Рис.4. Активность О! - ГФДГ лимфоцитов периферической крови под действием ПЗ in vitro у клинически резистентных больных ГН. * р < 0,05

о

представлениями об усилении синтеза специфических белков при действии стероидов. А у клинически резистентных больных, наоборот, их снижение.

Как правило, до начала лечения, в большинстве случаев активность ферментов возрастала под влиянием ПЗ in vitro у больных ^впервые заболевших и не получавших кортикостероидные или цитостатические препараты. Такие же изменения мы наблюдали у здоровых лиц. По-видимому, возрастание активности де-гидрогеназ под действием ПЗ можно считать нормальной реакцией клеток. В этом случае чаще всего у больных наступает довольно быстрое клиническое улучшение. Поэтому признак роста уровня окислительно-восстановительных ферментов определяет благоприятный прогноз для больных. Неблагоприятному течению заболевания сопутствует снижение ферментативной активности под действием ПЗ in vitro, а также низкие значения дегидрогеназ капиллярной и венозной крови в течение длительного времени (до 5 месяцев).

Чувствительность лимфоцитов больных ГН к антипролиферативному действую глюкокортикоидов, алкипирующих препаратов и цитохимические показатели

лейкоцитов.

Иммунодепрессивное действие глюкокортикоидных гормонов не в последнюю очередь обусловлено их способностью тормозить пролиферацию лим-фоидных клеток человека. Имеются выраженные индивидуальные различия в чувствительности лимфоидных клеток отдельных яиц к антипролиферативному действию глюкокортикоидов, что может быть связано с генетически детерминированной изменчивостью глюкокортикоидной рецепции. Чувствительность лимфоцитов периферической крови к антипролиферативному действию дексаметазона (ДМ) изучалась у 7 больных ГН с нефротическим синдромом (НС) и 1 больного с гипертоническим нефритом в процессе лечения.

При определении чувствительности мононуклеаров периферической крови к ДМ использовали линию регрессии, рассчитанную и проведенную для определения чувствительности мононуклеаров периферической крови 41 здорового донора (Калашникова Е.А., 1992), характеризующую связь между чувствительностью клеток к ДМ и данными о высоте пролиферативного ответа на ФГА.

Все 8 обследованных больных отнесены к резистентной группе ( результаты определенных значений ЕД50 ложатся выше линии регрессии) (рис.5). А ферментативная активность у этих же больных снижалась под действием ПЗ в пробах in vitro. В процессе лечения, в

log (ED50)

2,5

2

1,5

1

0,5 0

-0,5

Больные □ СОУШлДБ

^ О V Еи О м + ш — Регрессия

□

10

11

12

13

1п(имп/мин)

Рис.5. Чувствительность лимфоцитов больных ГН к антипролиферативному действию ДМ.

большинстве случаев, Линия регрессии вычислена для здоровых допоров, лимфоциты всех обследованных лиц оставались резистентными к глюкокортикои-дам, а тенденция уменьшения уровня ферментов также сохранялась. Поэтому можно сделать вывод о сопоставимости указанных процессов. Характер изменений активности альфа-ГФДГ и СДГ в значительной мере позволит быстро, в первые дни поступления больных в клинику, установить наличие гормоночувстви-тельности для правильного выбора лечения, а для более точного подтверждения полученных данных возможно исследование чувствительности лимфоцитов к антипролиферативному действию ДМ.

У 6 из 8 больных был выявлен высокий тип чувствительности лимфоцитов к антипролиферативному действию ХБ (1,17-3,38 срединной активной дозы) и у 4 из 8 больных к МФ (1,71-2,67 срединной активной дозы).

9

Цитохимические показатели лейкоцитов периферической крови под действием предниюлона in vitro у больных леченных плазмаферезом.

В эту группу вошли 14 человек , из них у 13 человек - нефротический синдром (НС), у 1 - гипертонический нефрит. Длительность НС у 6 больных была до 1 года, у 3-х-от 1 года до 2-х лет, у 3-х больных-от 3-х до 4-х лет и у 1 больного-до 8 лет. Из 14 больных этой группы 2 больных отнесены по клинической картине к стероидозависимым (возникновение обострений при снижении доз ПЗ), 4 - резистентны к преднизолонотерапии, 7 больных чувствительны к КС.

В группу клинически чувствительных к ПЗ до лечения ПФ вошли больные не получавшие КС - 5 исследований, принимающие 10-25 мг ПЗ - 1 исследование и 30 - 40 мг ПЗ в течение б дней с момента поступления в стационар - 3.

Под действием ПЗ in vitro у этой группы больных происходит возрастание активности альфа-ГФДГ через 5 и 20 мин. Активность СДГ значительно возрастает под действием малой концентрации ПЗ через 5 и 20 мин, б. к. через 20 мин (р<0,01). Не изменяется уровень СДГ с б.к. ПЗ через 5 мин (t=0,56, р>0,05) ( рис.6 а, б) Сравнительная оценка полученных результатов у больных, леченных преимущественно ПФ с уровнем активности изучаемых ферментов лейкоцитов до лечения показало, что ПФ ведет к снижению активности альфа-ГФДГ (р<0,001) и СДГ (р<(),001) в

капиллярной и венозной крови. А тенденция к повышению уровня аль-фа-ГФДГ и СДГ под действием ПЗ in vitro сохраняется и после проведения от 1 до 6 сеансов плазмафереза и с малой, и с большой концентрациями ПЗ ( р<0,001). Больным этой подгруппы назначался ПЗ в суточной дозе 30-60 мг и одновременно проводился плазмаферез от 2 до 9 сеансов через 2-4 дня.

Анализ цитохимических данных в подгруппе больных, леченных

а

Ср.число гранул в лимфоците

Щ Венозная кровь

ПЗ через 5 мин. ПЗ через 20 мин.

11

A ^vU'i-n / / X В < I

V

Малая

Бо.1Ьшая

б

Концентрация ПЗ in vitro

Ср.число гранул в лимфоците |

Малая Большая

Концентрация ПЗ in vitro

Рис.6. Активность ферментов лимфоцитов периферической крови под действием ПЗ in vitro у клинически чувствительных больных Г Н до лечения ПФ.

а- ос

* р <0,05

ГФДГ, 5 - СДГ.

ПФ и КС, показал, что уровень активности окислительно-восстановительных ферментов лимфоцитов значительно снижается по сравнению с исходными данными с применением только симптоматической терапии в капиллярной и венозной крови и не отличается от уровня активности дегидрогеназ у больных, леченных ПФ.

Активность альфа-ГФДГ с малой концентрацией ПЗ достоверно не различима по сравнению с активностью этого фермента в венозной крови, а с большой концентрацией ПЗ в контроле даже снижается (р<0,001). Уровень СДГ возрастает с малой и большой концентрациями ПЗ , что сопоставимо с исследованиями активности этого фермента до лечения и при проведении ПФ .

У больных, клинически резистентных к преднизолонотерапии активность альфа-ГФДГ в капиллярной и венозной крови довольно низкая. При взаимодействии с ПЗ in vitro отмечается снижение активности указанного фермента с большой концентрацией ПЗ через 5 и через 20 мин, с малой концентрацией через 20 мин. Активность СДГ достоверно снижалась уже через 5 мин взаимодействия с ПЗ.

Ферментный профиль лимфоцитов, чувствительность мононуклеаров периферической крови к антипролиферативному действию ДМ и алкилирующих агентов изменялись в процессе лечения ПФ. У больных достоверно снижались значения альфа-ГФДГ, в меньшей степени - СДГ в капиллярной и венозной крови ( рис. 7 а, б ). Тенденция увеличения уровней альфа-ГФДГ и СДГ у клинически чувствительных больных и снижение названных ферментов у клинически резистентных больных под действием ПЗ in vitro сохранялась вне зависимости от выбранного лечения. Чувствительность лимфоцитов к антипролиферативному действию ДМ, ХБ, МФ, как правило, снижалась в результате проведенных сеансов ПФ.

В результате проведенного ПФ плазма больных ингибирующее действие на нормальные лимфоциты (Vangelista A. et al., 1986). Кроме того, лейкоциты, прошедшие центрифугирование, сохраняют исходно низкую функциональную а ктивность (Воробьев А.И.,1994 г.).

Снижение ферментативной активности дегидрогеназ в капиллярной и венозной крови у больных, леченных ПФ, возможно за счет слабого регенераторного ответа лимфоидных клеток. Так как ПФ проводился при активном течении гломерулонефрита, особенно с НС, а проницаемость клеточных мембран повышена, то имеет место выделение ферментов из клеток, в частности из лимфоцитов, в кровяное русло с возможным последую-

а

щим выделением их с мочой.

Можно предположить, что КС не всегда являются решающими препаратами в лечении гломеру-лонефрита, так как ремиссия достигалась у некоторых больных без использования их, а с помощью симптоматической терапии, либо ПФ. Подход к лечению должен быть индивидуальным и возможен пересмотр терапевтических мероприятий в отношении больных гломеруло-

нефритом, разработка ^^ пф ПфиКС

новых лекарственных р^ ^ Активность ферментов лимфоцитов форм. больных гломерулонефритом в процессе лечения.

Изменения а- а-ГФДГ; б- СДГ

гормональной чувствительности клеток, вызванные самыми различными причинами, могут носить обратимый характер, приводя лишь к временному ослаблению, но не полному прекращению ответа клеток на стероид ( Cook P.W. et al., 1988, Cormier E.M. et al„ 1989, Mari H.S. et al., 1989, Vintermyr O.K. et al., 1989, Schwartz L.H. et al., 1991). Существует регуляция чувствительности к кортикостероидам, зависящая от особенностей взаимодействующих клеток. Нами наблюдались изменения ферментативной активности под действием ПЗ in vitro от снижения к повышению ее, и при этом довольно быстрый выход в стадию ремиссии. Если же происходит обратное изменение активности окислительно-восстановительных ферментов, то возможно персистирование про-

цесса, и необходима коррекция терапии.

Так как нами установлено действие Na на окислительно-

восстановительные ферменты и возможное совместное действие ПЗ с ионами Na на них, необходимо было исключить влияние NaCl. С этой целью нами выведен коэффициент отношения альфа - ГФДГ к СДГ. Мы сравнили коэффициенты альфа - ГФДГ к СДГ у здоровых и больных до лечения и в процессе лечения ПЗ перорально. Выяснилось, что данный коэффициент достоверно выше у здоровых лиц, а у больных коэффициент альфа - ГФДГ / СДГ менялся в процессе лечения (рис.8 ).

Оказалось, что у больных он варьировал от 0 до 0,33 у резистентных и от 0,4 и выше у отвечающих на кортикостероиды. В ряде случаев, по величине коэффициента (сравнение коэффициента по отношению к малой и большой концентрациям in vitro), можно ориентироваться в выборе доз для каждого конкретного случая.

Краткий анализ корреляционных плеяд.

С целью изучения взаимосвязей между отдельными ферментами лимфоцитов и нейтрофилов у больных гломерулонефритом проводился корреляционный анализ. Оказалось, что больные ОГН с НС и без НС отличались по характеру взаимосвязей между ферментами лимфоцитов и нейтрофилов периферической крови. При ОГН без НС между ферментами практически отсутствовали взаимосвязи, а при ОГН с НС до лечения ПЗ - прямая связь между альфа-ГФДГ капиллярной крови со всеми значениями СДГ, между альфа-ГФДГ с б.к. ПЗ in vitro и СДГ с м.к. и обратная связь между СДГ капиллярной крови и МП капиллярной крови; у больных ОГП, леченных ПЗ, все значения альфа-ГФДГ в пробах с ПЗ in vitro тесно коррелировали со всеми значениями СДГ, а связи с МП не отмечалось. У

Рис. 8. Отношение а - ГФДГ / СДГ у здоровых и больных.

больных ХГН в стадии обострения отмечалась высокая интегрированность систем лейкоцитов, что проявлялось появлением взаимосвязи между митохондри-альными ферментами, между СДГ и ЩФ, между альфа-ГФДГ и МП. Мито-хондриальные ферменты - альфа-ГФДГ и СДГ имели тесные корреляционные взаимосвязи с ведущими лабораторными признаками нефротического синдрома: альбумином, альфа-2-глобулином, холестерином, протеинурисй. Характер корреляционных взаимосвязей между самими ферментами, а также между цитохимическими и биохимическими показателями в стадии ремиссии значительно менялся, количество связей становилось гораздо меньше. На основании проведенного анализа можно предполагать, что купирование обострения изменяет ( и фактически нормализует) координацию менаду параметрами, которые в норме и должны обладать высокой степенью независимости (свободы) (Артемьева В.Б., 1989).

Таким образом, представленные результаты дают возможность рассмотреть изменения ферментативной активности лимфоцитов в ответ на гормональный сигнал. Изменение чувствительности гормонов отдельных ферментов может происходить и при сохранении рецепторного аппарата клеток. Вероятно, в этих случаях на первый план выходит регуляция гормональной чувствительности, основанная на перестройке внутриклеточных метаболических циклов, протекающих с участием ферментов.

Определение гормоночувствительности у больных гломерулонефритом на основе динамических изменений ферментативной активности альфа-ГФДГ и СДГ, а также антипролиферативного действия глюкокортикостероидов, имеет важное значение для нефрологии , так как дает возможность выбора адекватной терапии и прогнозирования заболевания.

Поскольку цитохимические исследования не требуют дорогостоящей аппаратуры, дефицитных реактивов и большой затраты времени, то внедрение их в практику любого стационара, в первую очередь, специализированных отделений, позволит своевременно выделить больных с возможной гормонорезистентностью и определить правильную тактику лечения.

выводы

1. Установлены изменения активности окислительно-восстановительных ферментов (альфа-ГФДГ, СДГ) лимфоцитов периферической крови больных гло-мерулонефритом под действием кортикостероидов in vitro:

а) в реакциях in vitro лимфоциты крови реагируют на кортикостероиды повышением либо понижением ферментативной активности;

б) повышение ферментативной активности является адекватной реакцией клеток на воздействие стероидов in vitro и указывает на гормоночувствительность,

в) снижение активности окислительно-восстановительных ферментов определяет возможную гормонорезистентность.

2. Динамические изменения цитохимических показателей активности де-гидрогеназ лимфоцитов у больных гломерулонефритом под влиянием стероидов in vitro могут служить одним из критериев ориентировочной оценки гормоночув-ствительности и прогноза эффективности терапии.

3. Изменения активности миелопероксидазы и щелочной фосфатазы нейтрофилов в пробах с преднизолоном in vitro не отражают гормоночувствительность.

4. Определение чувствительности лимфоцитов периферической крови к аптипролиферативному действию кортикостероидов и исследование активности окислительно-восстановительных ферментов в лимфоцитах под действием гормонов in vitro, и позволяет провести предварительную оценку гормоночувствитель-ности у больных гломерулонефритом.

5. Изменения ферментативной активности лимфоцитов и нейтрофилов коррелируют с основными биохимическими показателями сыворотки крови и мочи, отражающими степень выраженности нефротического синдрома, что подтверждает значение цитохимических тестов для оценки и тяжести почечного процесса.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

Методика определения ферментативной активности лимфоцитов под действием преднизолона in vitro у больных гломерулонефритом может быть рекомендована для практического применения в клинике с целью подбора терапии. При постановке проб in vitro необходимо учесть следующее:

1. Повышение ферментативной активности лимфоцитов периферической крови указывает на адекватную реакцию клеток, нормальную чувствительность к кортикостероидам.

2. Снижение ферментативной активности лимфоцитов периферической крови указывает на нарушение типичной реакции на кортикостероид или на возможную гормонорезистентность.

3. Для правильной оценки цитохимических показателей исходных значений ферментативной активности при динамическом наблюдении больных следует иметь в виду сезонные колебания активности альфа-ГФДГ, СДГ (март-апрель, октябрь), что является вариантом нормы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Изучение гормоночувствительности у больных гломерулонефритом. // Терапевтический архив, 1996, N б , стр.13-16 (Соавт. Кузнецова О.П., Комиссарова H.A., Калашникова Е.А.).

2. Проблема гормоночувствительности у пожилых больных гломерулонефритом. // Клиническая фармакология, 1995, N 4, стр.35 (Соавт. Кузнецова О.П., Комиссарова H.A., Калашникова Е.А.).