Автореферат и диссертация по медицине (14.00.07) на тему:ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИРОДНЫХ АНТИОКСИДАНТОВ В ЭКСПЕРИМЕНТАХ IN VITRO И IN VIVO



На правах рукописи

УДК 613.2:577.15+616-084

Морозов Сергей Викторович

ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИРОДНЫХ АНТИОКСИДАНТОВ В ЭКСПЕРИМЕНТАХ IN VITRO И IN VIVO

14.00.07. - гигиена

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2003

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательский институт питания Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор,

академик РАМН ТУТЕЛЬЯН Виктор Александрович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор,

член-корр. РАМН РАКИТСКИЙ Валерий Николаевич

доктор медицинских наук КОРОЛЕВ Алексей Анатольевич

Ведущая организация:

ГУ Научно-исследовательский институт экологии человека и гигиены окружающей среды им, А.Н.Сьіснна РАМН

Защита состоится «/£_*> 2004 г. в ¡Н ч. на заседании

Диссертационного Совета Д00ї.002.01 в ГУ НИИ питания РАМН по адресу: Москва, Устьинский проезд, д. 2/14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ питания

РАМН.

Автореферат разослан «// » __ _ 200.3 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Г" "г":цоваВ.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Воздействие неблагоприятных физических и химических факторов окружающей среды на организм человека часто сопровождается интенсификацией процессов свободнорадикального окисления и, как следствие, приводит к повреждению белков, липидов, нуклеиновых кислот, других макромолекул и мембранных структур клетки. В защите организма от влияния токсических факторов окружающей среды одно из центральных мест на всех этапах эволюционного развития занимает универсальная антиоксидантная система, существующая во всех типах клеток и представленная ферментативным и неферментативным звеньями. Нарушение работы этой системы сопровождается накоплением экзогенных и эндогенных прооксидантов, что ведет к окислительному повреждению клеточных структур и развитию окислительного стресса (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972; Бурлакова Е.Б., 1997,2002; Юдина Т.В., Ракитский В.Н. и др., 2003; Langseth L., 1995].

На поддержание активности системы антиоксидангной защиты (АОЗ) на адекватном функциональном уровне оказывают влияние различные алиментарные факторы, и если действие таких пищевых анти-оксидантов, как токоферолы, аскорбиновая кислота, p-каротин и селен, изучено достаточно детально, то антиоксидантная эффективность многих других минорных компонентов пищи, к числу которых относят индолы, изотиоцианаты, флавоноиды и каротиноиды, требует специальных исследований [Покровский А.А., 1979; Тутельян В.А., 1996; Да-дали В. А., 2001; Nïjveldt R.J. et al., 2001; Beecher G.R., 2003]. Наибольший интерес в этом плане представляют флавоноиды и каротиноиды. Известно, что эти природные соединения играют определенную роль в системе АОЗ, благодаря способности служить эффективными перехватчиками радикалов. Помимо этого имеются сведения о способности фла-воноидов и каротиноидов оказывать модулирующее действие и на другие звенья этой системы, в частности, индуцировать активность ключевых ферментов АОЗ и проявлять сберегающее действие по отношению к витаминам С и Б. Флавоноиды могут выступать и в качестве хелаторов ионов металлов переменной валентности, что позволяет им ингибиро-вать процессы ПОЛ на разных стадиях [Запрометов М.Н., 1974; Шаб-ров А.В. и др., 2003; Bravo L.. 1998; Harborne J.B., Williams С.А., 2000; Mortensen A. et al, 2001].

Среди загрязнителей окружающей среды, обладающих проокси-дантными свойства"мй7Тотгрокой распространенностью и высокой токсичностью выдел штся п]&Ш>дк£&контамит4анты пищевых продуктов Фо н ДНЙ иге pja т

и кормов — микотоксины, вторичные метаболиты микроскопических (плесневых) грибов [Тутельян В. А., Кравченко Л.В., 1985; Miller J.D., 1995; Conkova Е. et al, 2003]. Результаты многолетних наблюдений свидетельствуют, что в России наиболее часто обнаруживаются микотоксины, продуцируемые грибами рода Fusarium, в том числе трихотеценовые микотоксины и фумонизины [Кравченко Л.В. и др., 1998; Львова Л.С., Седова И.Б., 2003; Tutelyan V.A., 1998], Токсинообразование на различных субстратах в природных условиях — явление малопредсказуемое, и полное предотвращение накопления микотоксинов в пищевых продуктах и поступления в организм человека практически невозможно. В связи с этим важное значение приобретает изыскание путей снижения токсичности поступивших в организм токсинов. Одним из направлений может выступать пища и ее компоненты в качестве регулятора всех звеньев системы АОЗ.

Цель и задачи исследования

Цель работы — оценка эффективности природных антиоксидан-тов в различных системах окисления in vitro и в экспериментах in vivo. Задачи исследования:

— на экспериментальных моделях in vitro исследовать влияние природных антиоксидантов - ликопина, дигидрокверцетина (ДГК), си-лимарина, силибинина и олигомерных проантоцианидинов (ОПЦ) на параметры хемилюминесценцни системы НЬ-ШОг-люминол и резистентность микросом печени к ПОЛ, индуцированному системой НАДФН-Fe2*;

— изучить влияние ликопина, ОПЦ, ДГК и силимарина на антиок-сидантный статус крыс и резистентность микросом к индуцированному ex vivo ПОЛ;

— на моделях алиментарных микотоксикозов (вызванных фумони-зинами и три хоте ценовым микотоксином — Т-2 токсином) изучить влияние ликопина, ОПЦ и ДГК на защитно-адаптационный потенциал крыс.

Научная новизна

Получены новые данные о биохимических механизмах регуляции функциональной активности системы АОЗ природными биологически активными веществами, такими как ликопин и флавоноиды.

Обнаружено выраженное ингибирующее действие ликопина и фла-воноидов как на свободнорадикальное окисление люминола, так и на уровень индуцированного ПОЛ микросом печени in vitro. При этом на модели Hb—HiOi—люминол наиболее выраженная ингибирующая ак-

тивность обнаружена у ОПЦ, и значительно меньшая - у других антн-оксидантов (катехин > ДГК > силимарин ¿ ликопин > силиблнин). В то же время на модели ПОЛ микросом, индуцированного системой НАДФН— FeJ\ ПОЛ ингибировалось в наибольшей степени ликопином, и в меньшей степени флавоноидами (ОПЦ > силимарин > силибинин > ДГК).

Показано, что ликопин in vivo оказывает выраженное активирующее действие на систему АОЗ крыс, что характеризуется повышением антиоксидантной емкости (АОЕ) плазмы крови, подавлением образования продуктов ПОЛ в печени, увеличением активности глутатион-трансферазы в цитозоле печени. Отсутствие при этом изменений активности каталазы, глутатионпероксидазы и глутатио нредуктазы позволяет предположить, что антиоксидантное действие ли копи на связано с его прямым антирадикальным эффектом, а не с влиянием на ключевые ферменты АОЗ.

Обнаружено in vivo выраженное активирующее действие флавонои-дов на систему АОЗ крыс, характеризующееся повышением АОЕ плазмы крови и цитозоля печени.

Впервые показана способность флавоноидов (ОПЦ, ДГК и сили-марина) при включении в корм крыс оказывать подавляющее действие на индуцированное ек vivo ПОЛ микросом печени.

В работе дана количественная характеристика антиоксидантной активности отечественных препаратов ликопина и ДГК in vitro и получены экспериментальные доказательства их стимулирующего действия на систему АОЗ in vivo.

Практическая значимость работы

В работе показана способность каротиноидов (ликопина) и флавоноидов (ОПЦ и ДГК) снижать выраженность токсических эффектов приоритетных природных загрязнителей продовольственного сырья и пищевых продуктов, таких как фумонизины и Т-2 токсин.

Полученные данные могут быть использованы при гигиеническом обосновании величин потребности в пищевых биологически активных веществах (ликопине и флавоноидах) и адекватных уровней их поступления с рационом питания.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены на Пленуме Межведомственного Научного Совета по экологии человека и гигиене окружающей среды Российской Федерации «Угрозы здоровью человека: современные гигиенические проблемы и пути их решения» (Москва, 2002),

Первом Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2003), Международной конференции «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2003).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 3 статьи в научных рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на /£7 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, обоснования цели и выбора методов исследования, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, включает 68 таблиц и иллюстрирована 54 рисунками.

Указатель литературы включает (О отечественных и(2Л?зарубеж-ных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали диспергируемый в воде лнкопин ("Hoffman-La Roche", Швейцария), кристаллический ликопин (хроматографичес-кая чистота >80%) выделенный из гриба Blake$lea tmpora («Уралбио-фарм»), ДГК, содержание ДГК >90% (химический факультет МПГУ), препарат «Диквертин», содержание ДГК 92.6% (Инновационная научно-производственная фирма «Химия древесины», Иркутск), силимарин ("ICN Biomedicals", США), стандартизованный экстракт ОПЦ виноградных косточек, содержание ОПЦ 43.18% ("La Gardonnenque S.C.A.", Франция), силибинин, люминол, аскорбиновую кислоту и тиобарбитуровую кислоту ("Sigma"), пероксид водорода («Aldrich>, Германия), катехин, НАДФН, ЭДТА ("Fluka", Германия), остальные реактивы - отечественного производства квалификации ч.д.а.

Для изучения антирадикальной активности in vitro ликопина, ОПЦ, силибинина, силимарина и ДГК использовали систему НЬ-НзОг-лю-минол, принцип действия которой основан на регистрации хем и люминесценции и оценке ее параметров — латентного периода и максимальной интенсивности, позволяющих оценивать тормозящее действие антиоксидантов на свободнорадикальное окисление люминола [Теселкин Ю.О.идр., 1997,1998].

Для оценки антиоксидантных свойств исследуемых природных антиоксидантов in vitro была использована модель индуцированного

ПОЛ микросом печени крыс. Микросомы выделяли из печени крыс-самцов Вистар массой 100-150 г по методу B.G.Lake (1987). ПОЛ мембран микросом индуцировали системой НАДФН-Fe2* [Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972]. Окислительную модификацию липидов оценивали по накоплению ТБК-реактивных продуктов ПОЛ и по степени изменения активности ферментов микросом.

Эффективность природных антиоксидантов в экспериментах га vivo изучали с использованием половозрелых крыс-самцов Вистар, получавших полноценный полусинтетический рацион. Масляный раствор ликопина вводили животным внутрижелудочно в дозах 10 и 50 мг/кг, ОПЦ вносили в рацион в количестве, обеспечивающем суточную дозу 150 мг/кг, ДГК — в количестве, обеспечивающем суточную дозу 130 мг/кг, силимарин - в количестве, обеспечивающем суточную дозу 150 мг/кг , в течение 2 недель.

Для изучения влияния ликопина на защитно-адаптационный потенциал крыс при микотоксикозе, вызванном фумонизинами, в рацион крыс включали культуральный материал высокотоксигенного штамма Fusarium momliforme1 в количестве, обеспечивающем поступление фумонизинов В1+В2 в дозе 31-36 мг/кг, а ликопин в виде масляного раствора вводили внутрижелудочно в дозе 50 мг/кг в течение 3 недель.

Для изучения влияния ОПЦ на защитно-адаптационный потенциал крыс при микотоксикозе, вызванном фумонизинами, в рацион крыс включали культуральный материал высокотоксигенного штамма F. moni-hforme в количестве, обеспечивающем поступление фумонизинов В1+В2 в дозе 27-29 мг/кг, а ОПЦ вводили в виде водного раствора внутрижелудочно в дозе 250 мг/кг в течение 2 недель.

Для изучения влияния ДГК на защитно-адаптационный потенциал крыс при Т-2 микотоксикозе в рацион крыс включали ДГК в количестве. обеспечивающем поступление 130 мг/кг в течение 3 недель, раствор хроматографически чистого Т-2 токсина, выделенного из культуры F. sporotrichiella 53315 в лаборатории энзимологии питания ГУ НИИ питания РАМН, вводили внутрижелудочно в дозе 1 мг/кг в течение последних 10 дней эксперимента.

За 12 ч до забоя животных лишали пищи. Животных забивали декапитацией. Для исследования отбирали кровь и печень. Плазму крови выделяли немедленно после забора крови путем центрифугирования при комнатной температуре при 2800 об/мин в течение 15 мин и хранили при -20°С - -25°С. Исследования проводили в течение 3 дней и повторно плазму не замораживали. Из печени получали гомогенаты,

'Культуральный материал любезно предоставлен канд. б иол. наук Л.С.Львовой.

цитозольную и микросомальную фракции, которые хранили при -24°С. Все работы по выделению фракций производили при +4°С.

Содержание восстановленного глутатиона в печени определяли по методу [Sedlak J., Lindsay R., 1968]. Уровень МДА в печени определяли по методу [Ohkawa H. et al, 1979] в модификации [Костюк В.А., Потапо-вич А.И., 1987]. Скорость спонтанного и НАДФН-индуцированного ПОЛ s микросомах печени определяли по методу [Владимиров Ю.А., Арча-ков А.И., 1972] в небольшой модификации. АОЕ плазмы крови и цито-золя определяли по методу [Теселкин Ю.О. и др., 1998] в небольшой модификации. В цитозоле определяли активность каталазы по методу [Chance В., Herbert D., 1950] в модификации [Aebi Н.Е., 1984], глутати-онпероксидазы и глутатионредуктазы — по методу [Mohandas J. et al, 1984], глутатионтрансф ер азы — по методу [Habig W.H. et al, 1974].

Статистическую обработку полученных данных производили с использованием i-критерия Стьюдента и методом дисперсионного анализа ANQVA при помощи компьютерной программы «Statgraphics 2.6».

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка антиоксидантной активности ликопина и флавоноидов в модельных системах in vitro

Исследования проводили на 2 модельных системах окисления. Использование водной гомогенной тест-системы НЬ—Н2О2—люминол позволило показать, что все исследованные природные антиоксидан-ты обладают способностью инактивировать свободные радикалы и предотвращать развитие цепей свободнорадикальных реакций, что проявлялось в изменении параметров ХЛ — увеличении продолжительности латентного периода и снижении интенсивности ХЛ (рис. 1). При сравнении антиоксидантных свойств ликопина и флавоноидов по их способности задерживать развитие ХЛ системы НЬ—НзОг—люминол установлено, что антиоксидантная активность исследуемых природных анти-оксидантов превосходит активность аскорбиновой кислоты (рис, 2). При этом наибольшей активностью обладают ОПЦ виноградных косточек, а антиоксидантная активность других уменьшалась в ряду: катехин > ДГК > силимарин й ликопин > сшгибинин.

Важным представлялось изучение способности природных анти-оксидантов предотвращать ПОЛ мембран, т.к. именно окислительная модификация липидов мембран зачастую лежит в основе патогенеза многих заболеваний. При изучении влияния ликопина и флавоноидов

01 23456789 ЮН Ликолин, «кМ

0.2

0 5 10 1 5 20 25 30 Силлмарки, мкМ

0 12 3 4 ОПЦ. мкМ экв, ытехина

-50

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ДГХ, кнМ

О 5 10 15 20 25 30 Сипибинин, ымМ

1.1 500

1.0 450

400

0,9 350

0,8 зоо

250

07

200

0.6 150

0,5 100

50

а* 0

0,3 -50

01 23456789 Катехин, мкМ

Рис. 1. Влияние ликопина и флавоноидов на параметры люминолзависи-мойХЛ.

Оси ординат: слева — латентный период, с (кривая 1); справа — интенсивность, отн. ед. (кривая 2),

4 ¡¡кв. аскорбиновой кислоты

-ОПЦ

— Катам н -дгк

—Силимарин

— Я и копии

— Силибинин

—Аскорбиновая кислота

Рис. 2. Сравнительная антиоксидантная активность флавоноидов, лико-пина и аскорбиновой кислоты в системе НЬ—НгОг—люминол.

на чувствительность мембран микросом печени крыс к НАДФН-индуцированному ПОЛ обнаружено, что как ликопин, так и флавоноиды оказывают тормозящее действие на ПОЛ микросом печени, проявляющееся в подавлении накопления МДА (рис. 3) и снижении степени из-

Таблица 1. Влияние природных антиоксидантов на изменения скорости гидро-ксилирования 6енз(а)пирена (БПГ) и активности UDP-глюкуронозилтрансфе-разы (UDP-ГТ), вызванные индуцированным ПОЯ микросом печени крыс in vitro (M±m)

Воздействие МДА, нмоль/мг белка за 10 мин БПГ, усл. ед/мин на 1 мг белка UDP-ГТ, имоль/мин на 1 мг белка

Ликопин

контроль (без прооксиданта) 0.31 ±0.01 4.00±0.27 8,16+0.33

НАДФН (25 мкМ) 13,26+0.60* 1.02+0.02* 18.33±1.45*

НАДФН (25 мкМ) + ликопин (10 мкг/мл) 3,22+0.12*+ 3.44+0.03* 7.23±0.26*

ОПЦ

контроль (без прооксиданта) 0.23±0.05 5.25±0.75 3,50+0.70

НАДФН (25 мкМ) 9.20+0.10* 1.90+0.10* 12.6+0.81*

НАДФН (25 мкМ) + ОПЦ (10 мкг/мл) 4.14+0.18*+ 3.68+0,38*+ 6.65±0.35*+

ДХ

контроль (без прооксиданта) 0.55+0.04 7,46±0.24 11.3+12

НАДФН (25 мкМ) 10.40+0-13* 3.33+0.18* 31.4±0.5*

НАДФН (25 мкМ) + ДК (50 мкг/мл) 3.71 ±0.10*+ 5.70+0.70+ 11.9±0.5+

Силибиник

контропь (без прооксиданта) 0.25+0.04 752+0.09 6.25±1.90

НАДФН (25 мкМ) 9.52±0,10* 320+0.10* 23.60±2.00*

НАДФН (25 мкМ) + силибинин

(50 мкг/мл) 3.89±0.04'+ 4.85+0.19** 8.75+0.65+

Примечание. *р<0.05 по сравнению с контролем (без прооксиданта); *р<0.05 по сравнению с действием прооксиданта.

120

120

Ликотн, мкМ ОПЦ, мкМ эке. кагаина

ДГК, икМ По осям ординат — МДА,

менений активности ферментов микросом (табл. 1). При этом антиоксидантная активность изучаемых биологически активных соединений, рассчитанная по концентрации антиоксиданта, вызывающей 50% подавление накопления МДА, убывает в ряду: ликопин > ОПЦ > силима-рин > силнбинин > ДГК (рис. 4).

Таким образом, в экспериментах in vitro обнаружено, что как ликопин, так и флавоноиды способны оказывать выраженное ингибирую-

мкМ 140

120

100

SO

60

40

20

О

Рис. 4. Концентрации антиоксидантов, вызывающие подавление накопления МДА в микросомах печени крыс на 50%.

щее действие как на свободнораднкальное окисление люминола, так и на уровень индуцированного ПОЛ микросом печени.

Изучение влияния ликопина и флавонондов на антиоксидантний статус крыс

Полученные результаты показали, что как ликопин, так и изученные флавоноиды оказывают положительное влияние на антиоксидантний статус крыс, что в первую очередь проявлялось в увеличении об-

і і і і і і МДА А0Е гошмы Клалаза Глутатмон- Глутэтион- Гпутатион- Воестаное-

траиофвраза пероксидаза редуктоа пенный

гггуташои

Рис. 5, Влияние ликопина и флавоноидов на показатели антиоксидантного статуса крыс.

i — ликопин, 10 мг/иг; 2 — ликопин, 60 мг/кг; 3 — ОПЦ, 150 мг/кг; 4 — ДГК, 130 мг/кг; 5 — см и марин, 150 мг/кг. *р<0.05 по сравнению с контроле«,

Таблица 2. Влияние ликопина и флавоноидов на резистентность микросом печени крыс к ПОЛ ex vivo (M±m, п=6)

Соединение Группа Скорость НАДФН-завмсимого ПОЛ, МДА, нмопь/мг белка за 10 мин

Ликопин Контрольная 8.28+0.22

Опытная 1 (10 мг/кг) 8.45+0.18

Опытная 2 (50 кг/кг) 8.68+0.43

ОГЦ Контрольная 8,16±0,41

Опытная (150 мг/кг) 6.03±0.45*

ДГК Контрольная 10.55i0.99

Опытная (130 мг/кг) 7.85+0.56*

Силимарин Контрольная 8.16+0.41

Опытная {150 мг/кг) 559±0.63*

Примечание. *р<0.05.

щей АОЕ плазмы крови. Наряду с этим было обнаружено, что ликопин в использованных дозах не увеличивает резистентности микросом к окислению, индуцированному ex vivo и не оказывает влияния на активность ферментов АОЗ, одновременно несколько увеличивая активность цитозольной глутатионтрансферазы. Изучение влияния ОПЦ на анти-оксидантный статус крыс показало, что кроме увеличения общей АОЕ плазмы крови и цитозольной фракции печени ОПЦ вызывают также достоверное снижение активности каталазы и глутатионперок-сидазы. В эксперименте по изучению влияния ДГК на антиоксидант-ный статус крыс показано, что он, как и ОПЦ, достоверно увеличивает общую АОЕ плазмы крови, снижает активность каталазы, но при этом увеличивает активность глутатионтрансферазы в цитозоле и уменьшает содержание восстановленного глутатиона в печени. Силимарин увеличивает общую АОЕ плазмы крови и цитозольной фракции печени, достоверно снижает активность каталазы, но не влияет на активность других ферментов {рис. 5). При этом обнаружено, что все изученные флавоноиды достоверно увеличивают резистентность микросом к ПОЛ, индуцированному ex vivo, что проявлялось в снижении скорости накопления продуктов ПОЛ в микросомах (табл. 2).

Таким образом, в этой серии экспериментов установлено, что ликопин и флавоноиды оказывают выраженное активирующее действие на систему АОЗ крыс. Наряду с этим выявлена способность флавоноидов повышать устойчивость микросом печени к ПОЛ, индуцированному ex vivo.

Изучение влияния ликопина и флавоноидов на защитно-адаптационный потенциал крыс при алиментарных микотоксикозах

Для изучения влияния ликопина и флавоноидов на защитно-адаптационный потенциал крыс в качестве моделей были выбраны алиментарные микотоксикозы (вызываемые фумонизинами и Т-2 токсином), одним из проявлений которых является окислительный стресс.

В эксперименте по изучению влияния ликопина на антиоксидант-ный статус крыс при микотоксикозе, вызванном фумонизинами, было обнаружено, что у крыс, получавших ликопин в дозе 50 мг/кг, снижено количество и степень выраженности макроскопических изменений в печени. Кроме того, у крыс, получавших ликопин, в отличие от животных, получавших только фумонизины, не наблюдали изменений активности ферментов плазмы крови: аланинаминотрансферазы, щелочной фосфатазы, арилсульфатаз и (ї-галактози дазы. У этих животных в значительно меньшей степени увеличивалась как общая, так и неседиментируе-мая активность лизосомальных ферментов печени. Показатели антиоксидантного статуса крыс, получавших ликопин, изменялись следующим образом; практически не снижалась общая АОЕ цитозольной фракции печени, в меньшей степени увеличивался уровень продуктов ПОЛ в печени и достоверно меньше снижалась активность каталазы в цитозоле (рис. 6).

Исследование влияния ОПЦ на защитно-адаптационный потенциал крыс при микотоксикозе, вызванном фумонизинами, показало, что у крыс, получавших ОПЦ в количестве 250 мг/кг в сутки, при добавле-

МДА ДОЕ плазмы Каталааа Глутатион- Глутатион- Глутатион- Восстанов-

трансфераза пероисидаза редуктаза ленный

глутатион

Рис. 6. Изменение показателей антиоксидантного статуса крыс, получавших рацион с культуральным материалом Р. топіШогте и ликопин.

1 — контроль; 2 — фумонизины; 3 — фумонизины+ликопии. *р<0.05 по сравнению с контролем; **р<0.05 по сравнению с группой, получавшей фумонизины и не получавшей ликопин.

МДА АОЕ плазмы Каталаза Глутэтион- Гпушнон- Глутатиок- Восстанов-

трэнсфераза пероксиша редуктаза пенный

глутатион

Рис. 7. Изменение показателей антиоксидантного статуса крыс, получавших рацион с культурапьным материалом Р. топМогте и ОПЦ. 1 — контроль; 2 — фу мо низины; 3 — фумонизины+ОПЦ. *р<0.05 по сравнению с контролем; **р<0.05 по сравнению с группой, получашей фумониэины и не получавшей ОПЦ.

нии в рацион фумонизинов в меньшей степени выражено количество и степень макроскопических изменений печени, менее значительно увеличивается содержание билирубина в плазме крови и неседиментируе-мая активность ферментов лизосом печени. Наряду с этим у крыс, одновременно с фумонизинами получавших ОПЦ, в отличие от животных, получавших только фумонизины, достоверно в меньшей степени снижается АОЕ цитозоля и активность глутатионтрансферазы (рис. 7). Кроме того, у этих животных незначительнее увеличивается скорость спонтанного ПОЛ микросом печени.

В следующем эксперименте обнаружено, что введение Т-2 токсина крысам, получавшим ДГК, приводит к снижению степени выраженности Т-2 токсикоза, что проявляется в уменьшении количества и степени макроскопических изменений печени, а также в достоверно меньшей степени увеличения относительной массы печени. Наряду с этим у животных, получавших Т-2 токсин на фоне введения в рацион ДГК, в отличие от крыс, получавших только Т-2 токсин, не наблюдали снижения АОЕ плазмы крови и цитозоля печени, кроме того, у этих животных наблюдали достоверно меньший уровень МДА в печени. Что касается активности ключевых ферментов АОЗ, то у животных, получавших Т-2 токсин на фоне внесения в рацион ДГК, наблюдается более высокая активность каталазы и глутатионпероксидазы относительно животных, получавших только Т-2 токсин, и не снижается активность глутатионтрансферазы (рис. 8).

Положительное действие ДГК на защитно-адаптационный потенциал крыс при Т-2 токсикозе характеризовалось также нормализацией активности ферментов, осуществляющих детоксикацию Т-2 токсина в

МДА АОЕ плазмы АОЕ Каталізі Глугатион- Глутатион- Гпушиои- Восстанов-ііятозоля трансферам переюш редуктаза ленный

гпутатион

Рис. 8. Изменение показателей антиоксидантного статуса крыс, получавших рацион с ДГК и Т-2 токсин.

i — контроль; 2 —■ Т-2 токсин; 3 — Т-2 то ней н+ДГК. *р<0.05 по сравнению с контролем; **р<0.05 по сравнению с группой, получавшей Т-2 токсин на фоке базового рациона.

организме: UDP-глюкуронозилтрансферазы, карбоксила стеразы и бенз-пиренгидроксилазы.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что ли-копин и флавоноиды обладают способностью снижать токсичность приоритетных природных загрязнителей продовольственного сырья и пищевых продуктов, таких как фумонизины и Т-2 токсин, за счет активирующего действия на систему АОЗ крыс.

Полученные сведения об эффективности изученных природных антиоксидантов могут быть использованы при гигиеническом обосновании величин оптимального поступления минорных биологически активных веществ с рационом питания.

ВЫВОДЫ

1. Получены новые данные о биохимических механизмах регуляции функциональной активности системы АОЗ природными биологически активными веществами, такими как ликопин и флавоноиды,

2. В экспериментах in vitro выявлено выраженное ингибирующее действие ликопина и флавоноидов как на свободнорадикальное окисление люминола, так и на уровень индуцированного ПОЛ микро-сом печени. При этом на модели НЬ-НїОі-люминол наиболее выраженная ингибирующая активность обнаружена у ОПЦ, и значительно меньшая — у других антиоксидантов (катехин > ДГК > си-лимарин > ликопин > силибинин). В то же время на модели ПОЛ микросом, индуцированного системой НАДФН-Ре2\ ПОЛ инги-бировалось в наибольшей степени ликопином, и в меньшей степени флавоноидами (ОПЦ > силимарин > силибинин > ДГК).

3. Ликопин in vivo оказывает выраженное активирующее действие на систему АОЗ крыс, что характеризуется повышением общей АОЕ плазмы крови, подавлением образования продуктов ПОЛ в печени, увеличением активности глутатионтрансферазы в цитозоле печени. Отсутствие при этом изменений активности каталазы, глутати-онпероксидазы и глутатионредуюгазы позволяет предположить, что антиоксидантное действие ликопина связано с его прямым антирадикальным эффектом, а не с влиянием на ключевые ферменты АОЗ.

4. Флавоноиды in vivo оказывают активирующее действие на систему АОЗ крыс, характеризующееся повышением общей АОЕ плазмы крови и цитозоля печени.

5. Впервые показана способность флавоноидов (ОПЦ, ДГК и сили-марина) оказывать подавляющее действие на индуцированное ех vivo ПОЛ м икр о сом печени.

6. Впервые дана количественная характеристика антиоксидантной активности отечественных препаратов ликопина и ДГК in vitro и получены экспериментальные доказательства их стимулирующего действия на систему АОЗ in vivo.

7. Показана способность каротиноидов (ликопина) и флавоноидов (ОПЦ и ДГК) снижать выраженность токсических эффектов приоритетных природных загрязнителей продовольственного сырья и пищевых продуктов, таких как фумонизины и Т-2 токсин.

8. Полученные данные могут быть использованы при гигиеническом обосновании величин потребности в пищевых биологически активных веществах (ликопине и флавоноидах) и адекватных уровней их поступления с рационом питания.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛ И КОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Морозов С.В., Дерягша В.П., Авреньева Л. И. Гусева Г.В., Кравченко Л.В. Корригирующее действие флавоноидов на антиоксидантный статус крыс при Т-2 микотоксикозе // Материалы VI международного симпозиума «Биологически активные добавки к пище и проблемы оптимизации питания». Сочи, 2002. С. 172-173.

2. Кравченко Л.В., Морозов СВ., Тутелъян В.А, Оценка антиоксидантной эффективности проантоцианидинов по их действию на биохимические изменения, индуцированные перекисным окислением липидов мик-росом Ц Материалы VI международного симпозиума ^Биологически активные добавки к пище и проблемы оптимизации питания». Сочи, 2002. С. 124.

3. Кравченко Л-В., Морозов C.S., Бекетова Н, А., Авреньева Л. И., Дерягина В.П, Влияние ликопина на процесс перекисного окисления липидов in vitro и ex vivo Ij Материалы VI международного симпозиу-

ма «Биологически активные добавки к пище и проблемы оптимизации питания». Сочи, 2002. С. 123.

4. Морозов C.B., Авренъееа Л. И., Кравченко Л. В. Микотоксины гриба Fusarium mortiliforme. К механизму токсического действия // Материалы пленума межведомственного научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды Российской Федерации «Угрозы здоровью человека: современные гигиенические проблемы и пути их решения» / Под ред. акад. РАМН Ю.А,Рахманина. М„ 2002. С. 157-159,

5. Кравченко Л.В., Морозов C.B., Бекетова H.A., Дерягина В.П., Аврень-ева Л. И., Тутельян В.А. Антиоксидантный статус крыс, получавших разное количество ликопина // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2003. Т. 135, №4. С. 414-418.

6. Морозов C.B., Дерягина B.U., Авренъееа Л. И., Кравченко Л.В. Влияние трихотеценового микотоксина (Т-2 токсина) на антиоксидантный статус крыс // Вопросы обеспечения санэпидблагополучия населения в центральных регионах России. Научные труды Федерального научного центра гигиены им Ф.Ф.Эрисмана / Под ред. акад. РАМН, проф. А.И.Потапова. Воронеж, 2002. Вып. 6. С. 640-642.

7. Beketova N.A., Kravckenko L.V.. Morozov S.V., Avrenjeva L.I., Deryagina V.P, Simultaneous determination of vitamin A, E and lycopene in rat serum, microsomes and livers by HPLC with spectrophotometry detection // 3rd International symposium on separations in biosciences "100 years of chromatography" SBS'03. Moscow. 2003, P. 406,

8. Kravckenko L.V., Morozov S.V., Avren'eva L.I., Beketova N.A., Deryagina V.P. Evaluation of antioxidant properties of lycopene in vitro and in vivo // Материалы международной конференции «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека». Смоленск, 2003. С. 16.

9. Кравченко Л.В., Морозов C.B., Тутельян В.А. Влияние ликопина на устойчивость микросом печени крыс к ПОЛ, индуцированному in vitro // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2003. Т. 136, № 7. С. 76-79.

10. Морозов C.B. Подходы к оценке антиоксидантной активности флаво-ноидов // Теоретические основы и практические решения проблем санитарной охраны атмосферного воздуха. Сборник докладов конференции молодых ученых «Развитие научного творчества молодежи — объект постоянного внимания В.А.Рязанова». М„ 2003. С. 336-338.

11. Кравченко Л.В., Морозов C.B., Авреньева Л.И., Бекетова НА., Дерягина B.U. Оценка эффективности ликопина как биологически активного компонента пищи // Материалы VII Всероссийского конгресса «Государственная концепция «Политика здорового питания в России». М„ 2003. С. 264-265.

12. Морозов C.B., Кравченко Л.В. Изучение антирадикальной активности препаратов флавоноидов винограда в модельной системе in vitro // Материалы VII Всероссийского конгресса «Государственная концепция «Политика здорового питания в России». М., 2003. С. 369-371.

13. Кравченко Л.В., Морозов C.B., Тутельян В.А. Влияние флавоноидов на резистентность микросом к повреждающему действию ПОЛ in vitro и ex vivo // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2003. Т. 136, N* 12. С. 648-652.

Подписано к печати 8.12.03 г. Формат бумаги 60x34'/16 Заказ № 55 Тираж 130 экз.

Отпечатано в Издательстве РАМН 109240 Москва, ул. Солянка, д, 14 +7 (095) 298-21-08, +7 (095) 298-20-48 www.iramn.ruinfo@iramii.ru