Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Оценка диагностических свойств антигенных комплексов возбудителя альвеококкоза в эксперименте

На правах рукописи

[ АДЕЛЫНЙНА Галина Александровна

I \

ОЦЕНКА ДИАГНОСТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ АНТИГЕННЫХ КОМПЛЕКСОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ АЛЬВЕОКОККОЗА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

14.00.36 — аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ВОЛГОГРАД • 1996

Работа выполнена в Волгоградской медицинской академии и Волгоградском научно-исследовательском противочумном институте.

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Г. Р. ЯРУЛИН; доктор медицинских наук, профессор, академик РЭА Н. Г. ТИХОНОВ;

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, член-

корреспондент PATH, профессор А. К. АДАМОВ;

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник JI. В. САЯПИНА.

Ведущее учреждение: Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Кавказа и Закавказья.

Защита состоится_ _ 1996 г. в_час.

на заседании диссертационного совета К 074.32.99 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института «Микроб».

Автореферат разослан_ _ 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

старший научный сотрудник 3. Л. ДЕВДАРИАНИ

- з-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Эхинококкозы относятся к числу широко распространенных тяжелых паразитарных болезней, , наносящих значительный ущерб здоровью человека (Збарский А.И.. 1986; Геллер И.Ю., 1989; Ястреб В.Б., 1930 ). Альвеококкоз (многокамерный эхинококкоз) отличается эндемичным распространением в северных и северовосточных регионах Евразии, отдельных странах Ближнего ВТзстока, Северной Америки. Эпизоотология и эпидемиология этой инвазии в значительной степени определяются природными и, реже, ■антропогенными факторами i Лукашенко H.H., 19?5; Орлов U.C., Лей-кина Е.С., 1983; Яроцкий Л.С., 1390; Takao Eujikura, 1991). Возбудителем альвеококкоза человека и промекуточных хозяев является личиночная стадия (ларвоциста) Echinococcus CAIveococcus ) aulti-locularis. Она локализуется преимущественно в печени, но нередко поравает и другие органы. При запоздалой диагностике болезнь монет перейти в хроническую форму, трудно поддающуюся не только химиотерапии, но и радикальному хирургическому лечению (Лукашенко Н.П., 1975; Найт Р., 1985: Щербаков A.M., 1986. 1990: Астафьев Б.п., 1987 ; ücha P.N.. Szyfres В.. 198?; Lightoulers M.H. et al., 1993).

При разработке эффективных мер борьбы с эхинококкозами большое внимание уделяется усовершенствованию существующих и изысканию новых методов диагностики, терапии и профилактики инвазии, а такхе комплексному реиению общебиологических, медицинских, ветеринарных и социально-экономических проблем (Лейкина Е.С., 1985. 1987;. Яроцкий Л.С., 1990; Маслов С.С., Никифорова Т.В.. 1990; Bogel Konrad et al., 1992; Batteli G., Martini Marco, 1992; Гельдыев А.Г.. 1993).

В диагностике этих . гельминтозов значительную, а иногда и решающую роль играют серологические методы исследования. Одним из главных препятствий в создании устойчивой высокочувствительной тест-системы для определения многокамерного эхинококкоза является сложность антигенного состава паразита, . которая 'приводит к перекрестным реакциям и локноположительным результатам. Поэтому дальнейкее совершенствование методов очистки антигенов альве-

ококка и испытание их при конструировании тест-системы для выявления специфических антител в сыворотках крови зараженных животных является одним из этапов на пути к решению вопроса ранней диагностики этого гельминтоза.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: изучение диагностических свойств антигенных комплексов ларвоцист альвеококка и оценка в эксперименте полученных активных препаратов в микрогранулированной полиакриламид-ной тест-системе с магнитными сорбентами для обнаружения специфических антител.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ: - определение локализации антигенных комплексов в ларвоцистах альвеококка методом РИФ;

- выделение и очистка антигенов альвеококка с использованием методов ультрафильтрации на мембранных фильтрах, колоночной и аффинной хроматографии;

- получение антивидовых (крысы) иммунных сывороток к антигенам альвеококка и выделение из них иммуноглобулинов;

- иммунохимическая характеристика полученных препаратов;

- приготовление микрогранулированных магнитных сорбентов с иммобилизованными антигенами альвеококка;

- разработка тест-системы для обнаружения антител к альвео-кокку в сыворотках зараженных животных с помощью непрямого имму-нофлюоресцентного метода.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА: - определены содержание и локализация паразитарных антигенных комплексов в ларвоцистах альвеококка имму-нофлюоресцентным методом;

- рекомендованы методические приемы и предложена схема получения очищенных специфических антигенов при помощи ультрафильтрации на мембранных фильтрах и аффинной хроматографии;

- впервые использованы микрогранулированные магнитные сорбенты в качестве твердофазного носителя антигенных комплексов альвеококка в диагностической тест-системе;

- сконструирована высокочувствительная тест-система и разработан вариант метода непрямой реакции иммунофлюоресценции с гранулированными антигенными магнитными сорбентами для обнаружения антител в сыворотке крови зараженных альвеококкозом животных.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

1. По материалам диссертационной работы составлены методические рекомендации, утвержденные директором Волгоградского на-

-----учно-исследовательского противочумного института Г протокол N 3

Ученого совета от 17.03.93 г.: "Получение антигенов альвеококка и их иммунохимическая характеристика" и "Оценка диагностических свойств антигенов Alveococcus multilocularis , иммобилизованных в гранулированные магнитные сорбенты".

2. Полученные в результате исследования материалы используются при проведении иммунологических изысканий в научных лабораториях и при чтении курса лекций в Волгоградской медицинской академии на кафедрах медицинской биологии и генетики по разделу "Биологические основы паразитизма", инфекционных болезней и эпидемиологии в цикле "Паразитарные болезни" (Акты об использовании материалов диссертации от 26.01.95 г.).

3. Сконструированная тест-система рекомендована в практику отделением паразитологии Областного центра государственного санитарного эпидемиологического надзора Волгоградской области как способ определения антител при эхинококкозах (Акт о внедрении от 12.07.95 г.).

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

- паразитарные антигенные компоненты в ларвоцистах альвеококка распределены неравномерно;

- антигенные комплексы, выделенные из водно-солевых экстрактов зрелых ларвоцист и отдельно из протосколексов, различаются по физико-химическим и иммунохимическим свойствам;

- иммобилизация антигенов альвеококка на магнитных сорбентах, полученных на основе полиакриламидного геля, позволяет сконструировать тест-систему для определения специфических антител в сыворотках зараженных альвеококкозом животных;

- разработанная на основе антигенных магнитных сорбентов тест-система с высокоактивной, специфической фракцией пригодна для диагностики альвеококкоза в непрямой реакции иммунофлюорес-ценции.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

- Всесоюзном Координационном совещании по проблеме эхино-коккозов в Г. Тбилиси, 1987 г.;

- конференциях молодых ученых Волгоградской медицинской академии в 1988 - 1994 гг.;

- ежегодных научных сессиях преподавателей Волгоградской

медицинской академии в 1969 - 1994 гг.

ПУБЛИКАЦИИ. Основные положения 'диссертационной работы опубликованы в 9 научных работах.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов и заключения, выводов. Список литературы включает 198 источников, в том числе 106 зарубежных. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 16 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ I. Материалы и методы

Опыты проведены на 200 крысах линии Вистар и 100 мышах линии ВАЬВ/с,интактных и экспериментально зараженных альвеококко-зом путем внутрибршинного введения прогосколексов и ацефалоцист паразита по методу Ф.П.Коваленко с соавт. (1979). Для получения иммунных сывороток использованы 16 кроликов породы "Шиншила".

Локализацию паразитарного антигена в тканях ларвоцист аль-веококка определяли при помощи реакции непрямой иммунофлюорес-ценции на гистологических срезах.

Исходным материалом для экспериментов послужили антигены альвеококка в виде водно-солевых экстрактов зрелых ларвоцист и протосколекс-ов отдельно. С целью выделения высокомолекулярных компонентов водно-солевых экстрактов проводили последовательное фракционирование последних методом ступенчатой ультрафильтрации на мембранах Диафло марок ХМ-300, ХМ-100, ХМ-50, РМ-30, ИМ-10, ИМ-0,5 в ячейках фирмы Амикон (СЗЛА). Последующую очистку полученных из двух вариантов водно-солевых экстрактов фракций ХМ-300, ХМ-100 и ХМ-50 осуществляли с помощью гель-хроматографии на колонке, заполненной сефарозой 6В. Фракцию ХМ-300 (2) из водно-солевого экстракта протосколексов подвергали иммуносорбции с использованием в качестве аффинного лиганда антисыворотки против сывороточных иммуноглобулинов интактных крыс. Иммуноглобулины выделяли путем двукратного осаждения их 20%-ным раствором полиэ-тиленгликоля с м.м. 6000 а.е.м.

Все выделенные антигенные комплексы изучали по единой схеме. Содержание белка определяли по методу Лоури (1951). Видоспе-цифические и перекрестно-реагирующие антигенные компоненты выяв-

ляли в реакциях иммунозлектрофореза- -(РИЭФ)—и иммунодиффузии—

(РИД). РИЭФ проводили по Р.бгаЬаг, C.B.Williams (1953) в модификации Г.А.Абелева и В.С.Дветкова (1960). РИД осуществляли по методу О.Ухтерлони (Фримель Г., 1987). Для проведения этих реакций использовали гипериммунные кроличьи сыворотки против цельного водно-солевого экстракта протосколексов альвеококка, его фракций ХМ-300 (2) и ХМ-50 (2), сывороточных иммуноглобулинов интактных крыс и белков печени хозяина. Первые 4 антисыворотки получали после внутривенного введения препаратов кроликам по схеме K.Blau et, al. (1965), описанной Т.Девени и Я.Геррей (1976). Иммунизацию животных печеночным порошком крыс вели методом подкожных инъекций препарата с неполным адъювантом Фрейнда "Дифко" (США) в соотношении 1:1. Препарат вводили в 10 точек вдоль позвоночника один раз в неделю. Срок иммунизации составил 4 недели.

Антигенную активность препаратов определяли с помощью реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА) по общепринятой методике (Никитин В.М., 1977) с использованием иммунной сыворотки против водно-солевого экстракта протосколексов альвеококка и коммерческой эхинококковой агглютинирующей сыворотки в дозе 4 ГЕ. В качестве индикаторных частиц взят коммерческий набор сухого эхинококкового зритроцитарного диагностикума для непрямой реакции гемагглютинации производства Ставропольского НПО "Аллерген".

При конструировании гранулированной тест-систэмы для диагностики альвеококкоза использовали водно-солевой экстракт протосколексов, цельную фракцию ХМ-300 (2) и фракцию А, выделенную путем аффинной хроматографии. В качестве твердофазного носителя антигенов Епервые при эхинококкозах применили магнитные сорбенты на основе полиакриламидного геля. Иммобилизацию антигенов на них осуществляли двумя путями: l) механическим включением лиганда в решетку полимерного носителя в процессе его полимеризации с сохранением рецепторной функции по методу В.Г.Пушкаря с соавт. (1986); 2) ковалентной "сшивкой" различных антигенов ларвальной стадии альвеококка на поверхности гранул с помощью глютаральде-гидного метода активации магногелей (метод, реком. ВНИПЧИ, 1984).Работу тест-системы анализировали"в непрямой реакции имму-нофлюоресценции (РИФ), количественный вариант которой включал иммобилизацию антигенных комплексов в гранулы MC, инкубирование

их с антителами, последующую обработку препаратов коммерческой люминесцирующей кроличьей сывороткой против иммуноглобулинов крыс и учет полученных результатов. Сыворотки зараженных альвео-коккозом крыс испытывали на 45-е и 190-е сут после инвазии.

Для статисгическойобработки результатов по соответствующим формулам определяли среднюю арифметическую, стандартную оценку средней арифметической , стандартное отклонение. При установлении достоверности использовали критерий Стъюдента (Лакин Г.Ф., 1990).

2. Результаты исследований и их обсуждение

В первой серии экспериментов изучали локализацию паразитарных антигенов в ларвоцистах альвеококка на гистологических срезах в реакции иммунофлюоресценции. Результаты исследований показали, что сыворотки интактных мышей вызывали слабое неспецифическое свечение в пределах 15±0,7 отн.ед. По окраске оно было серо-зеленого цвета и охватывало площадь всего среза. Иную картину наблюдали в опытах с референс-сыЕоротками. Установлено, что специфические паразитарные антигенные комплексы сосредоточены в герминативной (зародышевой; оболочке ларвоцист, особенно во внутренней выводковой зоне. Паразитарные антигены кутикулярной оболочки содержали белково-полисахаридные компоненты хозяина, что проявлялось в неспецифическом оранжевом свечении ее отдельных слоев. Показатель средней интенсивности свечения с рефе-ренс-сыворотками, взятыми в разведении 1:20, достигал на герминативной оболочке 98,б±0,7 отн.ед., тогда как в области кутикулярной оболочки - 49,2±1,4 отн.ед. Дальнейшее разведение сывороток приводило к плавному снижению интенсивности специфического свечения.

Результаты экспериментов показали неравномерное распределение антигенных компонентов в ларвоцистах альвеококка с преобладающей локализацией паразитарного антигенного комплекса в герминативной оболочке и на протосколексах. Поэтому в качестве источника выделения антисенов для сравнения были взяты два варианта водно-солевых экстрактов ларвальной стадии альвеококка: первый -из цельных, покрытых кутикулярной оболочкой ларвоцист, а второй - из протосколексов.

В ходе проведения мембранной ультрафильтрации водно-солевых экстрактов получили ряд фракций, отличающихся по молекулярной

массе и содержанию белковых~компонентов. —Сравнительное-изучение-концентрации бедка в двух водно-солевых экстрактах и их фракциях выявило в них определенные различия. Так фракция ХМ-300 (1) по этому показателю на 13,4% превышала таковую из протосколексов (43,3 и 29,9% соответственно). Аналогичную картину, отличие почти на 50%, наблюдали по фракциям ХМ-100 (1) и ХМ-100 (2). Повышенное содержание белка в высокомолекулярных фракциях из водно-солевого экстракта цельных ларвоцист можно объяснить большим присутствием компонентов хозяина в ¡¡их по сравнению с аналогичными препаратами из протосколексов, что в дальнейшем было подтверждено в РИД и РИЭФ.

Последующая очистка антигенов с помощью гель-хроматографии на сефарозе 6В показала, что профиль элюции фракции ХМ-300 (1) включал три, а ХМ-300 (2) - четыре пика. Анализ полученных хро-матограмм свидетельствует о том, что 2-я и 3-я подфракции ХМ-300 (2) элюировались в объеме приблизительно одинаковом с таковым у 2-й подфракции-ХМ-300 (1). В связи с этим можно предположить, что вышеуказанные подфракции содержали в своем составе аналогичные антигенные компоненты. Фракционирование препаратов ХМ-100 и ХМ-50 из обоих вариантов водно-солевых экстрактов показало, что их профили элюции состояли из 4-х пиков, а преимущественное количество белка находилось в 3-х и 4-х подфракциях ( от 52,9 до 77,2%).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что выделенные фракции антигенов альвеококка неоднородны по молекулярной массе составляющих их компонентов и распределению белка в подфракциях. Установлено, что методами мембранной ультрафильтрации и гель-хроматографии не удалось получить специфические паразитарные антигены, свободные от компонентов хозяина. Кроме того, диагностически ценные подфракции антигенов отличались относительно невысоким содержанием белка, и для их накопления требовалось большое количество исходного антигенного материала. В связи с этим провели аффинную хроматографию фракции ХМ-300 (2), как наиболее перспективного антигенного комплекса, выделенного из водно-солевого экстракта протосколексов альвеококка . В результате иммуно-сорбции был получен антигенный комплекс-(фракция А), значительно очищенный от компонентов хозяина.

Всем антигенам, выделенным методами мембранной ультрафиль-

трации, гель-хроматографии и иммуносорбции была дана иммунохими-ческая характеристика. Сравнительное изучение в РИД антигенных комплексов, полученных из двух вариантов водно-солевых экстрактов выявило в них определенные различия (табл.1).

Как видно из таблицы N 1,у фракции ХМ-300 (1) обнаружено по 5 иммунных комплексов с антисыворотками против сывороточных иммуноглобулинов хозяина, водно-солевого экстракта протосколексов, фракции ХМ-300 (2) и два комплекса антиген-антитело с таковой

Таблица 1

Иммунохимическая характеристика антигенов ларвальной стадии альвеококка в РИД с кроличьими антисыворотками

1 1 |Число дискретных полос преципитации прояв-|

I ленных кроличьими антисыворотками против|

|Наименование | сыворо- 1 | водно- 1

| точных | солевого

| иммуно- | зкстрак- фракции фракции печени |

I фракции | глобули -1 та про- ХМ-300 ХМ-50 интакт-1

| нов ин- | тоско- (2) (2) ных |

| тактных | лексов крыс |

| крыс 1 1

| ХМ-300 (1) 1 5 1 1 5 5 2 I

I ХМ-300 (2) 1 з 1 4 4 2 I

| ХМ-100 (1) 1 2 1 4 3 2 I

| ХМ-100 (2) 1 2 1 2 2 2 1

1 ХМ-50 (1) 1 з 1 2 3 1 1 1

| ХМ-50 (2) 1 2 1 2 1 1 1 |

| РМ-30 (1) 1 2 1 2 3 - 1 1

| РМ-30 (2) 1 1 1 1 1 - 1 1

| ИМ-10 (1) | 1 1 1 1 |

1 им-10 (2) | 1 1 - 1 1

| ИМ-0,5 (1) 1 1 1 1 1 - • |

| ИМ-0,5 (2) 1 1 | ' - - - |

I Фракция I А 1 1 1 з > 2 ... , I

против печени интактных крыс. Характер расположения полос преципитации указывал на наличие трех общих антигенов, обнаруженных всеми антисыворотками, тогда как у фракции ХМ-300 (2) - всего один. Такая же тенденция прослеживалась и у препаратов с м.м. 100 ООО а.е.м. и ниже - белки хозяина преобладали в препаратах из водно-солевого экстракта ларвоцисг. Конструирование тест-системы с подобными антигенными комплексами,на наш взгляд,нецелесообразно, т.к. приводило бы к многочисленным перекрестным реакциям и резкому снижению специфичности' серологической реакции. Некоторое исключение может составить лишь фракция ХМ-300 (2), содержавшая в своем составе меньше хозяинных белков. Подфракции антигенных комплексов, полученные с помощью метода гель-фильтрации, свидетельствовали о неравномерности распределения в них антигенных компонентов и различии их серологической активности в РИД. Из первых подфракции, выделенных как из ХМ-300 (1), так и ХМ-300 .(2), большую активность проявил препарат из протосколек-сов. Более четкую картину дали вторые подфракции. В них обнаружено по одному общему антигенному комплексу, а остальные полосы преципитации, располагаясь дискретно, представляли от двух до четырех активных серологических зон. Лишь в третьей подфракции ХМ-300 (2) не обнаружено положительной реакции с антисывороткой • против печени крыс.

Исследование в РИД подфракции с м.м. 100 ООО а.е.м. показало присутствие в них антигенов, выявленных антисыворотками против сывороточных иммуноглобулинов хозяина, водно-солевого экстракта протосколексов, фракции ХМ-300 (2). Однако серологическая активность этих препаратов оказалась невысокой.

При изучении в РИД фракции А установлено наличие одной зоны преципитации с антисывороткой против сывороточных иммуноглобулинов хозяина, трех зон - с антисывороткой против водно-солевого экстракта протосколексов и двух - с таковой против фракции ХМ-300 (2). Характер расположения полос преципитации, образованных с каждой из антисывор'оток и находящихся ближе к лункам последних, свидетельствовал о некотором сходстве содержащихся в них компонентов. Полностью этот препарат освободить от белков хозяина не удалось, но содержание их во фракции А было значительно ниже по сравнению с исходной фракцией ХМ-300 (2).

Результаты иммунохимических исследований, полученные в РИЭФ, в значительной степени подтвердили данные по РИД. Так, во фракциях ХМ-300 (1) и ХМ-300 (2) выявлено наибольшее число полос преципитации. Особенно выделялась зона сывороточных иммуноглобулинов, включающая у фракции ХМ-300 (1) восемь, а у ХМ-300 (2) шесть полос преципитации. Эти данные свидетельствуют об активном участии сывороточных белков крови хозяина в формировании паразитарной опухоли. Динамика распределения серологической активности в РИЭФ по подфракциям ХМ-300, ХМ-100 и ХМ-50 сохранялась в том же виде, что и в РИД. Во фракции А,по данным РИЭФ,обнаружено заметное снижение числа полос преципитации по сравнению с исходным препаратом ХМ-300(2) особенно в зоне сывороточных иммуноглобулинов. В три раза меньше комплексов антиген-антитело образовалось' и с антисывороткой против водно-солевого экстракта протосколек-сов. В то же время с таковой против фракции ХМ-300 (2) эти показатели были близки как с исходным препаратом ХМ-300 (2), так и с ХМ-300 (1).

Известно, что среди основных антигенов паразита, обладающих диагностической ценностью, выделяют как термолабильный, так и термостабильный, обозначаемые 5-м и 4-м компонентами (Varela-Diaz Y.M. ,et al., 1977;; Davles C., et al., 1978; Thompson R.C.A., 1985). Оценка результатов РИД по выявлению термостабильных компонентов позволила'установить присутствие последних во всех выделенных нами антигенных комплексах с м.м. выше 30 ООО а.е.м. В большинстве случаев ани включали в свой состав антигенные структуры как паразита, так и хозяина, и обладали более слабой серологической активностью1 по сравнению с термолабильными компонентами. Обращает на себя; внимание тот факт, что фракция А образовала по одной полосе преципитации только с антисыворотками против водно-солевого экстракта протосксшексов и фракции ХМ-300 (2). В связи с этим можно предположить, что термостабильные компоненты этого антигенного комплекса имеют паразитарное происхождение.

Иммунохимический анализ антигенных комплексов включал и определение их антигенной активности в РТПГА. Результаты проведенных экспериментов свидетельствовали о том, что фракции, для которых исходным материалом служил водно-солевой экстракт протос-колексов альвеококка, обладали более высокой активностью в РТПГА

по сравнению с аналогичными препаратами из" водно-солевого—экстракта зрелых ларвоцис-т. Сходную картину наблюдали и в подфрак-циях, полученных методом гель-хроматографии на сефарозе 6В. Высокую антигенную активность проявила фракция А. Этот препарат оказался в 100 раз активнее исходного водно-солевого экстракта протосколексов и в 16 раз - цельной фракции ХМ-300 (2). Препараты с м.м. 30 000 а.е.м. и ниже обладали слабой антигенной активностью в РГПГА.

Таким образом иммунохимическая характеристика выделенных антигенных комплексов ларвальной стадии альвеококка выявила неоднородность их состава, различную серологическую ( в РИД и РИЭФ) и антигенную ( в РТПГА ) активность как цельных фракций, так и составляющих их подфракций. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования для диагностики альвеококкоза антигенов из водно-солевого экстракта протосколексов, по сравнению с таковыми из зрелых ларвоцист. Комплексный подход к ис -следованию антигенов позволил отобрать для конструирования тест-системы из анализируемых препаратов наиболее очищенную от компонентов хозяина и активную фракцию А, а для сравнения с ней взять цельную фракцию ХМ-ЗОО (2).

Современная практика обнаружения антител при эхинококкозах располагает в нашей стране различными официально регламентированными серологическими методами, в том числе с применением сорбентов (Кузьмин Ю.А., Каральник Б.В., 1984-, Зорихина В.И. .Баллад Н.Е., 1990; Подопригора Г.И., Полетаева О.Г., 1993 и др.).

Нами предпринята попытка использования магнитных сорбентов (МС), приготовленных на основе полиакриламидного геля и применяемых в микробиологических исследованиях, при конструировании тест-системы для определения специфических антител при альвео-коккозе в сыворотках крови зараженных животных.

Возможность механического включения антигенов альвеококка в гранулы МС изучали на примере цельного водно-солевого экстракта протосколексов. В результате проведенных с 4-мя сериями МС экспериментов установлено, что указанный антигенный комплекс прочно иммобилизуется е решетку полимерного носителя с магнитным материалом. Магнитные гранулы, используемые.в работе,имели хорошую подвижность в поле небольших постоянных магнитов. Показатели интенсивности люминесцентного свечения гранул МС плавно снижались

в зависимости от возрастания степени разведения испытуемых сывороток крови и достоверно отличались от контролей с сыворотками крови интактных крыс.

В контрольных опытах с применением физиологического раствора свечения гранул МС не выявлено. Аналогичную картину наблюдали с гранулами МС без включения в них антигена при использовании как цельных-, так и в разведениях до 1:200 сывороток крови зараженных альвеококкозом и интактных животных.

Таблица 2

Показатели интенсивности свечения гранул магнитных сорбентов с включенной фракцией ХМ-300(2) в зависимости от разведения сывороток крови крыс, полученных на 45-е и 190-е сут. после заражения

1 1 -------------- 1 Показатели интенсивности 1 свечения|

|Разведение 1 гранул МС в отн. ед.

| сывороток I 45-е 1 сут 190-е сут |

I Нативные 0 1 152,6+2,8 1=3,7 48,3+2,7 |

К 137,0+2,3 1 Р<0,01 33,0±2,2 Р<0,001|

| 1:10 0 1 |42,7±2,5 1=3,2 38,7±2,4 ^=3,3 |

к 137,0+2,2 1 Р<0,01 28,0+2,0 Р<0,01 |

| 1:100 0 1 129,7+2,1 1=3,4 24,2+1,9 1=4,0 |

к 120,6+1,7 1 Р<0,01 14,7±1,5 Р<0,01 |

I 1:200 0 1 118,8+1,7 1=3,3 14,9±1,6 1=3,3 |

к 111.8+1,3 1 Р<0,01 8,3+1,2 Р<0,01 |

| 1:1000 0 1 I 9,3±1,2 1=1,7 6,2±1,1 1=1,5 |

( к 1 6,7+1,0 г Р>0,05 4,0±0,9 Р>0,05 | |

Примечание. О - опыт, сыворотки зараженных крыс,

К -. контроль, сыворотки интактных крыс.

Следующую серию экспериментов по _конструированию__тестгсис-__ темы и оценке ее в РИФ проводили с фракциями А и ХМ-300 (2), а в качестве референс-сывороток выбрали сыворотки зараженных аль-веококкозом крыс, полученные на 45-е и 190-е сут после инвазии. В РИФ гранул МС с Еключенной фракцией ХМ-300 (2) при использовании иатиЕНЫх сывороток, полученных на 45-е сут после заражения, уровень свечения составил 52,б±2,8 отн.ед. (табл.2). Разведение испытуемых сывороток от 1:10 до 1:200 снижало этот показатель с 42,7+2,5 до 18,8+1,7 отн.ед., причем различие между

Таблица 3

Показатели интенсивности свечения гранул магнитных сорбентов с включенной фракцией А в зависимости от разведения сывороток крови крыс, полученных на 45-е и 190-е сут. после заражения

1 I Разведение Серия Показатели интенсивности гранул МС в отн. ед. 1 свечения |

| сывороток 45-е сут. 190-е сут. 1

| Нативные 0 К 70,4±2,7 29,5+1,7 t=12,8 Р<0,001 бб,4±2,б 28,6+1,7 t=12,2 | Р<0,001|

| 1:10 0 К ' 58,5±2,4 25,1+1,6 t=ll,5 Р<0,001 52,8+2,3 23,7+1,6 t=10,4 | Р<0,001|

| 1:100 0 к 43,3+2,1 18,2+1,4 t=10,0 Р<0,001 38,5+2,0 17,4+1,3 t=8,8 | Р<0,001|

| 1:200 0 к 31,5±1,8 12,8+1,1 t=8,9 Р< 0,001 27,7+1,7 11,5+1,1 t=8,l | Р<0,001|

I 1:1000 I 0 к 13,1+1,1 5,0+0,7 t=6,2 Р<0,001 12,3+1,1 4,5+0,7 t=6,0 | Р<0,001|

Примечание. О - опыт, сыворотки зараженных крыс,

К - контроль, сыворотки интактных крыс.

опытом и контролем было достоверным. Сыворотки в титре 1:1000 вызывали слабое свечение гранул МС, достоверной разницы между опытом и контролем в этом случае не наблюдали. В экспериментах с использованием сывороток крови зараженных крыс, полученных на 190-е сут после инвазии, наблюдали аналогичную картину уровня интенсивности свечения. В серии опытов с использованием гранул МС с включенной в них фракцией А и сывороток крови интактных и зараженных крыс, полученных на 45-е и 190-е сут после инвазии (табл.3) установлено, что самый высокий уровень интенсивности свечения гранул МС наблюдается при инкубации их с нативными ре-ференс-сыворотками, полученными на оба выбранных срока после заражения (70,4±2,7 и 6б,4±2,6 отн. ед. соответственно). Дальнейшее титрование сывороток приводило к постепенному снижению интенсивности свечения гранул МС, причем достоверное отличие результатов между опытом и контролем наблюдали во всех разведениях.

Сравнительный анализ экспериментальных данных показал, что на уровень интенсивности свечения гранул МС с включенными фракциями А и ХМ-300 (2) выбранные сроки получения сывороток крови зараженных животных не влияли.

Сопоставление между собой уровней интенсивности свечения гранул МС с включенными в них механическим путем фракциями А и ХМ-300 (2) обнаружило, что при всех разведениях испытуемых сывороток на обоих сроках их получения различия показателей РИФ были достоверными. Факт повышенной чувствительности тест-системы с фракцией А 'еще раз свидетельствует в пользу максимальной очистки этого антигенного комплекса от компонентов хозяина. Достоинством указанной тест-системы является ее работоспособность с рефе-ренс-сыворотками, взятыми на 45-е сут после инвазии в больших разведениях (1:1000), что в свою очередь открывает перспективу разработки диагностики заболевания на ранних сроках развития альвеококкоза.

При изучении возможности использования ковалентной "пришивки" к гранулам МС как водно-солевого экстракта протосколексов, так и выделенных из него антигенных комплексов выявлено, что интенсивность свечения гранул МС во веек случаях была слабой даже при применении нативных референсгсывороток, причем флюоресциро-

вали лишь отдельные микроучастки гранул. Достоверной разницы" результатов между опытом и контролем не обнаружено ни с одним антигеном. В связи с этим ковалентную "пришивку" антигенов к гранулам МС в дальнейших экспериментах не применяли.

Резюмируя изложенное выше, можно сделать следующее заключение: проведенное комплексное исследование способствовало углубленному пониманию сложности состава антигенных комплексов лар-вальной стадии развития многокамерного эхинококка, формирующихся в процессе паразито-хозяинных отношений. Оно позволило еыяс-нить локализацию паразитарных антигенов в пределах ларвоцист, провести сравнительное изучение иммунохимических свойств выделенных фракций с последующим отбором наиболее активных из них для разработки более эффективных методов определения болезни. Конструирование диагностической тест-системы на микрогранулиро-ванных магнитных сорбентах с высокоочищенной активной фракцией А открывает новые перспективы в решении проблемы ранней диагностики эхинококкозов.

выводы

1. На гистологических срезах ларвоцист альвеококка с помощью непрямой реакции иммунофлюоресценции установлено неравномерное распределение антигенных комплексов в пределах цисты. Основная масса паразитарных антигенов локализована в герминативной оболочке - преимущественно в ее внутренней выводковой зоне и на протосколексах.

2. Антигенные комплексы протосколексов ■ и ларвоцист различаются как по составу, так и по антигенной активности. Препараты из зародышевых сколексов, содержащие преимущественное количество специфических белков и в меньшей степени связанные с компонентами хозяина, обладают большей диагностической ценностью.

3. В составе высокомолекулярных антигенных комплексов (выше 100000 а.е.м.), полученных методами мембранной ультрафильтрации и гель-хроматографии на сефарозе 6В при иммунохимическом анализе в РИД и РИЗЕ, обнаружено присутствие серологически активных как паразитарных, так и хозяинных компонентов.

4. Из двух способов очистки антигенных комплексов от балластных веществ наибольший эффект получен при комбинации мембранной ультрафильграции и аффинной хроматографии. Метод гель-фильтрации на сефарозе 6В не позволил отделить сложные па-

раэито-хозяинные комплексы друг от друга.

5. Из антигенных комплексов протосколексов путем мембранной ультрафильтрации и аффинной хроматографии получен высокоактивный и специфичный препарат - фракция А, объединяющая термолабильные и термостабильные диагностически ценные компоненты, характеризующаяся низким содержанием белков хозяина, и которая может быть использована для конструирования диагностической тест-системы.

6. Определен способ иммобилизации антигенных комплексов ларвальной стадии альвеококка в гранулы магнитных сорбентов на основе полиакриламидного геля путем механического их включения в решетку полимерного носителя.

7. Разработанная на основе магнитных сорбентов тест-система с высокочувствительной фракцией А пригодна для ранней диагностики альвеококкоза (на 45-е сут после заражения) в реакции им-мунофлюоресценции и может быть использована в экспериментальной паразитологии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Ярулин Г. Р., Аделынин Ф. К., Медведкина Г. А. Локализация алынчжоккоиого антигена в органах промежуточного хозяина // Проблема лхинококкоз'ов в СССР. — Тбилиси, 1987. — С. Iii—üü

2. Медведкина Г. А. Иммунохимпчеекая характеристика антигенов ларваль-iioii стадии альвеококка фракцнеширошишых по молекулярной массу // Актуальные: проблемы науки н практики: Тез. докл. XI конф. молод, ученых. — Волгоград, Н)!Ш. — С. 50.

Медведкина Г. А. Иммобилизация ai пи генов ларпоцпст альвеококка на магнитные сорбенты и оценка их работы в реакции иммупофлкюцесценщш // Актуальные проблемы медицины п иракшки: Тез. доел. ХП коиф. молод, ученых. — Волгоград, 1!Ш. — С. 42.

4. Адслышша Г. А., Климова И. М. Выделение антигенных комплексов лавралыюи етадин альвеококка и их иммунохимпчеекая характеристика в РИЭ<1> М., 1993. Деп. п ВИНИТИ l(j.0ü.í)3, ФИ 1053—ВОЗ.

5. Адельшина Г. А., Климова И. М., Тихонов И. Г. Оценка в РИФ

магнитных сорбентов -с- иммобилизованным антигеном ларвоцист--------

альвеококка. М., 1993. Деп. в ВИНИТИ 16.06.93. ФН 1654—В93.

6. Адельшина Г. А. Характеристика антигенных комплексов ларвальной стадии альвеококка в РДДГ // Актуальные вопросы теоретической экспериментальной и клинической медицины: Тез. докл. XIII конф. молод, ученых. — Волгоград, 1993. — С. 23.

7. Адельшина Г. А. Оценка диагностических свойств антигенных комплексов ларвальной стадии альвеококка // Актуальные проблемы медицинской и ветеринарной паразитологии: Тез. докл. междунар. науч. конф. — Витебск, 1993. — С. 23.

8. Фролов В. И., Адельшина Г. А. Выявление термостабильных компонентов в антигенах ларвальной стадии альвеококка, фракционированных по молекулярной массе // Актуальные вопросы теоретической экспериментальной и клинической медицины: Тез. докл. XIII конф. молод, ученых. ;— Волгоград, 1993. — С. 108.

9. Адельшина Г. А. Иммуноэлектрофоретическая характеристика подфракций антигенов ларвальной стадии альвеококка // Актуальные вопросы медицины: Тез. докл. 49-й науч. сессии. — Волгоград, 1994. — С. 106.