Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Оценка диагностических свойств антигенных комплексов возбудителя альвеококкоза в эксперименте

I 1 о О Д

На правах рукописи

АДЕЛЬШИНА Галина Александровна

ОЦЕНКА ДИАГНОСТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ АНТИГЕННЫХ КОМПЛЕКСОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ АЛЬВЕОКОККОЗА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

14.00.36 — аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ВОЛГОГРАД • 1995

/

к

■г/

Работа выполнена в Волгоградской медицинской академии и Волгоградской научно-исследовательском противочумном институте.

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Г.Р. ЯРУЛИН, доктор медицинских наук, профессор, академик РЗА Н,Г.ТИХОНОВ

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, член-корреспондент PATH, профессор й.К.АДАМОВ: кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Л.В.СА5ШНА

Ведущее учреждение - Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Кавказа и Закавказья

в 1-2 часов на заседании диссертационного совета К.074.32.01 по заците диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" (410005, г.Саратов, ул.Университетская, 46).

С диссертацией мокно ознакомиться в научной библиотеке института "Микроб".

Автореферат разослан

Зацита диссертации состоится

Нченый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, старший научный сотрудник З.Л. ЙЕВДАРИАНИ

- з-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Зхинококкозы относятся к числу широко распространенных тяжелых паразитарных болезней, наносящих значительный уцерб здоровью человека (Збарский А.И., 1986; Геллер И.Ю., 1989; Ястреб В.Б., 1930 ). Альвеококкоз (многокамерный зхинококкоз) отличается эндемичным распространением в северных и северовосточных регионах Евразии, отдельных странах Ближнего ВТзстока, Северной Америки. Эпизоотология и эпидемиология этой инвазии в значительной степени определяются природными и, реже, ■антропогенными факторами Лукашенко H.H., 19?5; Орлов U.U., Лей-кина Е.С., 1 983; Яроцкий Л.С.. 1 990; Takao ¡-'ujikura, 1991). Возбудителем альвеококкоза человека и промекуточных хозяев является личиночная стадия Сларвоциста) Echinococcus (Alveococcus ) nuiti-locularis. Она локализуется преимущественно в печени, но нередко поравает и другие органы. При запоздалой диагностике болезнь монет перейти в хроническую Форму, трудно поддающуюся не только химиотерапии, но и радикальному хирургическому лечению (Лукашенко Н.П., 1975; Найт Р.. 1985: Цербаков A.M., 1986. 1990: Астафьев Б.А.. 198?; -ficha P.N.. Szyfres В., 1987; Lightoulers M.H. et al., 1993 ).

При разработке эффективных мер борьбы с эхинококкозами большое внимание уделяется усовершенствованию существующих и изысканию новых методов диагностики, терапии и профилактики инвазии, а такхе комплексному решении общебиологических, медицинских, ветеринарных и социально-экономических проблей (Лейкина Е.С., 1985, 1987; Яроцкий Л.С.. 1990: Наслов С.С., Никифорова Т.В.. 1990; Sögel Konrad et al., 1992; Batte Ii G., Martini Marco, 1992: Гельдыев fi.Г.. 1993).

В диагностике этих гельминтозов значительную, а иногда и решающую роль играют серологические методы исследования. Одним из главных препятствий в создании устойчивой высокочувствительной тест-системы для определения многокамерного эхинококкоза является слоиность антигенного состава паразита, которая 'приводит к перекрестным реакциям и лонноположительным результатам. Поэтому дальнейшее совершенствовав методов .очистки антигенов альве-

ококка и испытание их при конструировании тест-системы для выявления специфических антител в сыворотках крови зараженных животных является одним из этапов на пути к решению вопроса ранней диагностики этого гельминтоза.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: изучение диагностических свойств антигенных комплексов ларвоцист альвеококка и оценка в эксперименте полученных активных препаратов в микрогранулированной полиакриламид-ной тест-системе с магнитными сорбентами для обнаружения специфических антител.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ: - определение локализации антигенных комплексов в ларвоцистах альвеококка методом РИФ;

- выделение и очистка антигенов альвеококка с использованием методов ультрафильтрации на мембранных фильтрах, колоночной и аффинной хроматографии;

- получение антивидовых (крысы) иммунных сывороток к антигенам альвеококка и выделение из них иммуноглобулинов;

- иммунохимическая характеристика полученных препаратов;

- приготовление микрогранулированных магнитных сорбентов с иммобилизованными антигенами альвеококка;

- разработка тест-системы для обнаружения антител к альвео-кокку в сыворотках зараженных животных с помощью непрямого имму-нофлюоресцентного метода.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА: - определены содержание и локализация паразитарных антигенных комплексов в ларвоцистах альвеококка имму-нофлюоресцентным методом;

- рекомендованы методические приемы и предложена схема получения очищенных специфических антигенов при помощи ультрафильтрации на мембранных фильтрах и аффинной хроматографии;

- впервые использованы микрогранулированные магнитные сорбенты в качестве твердофазного носителя антигенных комплексов альвеококка в диагностической тест-системе;

- сконструирована высокочувствительная тест-система и разработан вариант метода непрямой реакции иммунофлюоресценции с гранулированными антигенными магнитными сорбентами для обнаружения антител в сыворотке крови зараженных альвеококкоэом животных.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

1. По материалам диссертационной работы составлены методические рекомендации, утвержденные директором Волгоградского на-

учно-исследовательского противочумного института, протокол N 3 Ученого совета от 17.03.93 г.: "Получение антигенов альвеококка и их иммунохимическая характеристика" и "Оценка диагностических свойств антигенов Alveococcus multilocularis , иммобилизованных в гранулированные магнитные сорбенты".

2. Полученные в результате исследования материалы используются при проведении иммунологических изысканий в научных лабораториях и при чтении курса лекций в Волгоградской медицинской академии на кафедрах медицинской биологии и генетики по разделу "Биологические основы паразитизма", инфекционных болезней и эпидемиологии в цикле "Паразитарные болезни" (Акты об использовании материалов диссертации от 26.01.95 г.).

3. Сконструированная тест-система рекомендована в практику отделением паразитологии Областного центра государственного санитарного эпидемиологического надзора Волгоградской области как способ определения антител при эхинококкозах (Акт о внедрении от 12.07.95 г.).

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

- паразитарные антигенные компоненты в ларвоцистах альвео-кокка распределены неравномерно;

- антигенные комплексы, выделенные из водно-солевых экстрактов зрелых ларвоцист и отдельно из протосколексов, различаются по физико-химическим и иммунохимическим свойствам;

- иммобилизация антигенов альвеококка на магнитных сорбентах, полученных на основе полиакриламидного геля, позволяет сконструировать тест-систему для определения специфических антител в сыворотках зараженных альвеококкозом животных;

- разработанная на основе антигенных магнитных сорбентов тест-система с высокоактивной, специфической фракцией пригодна для диагностики альвеококкоза в непрямой реакции иммунофлюорес-ценции.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

- Всесоюзном Координационном совещании по проблеме эхинококковое в г. Тбилиси, 1987 г.;

- конференциях молодых ученых Волгоградской медицинской академии в 1988 - 1994 гг.;

- ежегодных научных сессиях преподавателей Волгоградской

медицинской академии в 1989 - 1994 гг.

ПУБЛИКАЦИИ. Основные положения диссертационной работы опубликованы в 9 научных работах.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов и заключения, выводов. Список литературы включает 198 источников, в том числе 106 зарубежных. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 16 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ I. Материалы и методы

Опыты проведены на 200 крысах линии Вистар и 100 мышах линии BALB/c,интактных и экспериментально зараженных альвеококко-зом путем внутрибрюшинного введения протосколексов и ацефалоцист паразита по методу Ф.П.Коваленко с соавт. (1979). Для получения иммунных сывороток использованы 16 кроликов породы "Шиншила".

Локализацию паразитарного антигена в тканях ларвоцист аль-веококка определяли при помощи реакции непрямой иммунофлюорес-ценции на гистологических срезах.

Исходным материалом для экспериментов послужили антигены альвеококка в виде водно-солевых экстрактов зрелых ларвоцист и протосколексов отдельно. С целью выделения высокомолекулярных компонентов водно-солевых экстрактов проводили последовательное фракционирование последних методом ступенчатой ультрафильтрации на мембранах Диафло марок ХМ-300, ХМ-100, ХМ-50, РМ-30, ИМ-10, ИМ-0,5 в ячейках фирмы Амикон (США). Последующую очистку полученных из двух вариантов водно-солевых экстрактов фракций ХМ-300, ХМ-100 и ХМ-50 осуществляли с помощью гель-хроматографии на колонке, заполненной сефарозой 6В. Фракцию ХМ-300(2) из водно-солевого экстракта протосколексов подвергали иммуносорбции с использованием в качестве аффинного лиганда антисыворотки против сывороточных иммуноглобулинов интактных крыс. Иммуноглобулины выделяли путем двукратного осаждения их 20%-ным расгвором полиэ-тиленгликоля с м.м. 6000 а.е.м.

Все выделенные антигенные комплексы изучали по единой схеме. Содержание белка определяли по методу Лоури (1951). Видоспе-цифические и перекрестно-реагирующие антигенные компоненты выяв-

ляли в реакциях иммуноэлектрофореза (РИЭФ) и иммунодиффузии (РИД). РИЗЕ проводили по Р.Grabar, С.В.Williams (1953) в модификации Г.А.Абелева и В.С.Цветкова (1960). РИД осуществляли по методу О.Ухтерлони (Фримель Г., 1987). Для проведения этих реакций использовали гипериммунные кроличьи сыворотки против цельного водно-солевого экстракта протосколексов альвеококка, его фракций ХМ-300 (2) и ХМ-50 (2), сывороточных иммуноглобулинов интактных крыс и белков печени хозяина. Первые 4 антисыворотки получали после внутривенного введения препаратов кроликам по схеме K.Blau et al. (1965), описанной Т.Девени и Я.Геррей (1976). Иммунизацию животных печеночным порошком крыс вели методом подкожных инъекций препарата с неполным адъювантом Фрейнда "Дифко" (США) в соотношении 1:1. Препарат вводили в 10 точек вдоль позвоночника один раз в неделю. Срок иммунизации составил 4 недели.

Антигенную активность препаратов определяли с помощью реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА) по общепринятой методике (Никитин В.М., 1977) с использованием иммунной сыворотки против водно-солевого экстракта протосколексов альвеококка и коммерческой эхинококковой агглютинирующей сыворотки в дозе 4 ГЕ. В качестве индикаторных частиц взят коммерческий набор сухого эхинококкового эритроцитарного диагностикума для непрямой реакции гемагглютинации производства Ставропольского НПО "Аллерген".

При конструировании гранулированной тест-системы для диагностики альвеококкоза использовали водно-солевой экстракт протосколексов, цельную фракцию ХМ-300 (2) и фракцию А, выделенную путем аффинной хроматографии. В качестве твердофазного носителя антигенов впервые при эхинококкозах применили магнитные сорбенты на основе полиакриламидного геля. Иммобилизацию антигенов на них осуществляли двумя путями: 1) механическим включением лиганда в решетку полимерного носителя в процессе его полимеризации с сохранением рецепторной функции по методу В.Г.Пушкаря с соавт. (1986); 2) коваленгной "сшивкой" различных антигенов ларвальной стадии альвеококка на поверхности гранул с помощью глютаральде-гидного метода активации магногелей (метод, реком. ВНИПЧИ, 1984).Работу тест-системы анализировали в непрямой реакции имму-нофлюоресценции (РИФ), количественный вариант которой включал иммобилизацию антигенных комплексов в гранулы MC, инкубирование

их с антителами, последующую обработку препаратов коммерческой люминесцирующей кроличьей сывороткой против иммуноглобулинов крыс и учет полученных результатов. Сыворотки зараженных альвео-коккозом крыс испытывали на 45-е и 190-е сут после инвазии.

Для статистическойобработки результатов по соответствующим формулам определяли среднюю арифметическую, стандартную оценку средней арифметической , стандартное отклонение. При установлении достоверности использовали критерий Стъюдента (Лакин Г.Ф., 1990).

2. Результаты исследований и их обсуждение

В первой серии экспериментов изучали локализацию паразитарных антигенов в ларвоцистах альвеококка на гистологических срезах в реакции иммунофлюоресценции. Результаты исследований показали, что сыворотки интакгных мышей вызывали слабое неспецифическое свечение в пределах 15±0,7 отн.ед. По окраске оно было серо-зеленого цвета и охватывало площадь всего среза. Иную картину наблюдали в опытах с референс-сыворотками. Установлено, что специфические паразитарные антигенные комплексы сосредоточены в герминативной (зародышевой) оболочке ларвоцист, особенно во внутренней выводковой зоне. Паразитарные антигены кутикулярной оболочки содержали белково-полисахаридные компоненты хозяина, что проявлялось в неспецифическом оранжевом свечении ее отдельных слоев. Показатель средней интенсивности свечения с рефе-ренс-сыворотками, взятыми в разведении 1:20, достигал на герминативной оболочке 98,б±0,7 отн.ед., тогда как в области кутикулярной оболочки - 49,2±1,4 отн.ед. Дальнейшее разведение сывороток приводило к плавному снижению интенсивности специфического свечения.

Результаты экспериментов показали неравномерное распределение антигенных компонентов в ларвоцистах альвеококка с преобладающей локализацией паразитарного антигенного комплекса в герминативной оболочке и на протосколексах. Поэтому в качестве источника выделения антигенов для сравнения были взяты два варианта водно-солевых экстрактов ларвальной стадии альвеококка: первый -из цельных, покрытых кутикулярной оболочкой ларвоцист, а второй - из протосколексов.

В ходе проведения мембранной ультрафильтрации водно-солевых экстрактов получили ряд фракций, отличающихся по молекулярной

массе и содержанию белковых компонентов. Сравнительное изучение концентрации белка в двух водно-солевых экстрактах и их фракциях выявило в них определенные различия. Так фракция ХМ-300 (1) по атому показателю на 13,4% превышала таковую из протосколексов (43,3 и 29,9% соответственно). Аналогичную картину, отличие почти на 50%, наблюдали по фракциям ХМ-100 (1) и ХМ-100 (2). Повышенное содержание белка в высокомолекулярных фракциях из водно-солевого экстракта цельных ларвоцист можно объяснить большим присутствием компонентов хозяина в них по сравнению с аналогичными препаратами из протосколексов, что в дальнейшем было подтверждено в РИД и РИМ.

Последующая очистка антигенов с помощью гель-хроматографии на сефарозе 6В показала, что профиль элюции фракции ХМ-300 (1) включал три, а ХМ-300 (2) - четыре пика. Анализ полученных хро-матограмм свидетельствует о том, что 2-я и 3-я подфракции ХМ-300 (2) элюировались в объеме приблизительно одинаковом с таковым у 2-й подфракции ХМ-300 (1). В связи с этим можно предположить, что вышеуказанные подфракции содержали в своем составе аналогичные антигенные компоненты, фракционирование препаратов ХМ-100 и ХМ-50 из обоих вариантов водно-солевых экстрактов показало, что их профили элюции состояли из 4-х пиков, а преимущественное количество белка находилось в 3-х и 4-х подфракциях ( от 52,9 до 77,2%).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что выделенные фракции антигенов альвеококка неоднородны по молекулярной массе составляющих их компонентов и распределению белка в подфракциях. Установлено, что методами мембранной ультрафильтрации и гель-хроматографии не удалось получить специфические паразитарные антигены, свободные от компонентов хозяина. Кроме того, диагностически ценные подфракции антигенов отличались относительно невысоким содержанием белка,и для их накопления требовалось большое количество исходного антигенного материала. В связи с этим про-Еели аффинную хроматографию фракции ХМ-300 (2), как наиболее перспективного антигенного комплекса, выделенного из водно-солевого экстракта протосколексов альвеококка . В результате иммуно-сорбции был получен антигенный комплекс(фракция А), значительно очищенный от компонентов хозяина.

Всем антигенам, выделенным методами мембранной ультрафиль-

трации, гель-хроматографии и иммуносорбции была дана иммунохими-ческая характеристика. Сравнительное изучение в РИД антигенных комплексов, полученных из двух вариантов водно-солевых экстрактов выявило в них определенные различия (табл.1).

Как видно из таблицы N 1,у фракции ХМ-300 (1) обнаружено по 5 иммунных комплексов с антисыворотками против сывороточных иммуноглобулинов хозяина, водно-солевого экстракта протосколексов, фракции ХМ-300 (2) и два комплекса антиген-антитело с таковой

Таблица 1

Иммунохимическая характеристика антигенов ларвальной стадии альвеококка в РИД с кроличьими антисыворотками

1 1 |Число дискретных полос преципитации, 1 прояв-|

|ленных кроличь ими антисыворотками против|

I Наименование 1 | сыворо- водно-

| точных солевого

| иммуно- экстрак- фракции фракции печени |

I фракции I глобули- та про- ХМ-300 ХМ-50 интакт-|

| нов ин- тоско- (2) (2) ных |

| тактных лексов крыс |

| крыс

I ХМ-300 (1) 1 5 5 5 2 I

I ХМ-300 (2) 1 з 4 4 2 I

| ХМ-100 (1) 1 2 4 3 2 I

| ХМ-100 (2) 1 2 2 2 2 1

1 ХМ-50 (1) 1 з 2 3 1 1 1

| ХМ-50 (2) 1 2 2 1 1 1 1

I РМ-30 (1) 1 2 2 3 - 1 1

| РМ-30 (2) 1 1 1 1 - 1 1

I ИМ-10 (1) | 1 1 1 |

1 ИМ-10 (2) | 1 - 1 1

| ИМ-0,5 (1) 1 1 1 1 - • |

| ИМ-0,5 (2) ) 1 - - - |

I Фракция А 1 1 1 1 3 . 2 1

против печени ингактных крыс. Характер расположения полос преципитации указывая на наличие трех общих антигенов, обнаруженных всеми антисыворотками, тогда как у фракции ХМ-300 (2) - всего один. Такая же тенденция прослеживалась и у препаратов с м.м. 100 ООО а.е.м. и ниже - белки хозяина преобладали в препаратах из водно-солевого экстракта ларвоцист. Конструирование тест-системы с подобными антигенными комплексами, на наш езгляд,нецелесообразно, т.к. приводило бы к многочисленным перекрестным реакциям и резкому снижению специфичности серологической реакции. Некоторое исключение может составить лишь фракция ХМ-300 (2), содержавшая в своем составе меньше хозяинных белков. Подфракции антигенных комплексов, полученные с помощью метода гель-фильтрации , свидетельствовали о неравномерности распределения е них антигенных компонентов и различии их серологической активности в РИД. Из первых подфракции, выделенных как из ХМ-300 (1), так и ХМ-300 (2), большую активность проявил препарат из протосколек-сов. Более четкую картину дали вторые подфракции. В них обнаружено по одному общему антигенному комплексу, а остальные полосы преципитации, располагаясь дискретно, представляли от двух до четырех активных серологических зон. Лишь в третьей подфракции ХМ-300 (2) не обнаружено положительной реакции с антисывороткой • против печени крыс.

Исследование в РИД подфракции с м.м. 100 000 а.е.м. показало присутствие в них антигенов, выявленных антисыворотками против сывороточных иммуноглобулинов хозяина, водно-солевого экстракта протосколексов, фракции ХМ-300 (2). Однако серологическая активность этих препаратов оказалась невысокой.

При изучении в РИД фракции А установлено наличие одной зоны преципитации с антисывороткой против сывороточных иммуноглобулинов хозяина, трех зон - с антисывороткой против водно-солевого экстракта протосколексов и двух -. с таковой против фракции ХМ-300 (2). Характер расположения полос преципитации, образованных с каждой из антисывороток и находящихся ближе к лункам последних, свидетельствовал о некотором сходстве содержащихся в них компонентов. Полностью этот препарат освободить от белков хозяина не удалось, но содержание их во фракции А было значительно ниже по сравнению с исходной фракцией ХМ-300 (2).

Результаты иммунохимических исследований, полученные в РИЭЗ>, в значительной степени подтвердили данные по РИД. Так, во фракциях ХМ-300 (1) и ХМ-300 (2) выявлено наибольшее число полос преципитации. Особенно выделялась зона сывороточных иммуноглобулинов, включающая у фракции ХМ-300 (1) восемь, а у ХМ-300 (2) шесть полос преципитации. Эти данные свидетельствуют об активном участии сывороточных белков крови хозяина в формировании паразитарной опухоли. Динамика распределения серологической активности в РИЭФ по подфракциям ХМ-300, ХМ-100 и ХМ-50 сохранялась в том же виде, что и в РИД. Во фракции А,по данным РИЭФ,обнаружено заметное снижение числа полос преципитации по сравнению с исходным препаратом ХМ-300(2) особенно в зоне сывороточных иммуноглобулинов. В три раза меньше комплексов антиген-антитело образовалось и с антисывороткой против водно-солевого экстракта протосколек-сов. В то же время с таковой против фракции ХМ-300 (2) эти показатели были близки как с исходным препаратом ХМ-ЗОО (2), так и с ХМ-300 (1).

Известно, что среди основных антигенов паразита, обладающих диагностической ценностью, выделяют как термолабильный, гак и термостабильный, обозначаемые 5-м и 4-м компонентами (Varela-Diaz V.M.,et al., 1977; Davles C., et al., 1978; Thompson R.C.A., 1985). Оценка результатов РИД по выявлению термостабильных компонентов позволила установить присутствие последних во всех выделенных нами антигенных комплексах с м.м. выше 30 ООО а.е.м. В большинстве случаев они включали в свой состав антигенные структуры как паразита, так и хозяина, и обладали более слабой серологической активностью по сравнению с термолабильными компонентами. Обращает на себя внимание тот факт, что фракция А образовала по одной полосе преципитации только с антисыворотками против водно-солевого экстракта протосколексов и фракции ХМ-300 (2). В связи с этим можно предположить, что термостабильные kom-i поненты этого антигенного комплекса имеют паразитарное происхождение.

Иммунохимический анализ антигенных комплексов включал и определение их антигенной активности в РТПГА. Результаты проведенных экспериментов свидетельствовали о том, что фракции, для которых исходным материалом служил водно-солевой экстракт протосколексов альвеококка, обладали более еысокой активностью в РТПГ/

по сравнению с аналогичными препаратами из водно-солевого экстракта зрелых ларвоцист. Сходную картину наблюдали и в подфрак-циях, полученных методом гель-хроматографии на сефарозе 6В. Высокую антигенную активность проявила фракция А. Этот препарат оказался в 100 раз активнее исходного водно-солевого экстракта протосколексов и в 16 раз - цельной фракции ХМ-300 (2). Препара- ■ ты с м.м. 30 ООО а.е.м. и ниже обладали слабой антигенной активностью в РТПГА.

Таким образом иммунохимическая характеристика выделенных антигенных комплексов ларвапьной стадии альвеококка выявила неоднородность их состава, различную серологическую ( в РИД и РИМ» и антигенную ( в РТПГА ) активность как цельных фракций, так и составляющих их подфракций. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования для диагностики альвеококкоза антигенов из водно-солевого экстракта протосколексов, по сравнению с таковыми из зрелых ларвоцист. Комплексный подход к ис -ледованию антигенов позволил отобрать для конструирования тест-системы из анализируемых препаратов наиболее очищенную от компонентов хозяина и активную фракцию А, а для сравнения с ней взять цельную фракцию ХМ-300 (2).

Современная практика обнаружения антител при эхинококкозах располагает в нашей стране различными официально регламентированными серологическими методами, в том числе с применением сорбентов (Кузьмин Ю.А., Каральник Б.В., 1984; Зорихина В.И..Баллад Н.Е., 1990; Подопригора Г.И., Полетаева О.Г., 1993 и др.).

Нами предпринята попытка использования магнитных сорбентов (МС), приготовленных на основе полиакриламидного геля и применяемых в микробиологических исследованиях, при конструировании тест-системы для определения специфических антител при альвео-коккозе в сыворотках крови зараженных животных.

Возможность механического включения антигенов альвеококка в гранулы МС изучали на примере цельного водно-солевого экстракта протосколексов. В результате проведенных с 4-мя сериями МС экспериментов установлено, что указанный антигенный комплекс прочно иммобилизуется в решетку полимерного носителя с магнитным материалом. Магнитные гранулы, используемые.в работе,имели хорошую тодвижность в поле небольших постоянных магнитов. Показатели интенсивности люминесцентного свечения гранул МС плавно снижались

в зависимости от возрастания степени разведения испытуемых сывороток крови и достоверно отличались от контролен с сьшоротками крови интактных крыс.

В контрольных опытах с применением физиологического раствора свечения гранул МС не выявлено. Аналогичную картину наблюдали с гранулами МС без включения в них антигена при использовании как цельных, так и в разведениях до 1:200 сывороток крови зараженных альвеококкоаом и интактных животных.

Таблица 2

Показатели интенсивности свечения гранул магнитных сорбентов с включенной фракцией ХМ-300(2) в зависимости от разведения сывороток крови крыс, полученных на 45-е и 190-е сут. после заражения

1 |Разведение Серия Показатели интенсивности гранул МС в отн. ед. 1 свечения|

| сывороток 45-е сут 190-е сут

| Нагивные 0 К 52,6±2,8 37,0+2,3 1=3,7 Р<0,01 48,3+2,7 33,0±2,2 Ы Р<0 5 I 0011

| 1:10 0 к 42,7±2,5 37,0+2,2 1=3,2 Р<0,01 38,7±2,4 28,0±2,0 Р<0 3 1 01 |

I 1:100 0 к 29,7+2,1 20,6+1,7 1=3,4 Р<0,01 24,2±1,9 14,7+1,5 Ь=4, Р<0, 0 1 01 |

I 1:200 0 к 18,8+1,7 11.8+1,3 1=3,3 Р<6,01 14,9±1,6 8,3+1,2 й=3 Р<0 з I 01 1

| 1:1000 0 к 9,3±1,2 6,7+1,0 1=1,7 Р>0,05 6,2±1,1 4,0+0,9 1=1 Р>0 5 I 05 | |

Следующую серию экспериментов по конструированию тест-системы и оценке ее в РИФ проводили с фракциями А и ХМ-300 (2), а в качество референс-сывороток выбрали сыворотки зараженных аль-веококкозом крыс, полученные на 45-е и 190-е сут после инвазии. В РИФ гранул МС с включенной фракцией ХМ-300 (2) при использовании нативных сывороток, полученных на 45-е сут после заражения, уровень свечения составил 52,6+2,8 отн.ед. (табл.2). Разведение испытуемых сывороток от 1:10 до 1:200 снижало этот показатель с 42,7+2,5 до 18,8+1,7 отн.ед., причем различие между

Таблица 3

Показатели интенсивности свечения гранул магнитных сорбентов с включенной фракцией А в зависимости от разведения сывороток крови крыс, полученных на 45-е и 190-е сут. после заражения

1 |Разведение Серия 1 Показатели интенсивности свечения| гранул МС в отн. ед. |

| сывороток 45-е сут. 190-е сут. |

| Нативные 0 К 70,4+2,7 29,5+1,7 1=12,8 Р<0,001 6б,4±2,6 28,6+1,7 1=12,2 | Р<0,001|

| 1:10 0 К 58,5+2,4 25,1±1,6 1=11,5 Р<0,001 52,8+2,3 23,7±1,6 1=10,4 | Р<0,001|

| 1:100 0 К 43,3+2,1 18,2±1,4 1=10,0 Р<0,001 38,5±2,0 17,4±1,3 1=8,8 | Р<0,001|

| 1:200 0 К 31,5±1,8 12,8+1,1 1=8,9 Р<0,001 27,7±1,7 11,5+1,1 1=8,1 | Р<0,001|

| 1:1000 I > 0 К 13,1+1,1 5,0+0,7 1=6,2 Р<0,001 12,3+1,1 4,5+0,7 1=6,0 | Р<0,001| |

опытом и контролем было достоверным. Сыворотки в титре 1:1000 вызывали слабое свечение гранул МО, достоверной разницы между опытом и контролем в этом случае не наблюдали. В экспериментах с использованием сывороток крови зараженных крыс, полученных на 190-е сут после инвазии, наблюдали аналогичную картину уровня интенсивности свечения. В серии опытов с использованием гранул МС с включенной в них фракцией А и сывороток крови интактных и зараженных крыс, полученных на 45-е и 190-е сут после инвазии (табл.3) установлено, что самый высокий уровень интенсивности с-Еечения гранул МС наблюдается при инкубации их с нативными ре-ференс-сыЕоротками, полученными на оба выбранных срока после заражения (70,4+2,7 и 66,4+2,6 отн. ед. соответственно). Дальнейшее титрование сывороток приводило к постепенному снижению интенсивности свечения гранул МС, причем достоверное отличие результатов между опытом и контролем наблюдали во всех разведениях.

Сравнительный анализ экспериментальных данных показал, что на уровень интенсивности свечения гранул МС с включенными фракциями А и ХМ-300 (2) выбранные сроки получения сывороток кроеи зараженных животных не влияли.

Сопоставление между собой уровней интенсивности свечения гранул МС с включенными в них механическим путем фракциями А и ХМ-300 (2) обнаружило, что при всех разведениях испытуемых сывороток на обоих сроках их получения различия показателей РИФ были достоверными. Факт повышенной чувствительности тест-системы с фракцией А еще раз свидетельствует в пользу максимальной очистки этого антигенного комплекса от компонентов хозяина. Достоинством указанной тест-системы является ее работоспособность с рефе-ренс-сыворотками, взятыми на 45-е сут после инвазии в больших разведениях (1:1000), что в свою очередь открывает перспективу разработки диагностики заболевания на ранних сроках развития альвеококкоза.

При изучении возможности использования ковалентной "пришивки" к гранулам МС как водно-солевого экстракта протосколексов, так и выделенных из него антигенных комплексов выявлено, что интенсивность свечения гранул МС во всех случаях была слабой даже при применении нативных референс-сывороток, причем флюоресциро-

вали лишь отдельные микроучастки гранул. Достоверной разницы результатов между опытом и контролем не обнаружено ни с одним антигеном. В связи с этим ковалентную "пришивку" антигенов к гранулам МС в дальнейших экспериментах не применяли.

Резюмируя изложенное выше, можно сделать следующее заключение: проведенное комплексное исследование способствовало углубленному пониманию сложности состава антигенных комплексов лар-вальной стадии развития многокамерного эхинококка, формирующихся в процессе паразито-хозяинных отношений. Оно позволило выяснить локализацию паразитарных антигенов в пределах ларвоцист, провести сравнительное изучение иммунохимических свойств выделенных фракций с последующим отбором наиболее активных из них для разработки более эффективных методов определения болезни. Конструирование диагностической тест-системы на микрогранулиро-ванных магнитных сорбентах с высокоочюценной активной фракцией А открывает новые перспективы в решении проблемы ранней диагностики эхинококкозов.

ВЫВОДЫ

1. На гистологических срезах ларвоцист альвеококка с помощью непрямой реакции иммунофлюоресценции установлено неравномерное распределение антигенных комплексов в пределах цисты. Основная масса паразитарных антигенов локализована в герминативной оболочке - преимущественно в ее внутренней выводковой зоне и на протосколексах.

2. Антигенные комплексы протосколексов и ларвоцист различаются как по составу, так и по антигенной активности. Препараты из зародышевых сколексов, содержащие преимущественное количество специфических белков и в меньшей степени связанные с компонентами хозяина, обладают большей диагностической ценностью.

3. В составе высокомолекулярных антигенных комплексов (выше 100000 а.е.м.), полученных методами мембранной ультрафильтрации и гель-хроматографии на сефарозе 6В при иммунохимическом анализе в РИД и РИЭЕ, обнаружено присутствие серологически активных как паразитарных, так и хозяинных компонентов.

4. Из двух способов очистки антигенных комплексов от балластных веществ наибольший эффект получен при комбинации мембранной ультрафильграции и аффинной хроматографии. Метод гель-фильтрации на сефарозе 6В не позволил отделить сложные па-

разито-хозяинные комплексы друг от друга.

5. Из антигенных комплексов протосколексов путем мембранной ультрафильтрации и аффинной хроматографии получен высокоактивный и специфичный препарат - фракция А, объединяющая термолабильные и термостабильные диагностически ценные компоненты, характеризующаяся низким содержанием белков хозяина, и которая может быть использована для конструирования диагностической тест-системы.

6. Определен способ иммобилизации антигенных комплексов ларвальной стадии альвеококка в гранулы магнитных сорбентов на основе полиакриламидного геля путем механического их включения в решетку полимерного носителя.

7. Разработанная на основе магнитных сорбентов тест-система с высокочувствительной фракцией А пригодна для ранней диагностики альвеококкоза (на 45-е сут после заражения) в реакции им-мунофлюоресценции и может быть использована в экспериментальной паразитологии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Ярулин Г. Р., ...........щи Ф. К., Медпедкнна Г. Л. Локалижщня

альвеококкового антигена в органах П|юмсжутчного хозяина // Проблема пхипококкозов к СССР. — Тбилиси, 1!)87. — С. (.11—1Ш

2. Медведкшт Г. Л. Иммунохнмичеекая характеристика аитнгепов ларвальной стадии альвеококка фракционированных но молекулярном массе // Актуальные проблемы науки и практики: Теп. докл. XI коиф. молод, ученых. — Волтград, МНЮ. — С. 50.

3. Медведкииа I'. Л. Иммобилизация антигенов ларвоцнет альвеококка на магнитные сорбенты и оценю их работы в реакции иммунофлюо^еценцпн /'/ Актуальные .проблемы медицины и практики: 'IV;!. докл. XII конф. молод, ученых.— Волгоград, 1992. — С. 42.

4. Лдслышша Г. Л., Климова П. М. Выделение штГгенных комплексов лавральной стадии альвеококка и их иммунохимическая характеристика в 1П1ЭФ М., 19!)Л. Дем. в ВИНИТИ lti.0G.93, ФИ 1053—1393.

5. Лдслышша Г. А., Климова И. М., Тихонов II. Г. Оценка в РИФ магшгшмх сорбентов с иммобилизованным антигеном ларвоцист альвеокок-ка М., IПОЗ. Дон. в ВИНИТИ 10.06.03, ФН 1054—ВЯЗ.

0. Адельшина Г. Д. Характеристика антигенных комплексов ларвальной стадии альвеококка к РДДГ // Актуальные вопросы теоретической ;>кспе-римеиталыюй и клинической медицины: Тех доил. XIII кон(|). молод, ученых. — Волгоград. НШЗ. — С. 23.

7. Аделышша Г. А. Оценки диагностических свойств антигенных комплексов ларвалыюй стадии альвпокпкш // Актуальные проблемы медицинской и ветеринарной паразитологии: Те:), докл. междунар. науч. копф. — Витебск, 1Я93. — С. 23.

8. Фролов В. II. , Адельишна Г. А. Выявление термостабильных компонентов в антигенах ларналмтм стадии альвеококка, фракционированных но молекулярной массе /'/ Актуальные вопроси 'п-оретической .'жеперпмента.п,-11011 и клинической медицины: Те:!, докл. XIII конф. молод, ученых. — Волгоград, 1993. — С.108.

!3. Аделышша Г. А. Нммупоэлектрофоретичсскан характеристика иод-фракций антигенов лариалытй стадии ¡ии.веококка //Актуальные вопросы медицины: Тез. докл. 49-и науч. сессии. — Волгоград, НИМ. — (',. 10(5.