Автореферат и диссертация по медицине (14.01.08) на тему:Оценка биоценоза кишечника у новорожденных с помощью классических и молекулярно-генетических методов исследования

На правах рукописи

005534508

ГОЛУБЦОВА ЮЛИЯ МАРКОВНА

Оценка биоценоза кишечника у новорожденных с помощью классических и молекулярно-генетических методов исследования

14.01.08 - Педиатрия 03.02.03 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

10 0КТ 2013

Москва - 2013

005534508

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор,

заслуженный врач РФ

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой неонатологии ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России

доктор медицинских наук, профессор, заслуженный врач РФ, главный научный сотрудник научно-консультативного отдела ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева

Володин Николай Николаевич Кафарская Людмила Ивановна

Ефимов Михаил Сергеевич

Финогенова Наталья Анатольевна

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр здоровья детей» Российской академии медицинских наук.

Защита диссертации состоится « »_2013 года в_часов на заседании

диссертационного совета Д 208.050.01 при ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева» Минздрава России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Саморы Машела, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Федерального научно-клинического центра детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева» по адресу: 117997, г. Москва, ул. Саморы Машела, д. 1.

Автореферат разослан «_»_2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Чернов Вениамин Михайлович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Микрофлора желудочно-кишечного тракта играет чрезвычайно важную роль в поддержании здоровья ребенка. Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) является средой обитания для многочисленного и разнообразного сообщества микроорганизмов. Количество бактерий только в одном грамме содержимого толстой кишки достигает 1012 микробных клеток. Важно отметить, что даже незначительные изменения микробиоценоза кишечника у детей раннего возраста, особенно в период новорожденное™, могут явиться причиной патологического процесса. (Кафарская Л.И., Ефимов Б.А., Постникова Е.А., Донских Е.Е., Детские инфекции 2006, 1: 6-11.; Lindberg Е., Nowrouzian F., Adlerberth I., Wold A.E., Pediatric, research. 2000,48: 741-747).

Исследования последнего времени показывают, что, колонизируя кишечник, аутохтонные бактерии участвуют в метаболизме сложных полисахаридов, модулируют местный иммунный ответ и препятствуют заселению кишечника патогенными микроорганизмами, что особенно важно на первом месяце жизни ребенка.

До недавнего времени современные представления о качественном и количественном составе микрофлоры, особенностях формирования биоценоза кишечника в неонатальном периоде основывались на использовании исключительно культуральных методов исследования.

Активное внедрение молекулярно-генетических методов в практику микробиологических исследований позволило получить новую информацию о составе и свойствах микроорганизмов, колонизирующих различные анатомические области тела человека (Eckburg P.B. и соавт., 2005, Tringe S.G. и соавт., 2008, Woo P.C. и соавт., 2008, Karlsson F.H. и соавт., 2011). Так, в последние годы была разработана целая палитра методов, основанных на сравнительном анализе видоспецифических нуклеотидных последовательностей геномной ДНК бактерий, позволяющих быстро и достоверно определять таксономическую принадлежность выделяемых микроорганизмов (Olsen G.J. и соавт., 1993, Stubbs S.L. и соавт., 2000, Deng W. и соавт., 2007).

Преобладающие в количественном отношении в этой экосистеме бактерии принадлежат к порядкам Bacteroidales (тип Bacteroidetes, класс Bacteroidia), Clostridials (тип Firmicutes, класс Clostridia) и Bißdobacteriales (тип Acünobacteria, класс Acünobacteria) (Hayashi Н. и соавт., 2002, Qin J., 2010).

Однако, несмотря на доминирующее положение, занимаемое бактериями порядка Bißdobacteriales в кишечнике детей раннего возраста, наши представления об их видовом составе остаются ограниченными. Это, в свою очередь, связано с недостаточной информативностью используемых для решения этой задачи конвенциональных микробиологических методов, которые основаны, прежде всего, на изучении относительно небольшого спектра фенотипических свойств бактериальных штаммов, изолируемых из биологического материала.

Бифидобактерии колонизируют желудочно-кишечный тракт, вскоре после рождения ребенка и присутствуют в нем в высоких концентрациях на протяжении всей жизни.

У здоровых грудных детей с 6-7 дня жизни бифидобактерии являются основой микробного пейзажа кишечника (85-98% всей кишечной микрофлоры), и содержание их достигает Ю|0-10п в 1 грамме фекалий (Гончарова Г.И., 1986; Tannock G.W., 1994; Reuter G., 2001; Shanahan F., 2002; Tapianinen T. et al, 2006; Gronlund M.M. et al, 2007).

В этой связи, очевидна актуальность привлечения методов молекулярно-генетической идентификации для выяснения таксономической принадлежности бактерии порядка Bißdobacteriales кишечного происхождения.

Новым направлением в изучении пробиотического эффекта штаммов бифидобактерий является поиск и изучение свойств штаммов, продуцентов конъюгированной линолевой кислоты (KJIK).

КЛК обладает иммуномодулирующим эффектом, является ингибитором остеокластогенеза, обладает выраженным метаболическим потенциалом, влияет на липидный обмен, а также является одним из регуляторов апоптоза и обладает противовоспалительным и антиканцерогенным эффектом.

Таким образом, изучение микробиоценоза у новорожденных детей с использованием культуральных и молекулярно-генетических методов является актуальным, имеющим как научное, так и практическое значение.

Цель исследования: изучение особенностей формирования микрофлоры у детей раннего возраста с использованием классических и молекулярно-генетических методов и способности к продукции КЛК у штаммов бифидобактерий, выделенных из кишечника детей раннего возраста.

Задачи исследования:

1. Изучить особенности формирования микрофлоры у детей первых месяцев жизни с использованием классических бактериологических методов.

2. Подобрать нуклеотидные последовательности праймеров для детекции

4

представителей рода Bifidobacterium, Lactobacillus, Bacteroidales, Clostridium leptum и С. coccoides, Prevotella и Atopobium.

3. Используя молекулярно-генетические методы установить особенности формирования микрофлоры кишечника у детей первых месяцев жизни.

4. Провести сравнительный анализ информативности качественной и количественной детекции возбудителей в содержимом толстой кишки у детей раннего возраста.

5. Выделить и провести видовую идентификацию штаммов бифидобактерий колонизирующих кишечник доношенного новорожденного с помощью молекулярно-генетических методов.

6. Изучить способности выделенных штаммов к продукции КЛК.

Научная новизна

Подобраны нуклеотидные последовательности праймеров для детекции микроорганизмов в ПЦР-РВ, представителей рода Bifidobacterium, Lactobacillus, Bacteroidales, Clostridium leptum и С. coccoides, Prevotella и Atopobium, что дало возможность быстро и эффективно детектировать труднокультивируемые и некльтивируемые группы микроорганизмов у детей раннего возраста.

Впервые проведен сравнительный мониторинг становления микрофлоры толстой кишки у новорожденных с помощью классических и молекулярно-генетических методов, который показал более высокую чувствительность эффективность метода ПЦР-РВ по сравнению с классическим бактериологическим методом

Впервые в ходе выполнения настоящей работы проведен анализ видового состава бифидофлоры с помощью ПЦР-РВ у доношенных новорожденных, выявлены доминирующие виды микроорганизмов порядка Bifidobacteriales у детей разного возраста (3-7 сутки жизни; 12-15 сутки жизни, 30-40 сутки жизни): В. bifidum, В. longum и В. breve.

Впервые выделен штамм бифидобактерий (В. breve), обладающий способностью к изомеризации KJIK осуществляет пробиотический эффект. Практическая значимость

Получены новые данные о доминирующих видах состава бактерий порядка Bifidobacteriales у новорожденных детей при помощи ПЦР в реальном времени (В. bifidum, В. longum и В. breve), что необходимо учитывать при назначении пробиотических препаратов.

Новые пробиотические штаммы бифидобактерий, продуцента КЛК, могут служить в качестве перспективного штамма для создания нового пробиотического препарата.

Положения, выносимые на защиту

1. Микробиоценоз толстой кишки у клинически здоровых детей периода новорожденное™ характеризуется высокой концентрацией и частотой встречаемости, как облигатно анаэробных микроорганизмов, среди которых абсолютно доминирующими являются Bifidobacterium (100%), так и аллохтонных микроорганизмов относящиеся к роду: Klebsiella, Staphylococcus aureus, Clostridium leptum и С. coccoides.

2. Исследование, проведенное с помощью ПЦР-РВ, позволяет с большей эффективностью детектировать микроорганизмы представителей рода Bifidobacterium, Bacteroides, Lactobacillus, а также труднокультивируемые группы С. leptum и С. coccoides, род Prevotella и кластер Atopobium.

3. Получены новые данные о доминирующих видах бактерий порядка Bißdobacteriales у новорожденных детей при помощи ПЦР в реальном времени. Доминирующими видами в микрофлоре кишечника детей первых месяцев жизни, находящихся на естественном вскармливании, являются В. bifidum, В. longum и В. breve.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования включены в материалы лекционного курса и практических занятий для студентов 2-3 курсов лечебного и педиатрического факультетов на кафедре микробиологии и вирусологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России.

Штаммы, выделенные в ходе настоящей работы, используются сотрудниками кафедры микробиологии и вирусологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России для изучения биологических свойств бактерий порядка Bißdobacteriales.

Апробация работы

Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на VII Ежегодном Конгрессе специалистов перинатальной медицины «Современная перинатология: организация, технологии и качество» (Москва, 24-25 сентября 2012 г.), на XI Всемирном конгрессе по перинатальной медицине «Глобальные изменения в заботе о здоровье матери и ребенка: применение на практике достижений доказательной медицины для улучшения качества оказываемой помощи» (Москва, 19-22 июня 2013

6

г.), на VIII Ежегодном Конгрессе специалистов перинатальной медицины «Современная перинатология: организация, технологии, качество» (Москва, 23-24 сентября 2013 г.). Апробация работы проведена на совместной научно-практической конференции кафедры неонатологии ФУВ, кафедры микробиологии и вирусологии ФУВ ГБОУ ВПО РНИМУ Минздрава России (15 ноября 2012 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых научных журналах, 1 руководство для врачей.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 97 страницах машинописного текста, и включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, 4-х глав с изложением результатов собственных наблюдений и их обсуждением, заключение, выводы, практические рекомендации и приложения. Библиография включает 43 источника отечественной, и 148 зарубежной литературы. Работа иллюстрирована 11 таблицами, 23 рисунками и диаграммами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена на кафедре неонатологии ФУВ (заведующая кафедрой -

д.м.н., профессор Дегтярева М.В.) и кафедре микробиологии и вирусологии (заведующая кафедрой - д.м.н., профессор Кафарская Л.И.) ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, на базе лаборатории Лечебно-реабилитационного Центра Росздрава (ведущий научный сотрудник, д.б.н. Г.А. Осипов) за период с сентября 2010 г. по август - 2012 г. Комплексное обследование новорожденных детей проводилось на базе отделения физиологии новорожденных родильных домов г. Москвы (ЦПСиР, роддома №8) и динамическое наблюдение в поликлиниках.

Материалы и методы исследования. В основу данной работы были положены результаты динамического исследования кишечной микрофлоры клинически здоровых 75 новорожденных детей обоего пола в возрасте от 3 до 40 суток жизни, родившихся в срок от здоровых матерей.

Критерии включения в данное исследование явились следующие: гестационный возраст ребенка при рождении более 37 недель; роды физиологические; физиологическое течение периода постнатальной адаптации, отсутствие каких либо нарушений состояния здоровья в течение всего периода наблюдения; введение лекарственных препаратов, в том числе антибиотекотерапии не было и с момента рождения на грудном вскармливании. Критериями исключения явились гестационный возраст ребенка при рождении менее 37 недель, роды путем кесарево

сечения, дети получающие антибиотикотерапию, находившиеся на смешанном или искусственном вскармливании.

Возраст матерей обследуемых детей составил от 23 до 41 года (средний возраст матерей составил 30,8±5,9).

Акушерско-гинекологический анамнез (воспалительные заболевания репродуктивных органов, бесплодие, генитальные инфекции, медицинские аборты и самопроизвольные выкидыши в анамнезе, гормональные нарушения) был отягощен в 2,7% случаев.

Соматический анамнез (хронический пиелонефрит или цистит, хронический тонзиллит, варикозная болезнь, вегето-сосудистая дистония, гипертоническая болезнь, сахарный диабет и др.) — в 2,7% случаев.

Данная беременность I (64%), повторная (36%).

Многоплодная беременность наблюдалась в 2 (2,6)% случаев. Беременность наступила в результате экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) у (6,7%) женщин.

Течение было патологичным в 3% случаев. Угроза прерывания была отмечена у 3% женщин. Хорионамнионит был диагностирован у одной женщины (1,3%). Во время беременности перенесенные ОРВИ отмечены у 16% женщин.

Роды физиологические у 100% женщин. Безводный период у одной пациентки составил 8 часов (1,3%), у остальных не превышал 4 часов.

По массе тела и ГВ дети распределились следующим образом: 40 (53%) детей имели ГВ 37-38 недель и массу тела от 3400 до 3800 г.; 35 (47%) детей имели ГВ 39-41 недель и массу тела от 3820 до 4050 г., длина от 52 до 54 см. Мальчиков было 42, девочек — 33, детей от многоплодной беременности - 2.

Было обследовано всего 75 детей в трех возрастных периодах: 3-7, 12-15 и 3040 сутки жизни.

Состояние при рождении удовлетворительное у всех новорожденных (100%). Оценка по шкале Апгар на 8/9 баллов.

Синдром повышенной нервно-рефлекторной возбудимости в виде легкого тремора, повышения мышечного тонуса в конечностях отмечался у 5 новорожденных (6,7%). Неонатальные судороги не были диагностированы ни в одном случае.

Конъюгационная желтуха 1-Й степени отмечалась у 13% с максимальной интенсивностью на 3-4 сутки жизни и исчезала на 4-5 сутки жизни. Ни у одного обследуемого пастозности, отечного синдрома выявлено не было.

Всем детям, включенным в исследование, проводился мониторинг жизненно важных функций, включавший: измерение частоты дыхания, сердечных сокращений

8

и артериального давления. Контроль газового состава крови проводился у 4% детей. Комплексное клинико-лабораторное обследование включало общеклинические анализы крови, мочи, микробиологическое исследование фекалий.

Все дети находились на естественном вскармливании. Синдрома рвоты, срыгивания выявлено не было. Физиологическая потеря массы тела не превышала 4%.

На 4-5 сутки новорожденные дети выписаны домой в удовлетворительном состоянии.

Проведено бактериологическое и молекулярно-генетическое исследование.

Материалом для исследования являлись фекалии. Забор материала до выписки домой проводился в родильном доме, а в последующем на дому или в период осмотра ребенка при катамнестическом наблюдении в условиях поликлиники. Транспортировка исследуемого материала осуществлялась во флаконах с притертыми пробками. От момента забора материала до момента посева проходило не более 2 часов. В бактериологической лаборатории к навеске фекалий добавляли десятикратный объём физиологического раствора и гомогенизировали в фарфоровой ступке. Из полученного гомогената готовили десятикратные серийные разведения от 10"1 до 10"8. Далее по 0,1 мл из соответствующих разведений исследуемого материала засевали на элективные питательные среды.

Изучение состава микрофлоры кишечника и выделение штаммов бифидобактерий проводили на селективных питательных средах культуральным методом.

Выделение бактерий проводили на стандартных средах: бифидобактерии -Bifidobacterium-arap (Himedia Labs Inc., Mumbai, India), лактобактерии - среда MRS (HiMedia, Индия) с добавлением 1,5% агара, неспорообразующие облигатно-анаэробные бактерии (бактероиды) - Columbia agar Base (BBL, США) с добавлением канамицина (100 мг/л), витамина Ki (1,5 мг/л) и крови (5%), клостридии - TSN - агар (OXOID, England), представителей семейства Enterobacteriaceae - Endo агар (Serva, USA), стафилококки - Staphylococcus agar (Difco, США), энтерококки - Enterococcus agar (Serva, USA). Дрожжеподобные грибы рода Candida выделяли на среде Sabouraud Dextrose agar (Serva, USA) с добавлением хлорамфеникола (400 мг/л). Посевы облигатно анаэробных бактерий инкубировали при 37°С в течение 48-72 часа в микроанаэростатах (OXOID, England) с регенерированными палладиевыми катализаторами в атмосфере - 10% Н2, 5% С02 и 85% N2. Чашки с посевами лактобактерий инкубировались в анаэростатах (BBL, USA), продутых газовой смесью

(85% N2, 10% CO2, 5% H2), без палладиевых катализаторов в течение 48 часов при температуре 37°С.

Факультативно анаэробные и облигатно аэробные микроорганизмы инкубировали при 37°С в течение 48 часов.

Изоляция штаммов бифидобактерий

Единичные колонии бифидобактерий, полученные из высоких разведений исследуемого материала, были предварительно идентифицированы при помощи окраски по Граму, морфологии клеток и пересеяны на чашки с той же средой для получения чистой культуры. Чистые культуры поддерживались путем постоянного пересева на новые чашки со средой. Маточные культуры были сохранены путем лиофилизации.

Выделение тотальной ДНК и идентификация бифидобактерий

ДНК из бифидобактерий для ПЦР с видоспецифичными праймерами выделяли 5-минутным кипячением бактериальной суспензии в 50 мкл 1х ТЕ (ЮмМ TrisHCl, рН8.0, 1мМ ЭДТА) буфера, затем центрифугировали в настольной центрифуге.

Геномную ДНК из образцов бифидобактерий, выделенных от детей в возрасте от 3 до 40 суток жизни, выделяли по методу Stahl (Stahl et al., 1990) с небольшими модификациями. В частности, 4 мл ночной культуры центрифугировали, промывали один раз буфером TES (50 мМ NaCl, 100 мМ TrisHcl, pH 8.0, 70 мМ ЭДТА) и ресуспендировали в 250 мкл того же буфера с добавлением 25% сахарозы, 30 мг/мл лизоцима и 70 Ед мутанолизина, а затем инкубировали при 42°С в течение 1 часа. Последующие шаги идентичны оригинальному протоколу.

ПЦР и ферментативные манипуляции с ДНК

Нуклеотидные последовательности видоспецифичных пар праймеров для бифидобактерий, комплементарных участку гена 16S рибосомальной РНК, представлены в таблице 1. Олигонуклеотиды были синтезированы ЗАО «Синтол» амидофосфитным методом и очищены при помощи обращенно-фазовой ВЭЖХ (высоко эффективная жидкостная хроматография) или при помощи препаративного электрофореза в полиакриламидном геле.

Таблица 1

Набор олнгоиуклеотидных праймеров, использованных для видовой идентификации бнфндобактерий с помощью ПЦР___

Вид Праймер Последовательность Длина праймера (пн) Размер ПЦР-продукта (пн)

В. adolescentis BiADO-1 CTCCAGTTGGATGCATGTC 19 279

BiADO-2 CGAAGGCTTGCTCCCAGT 18

В. angulütum BiANG-1 CAGTCCATCGCATGGTGGT 19 275

BiANG-2 GAAGGCTTGCTCCCCAAC 18

В. bifidum BiBIF-1 CCACATGATCGCATGTGATTG 21 278

BiBIF-2 CCGAAGGCTTGCTCCCAAA 19

В. breve BiBRE-1 CCGGATGCTCCATCACAC 18 288

BiBRE-2 ACAAAGTGCCTTGCTCCCT 19

группа В, catenulatum BiCAT-1 CGGATGCTCCGACTCCT 17 285

BiCAT-2 CGAAGGCTTGCTCCCGAT 18

В. longum subsp. longum BiLON-1 TTCCAGTTGATCGCATGGTC 20 831

BiLON-2 GGGAAGCCGTATCTCTACGA 20

В. longum subsp. infantis BiINF-1 TTCCAGTTGATCGCATGGTC 20 828

BiINF-2 GGAAACCCCATCTCTGGGAT 20

В. dentium BiDEN-1 ATCCCGGGGGTTCGCCT 17 387

BiDEN-2 GAAGGGCTTGCTCCCGA 17

Таблица 2

Группоспецнфические праймеры 16S рРНК для ПЦР в реальном временн._

Бактериаль ная группа Прайм ер Нуклеотидная последовательность Размер амплико на, п.н. Темпера тура отжига Исто чник

Bacleroides g-Bfra-F ATAGCCTTTCGAAAGRA 495 50 Matsu

(род) AGAT ki и

g-Bfra-R CCAGTATCAACTGCAAT TTTA со авт. ,2002

Prevotella (род) g-Prevo-F CACRGTAAACGATGGAT GCC 513 55 « - »

g-Prevo-R GGTCGGGTTGCAGACC

Clostridium coccoides (кластер) g-Ccoc-F AAATGACGGTACCTGA CTAA 440 50 « - »

g-Ccoc-R CTTTGAGTTTCATTCTT GCGAA

продолжение таблицы 2

Clostridium leptum (кластер) sg-Clept -F GCACAAGCAGTGGAGT 239 50 Matsu ki и

sg-Clept -R3 CTTCCTCCGTTTTGTCA А соавт. ,2004

Atopobium (кластер) c-Atopo -F GGGTTGAGAGACCGACC 190 55 «- »

c-Atopo -R CGGRGCTTCTTCTGCAG G

Lactobacillu s (род) Lacto-F TGGAAACAGRTGCTAAT ACCG 232 50 Byun и

Lacto-R GTCCATTGTGGAAGATT CCC соавт ,2004

Идентификация бифидобактерий при помощи секвенирования гена ¡65рРПК

Для определения нуклеотидной последовательности фрагмента гена 165 рибосомальной РНК осуществляли ПЦР-амплификацию фрагмента размером 493 пн с использованием универсальных бактериальных праймеров №1 (5'-АОАСТТТСАТССТСОСТСАС-З') и 1Ж1 (5'-ОСТСССАССТАСТТАССС-3') в следующих условиях ПЦР: 60 мМ Трис-гидрохлорид рН 8.5, 1,5 мМ М§С12, 25 мМ КС1, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1% Тритон Х-100, 0,2 мМ каждого из четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ), по 0,5 мкМ каждого праймера, 1 Ед ДНК полимеразы ТацЗЕ (СибЭнзим), и 5 мкл препарата тотальной ДНК. Была использована следующая программа: 1) первоначальная денатурация 94°С 1 мин; 2) 35 циклов: 94°С 20 сек, 55°С 20 сек, 72°С 30 сек; 3) финальная элонгация 72°С 1 мин; 4) охлаждение до 4°С. Полученный ПЦР продукт очищали препаративным электрофорезом в 1% агарозном геле, после чего ДНК выделяли из гелевых блоков с использованием спин-микроколонок (Хеликон, Москва) или при помощи метода Бума.

Статистическая обработка. В работе использовались непараметрические описательные статистики: медиана, минимум, максимум, верхний и нижний квартили. Для сравнения повторных количественных измерений использовался парный математический критерий Уилкоксона. Для сравнения качественных признаков применялся критерий у2 (хи-квадрат) с поправкой Йетса. Для вычисления статистик и критериев использовалась программа 51аи51лса 6.0. Различия считали достоверными при р <0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование микрофлоры кишечника здоровых детей, проводилось с 3 суток до 1,5 месяцев жизни.

Все дети находились на грудном вскармливании в период всего наблюдения. Восстановление массы тела при рождении отмечалось на 4-8 сутки жизни, прибавка за первый месяц 500±35 г, рост +2 см, окружность головы +1,5 см.

Проведенное исследование на 3 сутки жизни с использованием бактериологического метода выявило, что бактерии рода детектировались

лишь у 4,4% новорожденных в концентрации 8,7 КОЕ/г. На 12-15 сутки жизни бактерии рода Валего'^ев встречались у 8,8%, в количестве 9,7 КОЕ/г, а в конце месяца бактероиды, напротив, не были обнаружены ни одного обследуемого.

Бифидобактерии в первые дни жизни были выделены у 55,6% в количестве ^ 8,9±1,4 КОЕ/г. На 12-15 сутки жизни бифидобактерии выявлялись у 37,50% в концентрации ^ 8,1+1,8 КОЕ/г. На 30-е — 40-е сутки жизни в содержимом кишечника детей уже в 100% случаев определялись бифидобактерии в количестве 1% 9,8±0,7 КОЕ/г.

Лактобациллы были обнаружены у 44,1% в концентрации 7,0±1,6 КОЕ/г. Частота встречаемости лактобацилл на 12-15 сутки жизни возросла до 57,4% детей, ^ 7,3±1,1 КОЕ/г. Частота выделения лактобацилл к концу месяца составила 61,4%, а их среднее количество составило 7,2+1,3 КОЕ/г.

Клостридии колонизировали кишечник у 22% детей в среднем количестве ^ 6,9±1,9 КОЕ/г в ранний неонатальный период, на 12-15 сутки жизни обнаружены были у 17,6% 6,4+2,2 КОЕ/г), к концу месяца клостридии колонизировали кишечник в количестве 6,8% 6,6 КОЕ/г).

Таким образом, анаэробные микроорганизмы в достаточно высокой концентрации встречаются в ранний неонатальный период, абсолютно доминирующими микроорганизмами являются бифидобактерии.

Энтеробактерии были представлены разнообразным спектром:

В ранний неонатальный период энтеробактерии детектировались у 39,7% детей. На 12-15 сутки жизни у 61,8%, в конце месяца у 75%.

При этом общее количество Е. соИ в ранний неонатальный период составляет 22%, в на 12-15 сутки жизни 52,9%, в конце месяца 54,5%.

При этом у 22% детей раннего возраста были выявлены лактозопозитивные кишечные палочки, среднее количество которых составило lg 9,6±0,6 КОЕ/г, на 12-15 сутки жизни 48,5%, а в конце месяца 54,5%.

Staphylococcus spp. детектируется в начале месяца у 57,4%, в на 12-15 сутки жизни у 44%, в конце месяца у 61,4% детей.

В том числе 5. aureus в раннем неонатальном периоде встречается в 30,9% случаях, на 12-15 сутки жизни детектируется у 8,81% обследуемых новорожденных, в конце месяца у 27,3%.

Энтерококки в количестве (lg 9,4+0,7 КОЕ/г) 70,6% обнаруживаются у детей в раннем неонатальном периоде, на 12-15 сутки жизни у 75%, в конце месяца у 68,1% (lg 9,3±0,9 КОЕ/г).

Грибы рода Candida не были обнаружены ни у одного ребенка при рождении, на 12-15 сутки жизни и в конце месяца обнаружены у 12% (lg 5,3 КОЕ/г) детей.

Данные представлены в таблице 3.

Таблица 3

Качественный и количественный состав микрофлоры кишечника у здоровых детей_

Возраст детей 3-7 сутки жизни 12-15 сутки с 30 до 40 суток

n= =75 жизни n=75 жизни n=75

Вид бактерий Кол- M±m Кол- Vl±m Кол- M±m

во/% (IgKOE/r) во/% (IgKOE/r) во/% (IgKOE/r)

Бифидобактерии 42/55,6 8,9+1,4 28/37,5 8,1+1,8 75/100 9,8±0,7

Лакгобациллы 33/44,1 7,0±1,6 43/57,4 7,3+1,1 46/61,4 7,2+1,3

Bacteroides spp 3/4,4 8,7 7/8,8 9,7

Клостридии (общ) 17/22 6,9+1,9 13/17,6 6,4±2,2 5/6,8 6,6

Энтеробактерии: 30/39,7 9,3±1,0 46/61,8 9,7±0,6 56/75 9,5±0,6

E.coli (lac+/hem-) 30/22 9,6+0,6 46/48,5 9,3±0,2 41/54,5 8,9±1,1

E.coli (lac-/hem-) 3/4,4 8,6 3/4,4 8,6

E. coli (общ) миг 9,6±0,6 40/52,9 9,3±0,2 41/54,5 8,9+1,1

К. pneumoniae 26/35,3 8,3±1,1 23/30,9 9,9+0,6 26/34 8,6±1,8

К. oxytoca 13/17,6 8,9 15/20,5 9,7±0,5

Klebsiella (общ) 20/26,5 8,7+1,5 30/39,7 9,9±0,6 41/54,5 9,0±1,4

Enterobacter spp. 3/4,4 9,3 3/4,4 9,3

S. aureus 23/30,9 6,3 7/8,8 9,7 20/27,3 5,9±0,7

Staphylococcus spp. 43/57,4 6,2±1,0 33/44 5,4±0,8 46/61,4 6,1±0,6

Энтерококки 53/70,6 9,4+0,7 56/75 8,7±1,2 51/68,1 9,3±0,9

Candida spp. 9/12 5,3 9/12 5,3

Bacillus spp. 3/4,4 6,9

Таким образом, для микробиоценоза кишечника детей первых 1,5 месяцев жизни характерно доминирование анаэробных микроорганизмов, в том числе и спорообразующих лецитиназанегативных клостридий.

Наряду с этим с большой частотой и в высокой концентрации встречаются микроорганизмы, которые принято относить к условнопатогенной микрофлоре (коагулазапозитивные стафилококки, дрожжеподобные грибы рода Candida, цитрат ассимилирующие энтеробактерии и эшерихии с низкой биохимической активностью, а также со способностью к продукции гемолизинов).

Идентификация штаммов бифидобактерий

Видовую идентификацию штаммов бифидобактерий проводили методом ПЦР с девятью парами видоспецифичных праймеров, комплементарных гену 16S рРНК (Bifidobacterium longum subsp. longum, В. bifidum, В. longum subsp. infantis, B. breve, B. adolescentis генотипы А и В, В. catenulatum, В. angulatum и В. dentium) (Matsuki Т., 2003).

С наибольшей частотой встречались бифидобактерии В. bifidum, В. longum и В.

breve.

В результате проведенного исследования было установлено, что частота обнаружения бифидобактерий вида В. longum subsp. longum в интестинальной микрофлоре детей раннего неонатального и позднего неонатального возраста составляла 11,8% и была статистически значимо ниже, по сравнению с частотой их обнаружения у детей в возрасте 30-40 суток жизни (29,4%).

В. bifidum с высокой частотой встречались у всех новорожденных детей, но наибольшая частота их встречаемости была у детей позднего неонатального периода (29,4%).

В. longum subsp. infantis встречался в одинаковом процентном содержании у детей в возрасте 3-7 и 12-15 сутки жизни (17,6%), только у детей в возрасте 30-40 суток жизни частота встречаемости 23,5%.

В. breve были обнаружены с наибольшей частотой встречаемости в возрасте 30-40 суток жизни (17,6%).

Частота встречаемости В. adolescentis у детей в возрасте 3-7 и 12-15 сутки жизни была статистически значимо ниже (5,9%), чем у детей 30-40 суток жизни 11,8%.

Вместе с тем, частота встречаемости бифидобактерий вида В. catenulatum имела тенденцию к росту по сравнению с ранним неонатальным периодом. Так, у

15

детей в возрасте 12-15 сутки жизни данный вид бифидобактерий обнаружен был в 5,9%. В дальнейшем у детей в возрасте от 30 до 40 суток жизни бактерии этого вида были обнаружены с частотой 11,8%.

В. dentium с низкой частотой были обнаружены только у детей раннего неонатального периода (11,8%).

Также с низкой частотой в исследуемом материале у всех детей, в испражнениях были обнаружены бифидобактерии вида В. angulatum, традиционно относящиеся к «взрослым» видам.

Таким образом, в наших исследованиях по изучению видового состава бифидобактерий у здоровых детей было выявлено, что у детей раннего возраста абсолютно доминирующими таксонами являются бифидобактерии видов В. bifidum, В. longum и В. breve. Частота встречаемости других видов бифидобактерий заметно уступала этим доминирующим видам.

Данные по видовому составу приведены в таблице 4.

Таблица 4

Видовой состав бифидобактерий в микрофлоре кишечника у здоровых детей, определенный при помощи метода ПЦР-РВ

Возраст детей 3-7 сутки жизни n=75 12-15 сутки жизни п=75 30-40 сутки жизни п=75

Видовой состав бифидобактерий Кол-во/% Кол-во/% Кол-во/%

В. longum subsp. longum 11,8 11,8 29,4

В. bifidum 23,5 23,5 29,4

В. breve 5,9 11,8 17,6

В. catenulatum 11,8 5,9 11,8

В. adolescentis 5,9 5,9 11,8

В. longum subsp. infantis 17,6 17,6 23,5

В. dentium 11,8 16,6 16,9

В. angulatum 5,9 5,9 16,6

В. animalis - - -

Следующим этапом нашего исследования была детекция различных групп микроорганизмов с помощью молекулярно-генетичеких методов (ПЦР-РВ).

Детекцию анаэробных микроорганизмов, относящихся к роду Bifidobacterium, Lactobacillus, Bacteroides, Prevotella а также кластерам Clostridium coccoides, Clostridium leptum, Atopobium, проводили с помощью ПЦР-РВ, для этого были созданы группоспецифические и родоспецифические праймеры (табл. 2).

Представители рода Bacteroides с помощью ПЦР-РВ в ранний неонатальный период, детектировались у 10% новорожденных, количественные значения при этом достигали lg 8,6 в 1 г. кишечного содержимого. На 12-15 сутки жизни, Bacteroides детектировались уже у 45% новорожденных в количестве сопоставимы с данными, полученными в первую неделю жизни. Исследование, проведенное в конце 30-40 суток, позволило детектировать представителей рода Bacteroides уже у 55% детей.

Таблица 5

Количество бактерий рода Вааего'Шез, выявленных методой ПЦР-РВ, в зависимости от суток жизни у новорожденных детей

Сутки жизни Медиана Min Мах Ниж. квартиль Верх. Квартиль

3-7 9,0 5,4 11,0 7,6 10,4

12-15 7,0 4,3 10,1 6,3 7,6

30-40 9,2 5,6 13,0 7,9 10,7

Р ((Э-7НИ2-15)) = 0,000000 Р «12.-1SH30^0))= 0,000000 р((!.7кммо»= 0,000000

В таблице 5 и на рисунке 1 представлено количество бактерий рода ВааегоШе5, выявленных методом ПЦР-РВ, в зависимости от суток жизни у новорожденных детей. На 3-7 сутки медиана количества выявленных бактерий составила 9,0; минимум - 5,4; максимум - 11,0; нижний квартиль — 7,6; верхний квартиль - 10,4. На 12-15 сутки медиана количества выявленных бактерий составила 7,0; минимум - 4,3; максимум - 10,1; нижний квартиль - 6,3; верхний квартиль - 7,6; что статистически достоверно меньше, чем на 3-7 сутки (р<0,05). На 30-40 сутки медиана количества выявленных бактерий составила 9,2; минимум — 5,6; максимум -13,0; нижний квартиль - 7,9; верхний квартиль - 10,7; что статистически достоверно больше, чем на 12-15 сутки (р<0,05) и статистически достоверно больше чем на 3-7 сутки (р<0,05).

Следующий этап исследования позволил детектировать представителей кластера АЮроЫит у детей в указанные выше сроки.

В ранний неонатальный период этот кластер микроорганизмов детектировался у 25% детей, на 12-15 сутки жизни у 20% детей, а к 30-40 дню жизни, уже у 34%.

17

Рис.1. Количество бактерий рода Вааего'ьйеь, выявленных методом ПЦР-РВ, в зависимости от суток жизни у новорожденных детей.

Таблица 6

Количество бактерий кластера А/ороЫит, выявленных методом ПЦР-РВ, в зависимости от суток жизни у новорожденных детей

Сутки жизни Медиана Мт Мах Ниж. квартиль Верх. Квартиль

3-7 0,0 0,0 2,0 0,0 1.0

12-15 0,0 0,0 2,0 0,0 1,0

30-40 0.0 0.0 3,0 0,0 2,0

Р «3-7x12-15» = 0,947967 Р «п-15х*мо»= 0,009906 р«з-7хз(мо»= 0,005121

3-7 12-15 3040

Сутки жизни

□ м«

□ 25%-75% Т Мин-Масс

3-7

12-15

30-40

□ Метизна

□ 25%-75%

"Т" Мнн-Махс

СУТКИ )М1Э4И

Рис. 2. Количество бактерий кластера А1ороЫит, выявленных методом ПЦР-РВ, в зависимости от суток жизни у новорожденных детей.

В таблице 6 и на рисунке 2 представлено количество бактерий кластера АюроЫит, выявленных методом ПЦР-РВ, в зависимости от суток жизни у новорожденных детей. На 3-7 сутки медиана количества выявленных бактерий составила 0,0; минимум - 0,0; максимум - 2,0; нижний квартиль - 0,0; верхний квартиль - 1,0. На 12-15 сутки медиана количества выявленных бактерий составила 0,0; минимум - 0,0; максимум - 1,0; нижний квартиль - 0,0; верхний квартиль - 1,0; статистически значимых различий с данными за 3-7 сутки не выявлено (р=0,947967). На 30-40 сутки медиана количества выявленных бактерий составила 0,0; минимум -0,0; максимум - 3,0; нижний квартиль - 0,0; верхний квартиль - 2,0; что статистически достоверно больше, чем на 12-15 сутки (р<0,05) и статистически достоверно больше чем на 3-7 сутки (р<0,05).

Представители кластера С. соссо1с1е5 встречается в 20% случаев и С. 1ерШт в 60% определялись с помощью ПЦР-РВ, представлены в таблицах 7-8 и на рисунках 34.

Таблица 7

Количество бактерий кластера С. соссоЫез, выявленных методом ПЦР-РВ, в зависимости от суток жизни у новорожденных детей

Сутки жизни Медиана Min Мах Ниж. квартиль Верх. Квартиль

3-7 0,0 0,0 1,0 0,0 1.0

12-15 0,0 0,0 2,0 0,0 1,0

30-40 0,0 0,0 4,0 0,0 1,0

P«J-7HIM5» = 0,0663135 P«I2-15K30-40)) = 0,824484 р «мнимой = 0,092546

4,5 -.-.-,-,-,-

4.0 -р

3,5 ■

3,0

2,5

2.0 -р 1,5

1,0 - —— ——

0,5

0,0 ■ L_a_l [.. □ □

-0,5 -■-1-■-■-i-

3-7 12-15 30-40

П 25%-75% Сутки хиэни -г ,,

' Мкн-иахс

Рис. 3. Количество бактерий кластера С. coccoides, выявленных методом ПЦР-РВ, в зависимости от суток жизни у новорожденных детей.

В таблице 7 и на рисунке 3 представлено количество бактерий кластера С. coccoides, выявленных методом ПЦР-РВ, в зависимости от суток жизни у новорожденных детей. На 3-7 сутки медиана количества выявленных бактерий составила 0,0; минимум - 0,0; максимум - 1,0; нижний квартиль - 0,0; верхний квартиль - 1,0. На 12-15 сутки медиана количества выявленных бактерий составила 0,0; минимум — 0,0; максимум — 2,0; нижний квартиль — 0,0; верхний квартиль — 1,0; статистически значимых различий сданными за 3-7 сутки не выявлено (р=0,0663135). На 30-40 сутки медиана количества выявленных бактерий составила 0,0; минимум -0,0; максимум — 4,0; нижний квартиль — 0,0; верхний квартиль — 1,0; статистически

достоверны различий с данными за 15-20 сутки и за 3-7 сутки не выявлено -р=0,824484 и р=0,092546 соответственно.

Таблица 8

Количество бактерий кластера С. 1ерШт, выявленных методом ПЦР-РВ, в зависимости от суток жизни у новорожденных детей

Сутки жизни Медиана Мш Мах Ниж. квартиль Верх. Квартиль

3-7 1,0 1,0 2,0 1,0 1,0

12-15 1,0 0,0 2,0 0,0 1,0

30-40 1,0 0,0 2,0 0,0 1,0

Р«3-7И12.15» = 0,045500 Р«1М5Н30-40))= 0,434724 р «)-7нзо-4о))= 0,066753

2.2 ---■-.---■-■--

2,0 Т Т Т

1,8 ■ 1,6 1,4 1,2

1,0 —в— —— Г"^

0,8 0.6 0.4 0,2

0,0 ■ —■— -

-0.2 -------1---

3-7 12-15 30-40

о Медиана □ 25%-75%

Сутки ХМЗНИ Л Мин-Макс

Рис. 4. Количество бактерий кластера С. 1ерШт, выявленных методом ПЦР-РВ, в зависимости от суток жизни у новорожденных детей.

В таблице 8 и на рисунке 4 представлено количество бактерий кластера С. 1ершт, выявленных методом ПЦР-РВ, в зависимости от суток жизни у новорожденных детей. На 3-7 сутки медиана количества выявленных бактерий составила 1,0; минимум - 1,0; максимум - 2,0; нижний квартиль - 1,0; верхний квартиль - 1,0. На 12-15 сутки медиана количества выявленных бактерий составила 1,0; минимум - 0,0; максимум - 2,0; нижний квартиль - 0,0; верхний квартиль - 1,0; что статистически достоверно отличается от данных за 3-7 сутки (р=0,045500). На 3021

40 сутки медиана количества выявленных бактерий составила 1,0; минимум - 0,0; максимум - 2,0; нижний квартиль - 0,0; верхний квартиль — 1,0; статистически достоверны различий с данными за 15-20 сутки и за 3-7 сутки не выявлено -р=0,434724 и р=0,066753 соответственно.

В ранний неонатальный период представители рода Prevotella, включающий: Prevotella corporis, Prevotella denticola, Prevotella melaninogenica, Prevotella veroralis, детектировались у 89% детей, на 12-15 сутки жизни у 87% детей, а к 30-40 дню жизни, уже у 85% новорожденных.

Таблица 9

Количество бактерий рода Prevotella, выявленных методом ПЦР-РВ, в зависимости от суток жизни у новорожденных детей

Сутки жизни Медиана Min Мах Ниж. квартиль Верх. Квартиль

3-7 1,0 0,0 3,0 1,0 2,0

12-15 1,0 0,0 3,0 1,0 2,0

30-40 2,0 0,0 4,0 2,0 2,0

Р ((3.7x12-15)) 0,887537 P ((12-15н*мо),= 0,000000 Р(ц.7кз(ыо))= 0,000106

4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1,0 0.5 0.0

3-7

12-15

30-40

о Мезона □ 25%-75%

Сутки Х413НИ J Мин-MlKC

Рис. 5. Количество бактерий рода Prevotella, выявленных методом ПЦР-РВ, в

зависимости от суток жизни у новорожденных детей.

В таблице 9 и на рисунке 5 представлено количество бактерий рода Prevotella, выявленных методом ПЦР-РВ, в зависимости от суток жизни у новорожденных детей. На 3-7 сутки медиана количества выявленных бактерий составила 1,0; минимум - 0,0; максимум - 3,0; нижний квартиль - 1,0; верхний квартиль - 2,0. На 12-15 сутки медиана количества выявленных бактерий составила 1,0; минимум - 0,0; максимум -3,0; нижний квартиль - 1,0; верхний квартиль - 2,0; статистически значимых различий с данными за 3-7 сутки не выявлено (р=0,887537). На 30-40 сутки медиана количества выявленных бактерий составила 2,0; минимум - 0,0; максимум - 4,0; нижний квартиль - 2,0; верхний квартиль - 2,0; что статистически достоверно больше, чем на 12-15 сутки (р<0,05) и статистически достоверно больше чем на 3-7 сутки (р<0,05).

Следующим этапом исследования нами проведен сравнительный анализ частоты встречаемости микроорганизмов при использовании бактериологического метода (БМ) и ПЦР-РВ, который позволил выявить эффективность и чувствительность каждого из данных методов. Данные приведены в таблицах 10, 11, 12.

Таблица 10

Выявляемость бактерий рода Bifidobacterium в микрофлоре кишечника у детей раннего возраста, в зависимости от суток жизни и метода обнаружения (БМ и ПЦР-РВ)

Метод Сутки жизни

3-7 12-15 30-40

Бактериологический 42 (56,0%) 28 (37,3%) 75 (100,0%)

ПЦР-РВ 42 (56,0%) 28 (37,3%) 54 (72%)

Р 1,0 1,0 0,0000

В таблице 10 представлена выявляемость бактерий рода Bifidobacterium, в зависимости от суток жизни у детей раннего возраста и метода обнаружения (БМ и ПЦР-РВ). На 3-7 и 12-15 сутки жизни обоими методами выявлены бактерии рода Bifidobacterium у одного и того же количества детей - 42 (56,0%) и 28 (37,3%) соответственно. На 30-40 сутки жизни бактериологическим методом бактерии вывялены достоверно чаще у 75 (100,0%) детей, чем методом ПЦР-РВ 54 (72%) (р<0,05), что объясняется отсутствием праймера В. angulatum.

Таблица 11

Выявляемость бактерий рода Вас1его'1йа1е$ в микрофлоре кишечника у детей раннего возраста, в зависимости от суток жизни и метода обнаружения (БМ и ПЦР-РВ)

Метод Сутки жизни

3-7 12-15 30-40

Бактериологический 8 (10,6%) 9(12,0%) 0 (0,0%)

ПЦР-РВ 8 (10.6%) 37 (49,3%) 51 (68,0%)

Р 1,0 0,0000 0,0000

В таблице 11 представлена выявляемость бактерий рода Bacteroidales, в зависимости от суток жизни у детей раннего возраста и метода обнаружения (БМ и ПЦР-РВ). На 3-7 сутки жизни обоими методами выявлены бактерии рода Bacteroidales у одного и того же количества детей - 8 (10,6%). На 12-15 и 30-40 сутки жизни бактериологическим методом бактерии вывялены достоверно реже у 9 (12,0%) детей, чем методом ПЦР-РВ 37 (49,3%) (р<0,05) и 0 (0,0%) против 51 (68,0%) (р<0,05) соответственно.

Таблица 12

Выявляемость бактерий рода Lactobacillus в микрофлоре кишечника у детей раннего возраста, в зависимости от суток жизни и метода обнаружения (БМ и ПЦР-РВ)

Метод Сутки жизни

3-7 12-15 30-40

Бактериологический 58 (77,3%) 47 (62,7%) 62 (82,7%)

ПЦР-РВ 75 (100,0%) 75 (100,0%) 75 (100,0%)

Р 0,0000 0,0000 0,0002

В таблице 12 представлена выявляемость бактерий рода Lactobacillus, в зависимости от суток жизни у детей раннего возраста и метода обнаружения (БМ и ПЦР-РВ). На 3-7, 12-15, 30-40 сутки жизни, методом ПЦР-РВ, бактерии рода Lactobacillus выявлены достоверно чаще, у 75 детей, то есть у 100,0% против 58 (77,3%), 47 (62,7%), 62 (82,7%) соответственно, выявленных бактериологическим методом (р<0,05).

При сравнительном анализе представители рода Lactobacillus в динамике наблюдения детектировались с высокой частотой при помощи метода ПЦР-РВ.

Принимая во внимание эффективность использования в качестве пробиотических препаратов штаммы бифидобактерий, мы изучили возможность

осуществлять изомеризацию линолевой кислоты с помощью хромато-масс-спектрометрии (ХМС) 4 штаммов бифидобактерий.

Химико-аналитическое исследование - газожидкостная хроматография - (ГЖХ) выполнялось на базе лаборатории Лечебно-реабилитационного Центра Росздрава (ведущий научный сотрудник, д.б.н. Г.А. Осипов).

Хромато-масс-спектрометрия является гибридным методом анализа. Процессы разделения и анализа здесь протекают совершенно независимо друг от друга. Для исследования изомеров применяются практически все известные физико-химические методы анализа. Среди них самым эффективным способом анализа смесей органических соединений, в том числе изомеров, является хромато-масс-спектрометрический (ХМС) метод. Возможности масс-спектрометрической части этого метода, используемые для идентификации, включают в себя библиотечный поиск, построение структуры молекулы на основании закономерностей фрагментации различных классов органических веществ.

Хромато-масс-пектрометрическому исследованию подвергнуты 6 штаммов бифидобактерий (2 контроля). Выявлена способность одного из штаммов осуществлять изомеризацию КЖК (таблица 13).

Таблица 13

Состав жирных кислот, мкг/мл

№ ИТ Обозначе пне Название Образ ец 1 Образ ец 2 Образ ец 3 Образ ец 4 Образ ец 5 Обра зец 6

1 13.4 0 13.40 гептадецен овая 33,85 39,80 51,67 98,28 33,71 42,75

2 13.6 9 13.69 маргарино вая 15,18 13,35 12,61 9,90 10,71 11,07

3 14.6 6 14.67 линолевая 183 3,60 114 6,99 1814,2 7 123 5,49 154 5,98 142 6,37

4 14.7 5 14.74 олеиновая 191 4,37 934,69 1603,8 4 836,01 109 4,62 138 0,58

5 14.7 9 14.76 цис- вакценовая 350, 95 238, 29 257, 14 195, 67 253, 79 219, 93

6 14.8 20 14.80 транс-вакценовая 77,69 35,72 58,47 29,98 65,08 67,48

Таким образом, было показано, что выделенные штаммы бактерий рода В. breve способны осуществлять изомеризацию KJIK. что может вносить значительный вклад в обеспечение противовоспалительного эффекта данных бактерий.

Выводы

1. Микробиоценоз толстой кишки у клинически здоровых детей в завершении неонатального периода характеризуется высокой концентрацией и частотой встречаемости анаэробных бактерий, среди которых абсолютно доминирующими являются Bifidobacterium (100%), представители рода Bacteroides (11,7%), Clostridium (14%). Наряду с анаэробными микроорганизмами в высокой концентрации выделяются аллохтонные микроорганизмы, относящиеся к роду: Klebsiella (72,7%), Staphylococcus aureus (15-45%), лецитиназопозитивные клостридии (22%) и дрожжеподобные грибы рода Candida (12%).

2. Исследование, проведенное с помощью ПЦР-РВ, позволяет с большей эффективностью детектировать микроорганизмы представителей рода Bifidobacterium, Bacteroides, Lactobacillus, а также труднокультивируемые группы С. leptum и С. coccoides, род Prevotella и кластер Atopobium.

3. Проведенная видовая идентификация бифидобактерий с помощью ПЦР-РВ показала, что у детей раннего возраста преобладающими видами являются бифидобактерий видов В. bifidum, В. longum и В. breve.

4. Штаммы бактерий рода В. breve, выделенные из кишечника новорожденного способны осуществлять изомеризацию KJ1K.

Практические рекомендации

1. Метод ПЦР-РВ позволяет более эффективно детектировать труднокультивируемые группы микроорганизмов: представителей родов Bifidobacterium, Lactobacillus, Bacteroidales, Prevotella, а также кластеров Clostridium leptum и С. coccoides, и Atopobium, что может быть рекомендован для исследования микрофлоры у детей раннего возраста.

2. Полученные данные о формировании кишечной микрофлоры у детей свидетельствуют о необходимости внедрения в педиатрическую практику методов генотипирования для определения видового и штаммового состава бифидобактерий.

3. Использование в ПЦР-РВ видоспецифических бифидобактериальных праймеров позволит с высокой точностью и в короткие сроки идентифицировать чистые культуры бифидобактерий.

4. Обнаружение в кишечнике детей раннего возраста доминирующих видов бифидобактерий: В. bifidum, В. longum и В. breve, позволит обосновать

26

применение пробиотических препаратов на основе содержания определенных видов бифидобактерий.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. L.I. Kafarskaya, M.L. Shunikova, O.A. Babak, Y.N. Vorontsova, L.A. Degtyareva, Y.M. Golubtsova. «Etiology of neonatal pneumonia in neonatal intensive care unit (NICU)».//Book of Abstract XXII European Congress of Perinatal Medicine. Spain, Granada.-2010.-P.571.

2. H.H. Володин, Л.И. Кафарская, Б.А. Ефимов, M.B. Дегтярева, А.Н. Шкопоров, Е.В. Хохлова, M.JI. Шуникова, Е.В. Кулагина, Л.А. Дегтярева, Ю.М. Голубцова. «Разработка метода экспресс-диагностики перинатальных инфекций на основе количественной оценки содержания ДНК цитомегаловируса и бактерий, колонизирующих организм плода и новорожденного. ПЦР в режиме реального времени, перинатальные бактериальные инфекции, цитомегаловирусная инфекция, колонизация кишечника у новорожденных детей».//«Вопросы практической педиатрии»,-20 Ю.-т.5.-№. 1 .-с. 12.

3. Л.И. Кафарская, М.Л. Шуникова, O.A. Бабак, Ю.Н. Воронцова, Л.А. Дегтярева, Ю.М. Голубцова. «К вопросу об этиологии пневмоний у недоношенных новорожденных в ОРИТН. Недоношенные новорожденные, нозокомиальные пневмонии, антибактериальная терапия, антибиотикорезистентность».//«Вопросы практической педиатрии»,-2010.-т.5.-№.1.-с.29.

4. Л.И. Кафарская, Б.А. Ефимов, А.Н. Шкопоров, М.Л. Шуникова, Ю.М. Голубцова. Пробиотики в педиатрической практике.//«Эффективная фармакотерапия. Гастроэнтерология»,-2011 .-№. 1 .-с.44-48.

5. Л.И Кафарская, H.H. Володин, Ю.М. Голубцова. «Формирование кишечной микрофлоры у новорожденных детей. Новорожденные дети, микробиоценоз кишечника, кишечная микрофлора».// Материалы I Международного Конгресса по перинатальной медицине, Москва, 2011.-е. 91-92.

6. Л.И. Кафарская, М.Л. Шуникова, Б.А. Ефимов, А.Н. Шкопоров, Ю.А. Сигова, Ю.М. Голубцова. «Особенности формирования микрофлоры у детей раннего возраста и пути ее коррекции с помощью пробиотиков».//«Педиатрическая фармакология»,-2011.-т.8.-№.2.-с.94-98.

7. Б.А. Ефимов, А.Н. Шкопоров, Е.В. Хохлова, Л.И. Кафарская, Ю.М. Голубцова. «Молекулярно-генетические технологии, основанные на полимеразной цепной

реакции, в диагностике перинатальных инфекций».//Справочник заведующего КДЛ,-2012.-№.4.-с. 9-20.

8. Ю.М. Голубцова, H.H. Володин, А.Н. Шкопоров, Е.А. Постникова, Л.И. Кафарская. «Молекулярно-генетические технологии в оценке особенностей микрофлоры кишечника у детей. Бифидобактерии, желудочно-кишечный тракт, микрофлора».//«Вопросы практической педиатрии»,-2012.-т.7.-№.4.-с. 27-33.

9. Е.В. Кулагина, З.А. Черная, А.Н. Шкопоров, Е.В. Хохлова, Б.А. Ефимов, Л.И. Кафарская, Ю.М. Голубцова. «Оценка влияния смеси, обогащенной штаммом бифидобактерии ВВ12, на становление микрофлоры кишечника у новорожденных».//«Вопросы современной педиатрии»,-2012,-т. 11.-№.4.-с. 47-53.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АМП - антимикробные препараты

АД — артериальное давление

ГВ - гестационный возраст

ГОБ - грамотрицательные бактерии

ГЖХ - газожидкостная хроматография

ГЦ пары - гуанин-цитозин пары

ЖКТ — желудочно-кишечный тракт

KJIK — конъюгированная линолевая кислота

КЦЖК - короткоцепочечные жирные кислоты

ЛПС - липополисахарид клеточной стенки грамотрицательных бактерий

НСГ — нейросонография

НЭК — некротический энтероколит

ОАГА — отягощенный акушерско-гинекологический анамнез

ОРВИ-острая респираторная вирусная инфекция

ОРИТ - отделение реанимации и интенсивной терапии

ОСА — отягощенный соматический анамнез

ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР — РВ — полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

УЗИ — ультразвуковое исследование

ХМС - хромато-масс-спектрометрия

ЦНС - центральная нервная система

ЧСС — частота сердечных сокращений

ЭХО-КГ - эхокардиография

PYY - регуляторный пептид

TLR - Toll - подобные рецепторы (рецепторы системы врожденного иммунитета)

Формат 60x90/16. Заказ 1711. Тираж 100 экз. Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов. Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. (495)774-26-96