Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Оптимизация методов оценки фагоцитарной активности лейкоцитов периферической крови с помощью лазерной проточной цитометрии

р

Р1

На правах рукописи

ОЛИФЕРУК НАТАЛЬЯ СЕРГЕЕВНА

ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДОВ ОЦЕНКИ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕЙКОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ С ПОМОЩЬЮ ЛАЗЕРНОЙ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ

14 00 36 - Аллергология и иммунология

Автореферат 003445798

диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

О * г 2000

Москва, 2008 г

003445798

Работа выполнена в ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России »

Научный руководитель

доктор медицинских наук, профессор

Борис Владимирович Пинегин

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор Владимир Викторович Яздовский доктор медицинских наук, профессор Заира Григорьевна Кадагидзе

Ведущая организация Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И И Мечникова РАМН

защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208 017 01 в ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России» по адресу. 115478, г. Москва, Каширское шоссе, дом 24, корп. 2. Тел /факс +7 (499) 617-10-27

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России»

Защита СО СТО ится «<

в ^^часо:

часов на заседании совета по

Автореферат разослан

2008 г

Ученый секретарь совета

по защите докторских и кандидатских

диссертаций, доктор медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Систему фагоцитоза можно определить как совокупность клеток и гуморальных факторов, обеспечивающих базальный уровень структурного гомеостаза [Маянский А Н., Пикуза О И, 1993] Центром системы фагоцитоза служат фагоциты. В этом термине отражается один из самых ярких функциональных признаков данных клеток -способность к поглощению и уничтожению чужеродного материала Конечным вариантом любого иммунного ответа является разрушение патогена или дефектных структур и их элиминация Основные механизмы разрушения при гуморальном и клеточном вариантах иммунного ответа связаны с фагоцитозом Дефекты функции фагоцитов могут существенно ухудшить эффективность и адекватность любого вариантов иммунного ответов Как высокочувствительный индикатор нормы и патологии, фагоциты служат полезным инструментом не только иммунологической, но общеклинической диагностки Одной из важных задач клинической иммунологии является всесторонняя оценка иммунного статуса Она включает в себя следующий комплекс оснрвных тестов: оценка фагоцитоза, гуморального иммунитета и системы комплемента, иммунофенотипирования лимфоцитов, функциональная активность лимфоцитов и оценка интерферонового статуса [Хаитов РМ, Игнатьева ГА, 1992]. Изучение показателей фагоцитоза имеет значение в комплексном анализе диагностики как первичных таких как хронической гранулематозной болезни, синдрома Чедиака-Хигаси, дефицита миелопероксидазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, синдроме «ленивых лейкоцитов», нарушение опсонизирующей активности сыворотки крови (дефицит компонента комплемента, гипогаммаглобулинемии) [Вельтищев Ю.Е, 1996, Йегер Л, 1990], так и вторичных иммунодефицитных состояний часто рецидивирующие гнойные воспалительные процессы, длительно не заживающие раны, склонность к послеоперационным осложнениям [Хаитов Р М, Пинегин Б В , 1995, Маянский А Н, Пикуза О И, 1993]. Но вместе с

этим, методические подходы к оценке фагоцитоза являются довольно трудоемкими и длительными, что не позволяет их широко использовать в клинической лабораторной практике. Современным подходом в изучении структуры и функции клеток является проточная цитометрия, ее возможности позволяют также изучать и этапы фагоцитоза Существующие методы оценки функциональной активности фагоцитов с использованием проточной цитометрии обобщены в ряде обзоров [Van Eeden S F. et al., 1999, Bjerknes R, Bassoe CF, 1989, Bassoe CF, 1984] Высокая точность, объективность скорость анализа, простота постановки реакции характеризуют изучение фагоцитоза с помощью автоматической проточной цитофлюориметрии

Цель работы Оптимизация существующих методов и создание новых подходов к оценке функциональной активности фагоцитов периферической крови с помощью проточной лазерной цитометрии Задачи исследования

1 Оценить значение исследования фенотипа нейтрофилов CD 16, CD1 lb/18, CD32, CD35 в норме и при некоторых патологиях

2 Разработать цитометрические методы определения фагоцитарного числа и индекса переваривающей способности лейкоцитов периферической крови в отношении St aureus

3 Отработать методики и оценить корреляцию определения фагоцитарного числа и индекса переваривающей способности фагоцитов по сравнению с классическими микроскопическими методами

4 Исследовать фагоцитарное число и индекс переваривающей способности лейкоцитов периферической крови в отношении St aureus у здоровых доноров in vitro для определения интервалов нормальных значений показателей.

5 Определить фагоцитарное число и индекс переваривающей способности у пациентов с наследственными и вторичными нарушениями фагоцитарного звена.

6 Оптимизировать метод оценки бактерицидной активности (внутриклеточный киллинг) фагоцитов с помощью проточной лазерной цитометрии, определить интервалы нормальных значений, оценить бактерицидную активность при наследственных и вторичных нарушениях фагоцитарного звена

Научная новизна. Впервые предложена и внедрена в клиническую практику модифицированная цитометрическая методика для оценки фагоцитарного числа лейкоцитов периферической крови в отношении St aureus-OHTLt (St aureus меченный флуоресцеин-5-изотиоцианатом) Впервые предложена и внедрена в клиническую практику цитометрическая методика для оценки определения индекса переваривающей способности лейкоцитов периферической крови в отношении St aureus-OHTLf" С помощью предложенных новых методов исследовано фагоцитарное число лейкоцитов периферической крови в отношении St aureus-ФИТЦ1", а также индекса переваривающей способности в норме и при патологиях, а так же проведена корреляция между предложенными методами и классическим микробиологическим методом С помощью созданных методов было выявлено резкое снижение фагоцитарного числа лейкоцитов периферической крови пациентов с ХГБ в отношении St aureus-ФИТЦ1", при нормальном уровне поглотительной активности (% фагоцитировавших клеток) и индексе переваривающей способности лейкоцитов периферической крови Цитометрические методы оценки фагоцитарного числа и индекса переваривающей способности фагоцитов позволили выявить, что у пациентов, страдающих хроническим рецидивирующим фурункулезом, фагоцитарное число ниже нормы и у некоторых из них значительно снижен индекс переваривающей способности При обследовании пациентов с хроническим гематогенным остеомиелитом обнаружено резкое снижение

фагоцитарного числа лейкоцитов при крайне тяжелом течении заболевания, а ИПС был снижен у большинства пациентов Установлена важность определения внутриклеточного киллинга в динамике, через 1 и 3 часа инкубации, что в ряде случаев позволяет выявить наличие нарушений в фагоцитарном процессе

Практическая значимость работы. Цитометрические методы оценки фагоцитарного числа и индекса переваривающей способности разработаны в микроварианте, пригодном для использования в рутинных исследованиях Предложенные тесты просты в исполнении и их адекватность подтверждена другими методами исследований, высокая степень корреляции с классическими микроскопическими методами оценки данных показателей свидетельствует о высокой информативности предложенных методик Цитометрические методы оценки фагоцитарного числа и индекса переваривающей способности являются перспективным в комплексе методов оценки иммунной системы человека Эти методы позволяют в кратчайшие сроки получить результат и не уступают другим автоматизированным методам оценки фагоцитарного числа и индекса переваривающей способности При обследовании группы здоровых доноров, установлены границы нормальных значений для данных показателей. Данные методы возможно использовать для поточных исследований в лабораториях, оснащенных проточным цитофлюориметром или флюоресцентным микроскопом Предлагаемые цитометрические методы позволяют оценить степень нарушения в функционировании фагоцитарного звена у пациентов с наследственными и вторичными иммунодефицитами, позволяет проводить контроль эффективности лечения больных с дефектами фагоцитоза

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 3 научных работы Материалы исследований были представлены на VIII Конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (27-29 июня, Москва, 2007)

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 111 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения исследований, выводов, списка литературы, включающего 127 источников Работа содержит 15 таблиц и 20 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В процессе работы обследовано 132 человека Среди них- доноры крови - 65 здоровых добровольцев (44 женщины и 21 мужчина) в возрасте от 20 до 45 лет, больные с хроническим рецидивирующим фурункулезом - 45 человек (27 женщин и 18 мужчин) в возрасте от 19 до 56 лет, дети, больные ХГБ - 7 детей (1 девочка и 6 мальчиков) в возрасте от 8 мес до 15 лет, больные хроническим гематогенным остеомиелитом - 15 человек (9 мужчин и 6 женщин) в возрасте от 37 до 68 лет

Выделение лейкоцитов на желатине Для постановки большинства реакций использовали лейкоцитарную суспензию, полученную из гепаринизированной крови здоровых доноров В силиконизированную пробирку с 4 мл крови добавляли 2 мл 3% желатины на ФСБ с рН=7,4, инкубировали в течение 10-15 минут при 37°С для осаждения эритроцитов Лейкоциты, полученные из надосадочной жидкости, двукратно отмывали в ФСБ Подсчет концентрации лейковзвеси проводили с помощью красителя Задорожного-Дозморова в камере Горяева

Методика мечения микроорганизмов ФИТЦ для оценки поглотительной активности и ФЧ фагоцитов, бактерицидной активности лейкоцитов (внутриклеточного киллинга) Бактерии Суточные культуры второй пересев аигеив \Vood 46, (ГИСК им Л А Тарасевича) смывают изотоническим раствором хлорида натрия, убивают нагреванием 96-98°С 40 минут (для бактерий которые будут использоваться в постановке реакции внутриклеточного киллинга данный этап исключен), осаждают 1000g 25 минут, дважды отмывают в 10 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) рН 7,4

По стандарту мутности концентрацию бактерий доводят до 200 млн/мл карбонатно-бикарбонатным буфером рН 9,5 К взвеси бактерий добавляют ФИТЦ (Sigma) в конечной концентрации для убитых бактерий 0,1мг/мл, для живых 0,05 мг/мл инкубируют при +4 °С 12 часов Затем несвязавшийся ФИТЦ удаляется при трехкратной отмывке 1000g 25 минут ФСБ Концентрацию бактерий доводят до 500 млн в мл Часть меченых бактерий опсонизируют пуловой сывороткой и препаратом Ig G (Sigma) Для этого готовят маточный раствор препаратом Ig G в концентрации 1мг/мл, прогревают при 56°С 30 минут, осаждают при 250g 10 мин Далее одну часть меченых бактерий опсонизируют пуловой сывороткой, а другую Ig G в конечной концентрации 100мкг/мл в течение 30 мин 37°С, затем бактерии отмывают ФСБ дважды. Взвесь бактерий аликвотируют и хранят при +4 °С в течение 1 месяца, при -70 °С до 6 месяцев

Методика определения поглотительной активности лейкоцитов периферической крови с помощью ПЛЦ Реакцию ставят в круглодонном 96-луночном планшете в лунки помещают взвесь ФИТЦ-меченных стафилококков как не опсонизированных, так и опсонизированных предварительно пуловой сывороткой, либо препаратом Ig и лейковзвесь в соотношение клетки^! aureus 1 10, инкубируют при 37°С 20 минут, клетки осаждают 200g 1,5 мин , при +4°С. Эритроциты лизируют лизирующим раствором Лейкоциты однократно отмывают охлажденным ФСБ с 0,02 % ЭДТА Образцы фиксируют охлажденным раствором ФСБ, содержащим 2% параформальдегида и 0,02% ЭДТА Приготовленные таким образам пробы можно хранить до 2 суток при +4°С. Образцы анализируют на проточном цитофлюориметре Процент флюоресцирующих (фагоцитировавших) нейтрофилов и моноцитов высчитывается автоматически и выводится в соответствующих гистограммам таблицах статистики Рекомендуемое количество собираемых событий по нейтрофилам 3000.

Определение фагоцитарного числа лейкоцитов периферической крови по отношению к St aureus с помощью проточной цитометрии Постановку

реакции проводят по той же методике, что и определения поглотительной активности лейкоцитов периферической крови с помощью ПЛЦ Образцы анализируют на проточном цитофлюориметре Процент флюоресцирующих (фагоцитировавших) нейтрофилов и моноцитов высчитывается автоматически, он выводится в соответствующих гистограммам таблицах статистики, также оценивают Geo Mean клеток, который используют для расчета фагоцитарного числа клеток Рекомендуемое количество собираемых событий по нейтрофилам 3000 Фагоцитарное число — среднее количество частиц, захваченных одной клеткой Для расчета фагоцитарного числа используют такой параметр проточной цитометрии как GeoMean, который является средней геометрической интенсивности свечения клетки «х„), используется для логарифмической шкалы) и позволяет судить о количестве частиц, захваченных клеткой. Фагоцитарное число для лейкоцитов периферической крови в отношении St aureus рассчитываеся по следующей формуле:

ФЧ= ("GeoMeantbmi -GeoMeanKnt (GeoMeanst+fitc -GeoMeanst) где ОеоМеапфкл - GeoMean (интенсивность свечения) фагоцитировавших клеток, GeoMeanioi - GeoMean клетки (аутофлюоресценция клетки),GeoMeanst+fitc - GeoMean ФИТЦ меченного стафилококка, GeoMeanst - GeoMean немеченного стафилококка (аутофлюоресценция микроорганизмов).

Методика оценки бактерицидной активности (внутриклеточного киллинга) фагоцитов периферической крови человека Реакцию ставят в круглодонном 96-луночном планшете В лунку вносят 90 мкл стафилококка в концентрации 10млн/мл, 20 мкл пуловой сыворотки или Юмкл Ig G в концентрации 100мкг/мл и 90 мкл лейкоцитов Соотношение нейтрофилы бактерии равно 1 5 Смесь инкубируют 20 мин при 37°С, лейкоциты осаждают 200g 1 мин при +4°С и 2 раза отмывают ФСБ от несвязавшихся бактерий, ресуспендируют в 200 мкл ФСБ рН=7,4 и инкубируют 1ч и 3

9

часа при 37°С Планшет центрифугируют 200g 1 мин. при +4°С, лейкоциты разрушают в течение 5-10 мин. 200 мкл раствора следующего состава ЮмМ карбонатно-бикарбонатного буфера рН=9,5, 0,2% сапонина, бактерии осаждают 1000g 10 мин. и ресуспендируют в 200 мкл ФСБ с 2,5 мкг/мл пропидиума иодида, через 10-15 мин пробы анализируют на проточном цитометре Анализ образцов на проточном цитофлюориметре- по параметрам SSC и FSC в режиме Dot Plot отображают всю популяцию стафилококка По двум другим параметрам (FL1 (зеленая) и FL3 (красная флюоресценция) в следующем окне Dot Plot выделяют ФИТЦ-меченый стафилококк (правые квадранты), устанавливая окно дискриминации, чтобы исключить дебриз (левые квадранты) Проекцию окна, выделяющего зеленые и зелено-красные бактерии, на FL3 выводят в виде гистограммы со статистикой для автоматического подсчета процента убитых бактерий (ФИТЦ1ПИ+) по отношению к сумме убитых и живых (ФИТЦ'ПИ")

Методика оценки фенотипа нейтрофилов с помощью проточнолазерной цитометрии Для постановки реакции используют лейкоцитарную суспензию Для анализа фенотипа нейтрофилов клетки инкубировали с меченными моноклональными антителами 30 минут при 4°С Затем клетки осаждали и лизировали эритроциты, для этого в каждую лунку добавляли лизирующий раствор на 5-10 минут (до прозрачности раствора) Далее нейтрофилы дважды отмывали холодным ФСБ с 0 02%ЭДТА Отмытые клетки фиксировались ФСБ, содержащим 1% параформальдегида Клетки анализировали на проточном цитометре FACSCahbur при помощи программы CellQuest (Becton Dickinson). Оценивали Geo Mean клеток.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов выполняли с помощью прикладной программы Excel 98 фирмы Microsoft и Statistica 6 0 Достоверность уровня различия сравниваемых величин оценивали с помощью t-критерия Стьюдента, критериев Вилкоксона и Манна-Уитни Взаимосвязь изучаемых параметров оценивали с помощью коэффициента корреляции (г) при уровне значимости р<0,05 [Гланц С , 1999]

Обработку данных, полученных с помощью проточного цитометра FACSCalibur, осуществляли в операционной системе Wmdows-98 с помощью прикладной программы Win MDI 2.8 фирмы Microsoft.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Оценка фенотипа нейтрофилов с помощью проточнолазерной цитометрии.

Около 40 лет тому назад на наружной мембране лейкоцитов были выявлены рецепторы, взаимодействующие с опсонизированными бактериями, от которых зависит феномен опсонизации" рецепторы, взаимодействующие с Fc-фрагментами иммуноглобулинов (FcR) [Berken А, Benacerraf В, 1966], и рецепторы, взаимодействующие с пептидами, образующимися при расщеплении СЗ компонента комплемента (CR) Так как CR обладают лектиноподобными свойствами, с некоторыми микробами эти рецепторы могут взаимодействовать непосредственно, без участия комплемента (неопсонизированный фагоцитоз).

Комплемент принимает активное участие в опсонизации микробов, усиливая и их внутриклеточную гибель На нейтрофилах имеется три типа рецепторов для комплемента (CR) CRI (CD35), CR3(CD1 lb/CD18) и CR4, участвующих в фагоцитозе Интегрины играют исключительно важную роль в физиологии нейтрофилов От них зависит прикрепление нейтрофилов практически ко всем субстратам Основную роль во взаимодействии с субстратами, в том числе в поглощении частиц, опсонизированных пептидом iCR3b, принадлежит рецепторам CR3 (CDllb/CD18), в количественном отношении преобладающим над всеми другими рецепторами комплемента [Gasque Р, 2004] Определение фенотипа нейтрофилов, в частности CD16, CDllb, CD35, CD18, CD32, является важным этапом в комплексной оценке фагоцитарного звена иммунной системы, и позволяет оценить такой этап фагоцитоза как адгезия. Нами был обследован 31 здоровый донор Нормативные

параметры, полученные при оценке фенотипа нейтрофилов доноров, приведены в таблице 1

Таблица 1 Нормативные параметры фенотипа нейтрофилов

CD 16 CDllb CD18 CD32 CD35

М±с 977,5±177,1 220,8±64,9 47,4±17,5 153,3±30,7 46,3±10,7

М ± а - среднее значение ± стандартное отклонение

Показаниями к определению фенотипа нейтрофилов являются первичные и вторичные иммунодефицитные состояния, сопровождающиеся

хроническими воспалительными вялотекущими процессами.

Таблица 2 Фенотип нейтрофилов пациентов с хроническим рецидивирующим фурункулезом, атопическим дерматитом, осложненным пиодермией____

CD 16 CDllb CD18 CD32 CD35

ХРФ 1016 120 J. 22,2J. 123 42,6

АТД1 2062| 4731 юзт 751 96!

АТД 2 15971 463 Т 105Т 63| 116!

Нормативы (М± о) 977,5±177,1 220,8±64,9 47,4±17,5 153,3±30,7 46,3±10,7

М ± а - среднее значение ± стандартное отклонение

При обследовании пациента страдающего хроническим рецидивирующим фурункулезом, было обнаружено снижение CD1 lb, CD18 (табл 2), что может быть одной из причин хронического течения и рецидивирования заболевания Данные, полученные при оценке фенотипа нейтрофилов пациентов, страдающих атопическим дерматитом, осложненным пиодермией в стадии обострения представлены в таблице 2.

Определение фагоцитарного числа лейкоцитов периферической крови по отношению к St. aureus с помощью проточной цитометрии.

Фагоцитарное число — среднее количество частиц, захваченных одной клеткой В данной работе была поставлена задача отработать метод оценки фагоцитарного числа лейкоцитов периферической крови в частности нейтрофилов и моноцитов в отношении стафилококка с помощью проточной цитометрии Для расчета фагоцитарного числа мы использовали такой

12

параметр проточной цитометрии как GeoMean, который является средней геометрической интенсивности свечения клетки (nV(xi»x2. .хп), используется для логарифмической шкалы) и позволяет судить о количестве частиц, захваченных клеткой Фагоцитарное число для лейкоцитов периферической крови в отношении St aureus Wood 46 рассчитывался по следующей формуле:

ФЧ= ЮеоМеапФкл -GeoMeaimi) (GeoMeanst+fitc -GeoMeanst) где СеоМеапфкл - GeoMean (интенсивность свечения) фагоцитировавших клеток, GeoMeanioi - GeoMean клетки (аутофлюоресценция клетки), GeoMeanst+fitc - GeoMean ФИТЦ меченного стафилококка, GeoMeanst -GeoMean немеченного стафилококка (аутофлюоресценция микроорганизмов)

Нами был обследован 31 донор в возрасте от 20 до 40 лет. Средние величины фагоцитарного числа нейтрофилов и моноцитов в бессывороточной среде, при опсонизации Ig G, при опсонизации пуловой сывороткой со стандартными отклонениями представлены в таблице 3

Таблица 3. Фагоцитарное число лейкоцитов периферической крови при поглощении стафилококка (М± о).__

Нейтрофилы Моноциты

Без опсонизации 1,1±0,5 0,8±0,37

One IgG 3,8±1,12 2,2±0,7

One. пул сывороткой 9,3±2,0 3,3±1,19

М ± а. - среднее значение ± стандартное отклонение

Корреляционный анализ метода проточной лазерной цитометрии с микроскопическим методом оценки фагоцитарного числа

Необходимым этапом отработки цитометрического метода оценки поглощения явилось его сравнение с классическим методом оценки с помощью светового микроскопа Коэффициент корреляции составил г=0,85

при р<0,005. На рис. 1 отображена корреляция двух методов для определения фагоцитарного числа.

г-0,84

Микроскопия j confidence j

Рисунок 1. Корреляция между цитометрическими и микроскопическими данными, оценивающими фагоцитарное число нейтрофилов. Результаты приведены по поглощению в бессывороточной среде, при опсонизации Ig G и при опсонизации пуловой сывороткой у 9 пациентов.

Дифференциальный анализ поглощения и адгезии бактерий к лейкоцитам периферической крови методом гашения внеклеточной люминесценции

Для установления достоверности поглощения бактерий фагоцитами и исключения и адгезии мы использовали метод гашения внеклеточной люминесценции. В качестве гасящего агента использовали трипановый синий (Sigma) рН 4,4. Данные, полученные при изучении поглотительной активности лейкоцитов по отношению к St. aureus на проточном цитометре без гашения (пробы находились в растворе ФСБ при рН 4,4), а также с гашением трипановым синим рН 4,4 представлены в таблице 4. Не обнаружено достоверных отличий в пробах с гашением и без него как для нейтрофилов, так и для моноцитов. Следовательно, использование ЭДТА и дифференцированного центрифугирования достаточно для удаления от несвязавшихся бактерий и достоверной оценки поглотительной активности

фагоцитов, а следовательно, и для достоверного расчета фагоцитарного числа

Таблица 4 Результаты поглотительной активности лейкоцитов периферической крови доноров опсонизированных пуловой сывороткой по отношению к St aureus без гашения и с гашением трипановым синим

№ образца Нейтрофилы Моноциты

ФСБ pH 4,4 Трипановый синий pH 4,4 ФСБ pH 4,4 Трипановый синий pH 4,4

1 90 90 77 75

2 89 87 69 68

3 92 91 80 78

4 87 87 77 75

5 95 95 83 82

6 97 95 85 83

7 94 94 83 82

М±а 92±3,3 92±3,0 79±5,0 78±5,4

М±0- среднее значение ± стандартное отклонение

Применение цитометрического метода оценки фагоцитарного числа лейкоцитов при различных патологиях

Фагоцитарное число у пациентов сХГБ

Таблица 5 ФЧ нейтрофилов и моноцитов больных с ХГБ и доноров (М± а)

Без опсонизации Опс Ig G Опс пуловой сывороткой

нейтрофилы моноциты нейтрофилы моноциты нейтрофилы моноциты

ХГБ 0,5**±0,2 0,3**±0,1 1,0***±0,2 0,8***±0,2 1,7***±0,5 1,5***±0,3

Доноры 1,1±0,5 0,8±0,37 3,8±1,12 2,2±0,7 9,3±2,0 3,3±1,19

*** - р<0,0001 достоверное отличие ФЧ больных ХГБ по сравнению с ФЧ здоровых доноров, **- р<0,005 достоверное отличие ФЧ больных ХГБ по сравнению с ФЧ здоровых доноров М±о- среднее значение ± стандартное отклонение

Ярким примером необходимости определения не только фагоцитарного индекса, но и фагоцитарного числа является исследование данных

показателей у больных с ХГБ. Показатели фагоцитарного числа для нейтрофилов и моноцитов пациентов с ХГБ и доноров представлены в сравнении в таблице 5 Показатели фагоцитарной активности лейкоцитов (% фагоцитировавших клеток) у всех семи обследованных пациентов оказались в пределах возрастных норм, тогда как показатели фагоцитарного числа резко снижены и свидетельствуют о значительных нарушениях в фагоцитарном процессе у данных пациентов Что позволяет говорить о необходимости оценивать не только фагоцитарную активность клеток, как критерий функционирования фагоцитарного звена иммунной системы, но и фагоцитарное число у пациентов, страдающих хронической гранулематозной болезнью

Фагоцитарное число у пациентов с хроническим рецидивирующим фурункулезом (ХРФ) Нами было обследовано 28 пациентов с ХРФ в стадии обострения, а также 17 в стадии ремиссии заболевания.

12 0-1 10 0 -В О ¡,0 -

4 о - "Г" 1Г2.7"'

iPii.3, ППиш

20 О О

1,1 '.3 1

□ доноры

В] ХРФ, обострение

И ХРФ, ремиссия

One IgG One пул Сив

Рисунок 2 Фагоцитарное число нейтрофилов периферической крови пациентов с ХРФ *** - р<0,0005, **- р<0,005, *- р<0,05 достоверное отличие ФЧ больных с ХРФ по сравнению с ФЧ здоровых доноров

На рисунке 2 показаны отличия фагоцитарного числа пациентов с ХРФ в стадиях обострения и ремиссии по сравнению с ФЧ здоровых доноров Обнаружено, что фагоцитарное число нейтрофилов у пациентов страдающих ХРФ достоверно (р<0,05) снижено при опсонизации IgG, а также пуловой сывороткой по сравнению с ФЧ доноров Установлено, что при опсонизации St aureus препаратом IgG ФЧ нейтрофилов у пациентов с ХРФ в стадию

обострения снижено на 16%, а в стадию ремиссии на 29%, при опсонизации пудовой сывороткой на 15% и 22 % соответственно.

Фагоцитарное число у пациентов с хроническим гематогенным остеомиелитом cm обострения Было установлено, что у 13 пациентов страдающих хроническим гематогенным остеомиелитом средней степени тяжести в стадии обострения фагоцитарное число при опсонизации St aureus IgG ФЧ нейтрофилов пациентов составило 4,4±0,9, у доноров 3,8±1,1, при опсонизации пуловой сывороткой ФЧ нейтрофилов больных с остеомиелитом составило 10,6±1,4, в то время как у доноров оно было равно 9,3±2,0 Для моноцитов сохраняется та же тенденция к повышению фагоцитарного числа у пациентов Вероятно, это связано с выраженным воспалительным процессом и наличием большого количества активированных лейкоцитов У двоих пациентов, состояние которых оценивалось как крайне тяжелое, фагоцитарное число было резко снижено по всем трем позициям, как для нейтрофилов, так и для моноцитов Данные приведены в таблице 6

Таблица 6 ФЧ лейкоцитов пациентов с хроническим гематогенным остеомиелитом тяжелой степени тяжести

Без опсонизации One IgG Опс пуловой сывороткой

нейтрофилы моноциты нейтрофилы моноциты нейтрофилы моноциты

П№1 о,4; 0,2; 1,Щ 0,8Ц 2,7;; 1,4;

П №2 о,5; о,4; 1,5; 0,9Ц 3.8U 2,2;

Доноры 1,1±0,5 0,8±0,37 3,8±1,12 2,2±0,7 9,3±2,0 3,3±1,19

| - снижение показателя ФЧ, !! - выраженное снижение показателя ФЧ, М±о- среднее значение ± стандартное отклонение

Низкие значения ФЧ вероятно возникли, вследствие очень тяжелого течения заболевания

Оценка бактерицидной функции фагоцитов периферической крови человека (внутриклеточного киллинга бактерий) с помощью проточнолазерной цитометрии

Был обследован 31 донор в возрасте от 20 до 40 лет Мы оценивали внутриклеточный киллинг стафилококка фагоцитами доноров, через час и три часа инкубации Средние величины бактерицидной активности лейкоцитов периферической крови в отношении St aureus, опсонизированного препаратом Ig G или пуловой сывороткой, представлены в таблице 7 Максимальная бактерицидная активность выражена у фагоцитов при киллинге микроорганизмов, опсонизированных пуловой сывороткой и составила через час инкубации 32,5%, а через три часа 62,5% Бактерицидная активность лейкоцитов периферической крови по отношению к St. aureus, опсонизированного препаратом Ig G ниже киллинга микроорганизмов, опсонизированных пуловой сывороткой, и составила через час инкубации 19,7%, а через три 46,6%

Таблица 7 Бактерицидная активность лейкоцитов периферической крови

доноров по отношению к опсонизированному St aureus (М± о) в %

1 час 3 часа

Опсонизация Ig G (М± а) 19,7±4,5 46,6±5,3

Опсонизация пуловой сывороткой (М± о) 32,5±4,9 62,5±7Д

М±с- среднее значение ± стандартное отклонение

Показатели бактерицидной активности лейкоцитов периферической крови (внутриклеточный киллинг бактерий) при различных патологиях

Показатели киллинга St aureus лейкоцитами периферической крови у пациентов с ХГБ Бактерицидность фагоцитов пациентов, по отношению к стафилококку после часовой инкубации составила, при опсонизации St aureus Ig G 8,7%±1,2, при опсонизации пуловой сывороткой 10,3%±1,7, что более чем в три раза ниже нормы После трехчасовой инкубации динамики нарастания киллинга St. aureus фагоцитами пациентов с ХГБ не наблюдалось ни при опсонизации микроорганизмов Ig G, ни пуловой сывороткой и бактерицидность составляла 11,3 °/о±1,7 и 12,9±1,6 соответственно При определении функциональной активности нейтрофилов пациентов с ХГБ с

помощью люминолзависимой хемилюминесценции, показания которой коррелируют с киллингом, было установлено, что уровни хемилюминесценции как спонтанной, так и стимулированной, были близки к нулю

Бактерицидная активность фагоцитов периферической крови пациентов с ХРФ Было обследовано 28 человек с хроническим рецидивирующим фурункулезом в стадию обострения Через час инкубации бактерицидная активность фагоцитов пациентов была выше в сравнении с донорами и составила, при опсонизации St aureus Ig G 23,1%±4,2, а при опсонизации пуловой сывороткой 40,6%±4,8, что свидетельствует об остроте процесса и, вероятно, связано с большим количеством активированных клеток в кровяном русле Показатели бактерицидности пациентов, полученные после трехчасовой инкубации можно разделить на две группы В первой, (N= 15 человек), показатели бактерицидности были сравнимы с такими же у доноров и составили 47,6%± 4,0 при опсонизации Ig G, и при опсонизации пуловой сывороткой 65,2%±3,9 Во второй группе выявленные значения были достоверно ниже, чем у доноров и составили 38,7%±3,6 и 52,8%±5,3 соответственно Снижение бактерицидных свойств у части пациентов, страдающих хроническим рецидивирующим фурункулезом, возможно, является одной из причин хронического течения заболевания, а также его рецидивирования

Бактерицидная активность фагоцитов периферической крови пациентов с хроническим гематогенным остеомиелитом в стадии обострения Нами было обследовано 15 пациентов с хроническим гематогенным остеомиелитом в стадии обострения У 13 из них степень тяжести заболевания была средней, а двое находились в крайне тяжелом состоянии Было установлено достоверное усиление бактерицидных свойств фагоцитов пациентов как после часовой, так и после трех часовой инкубации Киллинг микроорганизмов фагоцитами пациентов первой группы составил после часовой инкубации при опсонизации микробов Ig G 24,5%±4,4 и при

19

опсонизации пудовой сывороткой 45,5%±4,4 После трех часовой инкубации, динамика нарастания бактерицидной активности фагоцитов пациентов сохранялась и была схожей с таковой у доноров, и киллинг микроорганизмов составил 52,5 %±4,2 и 70,4%±4,9 соответственно Усиление бактерицидных свойств фагоцитов пациентов свидетельствует об остроте процесса, большом количестве активированных клеток в кровяном русле Также было обследовано два пациента, с хроническим гематогенным остеомиелитом состояние которых оценивалось как крайне тяжелое У них был обнаружен крайне низкий уровень бактерицидной активности фагоцитов после часовой инкубации (данные представлены в таблице 8), который незначительно увеличивался после трехчасовой инкубации, динамика нарастания показателей была весьма незначительной Такой аномально низкий уровень киллинга у пациентов с заболеванием воспалительного характера свидетельствует об очень тяжелом течении заболевания Таким образом, показатели бактерицидности фагоцитов может также служить критерием тяжести заболевания

Таблица 8 Бактерицидность фагоцитов пациентов с остеомиелитом в крайне тяжелом состоянии.

1 час 3 часа

One IgG Опс пул сывороткой Опс Ig G Опс пул сывороткой

Пациент №1 12J. 19Ц 20Ц ззц

Пациент №2 141 18Ц 23Ц 3511

Доноры (М±а) 19,7±4,5 32,5±4,9 46,6±5,3 62,5±7,2

М±о- среднее значение ± стандартное отклонение

Определение индекса переваривающей способности лейкоцитов периферической крови по отношению к St. aureus с помощью проточной цитометрии.

Нами была предложена методика определение индекса переваривающей способности лейкоцитов периферической крови по

отношению к St aureus с помощью проточной цитометрии. Для постановки реакции использовали убитый St aureus-ФИТЦ1" Следует отметить, что если в реакции использовать живые микроорганизмы, то это будет замедлять процесс переваривания, т к они устойчивы к литическим ферментам Поэтому чтобы не смешивать процесс киллинга и деградацию микроорганизмов решили использовать предварительно убитый St aureus-ФИТЦ1 Постановку реакции проводили по методике подробно описанной в разделе материалы и методы Образцы, полученные через 20 минут инкубации и 3 часа инкубации анализируют на проточном цитофлюориметре Оценивают Geo Mean клеток, который используют для расчета индекса переваривающей способности Рекомендуемое количество собираемых событий по нейтрофилам 3000

Расчет индекса переваривающей способности фагоцитарных клеток (завершенность фагоцитоза) производится по следующей формуле

ИПС= ЮеоМеапфкл 20 мин -СеоМеапфкл 3 часа ) *100%

(ОеоМеапфкл 20 мин)

где ИПС - Индекс переваривающей способности, СеоМеапфкл 3 часа -GeoMean (интенсивность свечения) фагоцитировавших клеток через 3 часа инкубации, СеоМеапфкл 20 мин - GeoMean фагоцитировавших клеток через через 20 минут инкубации

Нами было обследовано 28 доноров в возрасте от 19 до 43 лет, мы оценивали индекс переваривающей способности при поглощении St. aureus ФИТЦ4", опсонизированного пуловой сывороткой При обследовании группы доноров получили, что ИПС составил 78,1%±7,6 В процессе работы установили степень корреляции между определением ИПС цитометрическим и классическим микроскопическим методом Для этого из исследуемых образцов после анализа на проточном цитометре готовились мазки, окрашивались по Романовскому-Гимзе и оценивались под иммерсионным объективом, подсчитываются число фагоцитирующих фагоцитов и число фагоцитированных микробов По ним производят расчет

следующихпоказателей фагоцитарный показатель, фагоцитарное число, показатель завершенности фагоцитоза Цитометрический метод оценки индекса переваривающей способности показал достаточную степень корреляции в сравнении с классическим микробиологическим методом коэффициент корреляции г оказался равным 0,816 при р<0,05

Исходя из вышеизложенных результатов, мы сделали вывод, что оценка завершенности фагоцитоза по такому параметру проточной цитометрии как Geo Mean фагоцитировавших клеток довольно точно отражает процесс деградации, происходящий в клетке

Применение метода оценки переваривающей способности фагоцитарных клеток (ИПС) у пациентов с различной патологией.

ИПС у пациентов с ХГБ Было обследовано пять пациентов, страдающих хронической гранулематозной болезнью Данные представлены в таблице 9 Было обнаружено, что индекс переваривающей способности у данных пациентов в среднем составил 72,4%±8,5, что было сравнимо с донорами, Тогда как некоторые авторы отмечали, что лейкоциты пациентов с ХГБ, слабо переваривают бактерии, в действительности, в этих лейкоцитах имеется генетический дефект НАДФН-оксидазы, что приводит к неспособности генерировать активные формы кислорода и убивать бактерии, однако состав и активность лизосомальных ферментов находится в норме [Seger R А , Berthet F , Hossle J Р , 1992]

Таблица 9 Индекс переваривающей способности фагоцитов пациентов с ХГБ

Пациент ИЗФ (%)

ХГБ 1 59

ХГБ 2 74

ХГБ 3 80

ХГБ 4 67

ХГБ 5 82

М±о 72,4±8,5

М±с- среднее значение ± стандартное отклонение

Индекс переваривающей способности у пациентов с ХРФ и хроническим гематогенным остеомиелитом Нами было обследовано 23 пациента, страдающих хроническим рецидивирующим фурункулезом в стадии обострения У 14 пациентов индекс переваривающей способности составил 80,4%±5,9,что сравнимо с данным показателем у доноров 78,1%±7,6 и может свидетельствовать о том, что состав и активность лизосомальных ферментов у данной группы пациентов находится в норме У 9 пациентов индекс переваривающей способности, составил 53,9%±6,9, что достоверно р<0,0001 ниже, чем у доноров, что свидетельствует о нарушении протеолитической деградации поглощенного объекта и может являться одной из причин хронического течения заболевания

ВЫВОДЫ

1 При обследовании группы доноров определены нормативные значения экспрессии поверхностных маркеров нейтрофилов СБ 16 978,0±177,1, СБ11Ь/18 221,0±64,9/47,4±17;5, СБ32 153,3±30,7, СБ35 46,3±10,7 У некоторых пациентов, страдающих хроническим рецидивирующим фурункулезом, было обнаружено снижение экспрессии СВ11Ь/СВ18, что может быть одной из причин рецидивирования и хронического течения заболевания

2 Разработан метод определения фагоцитарного числа с помощью проточной лазерной цитометрии При обследовании группы здоровых доноров, определены нормативные значения фагоцитарного числа и показана значимость его определения на разных стадиях заболевания и при различных нозологиях; в частности у пациентов ХГБ, а так же с ХРФ фагоцитарное число снижено, у большинства пациентов с хроническим гематогенным остеомиелитом в стадии обострения ФЧ повышено, резкое снижение ФЧ наблюдается у больных с остеомиелитом, находящихся в крайне тяжелом состоянии

3 Разработан метод определения индекса переваривающей способности фагоцитов с помощью проточной лазерной цитометрии, установлены нормативные параметры, они составили 78,1±7,6% и показано, что ИПС снижен у части пациентов с ХРФ, а также у пациентов хроническим гематогенным остеомиелитом, у пациентов с ХГБ индекс переваривающей способности фагоцитов соответствует нормативным значениям

4 Установлена высокая корреляция разработанных методов по определению ФЧ и ИПС с классическими микроскопическими методами индекс корреляции г составил 0,85 при р<0,005 и 0,82 при р<0,05 соответственно

5 Оптимизирован метод оценки внутриклеточного киллинга лейкоцитами периферической крови Установлена важность определения внутриклеточного киллинга в динамике, через 1 и 3 часа инкубации, что в ряде случаев позволяет выявить наличие дефекта в фагоцитарном процессе Установлено достоверное снижение бактерицидной активности фагоцитов у части пациентов с ХРФ после 3-х часовой инкубации она составила 53,0±5,3%

6 Изменения во внутриклеточном киллинге не всегда влекут за собой изменения в переваривающей способности лейкоцитов периферической крови Так у пациентов с ХГБ при резком снижении внутриклеточного киллинга 1 час 10,3±1,7%, 3 часа 13,0±1,6%, индекс переваривающей способности фагоцитов соответствует нормативным значениям и составляет 72,4±8,5%

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1 Олиферук Н С , Ильинская А. Н, Пинегин Б В. Оценка фагоцитарной и бактерицидной активности нейтрофилов, макрофагов и незрелых дендритных клеток Иммунология, 2005, №1, с 10-12

2 Будихина А С , Олиферук Н С , Пинегин Б В Оценка бактерицидной активности сыворотки крови с помощью лазерной проточной цитофлюориметрии Клиническая лабораторная диагностика, 2006, №10, с 48-51

3 Олиферук Н С, Пинегин Б В, Определение фагоцитарного числа лейкоцитов периферической крови по отношению к Staphylococcus aureus с помощью проточной лазерной цитометрии Иммунология, 2007, №4, с 236-240

Подписано в печать }1 0?. 08 г Формат 60x84/16 Тираж 100 экз Заказ2

Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОЩ РАМН им НН БлохинаРАМН

115478, Москва, Каширское ш, 24

Актуальность темы диссертацииСистему фагоцитоза можно определить как совокупность клеток и гуморальных факторов, обеспечивающих базальный уровень структурного гомеостаза. [Маянский А.Н., Пикуза О.И., 1993] Центром системы фагоцитоза служат фагоциты. В этом термине отражается один из самых ярких функциональных признаков данных клеток — способность к поглощению и уничтожению чужеродного материала. Как сейчас установлено, фагоциты участвуют в клеточном взаимодействии, антигеном распознавании, процессинге и презентации антигенов. Конечным вариантом любого иммунного ответа является разрушение патогена или дефектных структур и их элиминация. Основные механизмы разрушения при гуморальном и клеточном вариантах иммунного ответа связаны с фагоцитозом. Дефекты функции фагоцитов могут существенно ухудшить эффективность и адекватность любого вариантов иммунного ответов. Как высокочувствительный индикатор нормы и патологии, фагоциты служат полезным инструментом не только иммунологической, но общеклинической диагностки. В организме человека фагоцитирующую функцию выполняют несколько типов клеток. Прежде всего, это те клетки, которые осуществляют защиту при каких-либо инфекциях и инвазиях - макрофаги, моноциты и нейтрофилы. В меньшей степени она представлена у эозинофилов и базофилов.

Одной из важных задач клинической иммунологии является всесторонняя оценка иммунного статуса. Она включает в себя следующий комплекс основных тестов: оценка фагоцитоза, гуморального иммунитета и системы комплемента, иммунофенотипированця лимфоцитов, функциональная активность лимфоцитов и оценка интерферонового статуса [Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., 1992]. Изучение показателей фагоцитоза имеет значение в комплексном анализе диагностики как первичных таких как хронической гранулематозной болезни, синдрома Чедиака-Хигаси, дефицита миелопероксидазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, синдроме «ленивых лейкоцитов», нарушение опсонизирующей активности сыворотки крови (дефицит компонента комплемента, гипогаммаглобулинемии) [Вельтищев Ю.Е., 1996, Йегер Л., 1990], так и вторичных иммуподефицитных состояний: часто рецидивирующие гнойные воспалительные процессы, длительно не заживающие раны, склонность к послеоперационным осложнениям [Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1995, Маянский А.Н., Пикуза О.И., 1993]. Но вместе с этим, методические подходы к оценке фагоцитоза являются довольнотрудоемкими и длительными, что не позволяет их широко использовать в клинической лабораторной практике. Современным подходом в изучении структуры и функции клеток является проточная цитометрия, её возможности позволяют также изучать и этапы фагоцитоза. Существующие методы оценки функциональной активности фагоцитов с использованием проточной цитометрии обобщены в ряде обзоров [Van Eeden S.F. et al., 1999, Bjerknes R., Bassoe C.F., 1989, Bassoe C.F., 1984]. Высокая точность, объективность скорость анализа, простота постановки реакции характеризуют изучение фагоцитоза с помощью автоматической проточной цитофлюориметрии.

Цель работыОптимизация существующих методов и создание новых подходов к оценке функциональной активности фагоцитов периферической крови с помощью проточной лазерной цитометрииЗадачи исследования:1. Оценить значение исследования фенотипа нептрофилов CD16, CD1 lb/18, CD32, CD35 в норме и при некоторых патологиях.

2. Разработать цитометрические методы определения фагоцитарного числа и индекса переваривающей способности лейкоцитов периферической крови в отношении St. aureus.

3. Отработать методики и оценить корреляцию определения фагоцитарного числа и индекса переваривающей способности фагоцитов по сравнению с классическими микроскопическими методами.

4. Исследовать фагоцитарное число и индекс переваривающей способности лейкоцитов периферической крови в отношении St. aureus у здоровых доноров in vitro для определения интервалов нормальных значений показателей.

5. Определить фагоцитарное число и индекс переваривающей способности у пациентов с наследственными и вторичными нарушениями фагоцитарного звена.

6. Оптимизировать метод оценки бактерицидной активности (внутриклеточный киллипг) фагоцитов с помощью проточной лазерной цитометрии, определить интервалы нормальных значений, оценить бактерицидную активность при наследственных и вторичных нарушениях фагоцитарного звенаНаучная новизнаВпервые предложена и внедрена в клиническую практику модифицированная цитометрическая методика для оценки фагоцитарного числа лейкоцитов периферической крови в отношении St. aureus - ФИТЦ+Впервые предложена и внедрена в клиническую практику модифицированная цитометрическая методика для оценки определения индекса завершенности фагоцитоза лейкоцитов периферической крови в отношении St. aureus - ФИТЦ+С помощью предложенных новых методов исследовано фагоцитарное число лейкоцитов периферической крови в отношении St. aureus - ФИТЦ+, а также индекса переваривающей способности фагоцитов в норме и при патологиях, а так же проведена корреляция между предложенными методами и классическим микробиологическим методом.

С помощью созданных методов было выявлено резкое снижение фагоцитарного числа лейкоцитов периферической крови пациентов с ХГБ в отношении St. aureus - ФИТЦ+, при нормальном уровне поглотительной активности (% фагоцитировавших клеток) и индексе переваривающей способности. Цитометрические методы оценки фагоцитарного числа и индекса переваривающей способности фагоцитов позволили выявить, что у пациентов, страдающих хроническим рецидивирующим фурункулезом, фагоцитарное число ниже нормы и у некоторых из них значительно снижен индекс завершенности фагоцитоза. При обследовании пациентов с хроническим гематогенным остеомиелитом обнаружено резкое снижение фагоцитарного числа лейкоцитов при крайне тяжелом течении заболевания, а ИПС был снижен у большинства пациентов.

Установлена важность определения внутриклеточного киллинга в динамике, через 1 и 3 часа инкубации, что в ряде случаев позволяет выявить наличие дефекта в фагоцитарном процессе.

Практическая значимость работыЦитометрические методы оценки ФЧ и ИПС разработаны в «микроварианте», пригодном для использования в рутинных исследованиях. Получены нормативные значения исследуемых показателей. Высокая степень корреляции (г=0,8) с классическими микроскопическими методами оценки данных показателей свидетельствует обинформативности предложенной методики. Данные методы возможно использовать для поточных исследованиях в лабораториях оснащенных проточным цитофлюориметром или флюоресцентным микроскопом. Предлагаемые цитометрические методы позволяют оценить степень нарушения в функционировании фагоцитарного звена у пациентов с наследственными (первичными) и вторичными иммунодефицитами.

выводы

1. При обследовании группы доноров определены нормативные значения экспрессии поверхностных маркеров нейтрофилов СБ 16 = 977,5± 177,1, СЭ11Ь/18 = 220,8±64,9/47,4±17,5, СВ32 = 153,3±30,7, СЭ35 = 46,3±10,7. У некоторых пациентов, страдающих хроническим рецидивирующим фурункулезом, было обнаружено снижение экспрессии СБ11Ь/СП18, что может быть одной из причин рецидивирования и хронического течения заболевания.

2. Разработан метод определения фагоцитарного числа с помощью проточной лазерной цитометрии. При обследовании группы здоровых доноров, определены нормативные значения фагоцитарного числа и показана значимость его определения на разных стадиях заболевания и при различных нозологиях; в частности у пациентов ХГБ, а так же с ХРФ фагоцитарное число снижено, у большинства пациентов с хроническим гематогенным остеомиелитом в стадии обострения ФЧ повышено, резкое снижение ФЧ наблюдается у больных с остеомиелитом, находящихся в крайне тяжёлом состоянии

3. Разработан метод определения индекса переваривающей способности фагоцитов с помощью проточной лазерной цитометрии, установлены нормативные параметры, они составили 78,1%±7,6 и показано, что ИПС снижен у части пациентов с ХРФ, а также у пациентов хроническим гематогенным остеомиелитом, у пациентов с ХГБ индекс переваривающей способности фагоцитов соответствует нормативным значениям.

4. Установлена высокая корреляция разработанных методов по определению ФЧ и ИПС с классическими микроскопическими методами: индекс корреляции г составил 0,85 при р<0,005 и 0,816 при р<0,05 соответственно.

5. Оптимизирован метод оценки внутриклеточного киллинга лейкоцитами периферической крови. Установлена важность определения внутриклеточного киллинга в динамике, через 1 и 3 часа инкубации, что в ряде случаев позволяет выявить наличие дефекта в фагоцитарном процессе. Установлено достоверное снижение бактерицидной активности фагоцитов у части пациентов с ХРФ после 3-х часовой инкубации она составила 52,8%±5,3.

6. Изменения во внутриклеточном киллинге не всегда влекут за собой изменения в переваривающей способности лейкоцитов периферической крови. Так у пациентов с ХГБ при резком снижении внутриклеточного киллинга 1 час 10,3***±1,7, 3 часа 12.9***±1,6, индекс переваривающей способности фагоцитов соответствует нормативным значениям и составляет 72,4±8,5.