Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Новые подходы к оценке функциональной активности лимфоцитов с помощью проточной лазерной цитометрии

На правах рукописи

РГБ ОД

1 5 АПР 2002

БАХУС Галина Олеговна

НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ОЦЕНКЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ С ПОМОЩЬЮ ПРОТОЧНОЙ ЛАЗЕРНОЙ ЦИТОМЕТРИИ

14.00.36-Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2002

Работа выполнена в Институте иммунологии Федерального управления «Медбиоэкстрем» при Министерстве здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Пинегин Б. В.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Кадагидзе 3. Г. доктор биологических наук Филатов А. В.

Ведущая организация:

Российский государственный медицинский университет

С>п

часов на

Защита состоится ;/;''/2002 г. в_

/

заседании диссертационного совета 208. 017. 01 при Институте иммунологии ФУ «Медбиоэкстрем» при МЗ РФ по адресу:

115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24, корп. 2. Автореферат разослан

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института иммунологии ФУ «Медбиоэкстрем» при МЗ РФ

Ученый секретарь

диссертационного совета, ■>,>

доктор медицинских наук ^^^ ^•^^/ ''Сеславина Л.С.

/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы диссертации. Одной из важнейших задач клинической иммунологии является всесторонняя оценка иммунного статуса. Она включает в себя следующий комплекс основных тестов: оценка фагоцитоза, гуморального иммунитета и системы комплемента, иммунофенотипирование лимфоцитов, функциональнальная активность лимфоцитов и оценка интерферонового статуса. [Петров Р. В.,"1984; 1997, Ковальчук Л. В., Чередеев А. Н., 1990, Хаитов Р. М., Пинегин Б. В., 2001].' При многих заболеваниях и вторичных иммунодефицитах наблюдается нормальное количественное содержание лимфоцитов, нй их функции зачастую изменены в значительной степени, и это может являться'определяющим звеном в патогенезе того или иного заболевания. Изменения функциональной активности лимфоцитов происходят при первичных иммунодефицитах, связанных с нарушениями клеточного иммунитета, вторичных иммунодефицитах, связанных с нарушениями клеточного иммунитета, которые развиваются вследствие'воздействия на организм какого-либо повреждающего фактора (ВИЧ-инфекция, острые и хронические вирусные инфекции, злокачественные заболевания и др.), при физиологических иммунодефицитах, например, при старении. Оценка клеточного звена иммунитета с целью диагностики, лечения, профилактики и прогнозирования этих заболеваний является актуальной задачей общей и клинической иммунологии. Для этих целей клинический иммунолог имеет достаточно большой спектр методов иммунологического' исследования. Но в связи с непрерывным движением иммунологической науки вперед задача разработки и внедрения в медицинскую практику информативных и адекватных тестов определения различных параметров иммунной системы продолжает оставаться важной задачей.

Результаты пролиферативного ответа лимфоцитов оцениваются чаще всего с помощью микроскопического метода (морфологическая идентификация и подсчет процента бластов), либо с помощью включения радиоактивной метки, либо с помощью МТТ-теста, основанного на изменении цвета связывающегося с клетками красителя из синего в желтый. Функциональную активность естественных (натуральных) киллерных клеток (Г\1К) чаще всего оценивают так же в радиоактивных цитотоксических тестах, используя в качестве мишеней меченые 3Н- уридином или 51 Сг клетки различных ЫК-чувствительных линий.[

Neville M. E., Oshimi К., 1981,Саидов M. 3. и соавт., 1986, Кулаков В. В., Пинегин Б. В., 1995]. NK-клетки лизируют клетки- мишени, такие, как, например, линия К-562, и мишени выделяют в среду культивирования радионуклид. По количеству высвободившейся из мишеней радиоактивной метки и определяют NK-активность. Традиционные методики имеют ряд недостатков, в случае микроскопического метода - это высокая субъективность оценки результата, в случае радиоактивных методов - использование радиоактивного излучателя.

С появлением проточной лазерной цитометрии (ПЛЦ) более 20-ти лет назад значительно расширились возможности изучения всех показателей иммунного статуса. Методы изучения клеточного звена иммунной системы с помощью проточной цитометрии имеют ряд неоценимых преимуществ: объективность, высокая скорость и точность анализа, простота постановки реакции, быстрое получение результата, безопасность.

В связи с этим целью работы явилась разработка цитометрических методов оценки цитотоксической активности NK-клеток и пролиферативной активности лимфоцитов крови человека пригодных для рутинных исследований в лаборатории клинической иммунологии.

Для проверки эффективности разработанных методов с перспективой их дальнейшего внедрения в лабораторную практику мы использовали три подхода: во-первых, сравнение новых методик с хорошо себя зарекомендовавшими старыми методами, во-вторых, применение новых методик для детекции изменений функций лимфоцитов под воздействием имунотропных веществ, в-третьих, определение с помощью разработанных методов нарушения функциональной активности лимфоцитов у больных с первичными и вторичными иммунодефицитами.

Задачи исследования.

1. Разработать микрометод оценки цитотоксической активности NK-клеток с использованием проточной лазерной цитометрии.

2. Разработать метод оценки функциональной активности лимфоцитов - их способности к пролиферации и бласттрансформации под влиянием Т-кпеточного митогена с использованием проточной лазерной цитометрии.

3. Провести корреляционный анализ между цитометрическими и классическими методами определения функциональной активности лимфоцитов.

- 4. Показать возможность изучения функциональной активности лимфоцитов с помощью цитометрической методики для оценки действия иммунотропных лекарственных препаратов на клетки иммунной системы.

5. Апробировать разработанные методики на больных с нарушениями этого звена иммунной системы.

Научная новизна. Разработана оригинальная методика, позволяющая оценивать цитотоксическую активность ЫК клеток периферической крови человека на клетки-мишени эритромиелобластоидной линии К-562. Оригинальность метода заключается в том, что впервые для данных целей применен флюоресцентный краситель -5- и 6-карбоксифлюоресцеиндиацетат-сукцинилмидил эфир, ковалентно связывающийся с белками клетки и обеспечивающий ей тем самым стойкое флюоресцентное окрашивание. Все это позволяет выделить клетки-мишени из общей массы реагирующих клеток, а дальнейшее применение пропидиума иодида (Р1) позволяет определить убитые киллерами мишени. Показана высокая степень корреляции данного метода с классическим радиоактивным тестом (коэффициент корреляции составил 0,75 при р<0,05).

С помощью цитометрического метода установлено достоверное повышение цитотоксической активности ¡МК-клеток здоровых доноров под воздействием Аллоферона - олигопептида с цитокиноподобной активностью.

Эффективность разработанной методики подтверждает её клиническая значимость: достоверное снижение функций ЫК-клеток у обследованных больных ВИЧ-инфекцией и у ребенка с синдромом Чедиака-Хигаси.

Модифицирован и адаптирован метод оценки функциональной активности лимфоцитов - их бласттрансформации и пролиферации с помощью проточной лазерной цитометрии. Предложены три параметра измерения активности вместо одного в радиоактивном методе: процент бласттрансформации, митотическая активность бластов и индекс деления, которые позволяют более подробно оценить функциональное состояние лимфоцитов. Новая методика имеет высокую степень корреляции с радиоактивным методом.

Коэффиценты корреляции по всем трем параметрам были высокими (0,72, 0,75 и 0,73)при р<0,05.

С помощью цитометрической методики установлено значительное угнетение как бласттрансформации, так и дальнейшей пролиферации лимфоцитов здоровых доноров под влиянием циклоспорина А - ингибитора синтеза ИЛ2. Цитометрический метод прзволил более детально изучить влияние этого иммуносупрессора на поведение лимфоцитов: установлено, что его влияние является дозозависимым.

При помощи разработанной методики подтверждено достоверное снижение функций лимфоцитов больных ВИЧ-инфекцией - их способности отвечать активацией и пролиферацией на поликлональный Т-митоген-фитогемагглютинин.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Двойная метка (КФСЭ/Р1) для клеток-мишеней К-562 является оптимальной в цитометрической методике оценки функциональной активности ЫК-клеток - их способности убивать мишени в 4-х часовом цитотоксическом тесте.

2. Использование меченых 5-,6-карбоксифлуоресцеиндиацетат-сукцинилмидил эфиром клеток линии К-562 позволяет более точно, быстро и эффективно оценивать цитотоксическую активность ЫК клеток, фиксировать эффекты влияния иммунотропных веществ на изучаемый параметр и подробно изучать его при различных патологиях.

3. Использование меченых 5-,6-карбоксифлуоресцеиндиацетат-сукцинилмидил эфиром мононуклеаров периферической крови позволяет точно и эффективно исследовать их способность отвечать бласттрансформацией и пролиферацией на митоген.

4. Применение проточной лазерной цитометрии позволяет всесторонне оценивать, во-первых степень влияния различных иммунотропных веществ на функциональную активность лимфоцитов, во-вторых изучать более тонкие механизмы функционирования лимфоцитов при различных иммунопатологиях.

Практическая значимость работы. Методы оценки функциональной активности лимфоцитов разработаны в микроварианте, подтверждены

классическими радиоактивными методами, набраны нормативные показатели, поэтому их можно использовать в рутинных исследованиях в любой иммунологической лаборатории при наличии проточного цитометра. Разработанные методы включены в методическоее пособие для врачей-лаборантов «Применение лазерной цитометрии для оценки функциональной активности иммунной системы человека».

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ в центральных отечественных журналах и издано методическое пособие для врачей-лаборантов.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 101 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных и выводов. Библиографический указатель включает 90 источников. Работа содержит 9 таблиц, 18 рисунков и 6 приложений.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Материалы и методы

В процессе работы было обследовано 73 человека, из них 45 доноров, 27 ВИЧ-больных, и 1 ребенок с синдромом Чедиака - Хигаси.

В группу доноров вошло 45 человек в возрасте 18-42-х лет (средний возраст 25,5 года) из них 29 мужчин и 16 женщин. Большинство из них являлись донорами пункта переливания крови при КБ № 7 г. Москвы.

В группу больных ВИЧ-инфекцией вошло 27 пациентов в возрасте от 19 до 48 лет (средний возраст 29,5 года). Клиническое наблюдение осуществляла кандидат медицинских наук М. Н. Папуашвили. ВИЧ-инфицированные люди находились на стадии пре-СПИДа с различными клиническими проявлениями этого заболевания: хронические инфекции бронхо-легочного аппарата, герпетические и цитомегаловирусные инфекции, кандидоз, диарея и др. Срок инфицирования больных колебался от 1 года до 10 лет.

Ребенок с синдромом Чедиака-Хигаси - мальчик 4,5 лет обследовался и находился на лечении в отделении клинической иммунологии Детской Республиканской Клинической больницы г. Москвы, заведующий - кандидат мед. наук, Кондратенко И. В.

Мечение 5- и 6-карбоксифлюоресцеиндиацетат-сукцинилмидил эфиром (КФСЭ) клеток линии К-562 и мононуклеаров периферической крови осуществляли в модификации методов Angulo et al (1998) и Fulcher D.A. et al (1999).

Мононуклеары выделяли по стандартной методике на градиенте плотности фиколл-пака (р=1,077)

Анализ образцов клеточных суспензий на проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson) с аргоновым лазером (исходная длина волны 488 нм) проводится на основе определения пяти параметров: малого. углового светорассеяния (FSC), бокового светорассеяния (SSC) и трёх показателей

* флуоресценции - зеленой FL1 для ФИТЦ (светофильтр 530 нм) оранжевой FL2

• для фикоэритрина, (светофильтр 585 нм) красно-малиновой FL3 для перидинхлорофилпротеина РегСР (светофильтр 697 нм). Флюоресценция PI имела широкий диапазон и находилась в промежутке между FL2 и FL3 с максимумом свечения при длине волны 620 нм, поэтому при двойном окрашивании КФСЭ и PI для более четкого отделения от КФСЭ флюоресценцию PI измеряли по FL3. Забор лимфоцитов и клеток линии К-562 осуществляли при высокой скорости. Данные поступали и анализировались с высоким разрешением по 1024 каналам на компьютере «Mackintosh». Программное обеспечение -

■■■'CellQuest.

-Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программного продукта фирмы «Microsoft» (США) - программы Excel 97. Достоверность ■гразличия между группами оценивали с помощью t- критерия Стьюдента. ii Взаимосвязь исследуемых величин оценивалась при помощи коэффициента ¡■корреляции г при уровне значимости р<0,05. Перенос и обработка цитометрических- 'файлов из компьютера «Mackintosh» в компьютер «1ВМ» ; осуществлялись с помощью программы WinMDI 2.0 фирмы «Microsoft».

2. Результаты и обсуждение 2.1. Разработка метода оценки функциональной активности NK-клеток » периферической крови с использованием проточной цитофлюорометрии.

. • -Мечение клеток-мишеней флюоресцентным красителем. При выборе красителя для цитометрического метода оценки способности NK-клеток убивать

клетки-мишени мы руководствовались следующими требованиями: краситель должен 1)иметь высокий квантовый выход (интенсивность свечения на одну молекулу), 2) прочно связываться с компонентами клетки, не меняя её жизнеспособность и функции, 3) длительно (недели) удерживаться клеткой, 4) быть недорогим.

В контексте этих требований мы выбрали как наиболее подходящий для лабораторной диагностики. 5-,6-карбоксифлуоресцеиндиацетат-сукцинилмидил эфир - КФДАСЭ [Parish (1999), Weston (1990)]. Первоначально нефлюоресцирующий, он проникает через клеточную мембрану, где от него отщепляются две ацетатные группы, и КФДАСЭ превращается в 5- и 6-карбоксифлуоресцеин-сукцинилмидил эфир (КФСЭ). Сукцинимидильная часть молекулы КФСЭ активно взаимодействует с аминогруппами и ковалентно связывает 5- и 6- карбоксифлюоресцеины (КФ) с внутриклеточными молекулами, часть из которых является "долгоживущими", формируя конъюгаты, которые не могут покинуть клетку быстро, чем и обеспечивается её стойкое и яркое флюоресцентное окрашивание Окрашенные КФСЭ клетки мишени можно легко выделить на цитометрической картинке из всех клеток, вовлеченных в реакцию.

В качестве второй флюоресцентной метки, окрашивающей только мертвые клетки, мы выбрали пропидиума йодид. Хорошее сочетание этих двух красителей (КФСЭ-PI) для двухпараметрического анализа в силу достаточной удаленности спектров их испускания, быстрота и прочность связывания КФСЭ с клетками-мишенями являлись основными причинами выбора такого метода анализа.

Облака живых и убитых клеток четко разграничивались по интенсивности свечения PI по FL3. Таким образом, среди всех вовлеченных в реакцию клеток мишени-К-562 определяются в координатах FL1-FL3 как, светящиеся зеленым по FL1 (включившие в себя КФСЭ) а "убитые" среди них определяются как светящиеся и по красному свечению FL3 (включившие и PI - рис. 1).

Учитывая эти эксперименты, мы пометили клетки линии К-562, которая является классической моделью для изучения цитолитической активности естественных киллеров. Клетки К-562 брали на второй день после их пересева, их жизнеспособность после отмывки должна была составлять не менее 95%, доводили до концентрации 106 кл./мл и окрашивали КФСЭ в течение 10 минут в среде RPMI-1640 (без белка). Затем клетки доводили до концентрации 0,1х106

полной культуральной средой - ПКС (RPMI-1640 с 10% сывороткой плода коровы, 2 мМ L-глютамина и 40мкг/мл гентамицина).

Выделение клеток-эффекторов. В качестве клеток-эффекторов мы использовали мононуклеары периферической крови здоровых доноров, которые выделяли по стандартной методике на градиенте плотности фиколл-пака.

Клетки-мишени смешивали с клетками- эффекторами в трёх соотношениях: 1:10, 1:50 и 1:100. В качестве контроля использовались клетки линии К-562, инкубированные только в присутствии среды. По окончании реакции клеточную взвесь переносили в цитометрические пробирки, и к ней добавляется йодистый пропидий - PI. Затем пробы анализировались на проточном цитометре. Процент убитых клеток К-562 (NK активность данного образца) вычисляли путем вычитания значения, полученного в контроле (K-562+среда) из значения опытного образца (K-562+мононуклеары).

Анализ образцов клеточных суспензий проводился на проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson, программное обеспечение - CellQuest.) с аргоновым лазером (исходная длина волны 488 нм). Сначала проводится гейтинг исследуемых клеток линии К-562 в координатах FSC (ось абсцисс) и SSC (ось ординат) - на экран компьютера выводится Dot Plot FSC-SSC. Затем данную группу анализировали на налиМие флуоресценции в координатах FL1 зеленое свечение (ось'абсцисс) и FL3 красно-малинововое свечение (ось ординат), для этого на экран выводится Dot Plot FL1-FL3. Проекцию окна выделяющего зеленые клетки (К-562+ КФСЭ) и красо-зеленые клетки (К-562+ КФСЭ+PI) выводили в виде гистограммы со статистикой для обсчета процента убитых мишеней, несущих двойную метку (правый верхний квадрат) к сумме живых и убитых клеток (нижний правый квадрат), при этом из счета исключались немеченые лимфоциты левые верхний и нижний квадраты (рис.1). Среднее значение процента убитых К-562 через 4 часа в контроле (клетки+среда) составляет 3,6±1,6 % У здоровых доноров средний процент убитых в ходе реакции К-562 зависит от соотношения «эффектор- мишень» и достигает максимума через 6 часов от начала реакции (рис. 2), а затем снижается, вероятно, вследствие лизиса уже мёртвых клеток.

Табл. 1. Процент «убитых» в цитотоксической реакции клеток линии К-562 через 2, 4 и 6 часов у здоровых доноров. *- р< 0,05 по сравнению с контролем (К562+среда).

Процент убитых мишеней

время Через 2 часа Через 4 часа Через 6 часов

N=20 100:1 50:1 10:1 100:1 50:1 10:1 100:1 50:1 10:1

М+ст 25,5* 20,8* 12,2* ± ± ± 13,2 12,3 9,8 38,3* 30,9* 16,7* + ± ± 16,2 15,8 13,6 40,2* 39,7* 33,3* ± ± ± 18,3 18,9 21,8

Рис. 1. Цитофлюорограммы меченых клеток К-562 в

- контроле - А - Dot Plot FSC-SSC с изображением только КФСЭ-меченых клеток К-562 - R1 и Б - Dot Plot FL1-FL3 с изображением облака спонтанно погибших и живых клеток К-562. Спонтанно погибшие мишени составляют в данной пробе 6 % - правый верхний квадрат.

-опыте - В - Dot Plot FSC-SSC с изображением всех вовлеченных в реакцию клеток и Г- Dot Plot FL1-FL3 с изображением облака убитых клеток К-562. Они составляют 39% (правый верхний квадрат), Левые верхний и нижний квадраты -мертвые и живые соответственно лимфоциты. Динамика роста убитых NK клетками мишеней К-562 представлена на рисунке 2.

*

Рис. 2. Зависимость количества убитых клеток линии К-562 ЫК-клетками здоровых доноров от времени. Ряд1 - соотношение «эффектор-мишень» 10:1, ряд 2 - 50:1 и ряд 3 -100:1. Приведены средние значения по всем донорам.

По степени активности их ЫК-клеток всех доноров мы разделили на 3 условные группы - нормальные, слабо- и сильно реагирующие. Средние значения по всем донорам представлены в таблице 1.

У доноров I группы мононуклеары не обладали выраженной цитотоксичностью, Процент «убитых» у них мишеней через 2 часа соответственно соотношениям эффектор-мишень составил 13,0±0,7%, 9± 1,7%, 3%; через 4 часа 16,5±0,7%, 13±5,7% и 3,5±0,7%; через 6 часов-15,5+0,7 %, 13± 5,7% и 1,0%. Мононуклеары доноров II группы обладали достаточно выраженной цитотоксичностью; процент «убитых» у них клеток К-562 через 2 часа соответственно соотношениям эффектор-мишень составил 20,0±8,6%, 15,4±7,5%, 7±4,2%; через 4 часа 30,2+9%, 23,1±6,4% и 10,3±5,3%; через 6 часов 36,3+11,8 32,5±5,6% и 13,3±4,2%.

Мононукпеары доноров III группы обладали ярко выраженной цитотоксичноотью; процент «убитых» у них клеток К-562 через 2 часа соответственно соотношениям эффектор-мишень составил 35+12,6%, 31,0+11%, 23,3±5,3%; через 4 часа 50;0+14,7%, 46,1+12,5%, 27,6+14,6%; через 6 часов 53,2+14,0%, 56,2+11,1% и46,2+11,2%.

2.2. Корреляционный анализ цитометрического и радиоактивного методов оценки функциональной активности NK-

клеток.

Для проверки правильности оценки ЕК активности с помощью КФСЭ мы параллельно провели радиоактивный классический цитотоксический тест с высвобождением 5Н-уридина [Хаитов P.M., 1995] для оценки степени корреляции

между двумя методами.

Одновременно были

обследованы 14 человек. На рис. 3 отображена графически корреляция по двум методам.

Рис.3. Корреляция между цитометрическим и радиоактивным методами оценки функциональной активности NK-клеток. По оси X -процент лизированных в ходе 16-часового теста клеток линии К-562, по оси У - процент убитых клеток К-562 в цитометрическом методе. Данные получены от 14 человек.

Цитометрический метод оценки показал высокую степень корреляции с радиоактивным методом, и коэффициент корреляции г составил 0,75 при р < 0,05.

2.3, Эффективность цитометрического метода при изучении влияния на NK-активность здоровых доноров препарата «Аллоферон».

Аллоферон - химически чистый препарат, представляет собой линейный олигопептид из 13 L-аминокислот, с молекулярной массой 1265 D. Аллоферон идентичен природному цитокиноподобному пептиду, выделенному из тканей насекомых. Показана способность аллоферона стимулировать in vitro

§70 X

111 СП

g 60

£50 X

£40 ^30

I20 10

1=

20 30 40 40 50 60 процент лизированных мишеней (радиоактивный тест)

лизис опухолевых клеток лимфоцитами селезенки мыши и оказывать аналогичное влияние на цитотоксические лимфоциты периферической крови здоровых людей и больных злокачественными заболеваниями крови и других органов. Нашей задачей являлось определить с помощью цитометрического метода степень влияние Аллоферона на цитотоксическую активность ЫК-клеток здоровых доноров.

Десяти здоровым донорам (возраст 22-55 лет) была однократно введена доза аллоферона 1мг в 1 мл физиологического раствора. Оценка 1ЧК-активности производилась перед введением (0 день) и на седьмые сутки после введения препарата.

В группе доноров, получивших аллоферон в дозе 1 мг, мы определили выраженное повышение функциональной активности 1ЧК-клеток. Процент убитых клеток-мишеней на 7-й день по сравнению с исходным уровнем вырос у них при всех трех соотношениях «эффектор-мишень». При соотношении «эффектор-мишень» 100:1 активность нормальных киллеров была увеличена на 75%, при соотношении 50:1 на 105%, то есть в два раза, а при соотношении 10:1 на 304 % или в три раза. Результаты изменения представлены в таблице 2. У одного донора с сходно высоким уровнем цитотоксической активности ЫК-клеток введение аллоферона вызвало некоторое понижение этой активности, но она продолжала оставаться в пределах определенных нами нормативов, что позволяет сделать предположение о том, что аллоферон стимулирует нормальную и заниженную цитотоксичность и не оказывает влияния на исходно высокие показатели.

Это дает основание считать Аллоферон не только перспективным средством, обладающим противовирусной активностью, для непосредственного лечения инфекций, но как средство активации и координации функций иммунной системы через воздействие на эффекторные (N1«) клетки. Таблица 2. Значения цитотоксической активности N К-клеток у доноров до и после введения аллоферона, **-р<0,005 по сравнению с нулевым днём.

Соотн. М+ст (N=10) Цитотоксическая активнось МК-клеток (% убитых мишеней) при введении аллооферона

100:1 50:1 10:1

Одень 40± 17,0 7 сутки 70**± 18,7 Одень 28,6 ± 13,4 7 сутки 58,6**± 17,6 0 день 12,3± 5,8 7 сутки 37,4**± 13,6

2.4. Применение цитометрического метода анализа функциональной активности NK-клеток для изучения NK-активности у больных ВИЧ-инфекцией и больного синдромом Чедиака-Хигаси.

Как уже отмечалось, у здоровых доноров средний процент убитых в ходе реакции К-562 зависит от соотношения «эффектор-мишень» и нарастает с увеличением времени инкубации, достигая максимума через 6 часов от начала реакции, а затем снижается, вероятно, вследствие лизиса уже мёртвых клеток. Показатели цитотоксической активности NK-клеток ВИЧ-больных представлены в таблице 3.

С помощью цитометрического метода мы обследовали 21 больного ВИЧ-инфекцией. У 19 из них, то есть почти в 90% случаев, цитотоксическая активность NK-клеток оказалась достоверно сниженной по , сравнению со здоровыми донорами. При соотношении «эффектор-мишень» 50:1 снижение было на 62,46 %, то есть более чем в 2 раза, а при соотношении эффекторов и мишеней 10:1 на 86,25% (таблица 3, рисунок 6), что соответствует литературным данным [ Леви Д. А.(1990), Хаитов Р. М. (1992), Hoffmann В et al. (1987,1989)]. Таблица 3. Цитотоксическая активность NK-клеток здоровых лиц и ВИЧ-больных, *-р<0,05 по сравнению со здоровыми донорами.

Соот- Доноры ВИЧ-больные N=21

ношение N=22

«эффектор- NK-активность NK-активность в

мишень» снижена N=19 норме (?)N=2

. Абс.(%) % от Абс.(%) % от

контр. контр.

100:1 38,3+16,2 Н/д н/д Н/д Н/д

50:1 30,9+15,8 11,6*+7,6 37,5 40,3±11,1 130

10:1 16,7+13,6 2,3*+1,4 13,8 21,4±10,6 128

У двух больных активность ЫК-клеток оказалась несколько завышенной и составила соответственно соотношениям 40,3+11,1% (50:1) и 21,4+10,6% (10:1), но в силу индивидуальных различий значений ЫК-активности у пациентов средний показатель активности достоверно не отличался от нормальных значений (р>0,05)

А

Б

ю!

10' 10''

||||р; 40%

из

10«

10"

19% Ш

г..''

10'

101

1СР

Ю'

FL

р

10"

101

10!

ю3

10ч П.1

Рис. 4. А - РепзКуРМ, отображающий процент убитых клеток К- 562 в ходе цитотоксической реакции у здорового донора, они составляют 40%-верхний правый квадрат. Б - ОепвКуРМ, отображающий процент убитых мишеней больного ВИЧ-инфекцией, верхний правый квадрат всего 19%.

Синдром Чедиака-Хигаси - первичный иммунодефицит, в основе которого лежит дефект гена 1_У5Т (1я42 хромосома), кодирующего полипептид, регулирующий внутриклеточные перемещения белков. В результате мутации происходит нарушение организации микротрубочек с формированием гигантских гранул в ядерных клетках. Образуются следующие клеточные дефекты: нарушено формирование фаголизосом в нейтрофилах, хемотаксис, функция цитотоксических Т-клеток и ЫК-клеток, созревание меланосом, функции тромбоцитов, Шванновских клеток, фолликулярных клеток щитовидной железы и клеток почечного тубулярного эпителия. Больной - мальчик с относительно благоприятным течением синдрома Чедиака-Хигаси, в отделении клинической иммунологии РДКБ наблюдался с 4,5-летнего возраста. С помощью цигометрического метода у больного мы диагностировали достоверное снижение цитотоксической активности ЫК-клеток, что является одним из основных нарушений иммунитета при данной патологии. Следует отметить, что значения активности при различных соотношениях «эффектор-мишень» у него практически не отличались и составили соответственно 16% при соотношении 50:1 и 13% при соотношении 10:1 (рис. 5).

ю

Со 50 ;------------

I 40 i 38'3 ь

0 30

1 20 t-

ra 10 *

Z 0

30,9

И

100:1

11,6 -16

16,7

|ПРяд1 ! ' | Ш Ряд2 !

ш

13

> 3

50:1

10:1

Рис. 5. Диаграмма значений цитотоксической активности NK-клеток при различных патологиях. Ряд 1- здоровые доноры, ряд 2- больные ВИЧ-инфекцией, ряд 3 - больной синдромом Чедиака-Хигаси.

3. Разработка метода оценки функциональной активности лимфоцитов периферической крови с использованием проточной лазерной цитометрии.

3.1. Выбор флюоресцентного красителя и мечение лимфоцитов.

При разработке цитометрической методики оценки функциональной активности лимфоцитов с помощью проточной лазерной цитометрии - . из всего многообразия флюоресцентных красителей и методик, предложенных зарубежными авторами, мы выбрали и адаптировали метод, который является наиболее информативным, безопасным и легко воспроизводимым для рутинных исследований в клинической лаборатории. Для нас самыми важными критериями являлись: высокая интенсивность флюоресценции' красителя на одну молекулу (высокий квантовый выход), в течение длительного (недели) промежутка времени, хорошая связь с объектом, относительная дешевизна. Всем перечисленным свойствам вполне отвечал 5-,6-карбоксифлуоресцеиндиацетат-сукцинилмидил эфир - КФДАСЭ, уже использовавшийся нами для определения NK активности, и методики А Bruce Lyons (2000) и D. A. Fulcher с соавт.(1999), предложенные ими для идентификации клеточных делений на проточном цитометре с помощью вышеуказанного красителя стали основой для работы'с ним. Сущность измерения пролиферативной активности лимфоцитов заключается в том, что окрашенные карбоксифлюоресцеином лимфоциты делятся под влиянием митогена, и из одной клетки с большей (исходной) интенсивностью свечения получаются две клетки, интенсивность каждой из которых в два раза ниже исходной и так далее (рис. 6). Клетки располагаются в виде ряда последовательных пиков с уменьшающейся интенсивностью свечения. С помощью цитометрического метода можно проследить до 8 митозов.

В качестве клеток-эффекторов мы использовали мононуклеары периферической крови, которые выделялись по стандартной методике на градиенте плотности фиколл-пака.

Процедура окрашивания мононуклеаров осуществлялась следующим образом. Клетки доводили до концентрации 50 х 10® кл./мл и окрашивали КФСЭ в концентрации 5мкМоль/мл в среде ЯРМ1-1640(без белка). Клетки инкубировали при 37° С в 5% атмосфере СОг 10 минут, через пять минут проводили повторное ресуспендирование, необходимое для более равномерного окрашивания, затем дважды отмывали охлаждённой до 4° С RPMI-1640 с 10% сывороткой плода коровы Затем клетки доводили до концентрации 1х106кл./мл полной культуральной средой.

Для индукции пролиферации нами был использован поликлональный Т-митоген - фитогемагглютинин (ФГА) - растительный лектин, получаемый из семян фасоли (Phaseolus vulgaris). Для стимуляции лимфоцитов к ним прибавлялся ФГА в трех концентрациях 1 мкг/мл ,5 мкг/мл. и 10 мкг/мл. Лимфоциты инкубировались в объёме 200 мкл в 96-луночном плоскодонным планшете в течение 120 часов, затем клеточная взвесь переносилась в цитометрические пробирки и оценивалась на проточном цитофлюориметре FACSCalibur (Becton Dickinson).

3.2. Отработка постановки реакции бласттрансформации и анализ её на проточном цитометре.

Цитофлюоресиентный анализ проводится на основе определения трех параметров: малого углового светорассеяния (FSC) и бокового светорассеяния (SSC) и одного показателя флюоресценции зеленой (КФСЭ) Настройка амплифайера проводилась таким образом, чтобы в окне Dot Plot FSC-SSC четко выделялось облако лимфоцитов. Проводится гейтинг исследуемых клеток в координатах FSC (ось абсцисс) и SSC (ось ординат). Затем данную группу анализировали на наличие флюоресценции в координатах FL1 зеленое свечение ' (КФСЭ). Проекцию окна выделяющего зеленые клетки выводили на экран в виде гистограммы, на которой курсорами М1-М8 последовательно отделяли пики лимфоцитов по мере уменьшения их флюоресценции со статистикой для обсчета процента каждой такой группы клеток. М1 Это клетки, которые не вышли в фазу деления и остались в «состоянии покоя», М2-8-делящиеся бласты.(рис. 6). Мы обследовали 23 человека здоровых доноров -17 мужчин и 6 женщин, в

возрасте от 18 до 39 лет, средний возраст 24±6 лет. Для определения функциональной активности лимфоцитов мы выбрали три параметра, которые, на наш взгляд, наиболее полно отражают состояние этого звена клеточного иммунитета (Angulo et al, 1998, FulcherD.A. etal, 1999].

1. Процент бласттрансформации (%БТ). Обозначает, сколько лимфоцитов перешло из покоящейся фазы в фазу деления (превратилось в бласты). Инициация процесса активации клеток - бластообразование и переход их в митоз - основной момент, с которого праю"ически начинается формирование любого иммунного ответа как гуморального, так и клеточного типа:

%БТ

=R2/(R1+R2)x 100%, где R1 -процент клеток, оставшихся «в покое», R2 - бласты (на Dot Plot FSC-SSC)

2. Митотическая активность бластов (МАБ%)- процент активно делящихся бластов (сколько всего бластов претерпело дальнейшие деления)

При этом все лимфоциты, вышедшие из фазы покоя (М2-М8) принимаются за 100%, и соответственно этому, рассчитывается процент бластов по пикам.

МАБ%

=(M3/2+M4/4+M5/8+M6/16+M7/32+M8/64) / (М2+ M3/2+M4/4+M5/8+M6/16+M7/32+M8/64) х 100%

3. Индекс деления* (ИД) — обозначает, сколько митозов претерпевает каждый лимфоцит в процессе культивирования. При этом все лимфоциты, вышедшие из фазы покоя принимаются за 100%, и соответственно этому, рассчитывается процент бластов по пикам. ИД= 100-Y

Y

где Y=M2+ M3/2+M4/4+M5/8+M6/16+M7/32+M8/64 где М 2-е -процент бластов в пиках. *Если ИД=1, то каждый лимфоцит соответственно претерпел (в среднем)1 деление, больший или меньший ИД свидетельствует о соответственно большей илИ меньшей митотической активности бластов.

Все исследуемые доноры в зависимости от величины этих параметров мы условно разделили на две группы: умеренно реагирующие - 4 человека, группа нормально и сильно реагирующих - 19 человек

А

У

1Л

Лимфоциты /';:.;'■/■. v V-.:

FSC-H

1023

10 10 FH-Н-КФСЭ Уменьшение интенсивности

Ayru-

cb ечешш

FSC-H

Рис. 6. A - Dot Plot FSC-SSC с изображением облака нестимулированных лимфоцитов - R1 и гистограмма интенсивности их свечения по FL1, М1 - 90,5 процентов лимфоцитов с исходной, высокой интенсивностью свечения. Б - Dot Plot FSC-SSC с изображением облака стимулированных ФГА (5 мкг/мл) лимфоцитов и гистограмма последовательного уменьшения интенсивности свечения бластов по FL1, по мере'Делений (М2-М8), с исходной интенсивностью осталось 11,8 процентов клеток. Пунктиром показаны гистограмма нестимулированных лимфоцитов, и аутофлюоресценция.

В целом все параметры по 23 донорам представлены в таблице 4, и их значения в дальнейшем принимаются как нормальные.

Таблица 4. Цитометрические параметры функциональной активности лимфоцитов у доноров. **-р<0,005 по сравнению контролем- показателями спонтанной бласттрансформации (0 мкг/млФГА)

Все доноры(Ы=23) Параметры функциональной активности лимфоцитов

М±ст %БТ МАБ (%) ид

73,7±21,7** 52,8 ±15,5** 2,9 ±0,9**

Мы исследовали влияние различных доз ФГА на цитометрические параметры бласттрансформации у 6 доноров (рис.7)

Как видно из графиков, оптимальный эффект наблюдается при дозе ФГА 5 мкг/мл, при большей дозе достигается стабилизация или уменьшение значений параметров.

Б. Зависимость митотическоГ! активности бластов (%) от дозы ФГА

В. Зависимость индекса деления от дозы ФГА

А. Зависимость бласттрансформации (%) ог дозы ФГА

Рис. 7. Зависимость цитометрических параметров функциональной

активности лимфоцитов от дозы ФГА. По оси абсцисс-1-0 мкг/мл ФГА, 2 - 1 мкг/мл ФГА, 3 - 5 мкн/мл ФГА и 4-10 мкг/мл ФГА.

4

3

2

1

0

3.3. Корреляция между цитометрическим и радиоактивным методами

Необходимым этапом разработки цитометрической методики измерения активности лимфоцитов являлось её сравнение с классическим радиоактивным методом оценки бласттрансформации по включению предшественника ДНК 3Н-тимидина. [Хаитов P.M., Пинегин Б.В., Истамов Х.И., (1995)].

На рис. 8 отражены корреляции между тремя цитометрическими параметрами бласттрансформации и ФГА-индуцированной

бласттрансформацией, измеренной с помощью включения 3Н-тимидина. Всего двумя методами было обследовано 9 человек- 7 доноров и 2 больных ВИЧ инфекцией. Цитометрический метод показал высокую степень корреляции с радиоактивным методом. Коэффициенты корреляции по всем параметрам были высокими (0,72, 0,73 и 0,75) при р<0,05. Это говорит о высокой достоверности предлагаемой методики.

Корреляция между Корреляция между

включением тимидина и митотической активностью

прцентом бласттрансформации бластов и включением

оценки бласттрансформации лимфоцитов.

тимидина

3

а

♦ ♦

% ё й юо -

z о е

♦ ♦ ♦

200000 300000

100000 200000 зооссю Импульсы в минуту

Корреляция между включением тамвдина и индексом деления

Рис.8. Корреляция между каждым цитометрическим параметром и бласттрансформацией, измеренной

радиоактивным способом. По оси абсцисс-

а-

величина

ФГА-индуцированной

0 5СООО 100000 150000 200000 250000 ЗСОООО

Импульсы в минуту

бласттрансформации в имп../мин. по оси ординат - значения цитометрических параметров.

3.4. Изучение влияния циклоспорина А на функциональную активность, лимфоцитов с помощью проточной лазерной цитометрии.

Циклоспорин А - липофильный циклический декапептид с метилированными остатками и наличием необычного нинеоненового аминокислотного остатка. Циклоспорин А был впервые выделен в 1970 г. из 2 штаммов грибов Tolypocladium inflatum Gams и Cylindrocarpon lucidium в процессе разработки противогрибковых препаратов. В конце 70-х годов этот препарат находит применение в трансплантологии, в настоящее время его используют также при лечении аутоиммунной патологии. Циклоспорин А является классическим ингибитором пролиферации Т-кпеток, поэтому задачей данного раздела работы было испытать эффективность цитометрического метода для оценки эффекта влияния циклоспорина А на бласттрансформацию и пролиферативную активность лимфоцитов под действием ФГА.

Для этого мононуклеары выделенные и окрашенные карбоксифлюоресцеином по методике разделяли на две части: одну оставляли в ПКС для контроля, добавляя оптимальную дозу ФГА а другую инкубировали в присутствии ФГА и 3-х доз Циклоспорина А.

Табл.5. Влияние различных доз циклоспорина А на функциональную активность лимфоцитов..* - р<0,05 по сравнению с донорами.

Контроль 5 мкг/мл ФГА +Циклоспорин А

5 мкг/мл Юмкг/мл 1 мкг/мл 0,1 мкг/мл

ФГА циклоспорина циклоспорина циклоспо рина

Pi Абс. % от . Абс. % от Абс. % от

контр контр контр

%БТ 69,4±21,3 24,4*±9,9 47,0 24,9*+15,8 35,9. 30,0*+16,9 43,2

МАБ 42,0+14,4 11,3*±2,7 26,9 19,3±2,8 46,0 16,5+14,8 39,3

ИД 2,2+0,7 0,6*+0,3 27,3 1,0+0,3 45,5 1,7+0,9 72,3

Установлено, что все исследуемые дозы ЦСА подавляют как процесс перехода покоящихся лимфоцитов в бласты, так и их дальнейшее деление. Все исследованные дозы препарата статистически значимо ингибировали процент бласттрансформации: доза в 10 мкг/мл на 53 % дозы в 1 и 0,1 мкг/мл - на 64% и 57% соответственно (табл. 5).

ЦСА оказывает влияние не только на процесс образования бластов, но и на их последующее деление. Соответственно этому наблюдалось и существенное

подавление митотической активности бластов и индекса деления, т.е. количества митозов, который претерпевает каждый Т-лимфоцит в процессе культивирования в присутствии ЦСА. Митотическая активность бластов и индекс деления были так же достоверно снижены при дозе ЦСА 10мкг/мл, при меньших дозах они в-целом оставались ниже нормы, но в силу индивидуальных различий доноров-; отличия не являлись значимыми (р>0,05).

3.4. Применение цитометрического метода для оценки функциональной активности лимфоцитов у больных ВИЧ-инфекцией.

Нами исследовано функциональное состояние лимфоцитов у больных ВИЧ-инфекцией. Мы обследовали четырех мужчин в возрасте от 20 до 45 лет, средний возраст - 29 лет. Они находились в стадии преСПИДа с проявлениями хронических бактериальных и вирусных инфекций. У всех пациентов мы определили достоверное снижение всех цитометрических параметров функциональной активности лимфоцитов по сравнению со здоровыми донорами (рис.9, таблица 6.)

Таблица 6. Цитометрические параметры функциональной активности лимфоцитов у ВИЧ-больных **-р<0,005 по сравнению с аналогичными параметрами у здоровых доноров.

Цитометрические параметры Доноры N=23 ВИЧ-больные N=4

Абсолютное Процент от

значение контроля

%БТ 73,7+21,7 14,60"±11,78 19,8

МАБ 52,8+15,5 19,10"±12,40 36,2

ИД 2,9 +0,9 0,73**±0,59 25,2

Как видно, все показатели функциональной активности лимфоцитов -бласттрансформации и пролиферации в ответ на поликлональный Т-митоген фитогемагглютинин у больных значительно снижены: процент бласттрансформации составляет около 20% от контроля, то есть, снижен в 5 раз, митотическая активность бластов и индекс деления также снижены на две трети и на 75 % соответственно. Указанные изменения, на наш взгляд, могут являться следствием усиленной гибели в культуре зараженных вирусом С04+ хелперов, подвергшихся активации [Ярилин, (1999)] либо являться следствием

поражения иммунной системы вирусом СПИДа то есть уменьшение Сй4+ хелперов и нарушение их функций. Кроме того, почти полное отсутствие ответа на ФГА так же может являться вторичным следствием глубокой иммуносупрессии организма, из-за развития сопутствующих и оппортунистических инфекций у наблюдаемых пациентов

10

10 РМ -Н

М1

87,2 %

(1

ю1

М2 МЗ^/

М4. ^

10 105 а1-н

ю*

Рис. 9. А - гистограмма уменьшения интенсивности флюоресценции лимфоцитов здорового донора и Б -гистограмма последовательного уменьшения интенсивности флюоресценции лимфоцитов больного ВИЧ-инфекцией - почти все лимфоциты М 1(87,2%) остались в «состоянии покоя».

выводы.

1. Разработан метод оценки функциональной активности 1ЧК-клеток, основанный на двойном флюоресцентном окрашивании (карбоксифлюоресцеин-пропидиума иодид) Метод высоко коррелирует с радиоактивным классическим тестом с включением ДНК-предшественника 5Н-уридина (г=0,75).

2. Показана высокая эффективность цитометрического метода как для оценки влияния иммунотропных препаратов на функциональную активность ЫК клеток, так и для оценки иммунного статуса у больных с первичными и вторичными иммунодефицитами.

3. Апробирован и модифицирован метод оценки функциональной активности лимфоцитов, основанный на двойном разведении карбоксифлюоресцеина при каждом клеточном делении. Предложены три параметра измерения активности: процент бласттрансформации, митотическая активность бластов и индекс деления. Метод высоко коррелирует с радиоактивным классическим тестом.

4. Показана эффективность применения цитометрической методики для детального изучения воздействия на пролиферацию лимфоцитов циклоспорина А - ингибитора активности Т-клеток: продемонстрировано, что данный иммуносупрессор угнетает процент бласттрансформации, митотическую активность бластов и индекс деления лимфоцитов здоровых доноров, и его влияние является дозозависимым.

5. На модели ВИЧ-больных показана высокая информативность по сравнению с радиоактивным тестом цитометрического метода оценки бласттрансформации и пролиферации лимфоцитов, позволяющего получить более подробную информацию о состоянии данного звена иммунитета.

Список принятых сокращений

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека '■-•■< ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ДМСО - диметилсульфоксид ИЛ - интерлейкин

ИФН - интерферон • '

КФСЭ - карбоксифлюоресцеин сукцинилмидил эфир

МПК-мононуклеары периферической крови

ПКС - полная культуральная среда

СПИД-синдром приобретенного иммунодефицита

CD - кластер дифференцировки

CFSE - карбоксифлюоресцеин сукцинилмидил эфир

Dot Plot - точечный рисунок

FACS - флюоресцентно активированный клеточный сортировщик FSC - прямое светорассеяние NK - нормальные киллеры РЕ - фикоэритрин

РегСР - перидинхлорофил-протеин PI - пропидиума йодид SSC - боковое светорассеяние Th-T-хелпер

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Г. О. Бахус, Д. В. Мазуров, В. В. Кулаков, Б. В. Пинегин Разработка метода оценки функциональной активности естественных киллерных клеток с использованием проточной цитометрии II Иммунология - 2001. - №3 - С 59-61.

2. Бахус Г. О., Пинегин Б. В. Применение карбоксифлуоресцеиндиацетат-сукцинилмидил эфира для определения активности естественных киллеров в диагностической лаборатории II Сборник трудов 4-го Национального конгресса Российской Ассоциации Аллергологов и Клинических Иммунологов «Современные проблемы аллергологии и иммунофармакологии» - Москва, 29-31 мая 2001 г.-Т.2,С.47.

3. Бахус Г. О., Пинегин Б. В. Новый метод оценки функциональной активности естественных киллерных клеток с использованием проточной цитометрии //Аллергия, астма и клиническая иммунология - 2001 - №7 - С. 65-66.

4. Б. В. Пинегин, А. А. Ярилин, А. В. Симонова, С. В. Климова, Д. В. Мазуров, С. В. Дамбаева, Г. О.Бахус Применение проточной цитометрии для оценки функциональной активности иммунной системы человека // Пособие для врачей-лаборантов - Москва - 2001.

5. Г. О. Бахус, Б. В. Пинегин Применение в проточной цитометрии 5- и 6-карбоксифлуоресцеиндиацетат-сукцинилмидил эфира для оценки пролиферативной активности лимфоцитов II Иммунология - 2002. - №3 принята к печати

6. А. Н. Ильинская, Л. В. Пичугина, Г. О. Бахус, С. В. Климова, Б. В. Пинегин Влияние отечественного циклоспорина А на функциональную активность лимфоцитов человека // Иммунология - принята к печати.

7. Г. О. Бахус, В. В. Кулаков, С. В. Климова, С. И. Черныш, Г. П. Беккер, Л. В. Бугаев, Б. В. Пинегин Влияние препарата «Аллоферон» на основные популяции лимфоцитов и функциональную активность ЫК-клеток здоровых доноров II Иммунология - принята к печати.

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25.09.2000 г. Подписано в печать 01.02.02 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,75

Печать авторефератов 174-32-31

Актуальность темы диссертации.

Одной из важнейших задач клинической иммунологии является всесторонняя оценка иммунного статуса. Она включает в себя следующий комплекс основных тестов: оценка фагоцитоза, гуморального иммунитета и системы комплемента, иммунофенотипирование лимфоцитов, функциональнальная активность лимфоцитов и оценка интерферонового статуса. [12]. Оценка функциональной активности лимфоцитов имеет важное значение, так как часто при многих заболеваниях и вторичных иммунодефицитах наблюдается нормальное количественное содержание этих клеток, но их функции зачастую угнетены /увеличены/ в значительной степени, и это может являться определяющим звеном в патогенезе того или иного заболевания. Комплекс оценки функциональной активности лимфоцитов включает в себя измерение цитотоксической активности NK-клеток, пролиферативный ответ лимфоцитов на Т- и В-митогены, определение Thl и Th2 клеток, определение количества синтезируемых цитокинов мононуклеарами периферической крови, апоптоз лимфоцитов при специфической и неспецифической стимуляции. Изменения функциональной активности лимфоцитов происходят при следующих состояниях:

-первичных иммунодефицитах, связанных с нарушениями клеточного иммунитета

-вторичных иммунодефицитах, связанных с нарушениями клеточного иммунитета, которые развиваются вследствие воздействия на организм какого-либо повреждающего фактора (ВИЧ-инфекция, острые и хронические вирусные инфекции, злокачественные заболевания и др.)

-физиологических иммунодефицитах, например, при старении, когда ослабление иммунитета затрагивает реакции, обусловленные Т-клетками, что служит одной из причин повышения частоты опухолей в старости -аутоиммунных заболеваниях.

Как правило, эти изменения, не являются основной причиной заболевания, но их анализ представляет определенный интерес для клинической иммунологии, так как позволяет оценить эффективность проводимого лечения и прогнозировать течение заболевания.

Функциональную активность лимфоцитов оценивают как их способность к пролиферации и бласттрансформации под влиянием митогенов. В России, результаты пролиферативного ответа лимфоцитов до последнего времени оценивались чаще всего с помощью микроскопического метода (морфологическая идентификация и подсчет процента бластов), либо с помощью включения радиоактивной метки (чаще всего это предшественник ДНК, 0-излучатель 3Н-тимидин[2]), либо с помощью МТТ-теста, основанного на изменении цвета связывающегося с клетками красителя 3-[4,5 диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенил 2-тетразолия из синего в желтый. Функциональную активность естественных (натуральных) киллерных клеток (NK) чаще всего оценивали так же в радиоактивных цитотоксических тестах, используя в качестве мишеней меченые 3Н-уридином или 51 Сг клетки культуры опухолевых миелобластов К-562, полученной из плеврального выпота больных хроническим эритромиелолейкозом. NK-клетки лизируют клетки- мишени, и К-562 выделяют в среду культивирования радионуклид. По количеству высвободившейся из мишеней радиоактивной метки и определяют NK-активность (процент NK-активности). Эти традиционные методики имеют ряд недостатков, в случае микроскопического метода - это высокая субъективность оценки результата, в случае радиоактивных методов -использование радиоактивного излучателя. Кроме того, классические радиоактивные тесты дают лишь косвенные данные о наличии (отсутствии) ответа.

С появлением проточной лазерной цитометрии (ТОЩ) более 20-ти лет назад значительно расширились возможности изучения всех показателей иммунного статуса. Методы изучения клеточного звена иммунной системы 8 с помощью проточной цитометрии имеют ряд неоценимых приемуществ: объективность, высокая скорость и точность анализа, простота постановки реакции, быстрое получение результата, безопасность. Существующие методы оценки функциональной активности лимфоцитов с использованием ПЛЦ обобщены в ряде обзоров (разделы 1.3.1-1.3.2)

В связи с этим целью работы явилась разработка цитометрических методов оценки цитотоксической акти »*'ости NK-клеток и пролиферативной активности лимфоцитов крови человека, пригодных для рутинных исследований в клинической лаборатории. Для проверки эффективности разработанных методов с перспективой их дальнейшего внедрения в лабораторную практику мы использовали три подхода: во-первых, сравнение новых методик с хорошо себя зарекомендовавшими старыми методами во-вторых, применение новых методик для детекции изменений функций лимфоцитов под воздействием иммунотропных веществ в-третьих, определение с помощью разработанных методов нарушения функциональной активности лимфоцитов у больных с первичными и вторичными иммунодефицитами.

Задачи исследования.

1. Разработать микрометод оценки цитотоксической активности NK-клеток с использованием проточной лазерной цитометрии.

2. Разработать метод оценки функциональной активности лимфоцитов -их способности к бласттрансформации и пролиферации под влиянием Т-клеточного митогена с использованием проточной лазерной цитометрии.

3. Провести корреляционный анализ между цитометрическими и классическими методами определения функциональной активности лимфоцитов.

4. Показать возможность изучения функциональной активности лимфоцитов с помощью цитометрической методики для оценки действия иммунотропных лекарственных препаратов на клетки иммунной системы.

S. Апробировать разработанные методики на больных с нарушениями этого звена иммунной системы.

Научная новизна.

Впервые разработана оригинальная методика, позволяющая оценивать цитотоксическую активность NK клеток периферической крови человека, которые лидируют клетки-мишени, с использованием проточной лазерной цитометрии Основой для определения убитых в ходе реакции клеток К-562 явилось двойное флюоресцентное окрашивание. Окрашенные карбоксифлюоресцеиндиацетат-сукцинилмидил эфиром (КФСЭ) мишени (К-562) смешиваются с клетками-эффекторами (мононуклеарами периферической крови - МПК) и инкубируются несколько часов. Затем пробы окрашиваются йодистым пропидием (PI). Среди всех вовлеченных в реакцию клеток мишени определяют как включившие в себя КФСЭ (зеленое свеченге), а убитые киллерами среди них, включившие в себя как КФСЭ, так и PI (красно-зеленое свечение). По количеству убитых в ходе реакции мишеней и определяется цитотоксическая активность образца. Показана высокая степень корреляции нового метода с классическим радиоактивным тестом (коэффициент корреляции составил 0,75 при г<0,05).

С помощью цитометрического метода установлено влияние на цитотоксическую активность МПК здоровых доноров Аллоферона -химически чистого олигопептида из 13 L-аминокислот с цитокиноподобной активностью, в частности то, что он вызывает достоверное повышение цитотоксической активности NK-клеток здоровых доноров на 7 сутки после введения.

Эффективность разработанной методики подтверждает её клиническая значимость: достоверное снижение функций NK-клеток у обследованных больных ВИЧ-инфекцией и у ребенка с синдромом Чедиака-Хигаси.

Впервые модифицирован и адаптирован метод оценки функциональной активности лимфоцитов - их бласттрансформации и пролиферации с помощью проточной лазерной цитометрии. Сущность измерения пролиферативной активности заключается в том, что окрашенные КФСЭ клетки делятся под влиянием митогена, и из одной клетки с большей исходной интенсивностью свечения образуются две клетки, интенсивность свечения каждой из которых примерно в два раза ниже исходной, и так далее. С помощью цитометрического метода можно наглядно проследить за судьбой почти всех клеток, определить до 8 митозов в реакции и тем самым более тонко определить функциональное состояние лимфоцитарной системы. Предложены три параметра измерения активности вместо одного в радиоактивном методе, процент бласттрансформации, митотическая активность бластов и индекс деления Новая методика имеет высокую степень корреляции с радиоактивным методом. Коэффиценты корреляции по всем трем параметрам были высокими (0,72,0,75 и 0,73)при р<0,05.

С помощью цитометрической методики установлено значительное угнетение как бласттрансформации, так и дальнейшей пролиферации лимфоцитов здоровых доноров под влиянием циклоспорина А - ингибитора синтеза ИЛ2. Цитометрический метод позволил более детально изучить влияние этого иммуносупрессора на поведение лимфоцитов: установлено, что его влияние является дозозависимым.

При помощи разработанной методики подтверждено достоверное снижение функций лимфоцитов больных ВИЧ-инфекцией - их способности отвечать активацией и пролиферацией на поликлональный Т-митоген-фитогемагглютинин.

Практическая значимость работы.

Методы оценки функциональной активности лимфоцитов разработаны в микроварианте, подтверждены классическими радиоактивными методами, набраны нормативные показатели, поэтому их можно использовать в рутинных исследованиях в любой иммунологической лаборатории при наличии проточного цитометра. Разработанные методики включены в методическое пособие для врачей-лаборантов «Применение лазерной цитометрии для оценки функциональной активности иммунной системы человека».

Основные положения, выносимые на защиту.

Двойная метка (КФСЭ/PI) для клеток-мишеней К-562 является оптимальной в щггометрической методике оценки функциональной активности NK-клеток - их способности убивать мишени в 4-х часовом цитопгоксическом тесте.

Использование меченых 5-,6-карбоксифлуоресцеиндиацетат-сукцинилмидил эфиром клеток линии К-562 позволяет более точно, быстро и эффективно оценивать цитотоксическую активность NK-клеток, фиксировать эффекты влияния иммунотропных веществ на изучаемый параметр и исследовать NK-активность при различных патологиях с нарушениями данного звена.

Использование меченых 5-,6-карбоксифлуоресцеиндиацетат-сукцинилмидил эфиром мононуклеаров периферической крови позволяет точно и эффективно исследовать их способность отвечать бласттрансформацией и пролиферацией на митоген. Применение проточной лазерной цитометрии позволяет всесторонне оценивать, во-первых, степень влияния различных иммунотропных веществ на функциональную активность лимфоцитов, во-вторых, изучать более тонкие механизмы функционирования лимфоцитов при различных иммунопатологиях.

выводы.

1. Разработан метод оценки функциональной активности NK-клеток, основанный на двойном флюоресцентном окрашивании (карбоксифлюоресцеин-пропидиума иодид). Метод высоко коррелирует с радиометрическим классическим тестом с включением ДНК-предшественника Н-уридина (г=0,75).

2. Показана высокая эффективность цитометрического метода как для оценки влияния иммунотропных препаратов на функциональную активность NK клеток, тал и для оценки иммунного статуса у больных с первичными и вторичными иммунодефицитами.

3. Апробирован и модифицирован метод оценки функциональной активности лимфоцитов, основанный на двойном разведении карбоксифлюоресцеина при каждом клеточном делении. Предложены три параметра измерения активности: процент бласттрансформации, митотическая активность бластов и индекс деления. Метод высоко коррелирует с радиометрическим классическим тестом.

4. Показана эффеетивносгь применения цитометрической методики для детального изучения воздействия на пролиферацию лимфоцитов циклоспорина А - ингибитора активности Т-клеток: продемонстрировано, что данный иммуносупрессор угнетает процент бласттрансформации, митотическую активность бластов и индекс деления лимфоцитов здоровых доноров, и его влияние является дозозависимым.

5. На модели ВИЧ-больных показана высокая информативность по сравнению с радиометрическим тестом цитометрического метода оценки бласттрансформации и пролиферации лимфоцитов, позволяющего получить более подробную информацию о состоянии данного звена иммунитета.

Заключение

Адаптирован метод оценки функциональной активности лимфоцитов - их способности к бластгрансформации и пролиферации в ответ на поликлональный Т-митоген - ФГА с помощью проточной цитометрии. Метод основан на уменьшении флуоресценции окрашенных карбоксифлюоресцеином клеток при делении, когда из одной клетки с исходной большой интенсивностью свечения образуются две клетки, интенсивность каждой из которых примерно в два раза меньше.

Цитометрической методика достоверно коррелирует с классическим радиометрическим тестом на включение 3Н-тимидин-1. Набраны показатели для контрольной группы доноров. Определены оптимальное время реакции и концентрация митогена. При помощи разработанной методики продемонстрирована её клиническая и диагностическая значимость: достоверное снижение способности лимфоцитов больных ВИЧ-инфекцией отвечать активацией на ФГА. Функциональная активность лимфоцитов по

83 данным реакции РБТЛ с ФГА при нормальном количественном содержании Т-хелперов достоверно коррелирует со степенью тяжести заболевания и поэтому может быть использована как прогностический маркер СПИДа, в частности, низкий ответ лимфоцитов на ФГА подтверждаяет прогрессирование течения инфекции.

Цитометрический метод зафиксировал значительное снижение ответа лимфоцитов при воздействии агента, блокирующего образование ИЛ 2 -циклоспорина А.