Острые и хронические формы аденовирусной инфекции глаз (клинико-иммунологическое исследование)

Клещева, Елена Александровна

Диссертации по медицине → Глазные болезни

Автореферат и диссертация по медицине (14.01.07) на тему:Острые и хронические формы аденовирусной инфекции глаз (клинико-иммунологическое исследование)

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Клещева, Елена Александровна Москва 2012 г.

Ученая степень: кандидата медицинских наук

ВАК РФ: 14.01.07

Автореферат диссертации по медицине на тему Острые и хронические формы аденовирусной инфекции глаз (клинико-иммунологическое исследование)

На правах рукописи

КЛЕЩЕВА Елена Александровна

ОСТРЫЕ И ХРОНИЧЕСКИЕ ФОРМЫ АДЕНОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ ГЛАЗ (КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.01.07 — глазные болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 2 НОЯ 2012

Москва-2012

005055613

Работа выполнена в ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздравсоцразвития России

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Кочергин Сергей Александрович

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Ненашева Наталия Михайловна

Официальные оппоненты:

Гусева Марина Раульевна — доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова» Минздравсоцразвития России, профессор кафедры глазных болезней педиатрического факультета.

Луцсвич Екатерина Эммануиловна - доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Первый московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова;) Минздравсоцразвития России, профессор кафедры глазных болезней.

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов». Защита состоится «Сб» ИЛ&5|а2012 г. в часов на заседании диссертационного совета Д. 208.071.03 при ГБОУ ДПО Российская медицинская академия последипломного образования Минздравсоцразвития РФ по адресу: 123995, г.Москва, ул. Баррикадная, д. 2/1.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздравсоцразвития России по адресу: 125445, г. Москва, ул. Беломорская, д.19.

Автореферат разослан « 2012г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Мосин Илья Михайлович.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

Воспалительные заболевания глаз имеют большой удельный вес в структуре всей офтальмопатологии (более 40% амбулаторного приема). Кроме того, на воспалительные заболевания приходится 80% временной нетрудоспособности среди больных с патологией глаз, до 50% стационарных больных, до 10-30% слепоты [Майчук Ю.Ф., 2010]. Более половины больных с воспалительной патологией глаз имеют доказанный или предполагаемый вирусный характер заболевания. Аденовирус является самой частой причиной вирусных и инфекционных конъюнктивитов во всем мире [Robert Р., Sambursky M.D., Nikole Fram, 1962]. О распространенности аденовирусных заболеваний человека свидетельствует тот факт, что 80% населения имеет комплементсвязывающие антитела к аденовирусам [Ацев С., Добрев И., 1965]. Аденовирусные инфекции глаз, проявляющиеся в виде аденовирусного конъюнктивита (ADK) или эпидемического кератоконъюнктивита (ЭКК), отличаются чрезвычайной распространенностью и являются серьезной проблемой здравоохранения. АВК составляет 90% всех случаев вирусных конъюнктивитов и от 15 до 70% случаев инфекционных конъюнктивитов [Маль-ханов В.Б., Грипась И.А., Кудоярова Э.Г., 1987; Казакбаев А.Г., 1989; Краснов М.М., Каспаров А.А., Каспарова Е.А., 1998; Robert P., Sambursky M.D., Nikole Fram, 1962; Ishii К., Nakazono N., Fujinaga K.,1987; Ishii K., Nakazono N., Fujinaga K.; 1987].

Предположение о существовании хронической (латентной) формы течения аденовирусного конъюнктивита высказало в единственной отечественной публикации. В этой же работе приведены данные, свидетельствующие о достаточно высокой частоте затяжных (до 60%) и рецидивирующих (до 33%) форм аденовирусной инфекции глаз [Азнабаев М.Т., Мальханов В.Б., 1995]. Сопоставляя эти данные с чрезвычайной распространенностью данной инфекции, можно гипотетически предположить, что пациенты с хроническим

(стертым, затяжным или рецидивирующим) течением являются значимым

скрытым резервуаром инфекции. Некоторые авторы связывают существование данных форм заболевания со штаммовыми особенностями возбудителя (серотипы 5, 6, 8, 9, 37), снижением общего иммунного фона у населения, а также последствиями нерационально проводимой терапии [Азнабаев М.Т., Мальханов В.Б., 1995; Краснов М.М., Каспаров A.A., Каспарова Е.А., 1998; Марченко Н.Р., Каспарова Е.А., Лосева И.Е., 1998; Коротких С.А., Шеломен-цев H.A., Бобыкин Е.В., 2005]. В зарубежной литературе описаны случаи аденовирусной инфекции глаз, длящиеся 45 и более дней с момента появления первых симптомов заболевания (более 25% всех наблюдаемых случаев аденовирусной патологии глаз) [Butt A.L., Chodosh J., 2006].

Следует особо подчеркнуть, что в системе естественной защиты при вирусных инфекциях контрольно-регуляторная роль принадлежит цитокинам, к самым известным из которых относятся интерфероны. Цитокины, являясь продуктами иммунокомпетентных и других клеток, обеспечивают развитие или подавление воспаления, участвуют в запуске специфического иммунного ответа.

Локальные регуляторные цитокиновые реакции (локальный цитокино-вый статус) изучаются в настоящее время достаточно активно при различной офтальмопатологии [Слепова О.С., 2001; Теплинская Л.Е., Филичкина Н.С., Матевосова К.С., 2005; Шевчук Н.Е., Мальханов В.Б., Марвапова З.Р., 2007; Никитин H.A., Кузбеков Ш.Р., 2009; Kasp-Grochowska Е., Graham Е., Sanders, 1981; Abu el-Asrar A.M., Geboes К., Tabarra K.F., 1996]. Основным объектом исследования локального цитокинового статуса является слезная жидкость, а доминирующим методом — иммуноферментный анализ (определение концентрации свободных цитокинов). В ряде работ прослеживается регуляторная роль цитокинов как медиаторов и катализаторов иммунного ответа при вирусной патологии органа зрения, причем некоторые авторы связывают избыточное повреждение тканей именно с нарушениями функционирования цитокиновой сети как эндогенного (аутоиммунитет), так и экзогенного (вирусы, микробы) характера.

В последние годы бурно развиваются наномедицииские технологии, особенно в области лабораторной диагностики. Разработан и внедрен в широкую практику в различных областях медицины метод мультиплексного анализа, основанный на использовании полистироловых наномикрочастиц (микросфер). В доступной отечественной и зарубежной литературе отсутствуют данные по использованию вышеописанной технологии для изучения закономерностей локального цитокиногенеза при аденовирусных инфекциях органа зрения.

Кроме количественного определения цитокинов, в мировой практике применяется также изучение тканевой экспрессии генов (мРНК) цитокинов методом полимеразной цепной реакции. По мнению отечественных исследователей в данной области науки наиболее полную информацию может дать одновременное применение как определения концентрации цитокинов, так и детекция экспрессии генов-прешественников (мРНК).

Все вышесказанное определило цель нашего исследования.

Цель исследования

Определить особенности клинической картины и патогенетическую значимость показателей локальной иммунореактивности на примере специфического иммунного (цитокинового) ответа при острых и хронических формах аденовирусной инфекции глаз.

Задачи исследования

1 .Дать общую характеристику больных с острыми и хроническими формами течения аденовирусной инфекции глаз.

2.0ценить динамику локальной вирусной нагрузки в процессе развития заболевания с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) при острых и хронических формах течения аденовирусной инфекции.

3.Изучить локальный иммунный статус по продукции генов цитокинов и самих цитокинов клетками конъюнктивы методами полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и проточной флуометрии у здоровых добровольцев.

4.Выявить возможную зависимость клинического течения аденовирусной инфекции глаз от состояния локального иммунного статуса по продукции генов цитокинов и самих цитокинов клетками конъюнктивы.

5.0ценить влияние микрофлоры конъюнктивы на развитие локальных цитокиновых реакций при острых и хронических формах аденовирусной инфекции глаз.

Научная новизна:

1.Изучена нормальная продукция генов цитокинов и самих цитокинов непосредственно клетками конъюнктивы методами ОТ-ПЦР и проточной цитофлюометрии.

2.Изучена продукция генов цитокинов и самих цитокинов непосредственно клетками конъюнктивы при различных формах аденовирусной инфекции глаз в динамике методами ОТ-ПЦР и проточной флуометрии у пациентов.

3.Исследован состав микрофлоры конъюнктивы, сопутствующей различным формам аденовирусной инфекции глаз.

4.Выявлена значимость методики ПЦР для диагностики аденовирусной инфекции глаз в динамике заболевания при различных формах течения инфекции.

5.Доказана достаточная чувствительность и специфичность метода ПЦР в отношении выявления ДНК аденовируса при острых и хронических формах течения инфекции.

Практическая значимость работы

1.Комплекс знаний о клинических особенностях хронического течения аденовирусной инфекции глаз позволит своевременно выявлять стертые и затяжные случаи этой инфекции, что может способствовать адекватным мероприятиям по предотвращению распространения внутригоспитальной инфекции.

2.Выявленная высокая чувствительность метода полимеразной цепной

реакции к обнаружению ДНК аденовируса позволяет считать его методом

выбора при подозрении на хроническую форму аденовирусной инфекции

глаз при дифференциальной диагностике хронических конъюнктивитов неустановленной этиологии.

3.Методика мультиплексного анализа конъюнктивального соскоба после соответствующих предварительных исследований может быть внедрена в клиническую практику офтальмологов для одномоментного определения десятков и сотен самых разных параметров (цитологии клеток, определения различных патогенов, биохимических показателей и т.д.).

4.Показатели локального иммунного статуса при острых и хронических формах вирусных инфекции глаз заболевания могут служить объективным критерием в оценке эффективности местной иммуномодулирующей терапии.

Основные положения, выноснмые на защиту:

1.Хроническая форма конъюнктивита при аденовирусной инфекции глаз имеет ряд клинико-иммунологических особенностей. Острое течение аденовирусного конъюнктивита характеризуется наличием феномена усиления интенсивности симптомов в первую неделю заболевания на фоне применения стандартной схемы терапии.

2.Экспрессия генов цитокинов, характеризующая потенциальный цито-киновый ответ, а так же их фактический синтез осуществляется и здоровыми клетками конъюнктивы на достаточно высоком уровне. До начала лечения как при острой, так и при хронической форме течения инфекции выявлены сходные уровни экспрессии генов клетками конъюнктивы, отражающие схожий потенциальный цитокиновый ответ (р>0,05).

3.До начала лечения фактические концентрации практически всех исследуемых цитокинов, продуцируемых клетками конъюнктивы, достоверно отличаются в группах с острым (группа А) и хроническим аденовирусным конъюнктивитом (группа В) и имеют разные векторы изменения по сравнению с нормой.

4.Сравнительный анализ видового и количественного состава микрофлоры конъюнктивы при острой и хронической формах аденовирусной инфекции глаз не вьивляет достоверных различий между группами А и В и обнаруживает отсутствие значимого влияния бактериального присутствия как

на интенсивность симптомов воспаления конъюнктивы, так и на локальный цитокиногенез.

Апробация работы

Апробация работы проведена на совместной научно-клинической конференции кафедры офтальмологии ГБОУ ДПО РМАПО Минздравсоцразви-тия России и сотрудников Офтальмологической клинической больницы Департамента здравоохранения г. Москвы (протокол № 6 от 2 марта 2012 г).

Публикации

Основные положения диссертации опубликованы в 8 печатных работах, из них 3 — в ведущих рецензируемых научных офтальмологических журналах.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, состоит из введения, 3 глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований), обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 15 рисунками и 20 таблицами. Список литературы включает 56 отечественных и 62 иностранных источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Клинические методы исследования

Нами проведен анализ клинических и лабораторных данных пациентов с аденовирусной инфекцией глаз, обратившихся в отделение неотложной помощи Московской офтальмологической клинической больницы и в городскую поликлинику № 33 ЮЗАО (г. Москва) за период 2009-2011 год.

Под наблюдением находилось 105 пациентов с аденовирусной инфекцией глаз в возрасте от 21 до 84 лет, из них женщин — 67 (68,8%), мужчин — 38 (32,2%). Средний возраст составил 44,9±18,2. Возрастная структура пациентов представлена в таблице 1.

Таблица 1. Возрастная структура пациентов, включепных в исследование.

Возраст Средний возраст Количество пациентов (%) Мода (наиболее часто встречаемый возраст)

17-29 24,8±4,2 22,8 25

3(М1 34,0£4,1 24,8 30

44-54 48,4±3,7 26,7 46

59-84 70,3±9,3 25,7 72

Все пациенты приглашались на осмотр, в среднем, 1 раз в педелю. В редких случаях (15,0%), в силу выраженной интенсивности симптомов, пациенты приглашались чаще одного раза в неделю для коррекции назначенной терапии. С целью мониторинга устойчивости отдаленного результата противовирусного лечения средний срок наблюдения составил 63±9,2 дня. К третьему визиту (14 день заболевания) у всех пациентов наблюдалась существенная редукция клинической картины и отчетливая тенденция к выздоровлению. Принимая во внимание этот факт, а также большой массив иммунологических параметров, лабораторное исследование ограничилось тремя точками забора материала для исследований — 1-м, 7-м и 14-м днями заболевания.

При каждом визите всем пациентам проводилось стандартное офтальмологическое обследование, измерение температуры (при необходимости), осмотр полости рта и зева, пальпацию предушных, подчелюстных и шейных лимфатических узлов.

Офтальмологическое обследование включало визометрию, пальпаторное определение внутриглазного давления, биомикроскопию, офтальмоскопию для исключения острых патологических изменений сетчатки. Более детально обследование не проводилось в связи с выраженностью клинической симптоматики и невозможностью корректной оценки результатов других методов исследования.

Исследовали состояние век, конъюнктивы, роговицы, влаги передней камеры. При этом, обращали особое внимание на цвет и консистенцию кожи век, на состояние желез и на края век. В некоторых случаях при сильном отеке век, для выворачивания верхнего века пользовались векоподъемником Демара.

При исследовании конъюнктивы обращали внимание на ее цвет, прозрачность, гладкость и на наличие фолликулов, пленок, сосочков, кровоизлияний, отделяемого и рубцов. Вовлечение роговицы в патологический процесс подкрепляли ее окрашиванием 2% раствором флюоресцеина натрия.

У всех пациентов фиксировали жалобы, собирали анамнез, осуществляли тщательное клиническое наблюдение. На каждого пациента заводили индивидуальную карту.

Все пациенты были разделены на две группы в зависимости от характера течения заболевания. Критерием хронического течения заболевания считали сохранение жалоб в течение трех и более месяцев при трехкратном положительном анализе на АДВ.

Первую группу (А) составили пациенты с острой формой аденовирусной инфекции глаз (п = 45), вторую (В) — пациенты с хронической и затяжной формой (и = 60).

Всем пациентам как группы А, так и группы В было назначено комплексное лечение, включающее противовирусные инсталляции (Офтальмо-ферон, производство Россия, «Фирн-М»). Кратность назначения Офтальмо-ферона в группе с острым течением аденовирусной инфекции глаз составляла 6-8 раз в день (согласно инструкции по использованию препарата). По мере стихания интенсивности симптомов конъюнктивита кратность инсталляций уменьшали до 3-4 раз в день. Схема лечения Офтальмофероном пациентов с хронической формой течения инфекции была несколько иной: с первого по седьмой день заболевания кратность назначения составляла 3—4 раза в день с последующим снижением количества инсталляций до 2-3 раз в день по мере стихания клинических симптомов. Режим назначения антимикробной и противовоспалительной терапия как при острой форме течения адено-

вирусной инфекции глаз, так и при хронической был одинаковым. При отсутствии гнойного отделяемого и профилактики развития вторичной инфекции назначали антисептический препарат Окомистин 0,1% (производство Россия, ООО «Славянская аптека»). Кратность - 4 раза в день в первую неделю заболевания, при стихании воспалительного процесса количество инсталляций снижали до 2—3 раз в сутки. При наличии слизисто-гнойного отделяемого применяли антибактериальный препарат фторхинолонового ряда — Ципромед 0,3% (производство Индия, Promed Exports Pvt. Ltd.). Режим инсталляций был аналогичен режиму назначения Окомистина. В качестве противовоспалительной терапии назначали нестероидное противовоспалительное средство (Индоколлир 0,1%, производство США, Baush+Lomb). В остром периоде — 4 раза в день, затем 2-3 раз в день при снижении интенсивности симптомов.

Назначение одних и тех же препаратов при различных формах течения инфекции продиктовано необходимостью получения единообразия результатов иммунологического исследования. Кроме того, для исключения влияния на иммунологическую картину исследований предшествующей терапии у пациентов группы В, всем пациентам этой группы было рекомендовано воздержаться от применения каких-либо местных офтальмологических противовирусных препаратов в течение трех дней. Средний срок лекарственной терапии в группе с острым течением инфекционного процесса составил 13±2,1 дней, с хроническим — 11±1,8 дней. Все пациенты были проинформированы о неосложненном ходе течения болезни и приглашались для корректировки лечения и проведения иммунологического исследования в среднем через 7 дней.

Группу контроля составили 60 здоровых добровольцев без признаков офтальмопатологии, с отсутствием анамнестических данных о перенесенных инфекциях глаз и с отрицательными результатами анализа на наличие ДНК аденовируса методом ПЦР.

Лабораторные методы исследования

Лабораторная диагностика проводилась на базе ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России, г. Москва, лаборатория микробиологии латентных инфекций. У всех пациентов диагноз аденовирусной инфекции подтвержден положительными результатами полимеразной цепной реакции (ПЦР) на наличие в конъюнктивальном соскобе ДНК АДВ. Для идентификации аденовируса применяли набор реагентов для амплификации ДНК-вирусов (Adenovirus) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле (АмплиСенс Adenovirus—EPh). В пробирки с исследуемым материалом добавляли лизирующий раствор, тщательно перемешивали и прогревали при температуре 65°. Смесь центрифугировали 5 сек при 5000 об/мин на микроцентрифуге. Для выделения ДНК использовали на-досадочную жидкость, перенеся ее в новую пробирку. Пробирки помещали в термостат на 5-10 мин при температуре 65° для подсушивания сорбента. В пробирки добавляли ТЕ-буфер для элюции ДНК, перемешивали и снова помещали в термостат 65° на 5 мин. Центрифугировали пробирки при 12000 об/мин в течение 1 мин на микроцентрифуге. Для проведения ПЦР пробы помещали в амплификатор при температуре 95°. Затем продукты амплификации вносили в лунки агарозного геля. Время электрофореза составляло 18-20 мин при напряжении 250 В. По завершению времени электрофореза гель преносили на трансиллюминатор. Изображение геля получали на компьютере с помощью видеосистемы. Учет результатов ПЦР-анализа проводился по-наличию или отсутствию на электрофореграмме специфических полос ам-плификационных фрагментов ДНК.

Локальный цитокиновый статус изучали как по уровню экспрессии генов цитокинов, так и по содержанию самих цитокинов в конъюнктивальном соскобе. Изучение вышеуказанных параметров проводили параллельно в группах пациентов и у здоровых добровольцев. Исследование экспрессии генов 11 цитокинов (ИФН-а, ИФН-у, ИЛ-lß, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-б, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-18, ФНО-а) путем определения их матричной РНК (мРНК) проводили методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции

(ОТ-ПЦР). Тотальную клеточную РНК из тканей выделяли согласно методи-

ке, предложенной Chromezynsky Р. и Sacchi N. в 1987 году. Лизат переносили в чистую пробирку и добавляли равный объем смеси фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (25:24:1). Смесь интенсивно встряхивали в течение 10 сек и затем центрифугировали суспензию при 12000 об/мин в течение 15 минут. Затем верхнюю водную фазу аккуратно отбирали, добавляли равный объем изопропанола и оставляли при —20°С па 6-8 часов. Далее, тотальную РНК осаждали, центрифугируя спиртовую смесь при 12000 об/мин в течение 15 минут. Супернатант удаляли. Осажденную РНК промывали охлажденным 75% этанолом, подсушивали при комнатной температуре в течение 5-6 минут и растворяли в 40 мкл стерильной воды. Хранили раствор РНК при — 70°С, предварительно добавив 2,5 объема 75% этанола и 0,2М ацетата натрия. После амплификации продукты ПЦР анализировали электрофоретиче-ски в 2,5% агарозном геле. В качестве позитивного контроля амплификации использовали ß-actin. Электрофорез кДНК проводили в 2,5% агарозном геле с бромистым этидием (0,5мкг/мл) в Трис—ацетатном буфере, содержащем 0.2 М ЭДТА. Электрофорез вели в течение 35 минут в камерах для горизонтального электрофореза фирмы «Bio-Rad». Фотографировали на пленку Ми-крат-500 под мягким (360 нм) ультрафиолетовым освещением. Для идентификации нуклеотидных последовательностей использовали маркер для электрофореза фирмы Promega.

Содержание 9 цитокинов в материале ( ИФН-у, ИЛ-5, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-13, ФНО-а, ГМ-КСФ) оценивали методом проточной флуо-метрии на двухлучевом лазерном автоматизированном анализаторе Bio-Plex Protein Assay System (пр-во «Bio-Rad», США) с использованием тест-систем в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. На первом этапе образец инкубировали с микрочастицами, покрытыми антителами к различным цитокинам, отличающихся друг от друга по размеру и интенсивности фло-уресценции, и с биотилированными антителами. Затем образец очищали путем отмывки и добавляли конъюгат стрептавидин-фикоэритрин. После инкубации и отмывки образцы анализировали на проточном флуометре. Точные значения концентрации оценивали с помощью специального программ-

ного обеспечения, прилагаемого к набору. Метод позволяет производить количественную оценку в режиме реального времени в малом объеме образца (50 мкл) до 100 цитокинов. Для отдельных цитокинов была возможность проследить как уровень продукции генов, так и непосредственное их количество. . .

Материалом для исследования во всех случаях служили ьслетки конъ-юнктивального соскоба. Забор материала проводили у всех пациентов трехкратно (при первичном обращении, на 7-й и 14-й день наблюдения), у здоровых добровольцев забор материала осуществляли однократно. Манипуляцию проводили универсальным зондом после местной анестезии раствором про-ксиметакаина («Алкаин», Алкон, США), материал помещали в пробирку с 0,1 мл физиологического раствора, перемешивали и отстаивали 4 часа при комнатной температуре. Надосадочную жидкость использовали для тестирования.

Во всех случаях проводили микробиологическое исследование. Мазки, взятые с конъюнктивы, помещали в сывороточный бульон и затем доставляли в лабораторию, где проводили микроскопию исследуемого материала. Затем материал помещали в термостат при 37°С. На второй день изучали характер роста в бульоне, и проводили бактериологическое исследование с окраской по Грамму. В зависимости от морфологии микроорганизмов делали высевы на элективные питательные среды для выделения чистых культур с последующей идентификацией и определением чувствительности. При отсутствии роста в первые сутки, посевы оставляли в термостате и ежедневно просматривали их. При обнаружении роста производили соответствующие отсевы. Окончательный результат об отсутствии роста определяли через трое суток.

Статистическая обработка результатов

Статистическая обработка результатов была произведена при помощи

пакета SPSS Statistics 19. Для сравнения частот экспрессии генов цитокинов

между группами использовался критерий независимости х2 Пирсона, и Q-

тест Кохрана для анализа различий по визитам внутри каждой из групп. Ста-

тистическая достоверность различий количества цитокинов подтверждалась использованием критерия в модификации Краскела-Уолеса в исследуемых группах и критерия Манна-Уитни для попарного сравнения 1рупп. Критерий Фридмана использовался для сравнения количественного содержания цитокинов в динамике (по визитам). Для выявления статистически значимых связей создавали таблицы сопряженности и проводили корреляционный анализ с использованием коэффициентов Пирсона и тау-Кендалла. Результаты считались статистически достоверными при р < 0,05.

Результаты исследований и их обсуждение

При проведении клинико-иммунологического исследовании пациентов группы А, нами была выявлена особенность острого течения аденовирусной инфекции глаз — возрастание интенсивности симптомов заболевания (отека век, гиперемии и отека конъюнктивы, увеличение количества фолликулов) к 7 дню болезни, несмотря на проводимую противовирусную, антимикробную, противовоспалительную терапию. Данный феномен носит транзиторный характер, не требуя при этом коррекции лечения. Полученные нами статистически достоверные связи между репликацией вируса и динамикой симптомов позволяют объяснить возникновение этого феномена прямым повреждающим действием аденовируса на клетки конъюнктивы.

Лабораторная диагностика выявила особенности иммунологических реакций в слизистой оболочке глаза при острой форме течения аденовирусной инфекции глаз. Экспрессия генов цитокинов отражает потенциальный (возможный, но не фактический) цитокиновый ответ. В первую неделю инфекции уровень экспрессии мРНК интерферонов поддерживался сходным (ИФН-а) или был выше (ИФН-у), чем таковой у здоровых добровольцев (таблица 2). Однако, к 7-му дню болезни доля обследуемых с экспрессией генов данных цитокинов повышалась в сравнении с первым визитом (р < 0,05), при этом отмечалось некоторое усиление выраженно-

ста явлений конъюнктивапыгого воспаления. Это может свидетельствовать о повышении активности данных щггокина в ответ на массивную репликацию аденовируса в конъюнктиве для предотвращения гибели здоровых клеток. К третьему визиту доля обследуемых с экспрессией мРНК как ИФН-а, так и ИФН-у снижаются в сравнении с первым и вторым посещениями (р < 0,05) на фоне уменьшения интенсивности клинической симптоматики. Полученные результаты, по-видимому, свидетельствуют о постепенном «выключении» генов цитокинов при купировании инфекционного процесса.

При оценке изменения частоты экспрессии гена ИЛ-8 (хемокин, привлекающий в очаг воспаления цитотоксические клетки) в группе А было выявлено ее повышение (в 92,3% случаев), в отличие от группы здоровых добровольцев (70,0%) (р <0,05). Количество пациентов с выявленной мРНК ИЛ-8 (также, как генов других провоспалительных цитокинов — ИЛ-2, ФНО-а), постепенно снижалось в ходе развития воспалительного процесса. Повышение экспрессии гена ИЛ-8 в начале заболевания, по— видимому, было связано с необходимостью сконцентрировать защитные иммунные факторы вокруг внедрившихся вирусов для эффективного борьбы с патогенами. Дальнейшее снижение количества пациентов с экспрессией мРНК ИЛ-8 в динамике заболевания может отражать отсутствие необходимости дальнейшего привлечения иммунокомпетентных клеток в очаг воспаления.

Кроме того, мы наблюдали снижение частот экспрессии генов таких цитокинов, как ИЛ—2, ИЛ-12, ИЛ-18 на второй неделе заболевания (р < 0,05) при острой форме аденовирусной инфекции глаз, что возможно, является отражением обычного процесса взаимодействия вирус-организм на местном уровне, т.е. при неосложненном течении аденовирусной инфекции глаз сроки экспрессии мРНК этих цитокинов не должны превышать 7-ми дней от начала заболевания.

Таблица 2. Количество пациентов (%) с экспрессией мРНК цитокинов в группе с острой формой течения аденовирусной инфекции глаз (группа А) в сравнении со здоровыми добровольцами.

Цитокины Группа здоровых добровольцев (п=60) Группа А (п=45)

1—й день 7—й день 14—й день

ИФН-а 65,0 53,8я 69,5* 23,1*

ИФН-у 30,0 Т61.5*" 71,2* 15,4"

ИЛ-1р 65,0 |15,4* 23,1 15,4

ИЛ-2 70,0 76,9* 38,5* 30,8

ИЛ—4 95,0 |69,2* 61,5* 38,5"

ИЛ-6 65,0 46,2 46,2* 23,1*

ИЛ—8 70,0 53,8* 15,4*

ИЛ-10 100 92,3* 69,2* 30,8*

ИЛ—12 65,0 61,5 61,5* 30,8*

ИЛ—18 90,0 84,6й 53,8* 38,5*

ФИО—а 70,0 69,2 61,5* 30,8*

* — достоверные различия по сравнению со здоровыми добровольцами (р^),05)

# — достоверные различия между визитами внутри группы (р<0,05).

Установлены статистически достоверные связи между выявлением ДНК аденовируса в клетках конъюнктивы и частотой экспрессии генов медиаторов в группе А. У пациентов с обнаружением вирусного генома в конъюнк-тивальном соскобе была подавлена экспрессия мРНК ИЛ-1Р, что возможно, связано с направленной вирусной стратегией.

При оценке результатов количественного содержания цитокинов (реальный, фактический цитокиновый ответ) в группе А, нами был выявлен феномен «ген есть — цитокина нет», что проявлялось резким подавлением синтеза некоторых цитокинов в первую неделю инфекции (ИФН-у, ИЛ-5, ИЛ-10, ФНО-а, ГМ-КСФ) - возможно, за счет направленной вирусной стратегии в целом против процесса интерферонообразования (таблица 3).

Таблица 3. Продукция цитокинов клетками конъюнктивы (выражена в средних рангах) у пациентов с острой формой течения аденовирусной инфекции глаз в сравнепии со здоровыми добровольцами

Цитокины Средние ранги у здоровых добровольцев (п=60) Острая форма(п=45)

1(1-й день) 2(7-й день) 3(14-й день)

ИФН~у 22,30 |13,91*(50,0%) 12,6(24,0%) 10,27(40,0%)

ИЛ-5 29,47 110,32*'" 20,07" 13,92"

ИЛ-2 20,27 25,64"(75,0%) 17,43"(57,1%) 13,35"(100%)

ИЛ—4 24,00 26Д4"(62,5%) 15,8"(100%) 12,35" (50,0%)

ИЛ-10 30,23 18,00*'"(92г3%) 17,13"(72,7%) 12,96" (55,6%)

ИЛ-12 27,00 22,73"(60,0%) 17г37"(75,0%) 13,62" (16,7%)

ИЛ-13 21,93 |36,09*'" 13,93" 14,18

ФИО—а 26,93 110,00*(70,0%) 10,64(87,5%) 6,91 "(16,7%)

ГМ—КСФ 22,30 15,93* 8,11 6,73

* — достоверные различия по сравнению со здоровыми добровольцами; " - достоверные различия между визитами внутри группы.

На фоне назначенной иммуномодулирующей терапии вторая неделя заболевания характеризовалась включением альтернативного гуморального пу-

ти элиминации вируса - происходило усиление синтеза ИЛ-5 и ИЛ-10, что к 14-му дню болезни приводило к снижению процента пациентов с выявленной ДНК аденовируса. Интенсивность некоторых симптомов воспаления конъюнктивы, по нашим данным, напрямую были связаны с уровнем секреции того или иного цитокина (ИЛ-5, ИЛ-10 и ФНО-а).

Хроническое течение аденовирусной инфекции также имело свои кли-нико—иммунологические особенности, на основании анализа которых были сформулированы критерии диагноза хронической формы аденовирусного конъюнктивита: 1) наличие хронического конъюнктивита неустановленной этиологии; 2) перенесенный в анамнезе эпизод конъюнктивита острого или подострого течения давностью от трех месяцев до двух лет; 3) положительный результат на наличие в копъгонктивальном соскобе ДНК аденовируса, полуенный методом полимеразной цепной реакции; отрицательные результаты обследования на наличие в конъюнктивальном соскобе антигенов хлами-дий и вирусов простого герпеса.

У 39 пациентов (65%) наблюдался хронический вялотекущий конъюнктивит, а у 21 пациента (35%) наблюдалось рецидивирующее течение конъюнктивита (с эпизодами выраженных обострений и ремиссий).

Выявление сопутствующих хронических воспалительных заболеваний различной локализации у 95% пациентов с хронической аденовирусной инфекцией свидетельствует об их связи с вторичным иммунодефицитным состоянием. Это является фоном для хронического конъюнктивита.

Полученные нами лабораторные данные по экспрессии мРНК цитокинов в группе В выявили повышенную частоту экспрессии генов ИФН-у, ИЛ-2, ИЛ-6 в сравнении со здоровыми добровольцами (р<0,05), что согласуется с литературными данными о закономерностях цитокиногенеза при персистен-ции вируса в тканях и не противоречит существующему на современном этапе представлению о механизмах противовирусного иммунитета (таблица 4).

Таблица 4. Количество пациентов (%) с экспрессией мРНК цнтокинов в группе с хронической формой течения аденовирусной инфекции глаз (группа В) в сравнении со здоровыми добровольцами

Цитокин Группа здоровых добровольцев (л=60) Группа В (п=60)

1-й день 7-й день 14-й день

ИФНа 65,0 73,3* 40,0* 26,7*

ИФН-у 30,0 Тэз.з*'* 33,3* 13,3*

ИЛ-1Р 65,0 126,7*^ 133* 13,3

ИЛ—2 70,0 193,3*"* 53,3* 33,3*

ИЛ—4 95,0 ¿66,7*"* 40,0* 33,3

ИЛ-6 65,0 180,0*"* 46,7* 33,3*

ИЛ-8 70,0 66,7" 46,7* 20,0*

ИЛ-10 100,0 93,3* 40,0* 26,7*

ИЛ—12 65,0 60,0 53,3* 33,3*

ИЛ—18 90,0 80,0* 53,3* 33,3*

ФНО-а 70,0 60,0* 33,3* 26,7

* — достоверные различия по сравнению со здоровыми добровольцами^,05);

и —достоверные различия между визитами внутри групп (р<0,05).

Кроме того, наблюдается постепенное снижение частот экспрессии мРНК цитокинов на фоне стихания воспалительных явлений в динамике заболевания в группе В. Полученные данные по продукции потенциального цитокинового ответа (транскрипция генов) отражают единообразие локального цитокинового ответа на внедрение аденовируса в обеих группах (А и В).

Анализ значимых корреляций в группе В показал достоверную взаимосвязь (р < 0,05) симптомов местного воспаления слизистой оболочки глаза с продукцией ИЛ-10 и ИЛ-13 — при снижении уровня продукции данных цитокинов происходит купирование симптомов заболевания у пациентов.

Для оценки влияния на механизмы местного иммунитета и картины клинического воспаления, нами было проведено микробиологическое обсле-

дование пациентов обеих групп. Концентрация выявленных микроорганизмов превышала нормальные значения (свыше 10 КОЕ/мл), что, возможно связано с активацией сапрофитной микрофлоры при снижении защитных свойств слизистой оболочки глаза во время активного воспалительного процесса. Однако, поиск общих взаимосвязей между экспрессией мРНК, продукцией цитокинов, интенсивностью клинических симптомов и данными микробиологического исследования обнаружил отсутствие значимого влияния бактериального присутствия как на интенсивность симптомов воспаления конъюнктивы, так и на локальный синтез цитокинов. Сравнительный анализ видового и количественного состава микрофлоры конъюнктивы при острой и хронической формах аденовирусной инфекции глаз не выявил достоверных различий между группами А и В.

ВЫВОДЫ

1. Установлено наличие феномена усиления интенсивности клинических симптомов транзиторного характера у 73,3% пациентов группы с острым течением аденовирусной инфекции глаз (группа А) при назначении комплекса стандартной терапии в первую неделю заболевания.

2. Выявлено, что хроническое течение аденовирусной инфекции глаз имеет ряд клинических особенностей, что позволило сформулировать диагностические критерии данной формы заболевания: 1) Наличие хронического конъюнктивита неустановленной этиологии. 2) Перенесенный в анамнезе эпизод конъюнктивита острого или подострого течения давностью от трех месяцев до двух лет. 3) Положительный результат на наличие в конъюнкти-валыгом соскобе ДНК аденовируса, полученный методом полимеразной цепной реакции; отрицательные результаты обследования на наличие в конъ-юнктивальном соскобе антигенов хламидий и вирусов простого герпеса.

3. Доказано, что метод полимеразной цепной реакции является эффективным для определении ДНК аденовируса в динамике заболевания, как при остром, так и при хроническом течении аденовирусной инфекции и может

быть использован для контроля эффективности лечения.

4. Выявлено, что клетки конъюнктивы в норме способны экспрессировать гены цитокинов и вырабатывать сами цитокины в широком диапазоне значений (при отсутствии видимого воспаления, отрицательных результатах вирусологического и микробиологического тестов), что является, по-видимому, иммунной «составляющей» барьерной функции конъюнктивы.

5. Установлено, что в первые две недели развития воспаления в группе А достоверно увеличено количество пациентов с выявленной в клетках конъюнктивы мРНК ИФН-а и ИФН-у по сравнению со здоровыми добровольцами (р<0,05). По мере стихания клинических симптомов, доля пациентов с мРНК всех изучаемых цитокинов постепенно снижается. Определены общие закономерности течения местной воспалительной реакции с участием цитокинов как при острой, так и при хронической формах аденовирусной инфекции глаз: во-первых, в клетках конъюнктивы пациентов обеих групп наблюдается повышенная частота экспрессии генов ИФН-у по сравнению со здоровыми добровольцами (р<0,05). Во-вторых, на фоне стихания воспалительных явлений в динамике заболевания происходит постепенное уменьшение доли пациентов с мРНК цитокинов.

6. Определено, что видовой и количественный состав микрофлоры конъюнктивы при острой и хронической формах аденовирусной инфекции глаз не имеет достоверных различий. Выявлено отсутствие значимого влияния микрофлоры, как на интенсивность симптомов воспаления конъюнктивы, так и на локальный цитокиногенез.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

¡.Комплекс знаний о возможном усилении интенсивности клинических симптомов транзиторного характера, наблюдаемый при применении комплекса рекомендованной стандартной терапии (рекомендации экспертного совета по «красному глазу», 2010 г) при острой форме течения аденовирусной инфекции глаз позволят врачам-офтальмологам информировать пациентов о данном феномене, не требующем изменения лечебной тактики.

2.Сформулированные в работе критерии диагноза хронической формы аденовирусной инфекции глаз позволят повысить эффективность диагностики и своевременного выявления этой нозологической формы. Высокий процент пациентов с сопутствующей воспалительной патологией различной локализации (95%) с данной формой инфекции свидетельствует о настоятельной необходимости рекомендовать тщательное общее обследование этого контингента пациентов.

3.Учитывая преимущества метода мультиплексного анализа (короткий срок получения результатов, возможность одномоментного определения сотен и тысяч аналитов в одной биопробе), мы считаем возможным внедрение его в практику в качестве универсального метода изучения любых локальных биологических продуктов клеток конъюнктивы или других тканей глаза в целом.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1.Кочергин С.А., Чернакова Г.М., Клещева Е.А., Мезенцева М.В. Значение полимеразной цепной реакции в диагностике вирусных микст— инфекций глаз // IX Всероссийская школа офтальмологов. Сборник научных трудов. — М., 2010. — С.185-187.

2.Кочергин С.А., Чернакова Г.М., Клещева Е.А., Шаповал И.М., Мезенцева М.В. Полимеразная цепная реакция в диагностике и оценке эффективности терапии вирусных микст—инфекций глаз // Журнал инфекционной патологии,—2010.—Т.17,№3.—С. 174.

3.Кочергин С.А., Чернакова Г.М., Клещева Е.А., Шаповал И.М., Мезенцева М.В. Локальный цитокиновый статус при острых и хронических формах аденовирусных инфекций глаз // X Всероссийская школа офтальмологов. Сборник научных трудов, — М., 2011. — С.215-220.

4.Кочергин С.А., Чернакова Г.М., Клещева Е.А., Шаповал И.М., Мезенцева М.В. Локальный цитокиновый профиль при аденовирусной инфекции глаз // Офтальмологические ведомости —2011. — № 4. — С. 3240.

5.Кочергин С.А., Черпакова Г.М., Клещева Е.А., Шаповал И.М., Мезенцева М.В. Некоторые аспекты офтальмоиммунологии // Цитокины и воспаление. — 2012. — № 1. — С.

6.Кочсргин С.А., Чернакова Г.М., Клещева Е.А., Шаповал И.М., Мезенцева М.В. Локальный цнтокиновый статус при хронических формах аденовирусной инфекции глаз // Вестник РАЕН. — 2012. — Т.12, № 1. — С. 61-67.

7.Кочергин С.А., Чернакова Г.М., Клещева Е.А., Шаповал И.М., Мезенцева М.В. Локальный цитокиновый статус клеток конъюнктивы здоровых добровольцев // XI Всероссийская школа офтальмологов. Сборник научных трудов. — М., 2012. — С.311-317.

8.Кочергин С.А., Чернакова Г.М., Клещева Е.А., Шаповал И.М.. Мезенцева М.В. Местный иммунитет при острых и хронических формах аденовирусной инфекции глаз // Интерферон 2011. Сборник научных статей. — М., 2012. — С.342-347.

Список сокращений АВК — аденовирусный конъюнктивит АДВ — аденовирус

ГМ-КСФ — гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

ИЛ — шперлейкин

ИФН — интерферон

КОЕ — колониеобразующие единицы

мРНК — матричная рибонуклеиновая кислота

ОТ-ПЦР —полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

ПЦР — полимеразная цепная реакция

ФНО — фактор некроза опухолей

ЭКК — эпидемический керагоконъюнкгивиг

Подписано в печать:

02.10.2012

Заказ № 7662 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Оглавление диссертации Клещева, Елена Александровна :: 2012 :: Москва

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность темы.

Цель исследования.

Задачи исследования.

Научная новизна.

Практическая значимость.

Основные положения, выносимые на защиту.

Апробация работы.

Публикации.

Объем и структура работы.

ГЛАВА 1 Обзор литературы.

1.1. История изучения и строение аденовирусов.

1.2. Классификация, клиническая и лабораторная диагностика аденовирусных поражений глаз.

1.3. Особенности иммунологических реакций в тканях глазного яблока в норме и при аденовирусной инфекции глаз.

1.4. Микрофлора конъюнктивы в норме и при патологии.

ГЛАВА 2 Материал и методы исследования.

2.1. Клинические методы исследования.

2.2. Лабораторные методы исследования.

2.3. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3 Результаты собственных исследований.

3.1. Определение иммунологической нормы для здоровых добровольцев

3.2. Результаты комплексного клинико-иммунологического исследования пациентов с острой формой течения аденовирусной инфекции глаз (группа

3.2.1. Результаты клинического исследования пациентов группы А.

3.2.2. Результаты исследования экспрессии генов цитокинов в конъюнктивальном мазке в группе А (клинико-иммунологические параллели).

3.2.3. Результаты исследования количественного содержания цитокинов в конъюнктивальном мазке в группе А (клинико-иммунологические параллели).

3.3.Результаты комплексного клинико-иммунологического исследования пациентов с хронической формой течения аденовирусной инфекции глаз (группа В).

3.3.1. Результаты клинического исследования пациентов группы В.

3.3.2. Результаты исследования экспрессии генов цитокинов в конъюнктивальном мазке в группе В (клинико-иммунологические параллели).

3.3.3 Исследование количественного содержания цитокинов в конъюнктивальном мазке в группе В (клинико-иммунологические параллели).

3.4. Микробиологическое исследование конъюнктивального мазка в группах А и В.

Введение диссертации по теме "Глазные болезни", Клещева, Елена Александровна, автореферат

Актуальность темы

Воспалительные заболевания глаз имеют большой удельный вес в структуре всей офтальмопатологии (более 40% амбулаторного приема). Кроме того, на воспалительные заболевания приходится 80% временной нетрудоспособности среди больных с патологией глаз, до 50% стационарных больных, до 1030% слепоты [34]. Более половины больных с воспалительной патологией глаз имеют доказанный или предполагаемый вирусный характер заболевания. Аденовирус является самой частой причиной вирусных и инфекционных конъюнктивитов, и, следовательно, причиной синдрома «красного» глаза во всем мире [102]. О распространенности аденовирусных заболеваний человека свидетельствует тот факт, что 80% населения имеет комплементсвязывающие антитела к аденовирусам [9]. Аденовирусные инфекции глаз, проявляющиеся в виде аденовирусного конъюнктивита (АВК) или эпидемического кератоконъ-юнктивита (ЭКК), отличаются чрезвычайной распространенностью и являются серьезной проблемой здравоохранения. АВК составляет 90% всех случаев вирусиых конъюнктивитов и от 15 до 70 % случаев инфекционных конъюнктивитов [20, 27,35,77, 102].

Предположение о существовании хронической (латентной) формы течения аденовирусного конъюнктивита высказано в единственной отечественной публикации. В этой же работе приведены данные, свидетельствующие о достаточно высокой частоте затяжных (до 60%) и рецидивирующих (до 33%) форм аденовирусной инфекции глаз [3]. Сопоставляя эти данные с чрезвычайной распространенностью данной инфекции можно гипотетически предположить, что пациенты с хроническим (стертым, затяжным или рецидивирующим) течением являются значимым скрытым резервуаром инфекции. Некоторые авторы связывают существование данных форм заболевания со штаммо-выми особенностями возбудителя (серотипы 5, 6, 8, 9, 37), снижением общего иммунного фона у населения, а также последствиями нерационально проводимой терапии [3, 27, 28, 38]. В зарубежной литературе описаны случаи аденовирусной инфекции глаз, длящиеся 45 и более дней с момента появления первых симптомов заболевания (более 25% всех наблюдаемых случаев аденовирусной патологии глаз) [64].

Локальные регуляторные цитокиновые реакции (локальный цитокиновый статус) изучаются в настоящее время достаточно активно при различной оф-тальмопатологии [42, 46, 49, 55, 57, 82]. Основным объектом исследования локального цитокинового статуса является слезная жидкость, а доминирующим методом - иммуноферментный анализ (определение концентрации свободных цитокинов). В ряде работ прослеживается регуляторная роль цитокинов как медиаторов и катализаторов иммунного ответа при вирусной патологии органа зрения, причем некоторые авторы связывают избыточное повреждение тканей именно с нарушениями функционирования цитокиновой сети как эндогенного (аутоиммунитет), так и экзогенного (вирусы, микробы) характера.

В последние годы бурно развиваются наномедицинские технологии, особенно в области лабораторной диагностики. Разработан и внедрен в широкую практику в различных областях медицины метод мультиплексного анализа (рисунок 1), основанный на использовании полистироловых наномикрочастиц (микросфер). Основным преимуществом метода является возможность одномоментного определения сотен и тысяч аналитов в одной биопробе (любая биологическая жидкость или биоптат). Технология мультиплексного анализа сю о V! Я О я а о

8 X X т Н а те К п X 0

1 о к X к ¡а 8 ы К т т т. 4»

Окрашивание иотастиротовых микросфер 5.6 мкм смесью стух флуорофоров. что позвотает получить 100 типов микросфер с уникальным спектральным адресом ф ч

Добавление суспензии кикросфер Добавление детектирующего агента Считывание результатов эксперимента.

-2500 шт) к исследует» образцах и флуоресцентно« иетк* (скесь Проточный анализатор идентифицирует каждую кровь плазка. лизаты клеток. стрептавидин/фикоэритрин). индивидуальную кикросферу и детектирует сыворотка и ар.) интенсивность сигнала метки. А включает в себя пять последовательных этапов. Первые два этапа (стадии) представляют собой подготовку микросфер посредством их обработки специальными красителями, и, затем, растворами моноклональных антител к искомым аналитам. На третьей стадии готовые микрочастицы добавляются в биологическую пробу, при этом нанесенные на микросферу антитела связываются с искомым веществом. На четвертом этапе к полученным комплексам добавляется биодетектор с флюоресцентной меткой. Конечный этап анализа получил название проточной флуометрии и представляет собой регистрацию степени люминисценции каждой микросферы со связанным аналитом с помощью лучевого лазерного анализатора, которая позволяет судить о концентрации аналитов. В доступной отечественной и зарубежной литературе отсутствуют данные по использованию вышеописанной технологии для изучения закономерностей локального цитокиногенеза при аденовирусных инфекциях органа зрения.

Все вышесказанное определило цель нашего исследования. Цель исследования

Определить особенности клинической картины, патогенетическую значимость показателей локальной иммунореактивности на примере специфического иммунного (цитокинового) ответа при острых и хронических формах аденовирусной инфекции глаз.

Задачи исследования

1. Дать общую характеристику больных с острыми и хроническими формами течения аденовирусной инфекции глаз.

2. Оценить динамику локальной вирусной нагрузки в процессе развития заболевания с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) при острых и хронических формах течения аденовирусной инфекции.

3. Изучить локальный иммунный статус по продукции генов цито-кинов и самих цитокинов клетками конъюнктивы методами полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и проточной флуомет-рии у здоровых добровольцев.

4. Выявить возможную зависимость клинического течения аденовирусной инфекции глаз от состояния локального иммунного статуса по продукции генов цитокинов и самих цитокинов клетками конъюнктивы.

5. Оценить влияние микрофлоры конъюнктивы на развитие локальных цитокиновых реакций при острых и хронических формах аденовирусной инфекции глаз.

Научная новизна

1. Изучена нормальная продукция генов цитокинов и самих цитокинов непосредственно клетками конъюнктивы методами ОТ-ПЦР и проточной цитофлюометрии.

2. Изучена продукция генов цитокинов и самих цитокинов непосредственно клетками конъюнктивы при различных формах аденовирусной инфекции глаз в динамике методами ОТ-ПЦР и проточной флуометрии у пациентов.

3. Исследован состав микрофлоры конъюнктивы, сопутствующей различным формам аденовирусной инфекции глаз.

4. Выявлена значимость методики ПЦР для диагностики аденовирусной инфекции глаз в динамике заболевания при различных формах течения инфекции.

5. Доказана достаточная чувствительность и специфичность метода ГПДР в отношении выявления ДНК аденовируса при острых и хронических формах течения инфекции.

Практическая значимость

1. Комплекс знаний о клинических особенностях хронического течения аденовирусной инфекции глаз позволит своевременно выявлять стертые и затяжные случаи этой инфекции, что может способствовать адекватным мероприятиям по предотвращению распространения внутригоспитальной инфекции.

2. Выявленная высокая чувствительность метода полимеразной цепной реакции к обнаружению ДНК аденовируса позволяет считать его методом выбора при подозрении на хроническую форму аденовирусной инфекции глаз при дифференциальной диагностике хронических конъюнктивитов неустановленной этиологии.

3. Методика мультиплексного анализа конъюнктивального соскоба после соответствующих предварительных исследований может быть внедрена в клиническую практику офтальмологов для одномоментного определения десятков и сотен самых разных параметров (цитологии клеток, определения различных патогенов, биохимических показателей и т.д.).

4. Показатели локального иммунного статуса при острых и хронических формах вирусных инфекции глаз заболевания могут служить объективным критерием в оценке эффективности местной иммуномодулирующей терапии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Хроническая форма конъюнктивита при аденовирусной инфекции глаз имеет ряд клинико-иммунологических особенностей. Острое течение аденовирусного конъюнктивита характеризуется наличием феномена усиления интенсивности симптомов в первую неделю заболевания на фоне применения стандартной схемы терапии.

2. Экспрессия генов цитокинов, характеризующая потенциальный цитокиновый ответ, а так же их фактический синтез осуществляется и здоровыми клетками конъюнктивы на достаточно высоком уровне. До начала лечения как при острой, так и при хронической форме течения инфекции выявлены сходные уровни экспрессии генов клетками конъюнктивы, отражающие схожий потенциальный цитокиновый ответ (р>0,05).

3. До начала лечения фактические концентрации практически всех исследуемых цитокинов, продуцируемых клетками конъюнктивы, достоверно отличаются в группах с острым (группа А) и хроническим аденовирусным конъюнктивитом (группа В) и имеют разные векторы изменения по сравнению с нормой.

4. Сравнительный анализ видового и количественного состава микрофлоры конъюнктивы при острой и хронической формах аденовирусной инфекции глаз не выявляет достоверных различий между группами А и В и обнаруживает отсутствие значимого влияния бактериального присутствия как на интенсивность симптомов воспаления конъюнктивы, так и на локальный ци-токиногенез.

Апробация работы

Основные положения диссертации были представлены на конференциях российского и регионального уровня:

• X Всероссийской школе офтальмологов (Москва, 2011);

• XI Всероссийской школе офтальмологов (Москва, 2012);

• Совместной научно-практической конференции кафедры офтальмологии и сотрудников Офтальмологической клинической больницы г. Москвы (Москва, 2012).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 3 в журналах, входящих в перечень ВАК ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание ученой степени кандидата наук.

Объем и структура работы

Заключение диссертационного исследования на тему "Острые и хронические формы аденовирусной инфекции глаз (клинико-иммунологическое исследование)"

выводы

2. Выявлено, что хроническое течение аденовирусной инфекции глаз имеет ряд клинических особенностей, что позволило сформулировать диагностические критерии данной формы заболевания: 1) Наличие хронического конъюнктивита неустановленной этиологии. 2) Перенесенный в анамнезе эпизод конъюнктивита острого или подострого течения давностью от трех месяцев до двух лет. 3) Положительный результат на наличие в конъюнктивальном соскобе ДНК аденовируса, полученный методом полимеразной цепной реакции; отрицательные результаты обследования на наличие в конъюнктивальном соскобе антигенов хламидий и вирусов простого герпеса

4. Выявлено, что клетки конъюнктивы в норме способны экспресси-ровать гены цитокинов и вырабатывать сами цитокины в широком диапазоне значений (при отсутствии видимого воспаления, отрицательных результатах вирусологического и микробиологического тестов), что является, по-видимому, иммунной «составляющей» барьерной функции конъюнктивы.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Комплекс знаний о возможном усилении интенсивности клинических симптомов транзиторного характера, наблюдаемый при применении комплекса рекомендованной стандартной терапии (рекомендации экспертного совета по «красному глазу», 2010 г) при острой форме течения аденовирусной инфекции глаз позволят врачам-офтальмологам информировать пациентов о данной феномене, не требующем изменения лечебной тактики.

2. Сформулированные в работе критерии диагноза хронической формы аденовирусной инфекции глаз позволят повысить эффективность диагностики и своевременного выявления этой нозологической формы. Высокий процент пациентов с сопутствующей воспалительной патологией различной локализации (95%) с данной формой инфекции свидетельствует о настоятельной необходимости рекомендовать тщательное общее обследование этого контингента пациентов.

3. Учитывая преимущества метода мультиплексного анализа (короткий срок получения результатов, возможность одномоментного определения сотен и тысяч аналитов в одной биопробе) мы считаем возможным, после соответствующих предварительных исследований, внедрение его в практику в качестве универсального метода изучения любых локальных биологических продуктов клеток конъюнктивы или других тканей глаза в целом.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2012 года, Клещева, Елена Александровна

1. Авдыкович A.A. Цитоскопия коньюнктивального соскоба при фа-ринго-коньюнктивальной лихорадке // Вести. Офтальмол. —1963. -—■ №1. — С. 46-51

2. Авдыкович, А. А. Аденовирусный фаринго-конъюнктивит и его лечение гаммаглобулином (фаринго-конъюнктивальная лихорадка). Автореф. дис. . канд. мед. наук. — Ленингр. гос. ин-т усоверш. врачей им. С. М. Кирова. — Ленинград, 1963.

3. Азнабаев М.Т., Мальханов В.Б. Аденовирусные и хламидийные заболевания глаз.— Уфа, «Билем», 1995. — с. 112.

4. Анджелов В.О. Аденовирусные заболевания глаз (этиология, кли-нико-эпидемиологические особенности, лечение и профилактика): Автореф. Дис. докт. мед. наук. — М., 1971. — с. 30.

5. Анджелов В.О., Майчук Ю.Ф., Поздняков В.И. Эпидемический ке-рато-конъюнктивит // Труды Туркменского научно-исследовательского института глазных болезней "Болезни конъюнктивы". — Ашхабад, — 1973. — Т. XIV. —С. 38-43.

6. Анджелов В.О., Кричевская Г.И, Хилько С.Н., Кирасова М.А., Конева Е.Б. Иммуноферментный анализ в диагностике АДВ заболеваний глаз // Вестн. Офтальмологии. — 1988 — №6. — С. 65-75.

7. Анджелов В.О., Майчук Ю.Ф., Кричевская Г.И., Конева Е.Б. Профилактика вспышек аденовирусных заболеваний глаз // Вестн. Офтальмол. — 1989. —№2. —С. 65-67.

8. Анджелов В.О., Кричевская Г.И. Лабораторная диагностика оф-тальмоинфекций. // Офтальмологический журнал. — 2001. — №1. — С. 5-9.

9. Ацев С., Добрев И. Цитологическое и цитохимическое исследование динамики цитопатогенного действия аденовируса 14. "Воздушно114капельные вирусные и бактериальные инфекции". — Пловдив, 1965. — С. 2630.

10. Бикбов М.М., Шевчук Н.Е., Мальханов В.Б. Цитокины в клинической офтальмологии. — Уфа, ГУ Уфимский научно-исследовательский институт глазных болезней АН РБ, ГУП РБ «Уфимский полиграфкомбинат». —2008.1. С. 11-20, 42^18.

11. Вохмяков A.B. Выбор оптимального антибиотика для профилактики инфекционных осложнений в офтальмохирургии /Вохмяков A.B., Околов H.H., Гурченок П.А. // Клиническая офтальмология. — 2007. — Т. 8, № 1. — С. 37-40.

12. Гинтер Е.К. Медицинская генетика. — М.,Медицина. — 2003. —448с.

13. Дрейзин Р. С., Жданов В. М. Аденовирусная инфекция. М., 1962.

14. Дрейзин P.C., Соболева В. Д. В Респираторные вирусные и энтеро-вирусные инфекции у детей.—М.,— 1971.— 137 е.

15. Дербасова Н. Н. Особенности иммунных нарушений при герпетической инфекции глаз и клинико-иммунологическая эффективность различных схем терапии: Автореферат дис. . канд. мед. наук.—М., — 2007. — 24 с.

16. Екимов А.Н., Шипулин Г.А., Бочкарев Е.Г. Рюмин Д.В. Новейшие технологии в генодиагностике: полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-Time PCR) // Вестник последипломного медицинского образования.2001. — №3. С.4—8.

17. Зильбер H.A. И.И. Мечников и учение об иммунитете // Научное наследство.-M.-JL, 1948.— Т. 1.— С.482-519

18. Золотарева М.М., Map Г.И. Роль аденофаринго-конъюнктивальной группы вирусов в некоторых воспалительных заболеваниях глаз // Вестник офтальмологии. — 1959. — №6. — С. 38-45.

19. Казакбаев А.Г. Комплексная диагностика и лечение эпидемического кератоконъюнктивита: Автореф. Дисс. . канд.мед.наук.—М.,1989.—19с.

20. Каранадзе H.A., Южаков A.M. Изучение бактериальной флоры конъюнктивы глаз и ее чувствительности к антибиотикам //Офтальмол. журн.— 1984. № 1,—С. 54-57.

21. Каспаров A.A. Офтальмогерпес. — М., Медицина. — 1994. — 224 с.

22. Каспарова Е.А., Марченко Н.Р., Лосева И.Е. Метод флюоресцирующих антител в экспресс-диагностике аденовирусных поражений глаза // Вестник офтальмологии. — 1998. — Т. 114. —№4. — С. 24-26.

23. Кетлинский С.А., Симбирцев A.C. Цитокины. — Санкт-Петербург, 2008, —549 с.

24. Кричевская Г.И., Яни Е.В., Вахова Е.С. Быстрые иммунохромато-графические методы в диагностике аденовирусных заболеваний глаз // III Российский общенац. офтальмол. форум. —М., —2010. — Т. 2. — С. 38-42.

25. Краснов М.М., Каспаров A.A., Воробьева O.K. и др. Полудан в лечении вирусных заболеваний глаз // Вестн. офтальмол. — 1997. —№ 5. — С. 35-39.

26. Краснов М.М., Каспаров A.A., Каспарова Е.А. Клинические особенности и иммунотерапия осложненных форм аденовирусного конъюнктивита //Вестн. офтальмол, — 1998. —№ 5, —С. 23-28.

27. Коротких С.А., Шеломенцев H.A., Бобыкин Е.В. Применение глазных капель Дикло-Ф в лечении аденовирусных кератоконъюнктивитов // Клиническая офтальмология. — 2005. — Т.6, № 3. — С. 130-131.

28. Майчук Ю.Ф. Вирусные заболевания глаз. — М., «Медицина»,— 1981,-269 с.

29. Майчук Ю.Ф. Профилактика и эпидемиология слепоты в мире.— М., 1986, —80с.

30. Майчук, Ю. Ф. Алгоритм терапии бактериальных конъюнктивитов и кератитов / Ю. Ф. Майчук // Справочник поликлинического врача. —2005. — №4, —С. 73-76.

31. Майчук Ю.Ф. Оптимизация фармакотерапии воспалительных болезней глазной поверхности // Рос. офтальмол. Журнал. — 2008. — № 3. — С. 18-25.

32. Майчук Ю.Ф., Зайцева О.В. 11Р8 Аденодетектор для экспресс- диагностики аденовирусного конъюнктивита // Новое в офтальмологии. — 2009. — №3. —С. 65-68.

33. Майчук Ю.Ф. Оптимизация фармакотерапии воспалительных болезней глазной поверхности. Издание второе. —Москва, 2010. — 114 С.

34. Мальханов В.Б., Грипась И.А., Кудоярова Э.Г. Актуальные вопросы профилактики, диагностики и лечения вирусных заболеваний глаз. — Уфа, 1987. —147 С.

35. Мальханов В.Б., Марванова З.Р., Шевчук Н.Е. Цитокиновый статус больных офтальмогерпесом // Вопросы вирусологии. — 2004. № 1. - С. 28-30.

36. Маркова Е.В. Анатомия, физиология и патология органа зрения. Иммунологические аспекты глазных заболеваний: учебное пособие/Е.В.Маркова, Т.В.Климова.—Новосибирск:Изд.НГПУ, 2010.

37. Марченко Н.Р., Каспарова Е.А., Лосева И.Е. Метод флюоресцирующих антител в экспресс-диагностике аденовирусных поражений глаз // Вестник офтальмологии. — 1998. — № 4. — С. 24-26.

38. Мезенцева M.B. Закономерности функционирования и направленная коррекция цитокиновой регуляторной сети: Автореферат дис. .док. мед. наук — М.—2006. — 43 с.

39. Микули С.Г., Орловская Л.Е., Поздняков В.И. Результаты иммунологического исследования слезной жидкости у больных эпидемическим керато-конъюнктивитом. — Вирусные заболевания глаз.—М.,— 1977. — С. 50-53.

40. Никитин H.A., Кузбеков Ш.Р. Роль TGFß в офтальмологии // Цитокины и воспаление. — 2009. — Т. 8, № 1. — С. 3-9.

41. Околов И.Н., Гурченок П.А., Вохмяков A.B. Нормальная микрофлора конъюнктивы у офтальмохирургических пациентов.// Офтальмологические ведомости. — 2008. — Т. 1 3.— С. 18-21.

42. Рабсон А., Ройт А., Делвз П. Основы медицинской иммунологии.1. М., 2006. — С.168-169.

43. Сакович В.Н. Характер микрофлоры конъюнктивальной полости глаза и ее чувствительность к антибиотикам при гнойных кератитах // Офталь-мол. журн.—1991. — №3.— с. 189-190.

44. Слепова О. С. Влияние нарушений иммунитета на исход лечения при хирургических вмешательствах на глазах // II Евро-Азиатская конф. по оф-тальмохирургии. — Екатеринбург, 2001. — С. 365-366.

45. Скопинская С.Н., Анджелов В.О., Вахова Е.С. Изучение эффективности метода ДНК-гибридизации в диагностике аденовирусных и хламидийных заболеваний глаз // Вестник офтальмологии. — 1997. —Т.113, № 2. —С.19-21.

46. Сомов Е.Е. Герпетические и эпидемические вирусные кератоконъ-юнктивиты. — С.-Петербург. — 1996. — 48 с.

47. Теплинская Л.Е., Филичкина Ы.С., Матевосова К.С. Эффективность лечения увеитов препаратом суперлимф// Вестник офтальмологии. — 2005. — №4. — С. 22.

48. Хаитов P.M. Аллергология и иммунология. Национальное руководство. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. - 636 е.;

49. Харченко Е.П., Клименко М.Н. Иммунная уязвимость моз-га//Журнал неврологии и психиатрии. 2007. - №1. - С.70-77.

50. Чешик С. Г. Клиническая характеристика аденовирусных заболеваний у детей. Автореф. Дисс. . канд.мед.наук. — М., 1961. — 24с.

51. Шаимова, В.А. Изучение состава микрофлоры клинически здоровой конъюнктивы и при бактериальном кератите / В.А. Шаимова // Актуальные проблемы офтальмологии: сб. тез. 9-й науч.-практ. конф. -М., 2006. — С. 85-87

52. Шевчук Н.Е., Мальханов В.Б., Марванова З.Р., Интерфероновый статус больных герпетическим кератитом // Проблемы офтальмологии. — 2007. -№ 1.-С. 29-32.

53. Ярилин А.А. Иммунология. — «ГЭОТАР-Медиа».— 2010 г.

54. Abu el-Asrar A.M., Geboes К., Tabarra K.F., Van den Oord J J., Missotten L. Immunopathogenesis of vernal keratoconjunctivitis // Bull. Soc. Beige. Ophthalmol.—1996.—Vol. 261. —P. 15-24.

55. Ahmed E., Roy S.N. A study of fifty cases of keratoconjunctivitis // Indian Journal of Ophthalmology. — 1973. —Vol.21, № 1. — P. 23-24.

56. Bell J.A., Ward T.G., Huebner R.J. Studies of adenoviruses (APC) in volunteers//Am. J. Public Health.— 1956.—Vol. 46, №4. — p. 1130-1146.119

57. Bell J. A. Epidemiology of pharingoconjunctival fever // American Journal of Ophthalmology.— 1957. — Vol. 43, № 3. — P. 36-40.

58. Benko M., Harrach, B., Russell, W. C. Adenoviridae. In VirusTaxonomy. Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, Edited by M. H. V. van Regenmortel, San Diego: Academic Press. — P. 227238.

59. Bennett F.M., Law B.B., Hamilton W. Adenovirus eye infections in Aberdeen//Lancet.— 1957. — №2. — P. 670.

60. Bryden A.S, Bertrand J. Diagnosis of adenovirus conjunctivitis by enzyme immunoassay //Br. J. Biomed. Sei. — 1996. —Vol. 53, № 3. —P. 182-184.

61. Butt A.L., Chodosh J. Adenoviral keratoconjunctivitis in a tertiary care eye clinic // Cornea. — 2006. — Vol.25, № 2. — P. 199-202.

62. Chodosh J., Miller D., Stroop W.G., Pflugfelder S.C. Adenovirus epithelial keratitis // Cornea. — 1999. —Vol.14, № 2. —P. 167-174.

63. Darougar S., Gibson J.A. Epidemic keratoconjunctivitis and chronic papillary conjunctivitis in London due to adenovirus type 19 // Br. J. Ophthalmol. — 1977. —Vol.61. —P. 76-85.

64. Dawson C. R., Hanna L., and Togni B. Adenovirus type 8 infection in the United States. IV-Observations on the pathogenesis of lesions in severe eye disease//Archives of Ophthalmology.— 1972. —Vol.87, № 4. — P. 258-268.

65. Elnifro E., Cooper R., Klapper P., Bailey A., Tullo A. Diagnosis of viral and chlamydial keratoconjunctivitis: which laboratory test? // Br J Ophthalmol. — 1999. —Vol.83, № 5. —P. 622-627.

66. Ferguson T.A., Griffith T.S. The role of Fas ligand and TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) in the ocular immune response // Chem. Immunol. Allergy.—2007.— Vol.92.— P. 140-154.

67. Fuchs E. Keratitis punctata superficialis // Wien. Klin. Wochenschr. — 1889. — №2. — P. 837-841.

68. Guarner F., Malagelada J.R. Gut flora in health and disease. //The Lancet, Volume 361, Issue 9356, 8 February 2003, Pages 512—519.

69. Guyer B., Hierholzer J.C. Epidemic keratoconjunctivitis: A community outbreak of mixed adenovirus type 8 type 19 infection // J. Infect. Dis. — 1975. — Vol. 132. —P. 142-150.

70. Herbert H. Superficial punctate keratitis associated with an encapsulated bacillus // Ophthalmol. Rev. — 1901. — №20. — P. 33.

71. Hierholzer J.C., Pumarola A., Rodriguez-Torres A. Occurrence of respiratory illness due to an atypical strain of adenovirus type 11 during a large outbreak in Spanish military recruits // Am. J. Epidemiol. — 1974. — Vol. 99. — P. 434-442.

72. Huebner R.J., Todaro G. J. Oncogenes of RNA tumor viruses as determinante of cancer // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. — 1969. — Vol. 64, № 3. — P. 1087-1091.

73. Ishii K., Nakazono N., Fujinaga K. Comparative Studies on Aetiology and Epidemiology of Viral Conjunctivitis in Three Countries of East Asia—Japan, Taiwan and South Korea // Int. J. Eppidemiol. — 1987. —Vol.16. P.98-103.

74. Isenberg S.J., Apt L., Valenton M. A controlled trial of povidone-iodine to treat infectious conjunctivitis in children // Am. J. Ophthalmol. — 2002. — Vol.134.-P.681-688.

75. Jackson R., Morrisa D.J., Cooper R.J., Bailey A.S., Klapper P.E., Cleator G.M., Tullo A.B. Multiplex polymerase chain reaction for adenovirus and herpes simplex virus in eye swabs // J. of Virol. Methods. — 1996. — Vol. 56, № 1. —P. 41-48.

76. Jawetz E., Hanna L., Kimura S. J., Thygeson P. Clinical Diseases of Adults Associated with Sporadic Infections by APC Viruses // AMA Arch Intern Med. — 1956. — Vol. 98, № 1. — P. 71 -79.

77. Jawetz E. The story of shipyard eye // B. M. J. — 1959. — № 1. P. 873876.

78. Kasp-Grochowska E., Graham E., Sanders MD., et al. Autoimmunity and circulating immune complexes in retinal vasculitis. // Trans. Ophalmol. Soc. UK.-1981.- Vol. 101.-P. 342-348.

79. Kazama H., Ricci J-E., Herndon J.M., Hoppe G., Green D.R., Ferguson T.A. Immune tolerance by apoptotic cells requires caspase dependent oxidation of HMGB1 //Immunity. — 2008. —Vol. 29.—P. 21-31.

80. Khanna K.M., Lepisto A.J., Decman V., and Hendricks R.L. Immune control of herpes simplex virus during latency // Curr.Opin.Immunol. — 2004. — Vol.16.—P. 463-469.

81. Kirkwood B. J. Normal flora of the external eye. //J. Amer. Sei. Ophthal. Regist. Nurs. — 2007. — Vol. 32, N 1. —P. 12-13.

82. Klapper P.E., Cleator G.M. Adenovirus cross-infection: a continuing problem // J. Hosp. Inf. — 1995. —№ 6. — P. 262-267.

83. Lenardo M.J. Introduction: The molecular regulation of lymphocyte apoptosis // Semin. Immunol. — 1997. — Vol. 9. —P. 1-5.

84. Mahy B.W., Regenmortel H.V. Encyclopedia of Virology (Third Edition). — Elsevier Ltd. —2008.

85. Mancini G., Garbonara A. O., Heremans G. F. Immunological quantitation of antigens by single radial immunodiffusion // Immunochemistry. — 1965. — Vol. 2, № 3. — P. 235-254.

86. Matsuda A., Tagawa Y., Matsuda II. TGF-beta2, tenascin, and integrin betal expression in superior limbic keratoconjunctivitis //Jpn.J.Ophthalmol. — 1999. -Vol.43, №4. -P.251-256.

87. Mclnnis K.A. et al, Synthesis of alpha-chemokines IP-10, I-TAC, and MIG are differentially regulated in human corneal keratocytes // Investigative Ophthalmology and Visual Science. — 2005. — Vol.46, № 5.— P. 1668-1674.

88. Medawar P.B. Uniqueness of the individual, —L., —1957.

89. Medawar P.B. Immunological tolerance // Les prix Nobel en 1960, Stockh.,—1961. —P. 125—134.

90. Nelson J. The conjunctiva: normal flora // Cornea: Fundamentals of cornea and external disease. —1998— Vol. 1., № 3 -— Mosby CD online.

91. Nichols J.E., Niles J.A., Roberts N.J. Human lymphocytes after exposure to influenza A virus//J. Virol. — 2001.— Vol. 75, № 13.—P. 5921-5929.

92. Niederkorn J.V. Mechanisms of immune privilege in the eye and hair follicle // J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. — 2003. — Vol. 8, № 2. — P. 168— 172.

93. Nussenblatt R.B., Palestine A.G. Uveitis. Fundamental and Clinical Practice. // Year book medical publishers, inc.-Chicago, London. — 1989. — P. 443.

94. Olsen C.W., Kehren J.C., DybdahlSissoko N.R., Hinshaw V.S. Bcl2 alters influenza virus yield, spread and hemagglutinin glycosylation // J. Jen. Virol. 1996. — Vol. 70. — P. 663-666.

95. Palay D.A.,Krachmer J.H. Ophthalmology for the primary care physician, — St. Louis, Mosby, — 1997.

96. Pelczar M.J., Chan E.C.S., Kreig N.R. Microbiology, 5th ed., McGraw-Hill Book Company, New York. — 1986.

97. Robert P., Sambursky M.D., Nikole Fram. The prevalence of adenoviral conjunctivitis at the Wills Eye Hospital Emergency Room // Optometry. — 2007.1. Vol.78, №5. —P.236-239.

98. Rosebury T. Microorganisms indigenous to man // N.Y., —1962. ■—P.45.65

99. Schwartz H.S., Vastine D.W., Yamashiroya H. Immunofluorescent detection of adenovirus antigen in epidemic keratoconjunctivitis // Invest. Ophthalmol.1976. —№15. P. 199-207.

100. Sonoda K.H., Nakamura T., Young H.A., Hart D., Carmeliets P., Stein-Streilein, J. NKT cell-derived urokinase-type plasminogen activator promoted peripheral tolerance associated with eye // J. Immunol. — 2007. — Vol.179. — P. 2215-2222.

101. Streilein J.W. Occular immune privilege: therapeutic opportunities from an experiment of nature // Nature. Rev. Immunol. — 2003. — Vol. 3, № 11. — P. 879-889.

102. Sumbursky R., Tauber S., Schirra F. The RPS Adeno Detector for diagnosis adenoviral conjunctivitis // Ophthalmology. — 2006. — № 10. — P. 17581764.

103. Takizawa T., Fucuda R., Miyawaki T. et al. Activation of apoptosis Fas antigenencoding gene upon influenza virus infection involving spontaneously produced betainterferon // Virol. — 1995. — Vol. 209. — P. 288-296.

104. Udeh B.L., Schneider J.E., Ohsfeldt R.L. Cost effectiveness of a pointof-care test for adenoviral conjunctivitis // Ophthalmology. — 2006. — № 10. — P.1758-1764.

105. Wadell, G. Molecular epidemiology of human adenoviruses // Curr. Top. Microbiol. Immunol.— 1999. — Vol. 110. — P. 191-220.

106. Ward T.G., Huebner R.J., Rowe W.P., Ryan R.W., Bell J.A. Production of pharyngoconjunctival fever in human volunteers inoculated with APC viruses // Science. — 1955. — Vol.122, №3.-1086-1087.

107. Weber C.M., Eichenbaum J.W. Acute red eye. Differentiating viral conjunctivitis from other, less common causes // Postgrad. Med. — 1997. — Vol. 101, № 5. P.185-186, 189-192, 195-196.

108. Wilhelmus K., Robinson N., Font R. et al. Fungal keratitis in contact lens wearers// Am. J. Ophthalmol. — 1988. — Vol. 106. — P. 708-714.

109. Youmans G.P., Paterson P.Y, Sommers H.M. The Biologic and Clinical Basis of Infectious Diseases, 1975Каспаров А.А. Офтальмогерпес. —M., Медицина.— 1994. — 224 с.

110. Zweighaft R.M., Hierholzer J.C., Bryan J.A. Epidemic keratoconjunctivitis at a Vietnamese refugee camp in florida // American Journal of Epidemiology. — 1977.— Vol.106, № 5.—P. 399-407.