Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Особенности цито-иммунологических показателей мокроты и функциональной активности легочных макрофагов детей с бронхиальной астмой контролируемого и неконтролируемого течения

На правах рукописи

БАБАЙЛОВ Михаил Сергеевич

ОСОБЕННОСТИ ЦИТО-ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ МОКРОТЫ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕГОЧНЫХ МАКРОФАГОВ ДЕТЕЙ С БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ КОНТРОЛИРУЕМОГО И НЕКОНТРОЛИРУЕМОГО ТЕЧЕНИЯ

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

14.01.08 - педиатрия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 и ЯР

Челябинск - 2012

005010962

Работа выполнена на кафедре факультетской педиатрии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор,

доктор медицинских наук, профессор

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский

государственный медицинский университет» министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Защита диссертации состоится «29» февраля 2012 года в_______

часов на заседании диссертационного совета Д 208.117.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Государственного бюджетного образовательного учреждения

высшего профессионального образования «Челябинская

государственная медицинская академия» министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Автореферат разослан « » января 2012 г.

Брюхин Геннадий Васильевич Жаков Ярослав Игоревич

Пищальников Александр Юрьевич Шилко Владимир Иванович

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук Л.С. Латюшина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность научного исследования

Бронхиальная астма (БА) относится к социально-значимым заболеваниям, что определяется ее распространенностью в популяции, высокими показателями обращаемости на уровне первичной медицинской помощи, тяжестью течения, а также возможностью развития смертельных исходов (Barnes P.G., 2006, Геппе H.A., 2007; Баранов A.A., Хаитов P.M., 2008; Чучалин А.Г., 2008).

Для единого подхода к ведению пациентов с БА специалистами разных стран была разработана Глобальная стратегия лечения и профилактики данного заболевания (GINA 2002, 2006, 2007, 2010). Базовые позиции этого документа постоянно пересматриваются и обновляются.

Согласно данным, представленным в GINA (начиная с 2006 г.) основной идеей в лечении БА является достижение контроля над заболеванием. Термин «контроль» означает отсутствие клинических проявлений заболевания и стабильность функциональных легочных тестов. Тем не менее, доказано, что даже при отсутствии клинических проявлений БА существует персистирующее аллергическое воспаление, которое запускает механизмы тканевого и клеточного ремоделирования дыхательных путей и приводит к необратимым структурным изменениям последних (Taylor Doherty Т., 2007).

Таким образом, крайне важно проводить комплексную оценку заболевания, затрагивающую как клинические симптомы, так и лабораторные маркеры воспаления (определение уровня оксида азота в выдыхаемом воздухе, количества эозинофилов в мокроте), что важно для своевременного назначения адекватной базисной терапии и ее коррекции (GINA, 2006).

Большинство методик, которые позволяют оценить воспалительный процесс, протекающий в слизистой оболочке бронхов, являются инвазивными и трудоемкими, что препятствует их применению в повседневной практике.

Одним из перспективных методов, который уже широко внедрен во многих странах и начинает использоваться в России, является метод индуцированной мокроты (ИМ), благодаря которому возможна оценка клеточного состава и цитокинового профиля бронхиального секрета. В патогенезе БА достаточно хорошо изучена роль эозинофилов, но все больше исследователей уделяют внимание и другим клеточным элементам, в частности, легочным макрофагам (Peters-Golden М., 2004; James R. Banks et al., 2009). Фагоцитарное звено в патогенезе БА является незаслуженно малоизученным и требует дальнейших исследований в этом направлении. Имеются немногочисленные работы, позволяющие предположить участие

легочных макрофагов в развитии и поддержании аллергического воспалительного процесса в слизистой оболочке бронхов при БА (Madore A.M. et al„ 2010; Herbert С. et al., 2010; Bang B.R. et al., 2011). Считается, что данная популяция клеток отвечает за формирование адекватной воспалительной реакции, необходимой для устранения патогенного фактора. Некоторые исследователи утверждают, что при БА происходит угнетение фагоцитарной активности легочных макрофагов (James R. Banks et al., 2009).

Таким образом, существующий в настоящее время метод индуцированной мокроты позволяет производить оценку цито-иммунологических показателей мокроты, а также в перспективе дает возможность оценить функциональную активность отдельных популяций клеток, в частности, легочных макрофагов (ЛМ). Использование этого метода, наряду со стандартными клиникофункциональными обследованиями, является более перспективным, так как позволит отслеживать воспалительный процесс на топическом уровне и своевременно корректировать лечение, поэтому актуальность проведения исследований в данном направлении не вызывает сомнений.

Цель исследования

Выявить особенности цитологического состава и иммунологических показателей индуцированной мокроты, функциональной активности легочных макрофагов у детей с контролируемым и неконтролируемым течением бронхиальной астмы.

Задачи исследования

1. Оценить клинико-анамнестические данные детей с контролируемым и неконтролируемым течением легкой персистирующей и среднетяжелой бронхиальной астмы, а также причины, способствующие неточной оценке контролируемости заболевания.

2. Исследовать цитологический состав индуцированной мокроты у детей с контролируемым и неконтролируемым течением легкой персистирующей и среднетяжелой бронхиальной астмы.

3. Оценить иммунологические показатели индуцированной мокроты у детей с контролируемым и неконтролируемым течением легкой персистирующей и среднетяжелой бронхиальной астмы.

4. Исследовать функциональную активность легочных макрофагов, выделенных из индуцированной мокроты детей с контролируемым и неконтролируемым течением легкой персистирующей бронхиальной астмы.

Научная новизна

Определены особенности клеточного состава и иммунологических показателей индуцированной мокроты у детей с легкой персистирующей и среднетяжелой бронхиальной астмой в зависимости от степени контролируемости заболевания.

Впервые проведена оценка функциональной активности легочных макрофагов, выделенных из индуцированной мокроты у детей с легкой персистирующей бронхиальной астмой.

Новизна подтверждена патентом РФ на изобретение: «Способ выделения альвеолярных макрофагов из мокроты» (№ 2430362 от 20.09.2010 г.).

Теоретическая и практическая значимость

Теоретическая значимость результатов исследования состоит в расширении знаний о воспалительных изменениях, происходящих на уровне слизистой оболочки бронхов при бронхиальной астме у детей, участии в них легочных макрофагов, в зависимости от уровня контроля заболевания.

Предложен способ выделения макрофагов из индуцированной мокроты (с количеством жизнеспособных клеток не менее 96%), позволяющий в последующем оценивать их морфофункциональные характеристики.

Полученные результаты научно обосновывают целесообразность изучения морфофункциональных характеристик легочных макрофагов для оценки контролируемости течения бронхиальной астмы у детей.

Основные положения, выносимые на защиту

1. При оценке анамнестических данных детей с контролируемым и неконтролируемым течением бронхиальной астмы значимых отличий выявлено не было.

2. При детальном анализе клинических данных детей с контролируемым течением бронхиальной астмы у 59% исходный уровень контроля был переоценен.

3. У 1/3 детей с контролируемым течением легкой персистирующей и среднетяжелой бронхиальной астмы имеет место несоответствие клинико-функциональных данных и количества эозинофилов индуцированной мокроты, являющихся маркером аллергического воспаления.

4. Изменения цитологического состава и иммунологических показателей мокроты, свидетельствующие о наличии аллергического воспаления, более выражены у детей с неконтролируемым течением бронхиальной астмы.

5. При исследовании основных функций легочных макрофагов у детей с лёгкой персистирующей бронхиальной астмой выявлены их изменения, которые наиболее выражены при неконтролируемом течении заболевания.

6. Исследование содержания и функциональной активности легочных макрофагов может быть использовано для комплексной оценки воспалительного процесса при бронхиальной астме.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования внедрены в работу детского аллергологического отделения МУЗ ГКБ №1 г. Челябинска.

Основные положения и выводы работы используются в учебном процессе кафедры факультетской педиатрии (раздел «Заболевания органов дыхания») и кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии (раздел «Органы дыхания») Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы заболеваний органов дыхания у детей и подростков» (Уфа, 2010), на I и II международной (VIII, IX итоговой) научно-практической конференции молодых ученых Челябинской государственной медицинской академии (Челябинск, 2010, 2011), IX конференции иммунологов Урала (Челябинск, 2011), XXI Национальном Конгрессе по болезням органовдыхания (Уфа, 2011).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 4 в журналах, рекомендованных ВАК РФ для опубликования результатов кандидатских диссертаций и 1 патент РФ на изобретение.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований,

заключения, выводов, практических рекомендаций, списка

литературы. Работа иллюстрирована 20 таблицами и 23 рисунками. В списке литературы указаны 253 источника, из них 107 отечественных и 146 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Тип исследования: по типу поперечного среза.

Метод выборки: сплошной (по мере поступления в стационар).

Источниковая популяция: дети с БА, поступившие на

обследование в детское аллергологическое отделение муниципального учреждения здравоохранения городскую клиническую больницу №1 (МУЗ ГКБ №1) г. Челябинска в осеннезимний период 2008-2009 гг.

Критерии включения: возраст от 5 до 16 лет, лёгкая

персистирующая или среднетяжёлая БА (в соответствии с критериями «Национальной программы», 2008) контролируемого или неконтролируемого течения; отсутствие в течение предшествовавшего месяца обострений БА, вакцинации; прием базисной терапии не менее 1 месяца до начала исследования; согласие на участие в исследовании.

Группу сравнения составили 16 детей того же возраста, без аллергических заболеваний, находящиеся в детском кардиоревматологическом отделении МУЗ ГКБ №1 на обследовании по поводу синдрома вегетативной дистонии или пролапса митрального клапана 1 степени.

Критерии исключения: наличие в течение предшествовавшего месяца эпизодов острых инфекционно-воспалительных заболеваний, табакокурение.

На всех детей была заполнена персональная анкета, состоящая из нескольких разделов: общие сведения о ребенке, подробный аллергологический анамнез, данные анамнеза жизни, дополнительные методы исследования. Проводилось исследование функции внешнего дыхания (ФВД) на аппарате «Бр1го1аЬ II» исходно и фармакологическая проба с (32-агонистом короткого действия (сальбутамол), исследование цитологического состава назального секрета и ИМ (окраска по Романовскому Д.Л., подсчет клеточных элементов не менее чем в 10 полях зрения, не менее 200 клеток, результат отображался в процентах), исследование иммунологических показателей ИМ, морфофункциональных характеристик легочных макрофагов..

Для исследования использовали мокроту, собранную у детей натощак, после ингаляции 5% раствора хлорида натрия; проводилась премедикация (В2-агонистом короткого действия (сальбутамол). В ИМ определяли следующие показатели: количество белка и муцина (Кочетов Г.А. 1980), уровень продукции эндогенного оксида азота (N0), который оценивали по концентрации конечных стабильных метаболитов с помощью реакции Гриса в модификации Э.Н. Коробейниковой (2002). Уровни иммуноглобулинов и интерлейкинов определяли методом ИФА. Для количественного иммуноферментного

определения slgA, IFN-y, общего IgE, IL-1p, IL-4, IL-8, IL-10, MCP-1 использовали тест-системы производства ЗАО «Вектор-Бэст» (г. Новосибирск). Результат реакции регистрировали при помощи аппарата «Multiscan Plus» и выражали в мкг/мл (slgA), пг/мл (IL-1p,

IL-4, IL-8, IL-10, МСР-1), и МЕ/мл (IgE). Для удобства интерпретации

полученных результатов все показатели были пересчитаны на единицу белка.

Производился подсчет количества ЛМ в мокроте с последующей оценкой их адгезивной способности. Оценку адгезивной реакции легочных макрофагов проводили с помощью нединамического метода (Редчиц Е.Г., Гузаева В.О.,1991), а тест распластывания

мононуклеаров по методу Rollany Н. (1982). Для оценки

внутриклеточных метаболических процессов макрофагов использовались цитохимические методы (Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996), которые позволили изучить интенсивность реакций на гликоген (ШИК-реакция по Мак Манусу), сукцинатдегидрогеназу (метод Нахласа, Валькера, Зелигмана), альфа-глицерофосфатдегидрогеназу (метод Нарциссова), кислую фосфатазу (метод Goldberg и Вагка), пероксидазу. Кислородзависимые метаболические процессы в легочных макрофагах исследовали по интегральному спонтанному и стимулированному НСТ-тесту (Нагаев Б.С., Шубич М.Г., 1981; Park В et al.,1968). Интенсивность всех цитохимических реакций оценивали цитофотометрически (Козинец Г.И. и др., 1986) с помощью фотометрической насадки ФМЭЛ-1А с умножителем ФЭУ-79 и выражали показателем интегральной оптической плотности (Славинский А.А., 1989).

Лизосомальную активность легочных макрофагов изучали с помощью метода флюоресцирующего зондирования отдельных клеток в тесте с акридиновым оранжевым (Фрейдлин И.С.,1976; Подосинников И.С., Бабаченко И.В., Захаров А.М., 1985) с

определением числа клеток с лизосомальной активностью и среднего цитохимического показателя.

Изучение фагоцитарной активности легочных макрофагов проводили на модели поглощения микросфер латекса с определением фагоцитарного показателя и фагоцитарного индекса легочных макрофагов (Фримель Г., 1987).

Статистический анализ данных проводился при помощи пакета статистических программ STATISTICA 6.0 (StatSoft, 2001) и SSPSS 12.0.

При распределении признака в выборке близком к нормальному, количественные значения представлялись в виде средней арифметической и её среднеквадратичного отклонения (М±а). При непараметрическом распределении признака рассчитывались медиана и интерквартильный размах (Me; 25-75%).

Для оценки различий между двумя группами в количественных признаках при распределении, близком к нормальному, применяли 1-критерий Стьюдента, в остальных случаях - непараметрический 11-тест Манна-Уитни. Для сравнения средних более чем в двух независимых группах применяли критерий Краскелла-Уоллиса. При уровне р<0,05 проводилось попарное сравнение групп с использованием непараметрического теста Манна-Уитни с поправкой Бонферрони. Оценка межгрупповых различий по качественным признакам проводилась с использованием критерия %2 и точного критерия Фишера.

При проведении корреляционного анализа использовался коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Оценка риска развития события проводилась путем вычисления величин относительного риска (ОР) и 95% доверительного интервала (95% ДИ).

Для всех видов анализа статистически достоверными считались значения р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изначально было отобрано 150 детей с БА, 109 из которых наблюдались с контролируемым, а 41 с неконтролируемым течением. При детальном расспросе детей с контролируемым течением было установлено, что из 109 детей 64 (59%) имели частично

контролируемое течение заболевания (44% и 74% соответственно при легкой и среднетяжелой БА) и поэтому не были включены в исследование.

Таким образом, согласно критериям включения/исключения, в исследование было включено 86 детей с легкой персистирующей и среднетяжелой БА, а также 16 детей группы сравнения.

БА

(п=150)

Рис. 1. Распределение обследованных детей по группам.

В ходе исследования дети с БА были разделены на 4 группы (рис.1).

Средний возраст обследованных детей составил 10,1 ±2,8 лет. В качестве базисной терапии дети с легкой персистирующей БА получали препараты группы кромонов, со среднетяжелой БА -ингаляционные глюкокортикостероиды (71,4%) и комбинированные препараты (28,6%).

Среди других аллергических заболеваний у детей с БА наиболее часто встречался аллергический ринит, составляя в группах с легкой БА - 77,4-81,5%, в группах со среднетяжелой БА - 85,7-100%. Более чем у 40% детей на момент обследования зафиксирована эозинофилия назального секрета; среднее содержание эозинофилов составило по группам от 12,3% до 60,7%. В группе сравнения детей с эозинофилией назального секрета выявлено не было.

Частота атопического дерматита в группах варьировала от 21,4% до 37,0%. Следует отметить, что в группах со среднетяжелой БА атопический дерматит в 100% случаев сочетался с аллергическим ринитом.

Во всех группах с БА выявлен высокий уровень общего 1дЕ и эозинофилов периферической крови (р<0,05 с группой сравнения). Между группами значимых различий не выявлено.

Среди значимых факторов риска, имеющих существенное значение в развитии БА, была отмечена наследственная отягощенность по аллергическим заболеваниям (аллергические заболевания у одного или обоих родителей) - установлена у 59 из 86 детей (68,6%), что достоверно выше, чем в группе сравнения. Была установлена ее значимость как фактора риска развития среднетяжелой БА - ОР=1,4; 95%ДИ [1,01 ;1,9]. Анализируя данные раннего анамнеза, были получены достоверные отличия в группах с БА по частоте перинатального поражения центральной нервной системы - более чем в 70% случаев, что в 3 раза чаще, чем в группе сравнения (р<0,05).

Частота дисбиоза кишечника в группах детей с БА была в 2,5 раза выше, чем в группе сравнения (р<0,05). Проявления аллергического диатеза в анамнезе имели более 50% детей независимо от тяжести и течения БА (р=0,003 с группой сравнения). Установлена значимость перинатального поражения ЦНС и дисбиоза кишечника как факторов риска развития БА (ОР=3,8; 95%ДИ [1,4; 10,6] и ОР=2,6; 95%ДИ [1,3; 5,4] соответственно).

В группах детей с неконтролируемым течением БА частота раннего искусственного вскармливания была выше, чем в группах с контролируемым течением заболевания (48,8% и 28,8% соответственно против 13% в группе сравнения). По данным нашей работы установлено, что раннее искусственное вскармливание

являлось фактором риска развития именно неконтролируемого течения БА (ОР=1,7; 95%ДИ [0,97; 2,9]).

При изучении значимости триггерных факторов в возникновении приступов БА обнаружено, что чаще всего ими являлись пыль (70,487,1%), острые респираторные заболевания (71,0-85,7%) и контакт с животными (50,0-64,3%). Отмечено, что в группах с неконтролируемым течением БА роль физической нагрузки в качестве триггера приступов прослеживается более отчетливо в сравнении с контролируемым течением заболевания. Достоверных отличий между группами выявлено не было.

При детальном расспросе 150 детей с БА у части из них проведена переоценка степени контроля заболевания (см. рис. 1). Были проанализированы причины, которые могли привести к недооценке клинических симптомов БА.

При расспросе детей и их родителей о частоте дневных симптомов выявлено, что 24 детей из 41 (59%) с неконтролируемым и 14 детей из 64 (22%) с частично контролируемым течением БА (которые не вошли в дальнейшее исследование) не отмечают ухудшения состояния в школе, тогда как половина из них признаются в использовании р2-агонистов короткого действия.

При дополнительных уточняющих вопросах детям, наблюдающимся с контролируемым течением БА (109 человек) и считающим, что они хорошо переносят физическую нагрузку, было установлено, что у 32 из них (29%) при подъеме по лестнице до 3 этажа (нагрузка выбрана условно для стандартизации полученных результатов) появлялся кашель и «тяжелое» дыхание. У 8 детей (7%) отмечалось появление кашля и «небольшое» нарушение дыхания после перемены между уроками.

У 33 пациентов из 82 (40%) с легкой персистирующей БА симптомы заболевания появлялись на уроке физической культуры, но, как правило, этих детей не освобождали от занятий. Таким образом, переносимость физической нагрузки, которая является триггером бронхоспазма, по-разному трактуется врачом, ребенком и его родителями.

Потребность в препаратах неотложной помощи (в основном р2-агонистах короткого действия) является не менее важным показателем уровня контроля заболевания. У детей дошкольного возраста почти всегда удается установить истинную частоту использования данных препаратов из беседы с родителями. У детей, которые начали посещать школу, самостоятельное бесконтрольное использование бронхолитиков затрудняет оценку этого показателя и требует уточнений. Так, при детальном расспросе 109 детей, наблюдавшихся с контролируемым течением БА, 29 детей (27%) использовали бронхолитики в школе чаще двух раз в неделю, не ставя в известность родителей.

По нашим данным, проводят спирометрию регулярно (не реже 2 раз в год) 71 из 150 детей с БА (47%).

Гораздо хуже обстоит ситуация с проведением пикфлоуметрии. Согласно нашим данным, лишь 15 детей из 41 (37%) с

неконтролируемым течением БА имели дома собственный пикфлоуметр, из которых только 9 (60%) проводили пикфлоуметрию регулярно. Следует отметить, что запись результатов в респираторный дневник делали всего 2 ребенка. Часть детей просто не хотели использовать пикфлоуметр даже при его наличии - 4 из 41 (10%).

В остальных случаях с неконтролируемым течением БА основной причиной отсутствия пикфлоуметра родители называли его высокую стоимость - 17 из 26 (65%); 2 (8%) - впервые узнали о существовании данного прибора во время настоящего исследования; 7 (27%) - не видели смысла в его приобретении.

Из 109 детей, наблюдающихся с контролируемым течением БА, собственный пикфлоуметр имели 63 ребенка (58%). Из них 26 (42%) проводили пикфлоуметрию нерегулярно (не чаще 1-2 раз в неделю). 37 детей (58%) проводили пикфлоуметрию ежедневно, но только 3 заносили результаты в респираторный дневник.

Таким образом, точность оценки дневных и ночных симптомов, переносимости физической нагрузки, кратности использования препаратов неотложной помощи зависит от многих факторов: возраста ребенка; источника получения информации (ребенок, родители); временного промежутка за который проводился анализ вышеуказанных показателей; единообразия трактовки симптомов, приступов БА и их эквивалентов; уровня комплайнса между ребенком, его родителями и врачом.

Далее в соответствии с целями и задачами работы нами были исследованы клеточный состав и иммунологические показатели ИМ у детей с БА и группы сравнения.

Одним из перспективных неинвазивных методов оценки изменений слизистой оболочки бронхов при БА является подсчёт клеточных элементов в мокроте; нами исследован не только цитологический состав ИМ, но и проведена оценка ее цитокинового профиля.

Проводя индукцию мокроты по протоколу, предложенному Куличковым В.И. с соавт. (2009), у всех детей было получено достаточное для исследования количество материала.

Выявлены следующие особенности клеточного состава ИМ у обследованных детей (табл. 1):

- высокое содержание эозинофилов во всех группах с БА (р<0,05 с группой сравнения);

- низкое содержание макрофагов в группах с БА, особенно при неконтролируемом течении заболевания (2 и 4 группа) - в 1,5-1,7 раз меньше, чем в группе сравнения (р<0,05);

- высокое содержание нейтрофилов в группах со среднетяжёлой БА (3 и 4 группа) - в 1,6-1,9 раза выше, чем в группе сравнения (р<0,05). В группах с легкой персистирующей БА содержание нейтрофилов от группы сравнения достоверно не отличалось.

Таблица 1

Клеточный состав индуцированной мокроты обследованных детей, __________________________Ме; 25-75% _________________________

Г руппы Эозинофилы, % Нейтрофилы, % Макрофаги, % Лимфоциты, %

1 группа 0,5* 38,5 49,4* 1,5

(п=31) 0-2,4 27,8-85,3 14,2-69,0 1,0-2,0

2 группа 1,0* 42,6 46,5* 1,2

(п=27) 0-4,0 24,0-74,0 25,0-65,0 1,0-2,0

3 группа 0,9* 61,0* 28,0* 2,0

(п=14) 0-5,0 40,8-89,1 10,0-47,7 1,0-3,0

4 группа 0,7* 54,0* 39,5* 1,0

(п=14) 0-3,38 37,0-70,0 29,0-55,5 0-2,0

Гр.сравнения 0 31,0 67,5 1,9

(п=16) 0-0,1 21,0-45,4 52,2-78,1 0,8-2,4

Примечание. Значимость различий (р<0,05): * - с группой сравнения.

Среди всех детей с БА эозинофилия мокроты (более 3%) выявлена у 26 детей из 86 (30,2%). При легкой персистирующей БА число детей с эозинофилией ИМ оказалось большим при контролируемом течении заболевания (35,5% против 22,2% при неконтролируемом течении), однако среднее содержание эозинофилов в мокроте было выше у детей с неконтролируемым течением астмы. При среднетяжелой БА число детей с эозинофилией ИМ и среднее содержание в ней эозинофилов достоверно не отличались между группами с контролируемым и неконтролируемым течением.

В результате исследования иммунологических показателей ИМ, мы выявили:

- более высокие уровни белка в группах с БА относительно группы сравнения, что возможно объясняется повышенной проницаемостью микроциркуляторного русла, связанного с активностью воспалительного процесса; достоверные отличия с группой сравнения получены только в группе легкой персистирующей БА неконтролируемого течения (р<0,05);

-значительное снижение IFN-y, обладающего широким спектром противовирусного действия, во всех группах с БА (р<0,05 с группой сравнения); особенно выражено снижение при среднетяжелой неконтролируемой БА (в 4 раза относительно группы сравнения);

- низкое содержание slgA в группах с БА, однако, достоверные отличия с группой сравнения получены только в группе легкой персистирующей БА контролируемого течения (р<0,05);

- высокую концентрацию ИЛ-13 в группах детей со среднетяжелой БА (р<0,05 с группой сравнения);

- большие показатели IL-4 в группах с БА, хотя достоверной разницы с группой сравнения выявлено не было; возможно это связано с тем, что все дети с БА длительно получали базисную терапию;

- высокое содержание IL-8 при БА, особенно при неконтролируемом течении (р<0,05 с группой сравнения); известно, что данный цитокин влияет на активацию нейтрофилов, число которых увеличивается по мере возрастания степени тяжести БА;

- более низкие показатели IL-10 при БА относительно группы сравнения, но достоверных отличий выявлено не было;

- высокое содержание N0 в группах с легкой персистирующей БА; более низкие показатели N0 в группах со среднетяжелой БА скорее всего связаны с более интенсивной противовоспалительной базисной терапией;

- значительное снижение содержания МСР-1 во всех группах с БА относительно группы сравнения (р<0,05), что, возможно, связано с принимаемой базисной терапией, а так же со сниженным количеством легочных макрофагов в группах с астмой; между группами с БА достоверных отличий получено не было;

- высокий уровень IgE во всех группах с БА (р<0,05 с группой сравнения).

Помимо этого, у детей с легкой персистирующей БА проводилась комплексная оценка функционального состояния легочных макрофагов (ЯМ) с использованием цитохимических и иммунологических методов (табл. 2).

При исследовании количества ЯМ установлено, что их абсолютное содержание в мокроте у детей с контролируемым и неконтролируемым течением БА было соответственно в 1,3 и 1,8 раза меньше, чем в группе сравнения, что коррелировало с их относительным содержанием.

Известно, что усиление адгезивных свойств сопутствует возбуждению мононуклеарных фагоцитов, являясь важным признаком активации клетки (Фрейдлин И.С.,1984; Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989).

Адгезивные свойства ЯМ изучались нами через 30 и 60 минут после начала инкубации.

Коэффициент адгезии от 30 к 60 минуте инкубации возрос: в группе сравнения - на 15,0%; в группе с БА контролируемого течения -на 8,1%; в группе с неконтролируемым течением БА - на 10,9%.

Такая же тенденция прослеживается при исследовании способности к распластыванию. Как видно из табл. 2, у детей группы сравнения число распластанных ЛМ от 30 к 60 минуте увеличилось на 9,9%; у детей с контролируемым течением БА - на 16,5%; в группе с неконтролируемым течением - на 8,1%.

Таблица 2

Абсолютное содержание ЛМ и их мембранные характеристики в группах с легкой персистирующей БА и в группе сравнения, ___________________________Ме; 25-75%___________________________

Группы 1 группа БА контролир. (п=10) 2 группа БА неконтролир. (п-Ю) _ Г руппа сравнения _ (п=10) _ Р

Абсолютное содержание ЛМ

ЛМ мокроты (Ю3/мл) 10,6 8,5-18,8 7,5 6,8-14,9 13,8 8,8-25,0 Рг-гс<0,05

Коэффициент адгезии ЛМ

Инкубация 30 минут 64,2 60,0-69,0 58,2 55,0-65,0 71,0 65,0-78,0 Р2-гс<0,05 Рм<0,05

Инкубация 60 минут 72,3 67,0-78,0 69,1 66,0-73,0 86,0 78,0-91,0 Р1тс<0,05 Р2-гс<0,05

Коэффиц иент распластывания ЛМ

Инкубация 30 минут 72,7 70,0-81,0 75,3 67,9-81,1 85,0 80,0-100,0 Рі-гс<0,05 Р2-гс<0,05

Инкубация 60 минут 89,2 84,6-95,0 83,4 80,0-87,0 94,9 91,6-100,0 Р2-гс<0,05

Таким образом, у детей с БА имеет место депрессия

распластывания и нарушение адгезивных свойств ЛМ, которые наиболее выражены при неконтролируемом течении заболевания.

Характер цитохимического спектра ЛМ во многом отражает реактивные изменения в организме. В связи с этим была проведена оценка содержания в ЛМ энергетического субстрата (гликогена), а также активность ферментов (альфа-глицерофосфатдегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы) и оксидазных систем, генерирующих супероксидные радикалы.

В ЛМ детей с контролируемым течением БА (1 группа) содержание гранулярного гликогена оказалось ниже, в то время как у детей с неконтролируемым течением БА (2 группа), напротив, выше относительно группы сравнения (р<0,05). Эти результаты находятся в полном соответствии с данными, полученными при анализе интенсивности цитохимической реакции на а-

глицерофосфатдегидрогеназу (а-ГФДГ), участвующую гликолитическом пути расщепления углеводов (рис. 2).

1 группа п=10

2 группа п=10

Группа сравнения п=10

Рис. 2. Содержание ШИК-позитивного материала (гликогена) и интенсивность цитохимической реакции на а-ГФДГ и сукцинатдегидрогеназу в ЛМ исследуемых детей.

Примечание. Значимость различий (р<0,05): сравнения,**- со 2 группой.

- с группой

Анализ активности сукцинатдегидрогеназы (рис. 2), являющейся одним из важных ферментов энергетического обмена (индикатор цикла трикарбоновых кислот), позволил установить ее снижение у детей с БА, особенно с неконтролируемым течением относительно группы сравнения (р<0,05).

В целом, результаты цитохимического исследования ЛМ детей с легкой персистирующей БА позволяют констатировать, что имеют место нарушения цитохимического спектра этих клеток. В частности, у детей с контролируемым течением БА наблюдается повышение активности сукцинатдегидрогеназы и усиление гликолитического пути расщепления углеводов, о чем свидетельствует повышение активности альфа-глицерофосфатдегидрогеназы и снижение содержания ШИК-позитивного материала, что может указывать на усиление метаболитических процессов в них, в то время как у детей с неконтролируемым течением заболевания отмечается подавление гликолитического пути расщепления углеводов.

В сложном комплексе функциональных преобразований ЛМ при их активации важная роль принадлежит лизосомальному аппарату и его ведущим компонентам - кислой фосфатазе и пероксидазе (Фрейдлин И.С.,1984.; Ефремов A.B. и др., 2007).

У детей с контролируемым и неконтролируемым течением БА интенсивность цитохимической реакции на кислую фосфатазу оказалась ниже - (Ме; 25-75%) 1,25; 1,03-1,5 у.е. и 1,29; 0,65-1,6 у.е. соответственно) относительно группы сравнения - 1,54; 1,37-1,75 у.е. (рис. 3).

При исследовании интенсивности цитохимической реакции на пероксидазу, которая, наряду с кислородными радикалами и перекисью водорода, составляет эффекторное звено

кислородзависимого компонента бактерицидное™ фагоцитов (Долгушин И.И. и др., 2009) также выявлено ее снижение относительно группы сравнения (рис. 3).

1,8 -1,6 -

1

0,8

1 группа п=10 2 группа п=10 Группа

сравнения п=10

Рис. 3. Интенсивность цитохимической реакции на кислую фосфатазу и пероксидазу в ЛМ исследуемых детей.

Примечание. Значимость различий (р<0,05): * - с группой сравнения.

Общепризнанно, что лизосомальные энзимы обеспечивают переваривание, в основном, убитых микроорганизмов (Фрейдлин И.С.,1989; Цыганкова О.В., и др, 2009). Таким образом, снижение в ЛМ активности пероксидазы и кислой фосфатазы у детей с БА позволяет говорить об угнетении гидролитических процессов в них. Результаты исследования лизосомальной активности ЛМ отражены на рисунке 4.

100

95 % 90

85

80

Рис. 4. Оценка лизосомальной активности ЛМ у исследуемых детей.

Примечание. Значимость различий (р<0,05): * - с группой сравнения, ** - с 1 группой.

Как видно из рисунка, число акридиноранжпозитивных клеток среди ЛМ детей с БА контролируемого (1 группа) и неконтролируемого (2 группа) течения несколько ниже такового в группе сравнения. Наименьшее число акридиноранжпозитивных ЛМ выявлено у детей с неконтролируемым течением БА.

93,5 . . . , 94,5

88,4*,**

■ г - ■“ ■

1 группа п=10 2группап=10 Группа сравнения

п=10

1,68

□ Кислая фосфатаза И Пероксидаза

Наиболее важным индикатором лизосомальной активности является индекс, отражающий ее средний уровень из расчета на одну макрофагальную клетку (индекс лизосомальной активности). Установлено, что данный индекс у детей с контролируемым и неконтролируемым течением БА снижен (1,59; 1,4-1,73 у.е. и 1,48; 1,34-1,7 у.е. против 1,99; 1,95-2,06 у.е. в группе сравнения). Наиболее выраженное снижение лизосомальной активности выявлено у детей с неконтролируемым течением легкой персистирующей БА (р<0,05).

Снижение активности пероксидазы и кислой фосфатазы, а также общей лизосомальной активности у детей с БА, особенно при неконтролируемом течении, позволяет предположить у них нарушение бактерицидной функции ЛМ.

В следующей серии исследований проведена оценка кислородзависимого метаболизма ЛМ, который оценивали с помощью спонтанного и стимулированного теста восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-теста), как одного из характерных и наиболее надежных показателей функциональной активности фагоцитирующих клеток. Согласно современным представлениям, НСТ-тест можно рассматривать как биохимический критерий готовности клетки к завершенному фагоцитозу. Полученные результаты представлены на рис. 5.

Как видно из рисунка, в группах детей с БА интенсивность спонтанного НСТ-теста снижена относительно группы сравнения, что указывает на тенденцию к угнетению кислородзависимой метаболической активности ЛМ.

Активация ЛМ, связанная с процессом фагоцитоза, оценивалась при помощи индуцированного НСТ-теста с использованием микросфер латекса диаметром 1,2 мкм. Данный тест отражает метаболическую активность индуцированных ЛМ.

Как видно из рис. 5, метаболическая активность индуцированных ЛМ у детей с БА контролируемого и неконтролируемого течения несколько снижена относительно группы сравнения. Обращает на себя внимание тот факт, что у детей группы сравнения коэффициент стимуляции НСТ-теста, отражающий отношение индуцированного НСТ-теста к спонтанному НСТ-тесту, в ЛМ составил 1,46; 1,17-1,64 у.е.. В то же время у детей с БА контролируемого и неконтролируемого течения данный коэффициент оказался ниже относительно группы сравнения и составил 1,33; 1,061,44 у.е. и 1,39; 1,18-1,55 у.е. соответственно.

Оценивая данные результаты, можно констатировать, что метаболическая активность ЛМ в спонтанном и индуцированном НСТ-тесте у детей с легкой персистирующей БА контролируемого и неконтролируемого течения снижена относительно группы сравнения.

2 -1,5 у.е. 1 0,5 О

1 группа п=10 2 группа п=10 Группа

сравнения п=10

Рис. 5. Интенсивность спонтанного и индуцированного НСТ-теста в ЛМ исследуемых детей.

Примечание. Значимость различий (р<0,05): * - с группой сравнения.

Согласно современным представлениям, НСТ-тест является наиболее информативным показателем, характеризующим состояние общей адаптации и связанной с ней устойчивости к экстремальным воздействиям (Маянский А.Н., Маянский Д.Н.,1989; Фрейдлин И.С.,1984). В свете этой концепции, выявленное нами у детей с легкой персистирующей БА снижение как спонтанного, так и индуцированного НСТ-теста в ЛМ, можно рассматривать как угнетение антистрессорной резистентности.

Для оценки фагоцитарной активности ЛМ мы определяли фагоцитарный показатель, отражающий процент ЛМ, содержащих частицы латекса, а так же фагоцитарный индекс, отражающий количество частиц латекса в 100 подсчитанных ЛМ в перерасчете на одну клетку. Как видно из табл. 3, в группах детей с БА фагоцитарный показатель практически не отличался от группы сравнения.

Таблица 3

Показатели фагоцитарной активности ЛМ, Ме; 25-75%.

Показатель 1 группа 2 группа Группа сравнения

(п=10) (п=10) (п=Ю)

Фагоцитарный 95,3 94,5 93,9

показатель, % 92,1-100,0 91,6-100,0 87,5-100,0

Фагоцитарный 16,15 13,43* 24,85

индекс, у.е. 13,4-20,7 9,0-17,6 16,8-29,5

Примечание. Значимость различий (р<0,05): * - с группой сравнения.

Обращает на себя внимание, что фагоцитарный индекс у детей с контролируемым течением заболевания оказался ниже на 35%, а с

неконтролируемым течением БА на 46% относительно группы сравнения. Таким образом, минимальная поглотительная способность ЛМ выявлена у детей с неконтролируемым течением заболевания.

Анализ полученных результатов, позволяет констатировать, что у детей с легкой персистирующей БА имеет место уменьшение количества ЛМ и нарушение их эфферентных функций: угнетение адгезивных свойств и метаболической активности, в том числе кислородзависимого метаболизма, а также депрессия гидролитической и лизосомальной активности, что обусловливает, в конечном итоге, снижение фагоцитарной активности ЛМ. Обращает на себя внимание то, что наиболее выраженные изменения изученных функций ЛМ имеют место у детей с неконтролируемым течением БА.

ВЫВОДЫ

1. При оценке клинико-анамнестических данных детей с бронхиальной астмой, достоверных отличий между группами с контролируемым и неконтролируемым течением выявлено не было. Выявлен ряд причин, приводящих к неточной клинической оценке уровня контроля бронхиальной астмы (в 59% случаев) у детей: неверная трактовка дневных и ночных симптомов, переносимости физической нагрузки, кратности использования препаратов неотложной помощи; нерегулярное проведение спирометрии, отсутствие достоверных данных пикфлоуметрии.

2. Несмотря на проводимую базисную терапию, у 35% детей с контролируемым течением бронхиальной астмы выявлена эозинофилия индуцированной мокроты; при неконтролируемом течении легкой персистирующей бронхиальной астмы у детей с эозинофилией мокроты среднее содержание эозинофилов выше, чем при контролируемом течении (11,5% и 5,5% соответственно).

3. Содержание цитокинов различно во всех исследуемых группах; получены достоверные отличия по большинству цитокинов между группами с бронхиальной астмой и группой сравнения (1дА, 1РМ-у, МСР-1,1Ир, 11.-8, 1дЕ); достоверных отличий между группами с контролируемым и неконтролируемым течением бронхиальной астмы выявлено не было.

4. Наиболее значимые и статистически достоверные отличия

получены при исследовании легочных макрофагов. У детей с легкой персистирующей бронхиальной астмой имеет место уменьшение количества легочных макрофагов и нарушение их эфферентных функций: угнетение адгезивных свойств и метаболической

активности, в том числе, кислородзависимого метаболизма; депрессия гидролитической и лизосомальной активности, снижение фагоцитарной активности, особенно у детей с неконтролируемым течением заболевания.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. У детей с бронхиальной астмой для оценки контролируемости заболевания, помимо клинических данных и определения параметров функции внешнего дыхания, необходимо исследование цитологического (а по возможности и иммунологического) состава индуцированной мокроты, так как клинические проявления заболевания не всегда соответствуют воспалительным изменениям слизистой оболочки бронхов, что необходимо учитывать для подбора адекватной базисной терапии.

2. С целью коррекции проводимой медикаментозной терапии детям с бронхиальной астмой, особенно с неконтролируемым течением, необходимо проводить оценку функционального состояния легочных макрофагов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Жаков, Я.И. Применение метода индуцированной мокроты у детей с впервые выявленной бронхиальной астмой: цито-иммунологические особенности / Я.И. Жаков, О.Г. Рыбакова, М.С. Бабайлов II Уральский медицинский журнал. - 2009. - № 7 (61).-С. 34-37.

2. Минина, Е.Е. Изменение цито-иммунологического профиля у детей с бронхиальной астмой, получающих ингаляционные глюкокорткостероиды / Е.Е. Минина, B.C. Ишимова, М.С. Бабайлов, Я.И. Жаков, В.И. Куличков II Материалы научно-практической конференции, посвященной 50-летию МУЗ Детской городской клинической больницы № 8 г. Челябинска. — Челябинск: Печать и копия, 2010.-С. 122-125.

3. Бабайлов, М.С. Клинико-лабораторная оценка контролируемости бронхиальной астмы у детей / Е.Е. Минина, М.С. Бабайлов // Материалы I международной (VIII итоговой) научнопрактической конференции молодых ученых. — Челябинск: Изд-во Чел ГМ А, 2010.-С. 15-16.

4. Тричик, Е.М. Ранняя диагностика респираторных аллергозов с помощью исследования индуцированной мокроты и назального секрета в группе часто болеющих детей / Е.М. Тричик, Ф.Ф. Хайбуллина, Е.Е. Минина, М.С. Бабайлов И Материалы I международной (VIII итоговой) научно-практической конференции молодых ученых. — Челябинск: Изд-во ЧелГМА, 2010. — С. 244-245.

5. Жаков, Я.И. Ранняя диагностика респираторных аллергозов в группе часто болеющих детей / Я.И. Жаков, Е.Е. Минина, М.С. Бабайлов, В.Я. Жаков // Материалы девятого Российского конгресса

“Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии”. - М., 2010.-С. 37.

6. Жаков, Я.И. Оценка контролируемости бронхиальной астмы у детей по клинико-лабораторным данным / Я.И. Жаков, М.С. Бабайлов, Е.Е. Минина, A.B. Ленец Н Материалы девятого Российского конгресса “Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии". - М., 2010. - С. 261-262.

7. Жаков, Я.И. Ранняя диагностика аллергических заболеваний лёгких в группе часто болеющих детей / Я.И. Жаков, Е.Е. Минина, М.С. Бабайлов, В.Я. Жаков // Пульмонология детского возраста: проблемы и решения / под ред. Ю.Л. Мизерницкого, А.Д. Царегородцева. - М., 2010. - Вып. 10. - С. 152-153.

8. Бабайлов, М.С. Возможности метода индуцированной мокроты в оценке контролируемости бронхиальной астмы у детей / М.С. Бабайлов, Е.Е. Минина, Я.И. Жаков II Вестник уральской медицинской академической науки. - 2011. - № 2/1 (35).-С. 91-92.

9. Бабайлов, М.С. Функциональная характеристика альвеолярных макрофагов у детей с бронхиальной астмой / М.С. Бабайлов, Г.В. Брюхин, Я.И. Жаков II Вестник Южно-Уральского государственного университета. - 2011. - № 20 (237). - С.89-92. -(Сер. «Образование, здравоохранение, физическая культура»; Вып. 27).

10. Бабайлов, М.С. Влияние кромонов на морфофункциональное состояние бронхоальвеолярных макрофагов детей с бронхиальной астмой / М.С. Бабайлов, Г.В. Брюхин, Я.И. Жаков II Вестник Челябинского государственного педагогического университета. - 2011. - № 5. - С. 348-356.

11. Пат. 2430362 РФ Способ выделения альвеолярных

макрофагов из мокроты / Я.И. Жаков, М.С. Бабайлов, Г.В. Брюхин, Е.Е. Минина, В.И. Куличков, B.C. Ишимова. - №

2010138744; заявл. 20.09.2010; опубл. 27.09.2011, Бюл. № 27. - 6 с.

12. Бабайлов, М.С. Цитохимическая характеристика альвеолярных макрофагов у детей с легкой персистирующей бронхиальной астмой / М.С.Бабайлов II Материалы II международной (IX итоговой) научнопрактической конференции молодых ученых. - Челябинск: Изд-во ЧелГМА, 2011.-С. 9-13.

13. Жаков, Я.И. Влияние Лазолвана (Амброксола) на динамику воспалительного процесса слизистой оболочке бронхов после перенесенного острого бронхита у детей по данным индуцированной мокроты / Я.И. Жаков, Е.Е. Минина, М.С. Бабайлов // Русский медицинский журнал. -2011. - № 22 (19). - С.1361-1364.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БА

ИМ

ЛМ

ПСВ

ФВД

ЦНС

ам

ід

ІРМ-у

\1

N0

а-ГФДГ

Бронхиальная астма

Индуцированная мокрота

Легочные макрофаги

Пиковая скорость выдоха

Функция внешнего дыхания

Центральная нервная система

Глобальная стратегия лечения и профилактики бронхиальной астмы

Иммуноглобулин

Интерферон-у

Интерлейкин

Оксид азота

Фактор некроза опухолей

Ал ьфа-гл и церофосфатдегидрогеназа

БАБАЙЛОВ Михаил Сергеевич

ОСОБЕННОСТИ ЦИТО-ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ МОКРОТЫ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕГОЧНЫХ МАКРОФАГОВ ДЕТЕЙ С БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ КОНТРОЛИРУЕМОГО И НЕКОНТРОЛИРУЕМОГО ТЕЧЕНИЯ

14.03.09- клиническая иммунология, аллергология

14.01.08 - педиатрия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Отпечатано в ООО «Типография ВК».

Подписано к печати 25.01.2012г. Объем 2 п.л. Формат 64-84. Гарнитура «Times New Raman суг». Бумага для офисной техники, 80 мг/м2. Тираж 100 экз.