Автореферат и диссертация по медицине (14.01.08) на тему:Клинико-анамнестические и иммуногенетические аспекты бронхиальной астмы с позиции контроля над течением заболевания у детей

На правах рукописи

ТЮТИНА Ольга Сергеевна

АСПЕКТЫ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ С ПОЗИЦИИ КОНТРОЛЯ НАД ТЕЧЕНИЕМ ЗАБОЛЕВАНИЯ У ДЕТЕЙ

14.01.08 - педиатрия 14.03.09-клиническая иммунология, аллергология, медицинские науки

Автореферат на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 6 МАИ ¿013

Красноярск - 2013

005058735

005058735

Работа выполнена в лаборатории клинической патофизиологии и аллергологии ФГБУ «Научно-исследовательский институт медицинских проблем Севера» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук и на кафедре детских болезней с курсом ПО ГБОУ ВПО «Красноярский государственный университет им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Смирнова Светлана Витальевна Ильенкова Наталья Анатольевна

Официальные оппоненты:

Терещенко Сергей Юрьевич - доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «НИИ медицинских проблем Севера» СО РАМН, руководитель отдела соматического здоровья детей

Петрова Алла Германовна - доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет» Минздрава России, профессор кафедры детских инфекционных болезней

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр здоровья детей" Российской академии медицинских наук, г. Москва

Защита состоится « 23 » мая 2013_г. в 900 часов на заседании диссертационного совета Д 208.037.01, созданного на базе ГБОУ ВПО «Красноярский государственный университет им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Красноярский государственный университет им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автореферат диссертации разослан апреля 2013 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета Д 208.037.01 доктор медицинских наук, доцент

Штарик Светлана Юрьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Бронхиальная астма — одно из самых распространенных хронических неспецифических воспалительных заболеваний органов дыхания в детском возрасте. Инвалидность среди детского населения при аллергических заболеваниях формируется преимущественно за счет бронхиальной астмы (Безрукова Д.А., 2009; GINA 2011; Намазова-Баранова JI.C., 2011; Геппе H.A.,2012; Таточенко В.К., 2012; International consensus on (ICON) pediatric asthma, 2012). Эти обстоятельства характеризуют бронхиальную астму как глобальную медико-социальную проблему и диктуют необходимость ее дальнейшего всестороннего изучения.

В настоящее время достигнуты большие успехи в изучении патогенеза бронхиальной астмы, однако многие этапы формирования и модификации течения этого заболевания являются спорными и не совсем ясными. Возможно, отсутствие адекватного контроля над течением заболевания обусловлено особенностями эндогенной регуляции межклеточных взаимодействий, осуществляемой цито кипами - регуляторами, как неспецифических воспалительных процессов, так и аллерген-специфического иммунного ответа "клеточного" и "гуморального" типов. Формирование атопии связано с активацией аллерген-специфичных клонов ТЬ2-клеток. Цитокины, продуцируемые Th-2 лимфоцитами, поддерживают биосинтез IgE и других иммуноглобулинов, участвуют в аллергическом воспалении, активируя тучные клетки и эозинофилы (Kay A.B. et al., 2006; Lärche M. et al., 2007; Кетлинский C.A., 2008; Симбирцев A.C.; 2008, Козлов B.A. с соавт., 2009;). Безусловно, существует необходимость дальнейшего изучения особенностей цитокиновой регуляции межклеточных взаимодействий для выявления маркеров прогноза течения бронхиальной астмы и оптимизации достижения адекватного контроля над заболеванием.

Поиск генетических маркеров, контролирующих ключевые звенья патогенеза бронхиальной астмы, является актуальным. Наиболее перспективным является выявление ассоциации полиморфных локусов генов-кандидатов с риском развития тяжелых форм бронхиальной астмы у детей. Частым изменением структуры генов является полиморфизм единичных нуклеотидов, которые влияют на фенотип заболевания и предопределяют различия в клинических проявлениях одной и той же нозологической формы (Bidwell J. et al., 2001; Gray I. C. et al., 2002; Пузырев В.П.,; Фрейдин М.Б., 2006; Огородова Л.М., 2010).

Изучение промоторных регионов генов цитокинов и выявление особенностей функционирования цитокиновой сети с учетом средовых факторов риска заболевания позволит приблизить понимание механизмов формирования неконтролируемого течения бронхиальной астмы в детском возрасте и усовершенствовать профилактические мероприятия. Цель исследования: выделить предикторы неконтролируемого течения бронхиальной астмы у детей с учетом факторов риска, иммунологических особенностей, цитокиновой регуляции межклеточных взаимодействий и полиморфизма промоторных регионов генов цитокинов.

Задачи исследования

1. Определить факторы риска и оценить их вклад в формирование уровня контроля атопической бронхиальной астмы у детей.

2. Провести сравнительную оценку показателей клеточного и гуморального звеньев иммунитета в зависимости от уровня контроля течения атопической бронхиальной астмы.

3. Исследовать содержание цитокинов (IL-2, IL-4, IL-10, TNF-a) в сыворотке крови, с проведением анализа параметров в зависимости от уровня контроля течения бронхиальной астмы у детей.

4

4. Определить полиморфизм промоторных регионов генов цитокинов (С-590ТIL4 и С-592А ILIO) при атопической бронхиальной астме с различным уровнем контроля течения заболевания и группой здоровых детей.

5. Выделить анамнестические и иммунологические маркеры, имеющие значимость в формировании неконтролируемого течения атопической бронхиальной астмы у детей.

Научная новизна исследования

Определен вклад и ранговое место факторов риска при атопической бронхиальной астме (АБА) у детей. Среди социальных факторов риска неконтролируемого течения АБА приоритетное место занимают факторы «неполная семья», «низкий уровень материального дохода (менее 10 тыс. р. на семью/мес.)». Среди бытовых факторов риска формирования неконтролируемого течения атопической бронхиальной астмы у детей отмечены - «субъективная оценка родителями бытовых условий, как неудовлетворительные», «скопление коллекторов пыли», «избыточная сырость воздуха» «курение мамы», «курение папы». Достоверным анамнестическим фактором риска неконтролируемого течения АБА у детей является «раннее проявление симптомов бронхиальной обструкции - до 3 лет». Анализ коморбидных заболеваний с позиции риска формирования неконтролируемого течения АБА показал, что основной вклад вносит наличие «атонического дерматита».

Выявлены особенности эндогенной регуляции межклеточных взаимодействий, определяющие характер иммунного реагирования при неконтролируемой атопической бронхиальной астме у детей: снижение количества зрелых лимфоцитов (CD3*), CD4+, CD8+ клеток, снижение индекса (CD4+/CD8+), увеличение уровня IgE в сравнении с контролируемым течением атопической бронхиальной астмы и группой контроля. Показана практическая

значимость определения концентрации цитокинов в сыворотке крови, подтверждённая статистически значимой большей частотой встречаемости высоких концентраций IL-4, IL-10, TNF-a при неконтролируемом течении атопической бронхиальной астмы.

Установлена ассоциация полиморфных вариантов промоторных регионов генов цитокинов С-590Т IL4 и С-592А ILIO с уровнями продукции соответствующих интерлейкинов. Выявлены прогностически неблагоприятные для течения АБА ассоциации полиморфных вариантов генов цитокинов. Определено, что характер распределения аллельных вариантов промоторных регионов генов цитокинов С-590Т IL4 и С 592А ILIO среди больных атопической бронхиальной астмой детей Красноярского края европеоидного происхождения имеет тенденцию к большей частоте встречаемости аллельного варианта -592А ILIO при контролируемом течении АБА, -590Т IL4 - при неконтролируемом течении болезни. Практическая значимость работы

Определены анамнестические факторы риска неконтролируемого течения атопической бронхиальной астмы, что позволяет формировать группы пациентов, угрожаемых по неконтролируемому течению АБА и определить комплекс мероприятий первичной профилактики.

Выявленные иммунологические маркеры могут быть рекомендованы в качестве дополнительных прогностических критериев формирования неконтролируемого течения атопической бронхиальной астмы у детей. Внедрение результатов исследования

Результаты исследования внедрены в практическую работу врачей педиатров, аллергологов-иммунологов, пульмонологов клинических отделений детской аллергологии и пульмонологии ФГБУ «НИИМПС» СО РАМН. Теоретические и практические положения, изложенные в диссертации,

используются в учебном процессе кафедр клинической иммунологии, педиатрии с курсом ПО Красноярского государственного медицинского университета им В.Ф. Войно-Ясенецкого. Положения, выносимые на защиту

1. Факторы риска оказывают влияние на уровень контроля течения атопической бронхиальной астмы у детей.

2. Установлены особенности эндогенной регуляции межклеточных взаимодействий, определяющие характер иммунного реагирования при атопической бронхиальной астме с позиции контроля течения заболевания у детей.

3. Полиморфные варианты промоторных регионов генов цитокинов С-590Т IL4, С-592А IL10 ассоциированы с изменениями концентрации IL-4, IL-10 в сыворотке крови и оказывают влияние на течение атопической бронхиальной астмы у детей.

Апробация работы. Основные материалы представлены на региональных, Всероссийских и международных конференциях: 9-й, 10-й научно-практических конференциях молодых ученых с международным участием ФГБУ «НИИМПС» СО РАМН «Актуальные вопросы охраны здоровья населения регионов Сибири» (Красноярск, 2011, 2012); 13-й, 15-й, 16-й межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы медицины» (Абакан, 2010, 2012, 2013); Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» с международным участием (Красноярск, 2010, Иркутск, 2012); научно-практической конференции «Актуальные вопросы педиатрии» (Красноярск, 2011); 15ft International Congress on Circumpolar Health (Fairbanks, AK, USA, 2012), 22nd ERS Annual Congress (Vienna, Austria, 2012), XVI Конгрессе педиатров России (Москва 2013).

Личный вклад автора. Автором выполнен весь объем клинических и большая часть инструментальных и лабораторных исследований, сформирована база данных, проведена статистическая обработка материала, подготовлены и оформлены тезисы и статьи.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 4 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», собственных результатов исследования, отраженных в трех главах, заключения, выводов и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 36 таблицами и 10 рисунками. Список литературы содержит 264 источника, в том числе 64 работы отечественных и 200 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования. Работа проводилась с 2010 по 2013 год в рамках НИР ФГБУ «НИИМПС» СО РАМН № госрегистрации 0120.0950339. Исследования одобрены на заседании этического комитета ФГБУ «НИИМПС» СО РАМН.

В соответствие с целью и задачами выделены объекты исследования: первый - дети, больные среднетяжелой АБА с контролируемым течением заболевания (КАБА, п=59), второй - дети, больные тяжелой/среднетяжелой АБА с неконтролируемым течением заболевания (НАБА, п=51), третий -контрольная группа (практически здоровые дети без признаков атопии, п=33). Все дети, включенные в группу больных АБА, в течение последних трех месяцев получали моно/комбинированную базисную терапию в высоких/среднетерапевтических дозах (табл.1).

Характеристика объемов базисной терапии (по будесониду) в группах с контролируемым и неконтролируемым течением атопической бронхиальной

астмы

Базисная терапия КАБА НАБА Р

(п=59) (п=51)

Эквивалентная доза по 500 640 р<0,01

будесониду мкг/сут, [400;600] [500;1000]

Me [С25;С75]

При включении больного ребенка в исследование проводилось общеклиническое обследование, включающее оценку выраженности клинических симптомов заболевания за последние 3 месяца. Для комплексной оценки уровня контроля над заболеванием дети вместе с родителями отвечали на вопросы теста по контролю над астмой (ACT™). Методами специфической аллергологической диагностики являлись сбор аллергологического анамнеза и проведение скарификационных проб в группе с контролируемым течением заболевания, а в группе с отсутствием контроля анализ этиологических факторов проведен ретроспективно по данным амбулаторных карт. Функциональные методы исследования включали в себя определение показателей функции внешнего дыхания - спирометрия, пикфлоуметрический тест на обратимость бронхиальной обструкции.

Иммунологическое обследование включало определение показателей клеточного звена иммунитета методом флуоресцентной микроскопии с использованием моноклональных антител к поверхностным рецепторам -CD3+, CD4+, CD8+. Гуморальное звено иммунитета оценивалось определением уровня иммуноглобулинов (IgA, IgM, IgG, IgE) в сыворотке крови путем твердофазного иммуноферментного анализа, с помощью тест-систем ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск. Концентрация цитокинов (IL-2, IL-4, IL-10,

9

TNF-a) определялась путем твердофазного иммуноферментного анализа с помощью тест-систем ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск.

Выделение ДНК проводилось при помощи стандартного набора для выделения ДНК, производитель ООО «Лаборатория МЕДИГЕН», г. Новосибирск. В качестве биоматериала использовалась цельная кровь в количестве 100 мкл. После завершения всех этапов вьщеления, согласно рекомендациям производителя, в водной фазе получаем ДНК, пригодную для последующих ферментативных реакций (рестрикция, мечение, ПЦР). Исследовано 2 полиморфных варианта генов цитокинов: С-590Т IL4, С-592А ILIO. Все изученные мутации локализованы в промоторных участках соответствующих генов. Генотипирование аллельных вариантов осуществлялось методом рестриктного анализа продуктов амплификации (ПДРФ - анализ) специфических участков генома. Амплификация проводилась путем полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе (табл.2) и учитывая применение амплификатора "Tercik МС2" ("ДНК-технология", Москва).

Таблица 2

Характеристики исследованных полиморфизмов генов цитокинов

Ген Полиморфизм Структура праймеров Температура отжига праймеров, °С Фермент рестрикции Продукты гидролиза, п.н. Лит-ра

Аллель «дикого» типа Мутант -ный аллель

IL4 С-590Т 5'cacctaaacttgggaacat ggt3' 5 'gttgtaatgcagtcctcctg 3' 60 Bme 181 194; 23 217 Cantagrel А. et а!, 1999.

ILIO С-592Л 5'atccaagacaacactacta a-3' 5 'taaatcctcaaagttcc-3' 58 Rsal 306; 232;42 240; 232; 66; 42 Мок С.С. et al, 1998.

Статистическая обработка результатов исследования проводилась на персональном компьютере Amd Athlon. По результатам исследования в пакете электронных таблиц MS Excel 2003 была сформирована база данных, на основе которой с помощью статистических пакетов прикладных программ Windows ХР Professional v. 2002 (SP 2) и Statistica 8.0 производился статистический анализ. Для представления количественных данных, не подчиняющихся нормальному закону распределения, применялись непараметрический критерий U-test Манна-Уитни. Данные в таблицах и тексте представлены в виде медианы, 25 и 75 квартили (Ме, (C25-C7J)). Критический уровень значимости, при проверке статистических гипотез о существовании различий показателей между группами, р принят равным 0,05. Распределение генотипов по полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга (РХВ) с помощью критерия %2 и точного теста Фишера. Обработка результатов генетических исследований осуществлялась с использованием критерия отношения шансов OR с расчетом для него 95% доверительного интервала (CI).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ При оценке социальных факторов риска, оказывающих влияние на модуляцию уровня контроля над течением АБА у детей, выявлено, что фактор «неполная семья» в группе контролируемого течения болезни (п=59) отмечалось у 23,7% детей, а в группе детей с неконтролируемым течением болезни АБА (п=51) у 39,2% пациентов с ОШ=3,61 (95% ДИ=2,28-6,54, р=0,038); фактор «первый ребенок в семье» с контролируемым течением АБА выявлялся в 30,5% случаев, а при отсутствии контроля - в 74,5% с 0111=3,42 (95% ДИ=0,04-5,6, р=0,002); фактор «уровень материального дохода в семьях (менее 10 тыс. р. на семью/мес.)», при АБА с отсутствием контроля над заболеванием встречался в 19,6% случаев, а с контролируемым течением

болезни не наблюдался ОШ =0,04 (95% ДИ=0,002-0,7, р=0,004). Средний стаж заболевания в группе КАБА составил 10,9 ± 1,1 лет, а в группе НАБА -11,8±4,28 лет. Анализ фактора риска «сухость воздуха» установил, что у детей с неконтролируемым течением АБА данный признак регистрировался в 21,5% случаях, а у детей с контролируемой АБА - в 8,4% случаях с 0111=2,14 (95% ДИ=1,8-6,06, р=0,03). Признак «избыточная сырость воздуха» в группе НАБА выявлялся в 72,8 % случаев, а при контролируемой АБА - в 39,2%, 0111=4,0 (95% ДИ=2,1-7,7, р=0,009). Наличие коморбидного заболевания -атопический дерматит в группе с неконтролируемым течением болезни отмечено в 84,3%, а при контролируемом течении АБА - в 40,6%, ОШ =4,8 (95% ДИ=2,6-9,06, р=0,03) (рис. 1).

курени« папы

коморбидная патология (АтД)

аллергические ааболеаанмя у бабушки/деда

аллергические ааболеаания у матери

коллекторы пыли

наличие жиаотных • доме

ибыточная сырость

неполная семья

миакий уровень материального дохода

один ребенокссамье курение мамы

-ОШ

Рисунок 1. Ранжирование факторов риска по показателю ОШ (95%ДИ) р<0,05

Анализ особенностей реагирования иммунной системы при различных фенотипических проявлениях атопической бронхиальной астмы у детей представляет большой интерес для практического здравоохранения (табл. 3).

Показатели клеточного и гуморального звеньев иммунитета при АБА с различным уровнем контроля над течением заболевания у детей

Показатели Ме(С25;С75) КАБА (1), n=59 НАБА (2), n=51 Контроль (3) (n=33) P

Лимфоциты, (%) 38,0 (31,0;44,0) 30,0 (25,0;37,0) 37,0 (34,0;39,0) p^=0,023 pu=0,086 Р2.З=0,032

CD3+, (%) 38,0 (31,0;44,0) 60,0 (54,0;67,0) 65,0 (61,0;68,0) PU=0,049 pi,3=0,025 Р2.З=0,028

CD3+, yt\Jll 1V1IW1 j 1536 /1 л1п.1/:пл\ 695,5 /•<04 m ^ У A J 1388 л па^-ПЮ"» v----• --J PU=0,014 pu=0,022 P2J=0,0014

CD4+, (%) 34,0 (19,0;40,0) 24,0 (18,0;30,0) 37,0 (20,0;30,0) p,.r=0,007 pi,3=0,0022 Р2,З=0,0004

CD4+, (кл/мкл) 490 (101;707) 207 (146;263) 754 (573;964) Pii=0,039 pi,3=0,0073 Р2.з=0,001

CD8+, (%) 26,0 (21,0;29,0) 38,0 (31,2;42,0) 25,0 (21,0;39,0) pu=0,038 ри=0,048 р2.з=0,0002

CD8+, (кл/мкл) 316 (133;531) 288 (211;419) 402 (238;533) PU=0,05 PU=0,123 Рг.з-0,014

ИРИ, CD4+/ CD8+ 1,3 (0,7; 1,9) 0,7 (0,49;0,85) 1,8 (1,4;2,7) р1Д=0,047 pu=0,0006 Р2.З=0,0046

IgA, (г\л) 1,2 (0,9;2,1) 1,6 (0,9;2,5) 1,9 (0,7;2,1) Р1Д=0,075 pu=0,048 P2J=0,06

IgM, (г\л) 1,2 (1,0;1,3) 1,1 (1,0;1,3) 1,2 (0,7; 1,9) PU=0,117 Pi.3=0,42 p2 }=0,36

IgG, (г\л) 15,1 (11,8;18,9) 12,6 (10,0; 17,7) 10,7 (8,2; 14,8) PU=0,113 PU=0,06 Р2.3=0,И

IgE, (МЕ/мл) 128,0 (151;296) 235,5 (169,9;599,9) 31,13 (1,79;49,5) PU=0,047 Pu<0,001 Р2.з<0,001

Примечание: р-достоверность различий критерий Манна-Уитни

Изучение популяционного и субпопуляционного составе лимфоцитов при различных уровнях контроля над течением АБА позволит определить иммунологические маркеры неконтролируемого течения болезни. Анализ распределения субпопуляционного состава лимфоцитов показал, что в группе НАБА по сравнению с КАБА выявлено статистически значимое снижение общего количества лимфоцитов, зрелых Т-лимфоцитов (CD3*), р=0,014, относительного и абсолютного содержания Т-лимфоцитов с фенотипом CD4+-, С08+-лимфоцитов и, как следствие, снижение иммунорегуляторного индекса (CD4+/CD8+). Возможно, снижение суммарного содержания Т-лимфоцитов свидетельствует о миграции этих клеток в очаг повреждения, либо о подавлении дифференцировки Т-клеток, либо селективном апоптозе определенных фенотипов Т-лимфоцитов. Выявленные изменения гуморального звена иммунитета показали характерные особенности для АБА в целом - пшерпродукция IgE по сравнению с группой контроля. Внутри групп выявлено достоверное увеличение концентрации IgE в группе с неконтролируемым течением болезни. Закономерно, что при отсутствии контроля над течением АБА, вследствие персистенции воспаления, наблюдается гиперпродукция IgE.

Для анализа патогенетических особенностей воспалительной реакции при атопической бронхиальной астме с различным уровнем контроля над течением заболевания у детей нами изучены концентрации цитокинов в сыворотке периферической крови (табл. 4). В общей группе больных АБА выявлено, что концентрация цитокинов Th-2-профиля (IL-4, IL-10) и Th-1-клеток (IL-2, TNF-a) достоверно превышает показатели контрольной группы. При НАБА по сравнению с КАБА отмечено достоверное увеличение концентрации TNF-a и снижение содержания IL-2. Следовательно, увеличенная концентрация TNF-a - один из прогностических маркеров

неконтролируемого течения АБА, а увеличенное содержание 1Ь-2 -прогностический маркер контролируемого течения АБА у детей.

Таблица 4

Концентрация цитокинов в сыворотке крови детей, больных АБА с различным уровнем контроля над течением заболевания

Наименование группы 1Ь-2 (пг/мл) Ме(С25;С75) 1Ь-4 (пг/мл) Ме (С25;С75) 1Ь-10 (пг/мл) Ме(С25;С73) ЮТ-а (пг/мл) Ме (С25;С73)

КАБА (1) V" -ч 24,06 п ъкля. ¿п \ ' 5-->-'/ 5,27 п к<;-7 »--- ' 36,52 V--!-» •->■ / 16,61 к оо-^о г)— >—

НАБА (2) (п=51) 11,8 (8,5 ;3 0,6) 5 83 (3,97; 14,8) 37,39 (21,7;42,б) 25,6 (18,6;31,5)

Контроль (3) (п=33) 5,2 (2,4;7,2) 2,45 (0,84;4,9) 15,89 (6,74;27,8) 6,63 (2,58:11,9)

Р Р1Д = 0,048 Р1, з=0,006 р2,з =0,005 Ри = 0,48 Р1,з =0,0019 р2^<0,001 Ри =0,98 ри<0,001 р2^<0,001 ри =0,006 Ри<0,001 Р2,з<0,001

Примечание: р - достоверность различий критерий Манна-Уитни

Проведение оценки уровней маркеров воспаления в группах с различным контролем над течением АБА по значению медианы и интерквартильных размахов выявило, что многие показатели существенно отличались, однако в связи с высокой их вариабельностью, не удалось выявить статистически значимых различий в группах. Распределения пациентов с учетом значения концентрации 1Ь-4 в пределах перцентильных величин при АБА в перцентильных значениях группы контроля показало, что высокие показатели концентрации 1Ь-4 (95 перцентиль) в сыворотке крови отмечены у большего числа детей при НАБА - 92,2%, чем при КАБА - 78,5% (р=0,019). При НАБА, выявлены высокие значения концентрации 1Ь-10 (95 перцентиль) у

84,4%, против 57% группы КАБА (р=0,011). Статистически значимых различий в концентрации IL-2 не выявлено. Высокие концентрации TNF-a (95 перцентиль) отмечались в 53,1% при КАБА и в 84,4% при НАБА (р=0,014). Диагностическая значимость повышения уровня IL-4 в сыворотке крови при НАБА подтверждена диагностической чувствительностью (ДЧ) - 85,4%, диагностической специфичностью (ДС) - 94,9%. диагностической эффективностью (ДЭ) - 89,1%, при этом прогностическая ценность положительного результата (ПЦПР) и прогностическая ценность отрицательного результата (ПЦОР) составили 95,5% и 8%, соответственно. Диагностическая значимость повышения уровня IL-10 в сыворотке крови при НАБА доказана ДЧ - 92,1%, ДС - 91,5%, ДЭ - 91,8%, ПЦПР и ПЦОР - 90,3% и 6,7%, соответственно. По уровню концентрации TNF-a в сыворотке крови при НАБА показатели составили: ДЧ -89,2%, ДС - 93,2%, ДЭ- 82,8%, ПЦПР -89,7%, а ПЦОР-22%.

Полиморфные гены цитокинов способны принимать активное участие в формировании фенотипа патологических состояний. При этом отдельные аллельные варианты могут быть ассоциированы с уровнем синтеза соответствующего белкового продукта, что тоже оказывает влияние на характер течения заболеваний (табл.5).

При сравнении анамнестических данных в группах больных с различными полиморфными вариантами промоторных регионов генов С-590Т IL4 и С-592А ILIO верифицированы прогностически неблагоприятные варианты, характеризующиеся более ранним началом эпизодов бронхиальной обструкции, ранней верификацией диагноза, более ранним наступлением инвалидности и низкими показателями ACT™ на момент проведения исследования.

Таблица 5

Клинико-анамнестические особенности при АБА с учетом полиморфных вариантов генов цитокинов

Показатель С-590СIL4, Me (С25;С75) С-590Т и Т-590Т IL4, Me (С23;С75) Р

Возраст 1 эпизода обструкции, лет 3,5 (2,0:4,0) 2,5(2,0:4,5) , 0,056

Возраст верификации диагноза, лет 5,0(3,0:8,0) 4(3,0:6,0) 0,065

Стаж болезни, лет 8,0 (5,0;10,0) 8,0(6,0;ii,0) 0,3

Стаж инвалидности, лет 0,5 (0;8,0) 6,0(0;8,0) 0,0049

Значения ACT, баллы 20,0 (17,0;22,0) 17,0 (15,0;22,0) 0,001

Показатель С-592СIL10, Me (С25;С75) С-592А и А-592АIL10, Me (С25;С75) Р

Возраст 1 эпизода обструкции (лет) 3,5 (2,0:5,0) 3,0 (2,5:5,0) 0,56

Возраст верификации диагноза, лет 5,0 (3,0;7,0) 6,0 (4,9;8,0) 0,03

Стаж болезни, лет 8,0 (6,0;Ю,0) 7,6 (3,0;Ю,0) 0,05

Стаж инвалидности, лет 5,0 (0;8,0) 0 (0;8,0) 0,001

Значения ACT , баллы 18 (16;22) 22(16;22) 0,001

Примечание: р-достоверность различий критерий Манна-Уитни

С помощью изучения аллельного полиморфизма генов делаются попытки определить генетическую основу индивидуальных различий в иммунном ответе путем определения взаимосвязи между индивидуальными полиморфными аллелями, или гаплотипами генов цитокинов и синтезом белкового продукта. Результатом является выявление отдельных аллелей генов, ассоциированных с повышенной, либо пониженной продукцией соответствующего цитокина (табл. 6).

Показатели концентрации цитокинов при АБА с учетом полиморфных вариантов генов цитокинов

Показатель С-590СIL4 Ме (С25;С75) С-590Т, Т-590ТIL4 Ме(С25;С75) Р

IL-4 5,6 (3,6;9,7) 7,2 (3,7;14,8) 0,043

IL-10 38,4(21,5;46,5) 36,5 (21,3;60,0) 0,87

IL-2 11,8 (7,2;31,1) 24,9(10,5;56,4) 0,047

TNF-a 22,7(15,24;33,87) 26,3 (15,0;22,0) 0,059

Показатель С-592С/70, Ме (С25;С75) С-592А, А-592А ILIO, Ме (С25;С75) Р

IL-4 4,9 (3,7;10) 6,5 (4,4; 14,8) 0,044

IL-10 38 (22,1;50,4) 35,6(19,1:42,6) 0,037

IL-2 14,07 (7,9;42) 12,5(8,7:33,4) 0,29

TNF-a 22,3 (15,4;29) 26 (16,6:33,9) 0,022

Примечание: р-достоверность различий критерий Манна-Уитни

При изучении концентрации цитокинов в сыворотке крови больных АБА с полиморфными вариантами гена IL4 определено, что при наличии полиморфного варианта С/С концентрация IL-4 была достоверно ниже и составила 5,6 (3,6-9,7) пг/мл, а при варианте С/Т гена IL4 7,2 (3,7-14,8) пг/мл (р=0,043). При изучении концентрации цитокинов в сыворотке крови больных АБА с полиморфными вариантами гена ILIO определено, что при варианте С/С гена ILIO концентрация IL-10 была достоверно выше и составила 38 (22,1-50,4) пг/мл, а при варианте С/А rem ILIO - 35,6 (19,1-42,6) пг/мл (р=0,037).

Многочисленные исследования, проведенные во всем мире, выявили ассоциативную связь аллеля -590Т с гиперпродукцией IL-4, одного из ключевых цитокинов, участвующих в патогенезе АБА. Он способствует пролиферации плазматических клеток, увеличивает экспрессию низкоафинного рецептора к IgE на B-клетках, селективно индуцирует синтез IgE. В проведенном исследовании выявлено статистически значимое

увеличение концентрации 1|>Е у больных АБА с генотипами С-590Т, Т-590Т 1Ь4 (р=0,035) (табл.7).

Таблица 7

Иммунологические показатели у больных АБА с учетом полиморфных вариантов генов цитокинов

Показатель C-590CIL4, Me(C25;C75) C-590T, T-590TIL4, Me (C2s,C75) P

IgE, мЕ/мл 267(184;604) 460 (221;679) 0,025

IgA, г/л 1,5 (0,9;2,3) 1,4(1,0:2,6) 0,82

IgM, г/л 1,1 (1,0;1,3) 1,0(1,0:1,2) 0,91

IgG, г/л 13,8 (10,7;18,8) 12,7(11,5:17,5) 0,25

Лимфоциты, (%) 32 (19;37) 28,5 (26;38) 0,17

Лимфоциты, (кл/мкл) 1536(1120;2220) 1431 (1080:1900) 0,19

CD3+, (%) 54 (28;60) 61 (51;68) 0,28

CD3+, (кл/мкл) 638 (478:1065) 723(621:1178) 0,15

CD4+, (%) 20 (15;26) 22(18:30) 0,03

CD4+, (кл/мкл) 160 (72;261) 207(141:266) 0,03

CD8\ (%) 28 (20;46) 37 (28;39) 0,072

CD8+, (кл/мкл) 220 (127:298) 270(211:329) 0,15

CD4+/CD8+ 0,7(0,45:0,8) 0,6 (0,5;0,85) 0,47

Показатель C-592C/L70, Me (C25;C75) C-592A, A-592AIL10, Me (C25;C73) P

IgE, мЕ/мл 452 (174:656) 270 (221;604) 0,05

IgA, г/л 1,5 (0,9;2,3) 1,4(1,0:2,1) 0,28

IgM, г/л 1,1 (1,0:1,3) 1,1(1,1:1,3) 0,9

IgG, г/л 12,9 (10,7;17,5) 14,4(11,3:19,1) 0,08

Лимфоциты, (%) 28,5,5 (26,5;39) 33,5 (25,5;37) 0,32

Лимфоциты, (кл/мкл) 1490(1120:1600) 1544(1095:1979) 0,39

CD3+, (%) 56,2 (47;62) 59 (49;73) 0,04

CD3+, (кл/мкл) 683 (615:889) 879 (623;1210) 0,15

CD4+, (%) 19(16:30) 20 (19;21) 0,01

CD4+, (кл/мкл) 160(103;284) 187,5 (121;225) 0,01

CD8+, (%) 36 (26;42) 37,5 (32;42) 0,45

CD8+, (кл/мкл) 234 (138;329) 187(121:252) 0,05

CD4+/CD8+ 0,67 (0,4;0,8) 0,52 (0,4;0,6) 0,45

Примечание: р-достоверность различий критерий Манна-Уитни

Для изучения особенностей распределения аллельных вариантов генов цитокинов у детей больных АБА проведено типирование исследуемых полиморфизмов генов цитокинов. В результате анализа частот генотипов и отдельных аллелей показан ряд отличий в распределении среди больных АБА с различным уровнем контроля над течением заболевания, а также по сравнению со здоровыми лицами (табл.8).

Таблица 8

Частоты генотипов и аллелей С-590Т11А среди детей больных АБА с различным уровнем контроля

i руппа и/с С/i 1/1 С Т

КАБА (п=41) 63,4 34,2 2,4 0,8 0,2

НАБА (п=33) 51,5 42,2 6,1 0,73 0,27

OR (95% CI) 1,2 (0,49-2,91) 0,81 (0,28-2,31) 0,57 (0,02-8,62) 1,55 (0,67-3,58)

Р 0,66 0,66 0,64 0,26

Примечание: значение у2 критерия = 1,24, р=0,26.

В распределении частот генотипов в группах больных АБА с различным уровнем контроля над течением болезни отмечается тенденция к учащению встречаемости генотипов С/Т и Т/Т в группе НАБА (частота аллеля Т 0,2 и 0,27, соответственно), а генотип С/С - в группе КАБА (ÓR=1,55, р=0,26).

При анализе распределения частот генотипов С-592А ILIO выявлено, что в группе КАБА отмечается увеличение генотипа А/А в 2 раза по сравнению с группой НАБА OR=0,55, р=0,14. Частота аллельного варианта -592А, ассоциированного со сниженной экспрессией IL-10 выше в группе КАБА, OR=0,83, р=0,64 (табл.9).

Частоты генотипов и аллелей С-592АIL10 у детей при атонической бронхиальной астме с различным уровнем контроля

Группа С/С С/А А/А С А

КАБА (п=41) 63,4 24,4 12,2 0,76 0,24

НАБА (п=33) 63,6 30,3 6,1 0,79 0,21

OR (95% CI) 0,69 (0,4-2,29) 0,5 (0,18-1,40) 1,6 (0,2-1,48) 0,83 (0,36-1,94)

Р 0,92 0,14 0,61 0,64

Т Тгли\*смпиттр- atratjptiWA v9 imlTTpnmr = О 9. t?=0.64.

------ fj- -----1---- -7-> r ->-

Сопоставляя результаты анализа с известными ассоциациями отдельных аллелей генов цитокинов с уровнем продукции соответствующего цитокина, можно последовательно выявить характерные для больных сочетания вариантов генов (табл.10).

Согласно полученным результатам, уровень цитокинов ГЬ-4 и 1Ь-10 в сыворотке крови больных АБА, независимо от уровня контроля над заболеванием и генотипов исследованных цитокинов, был выше, чем в контрольной группе (табл.9). Концентрация в 1Ь-4 сыворотке крови у при КАБА носителей генотипов С/Т+Т/Т гораздо выше, чем у носителей С/С (р=0,98), а в группе НАБА этот показатель отличался практически в 2 раза (р=0,51). Выявлена тенденция к гиперпродукции интерлейкина при наличии аллельного варианта -590Т гена 1Ь4 при атопической бронхиальной астме у детей В группе КАБА среди носителей генотипов С/С и С/А гена 1Ы0 отмечалась тенденция к снижению концентрации 1Ь-10 в сыворотке крови у носителей генотипа С/А. Подобная направленность отмечалась и в группе с неконтролируемым течением АБА у детей (р=0,17).

Связь генотипов 11,4 с концентрацией цитокинов в сыворотке крови детей, больных АБА с различным уровнем контроля над течением заболевания

Контролируемое Неконтролируемое Контроль

течение АБА течение АБА

Генотип Концентрация Генотип Концентрация Генотип Концентрация

IL4 IL-4 /14 IL-4 114 IL-4

(С-590Т) (пг/мл) (С-590Т) (пг/мл) (С-590Т) (пг/мл)

Ме (С25-С75) Ме (С25-С75) Ме (С25-С75)

С/С 3,96 С/С 5,13 С/С 0,99

(п-26) (1,7-6,08) (п=17) (3,6-13,9) (п=16) (0,3-1,3)

С/Т+ 4,15 С/Т+ 8,26 С/Т+ 1,29

Т/Т (2,5-5,5) Т/Т (3,8-15,1) Т/Т (0,8-1,6)

(п=15) (п=16) (п=17)

Р=0,98 Р=0,51 Р=0,2

Генотип Концентрация Генотип Концентрация Генотип Концентрация

ILIO IL-10 то IL-10 то IL-10

(С-592А) (пг/мл) (С-592А) (пг/мл) (С-592А) (пг/мл)

Ме (С25-С75) Ме (С25-С75) Ме (С25-С75)

С/С 34,78 С/С 39,13 С/С 6,16

(п=2б) (13,3-44,3) (п=21) (24,3-42,6) (п=18) (2,1-13,4)

С/А+ 21,8 С/А+ 33,47 С/АЛ- 4,6

А/А (5,6-39,1) А/А (19,8-39,6) А/А (2,6-14,3)

(п=15) (п=12) (п-15)

Р=0,38 Р=0,18 Р=0,1

Примечание: р-достоверность различий критерий Манна-Уитни

Таким образом, в результате проведенного исследования выделены предикторы неконтролируемого течения атопической бронхиальной астмы у детей с учетом средовых факторов риска, характера иммунного реагирования, особенностей цитокиновой регуляции межклеточных взаимодействий и полиморфных вариантов промоторных регионов генов цитокинов С-590ТIL4 и С-592А ILIO.

выводы

1. Определены значимые факторы риска неконтролируемого течения атопической бронхиальной астмы у детей: «раннее начало заболевания» (до 3 лет); отягощённый аллергологический анамнез - «аллергические заболевания у матери», «аллергические заболевания у бабушки/деда»; наличие коморбидной патологии - «атопический дерматит»; негативное влияние факторов окружающей среды - «избыточная сырость», «домашние животные», «коллекторы пыли», «курение мамы и папы»; социальные аспекты - «неполная семья», «один ребенок в семье», «низкий уровень материального дохода».

2. Выявлены иммунологические маркеры неконтролируемого течения атопической бронхиальной астмы у детей: снижение содержания Т-лимфоцитов с фенотипами CD3+, CD4+, CD8+, снижение показателя CD4+/ CD8+; увеличение концентрации общего IgE.

3. Доказана высокая диагностическая значимость повышения концентрации IL-4, IL-10, TNF-a в сыворотке крови при неконтролируемом течении АБА в сравнении с контролируемым течением, подтвержденная анализом точности метода с расчетом ДЧ, ДС, ДЭ, ПЦПР, ПЦОР, что позволяет рассматривать данные показатели в качестве маркеров неконтролируемого течения заболевания.

4. Установлена ассоциативная связь для С-590Т полиморфного локуса гена 1L4 с увеличением концентрации IL-4 в сыворотке крови и его прогностически неблагоприятная роль в течении атопической бронхиальной астмы у детей.

5. Определено, что присутствие полиморфного варианта промоторного региона гена С-592А ILIO ассоциировано с уменьшением концентрации IL-10 в сыворотке крови (р=0,037), определено, что генотип С/А является прогностически благоприятным фактором в формировании характера течения атопической бронхиальной астмы у детей.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Определены факторы риска формирования неконтролируемого течения бронхиальной у детей, представлены конкретные данные об их взаимосвязи с неконтролируемым течением АБА, что позволяет разработать комплекс мер первичной профилактики. Врачам-педиатрам и аллергологам рекомендуется проводить комплекс мероприятий по пропаганде устранения факторов риска, определяющих прогноз атопической бронхиальной астмы у детей с позиции контроля над заболеванием: создание оптимального микроклимата в помещении, где проживает ребенок, отказ от курения.

2. Высокая диагностическая значимость маркеров неконтролируемого течения АБА, 1Ь-4, 1Ь-10, ЮТ-а в сыворотке крови позволяет рекомендовать их назначение в качестве дополнительного диагностического теста при неконтролируемой АБА.

3. На этапах стационарной помощи рекомендуется проведение иммунологического обследования детей больных атопической бронхиальной астмой для выявления клеточных и гуморальных предикторов неконтролируемого течения заболевания.

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Особенности социального статуса семей детей с тяжелой не контролируемой бронхиальной астмой / С. В. Бычковская, Н. А. Ильенкова, С. В. Смирнова, О. С. Тютина // Дни иммунологии в Сибири : матер. Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. - Красноярск : КрасГМУ, 2010. - С. 287-288.

2. Особенности преморбидного статуса у детей с тяжелой не контролируемой бронхиальной астмой / С. В. Бычковская, Н. А. Ильенкова,

С. В. Смирнова, О. С. Тютина // Актуальные проблемы медицины : матер. 13-й межрегион, науч.-практ. конф. с междунар. участием. - Абакан, 2010. - С. 401-402.

3. Вакцинация детей с аллергическими заболеваниями / Н. А. Ильенкова, О. С. Тютина, С. В. Бычковсая (и др.) // Актуальные вопросы педиатрии : матер, краевой науч.-практ. конф. - Красноярск : Новые компьютерные технологии, 2011.-С. 74-79.

4. Неотложная помощь при бронхообструктивном синдроме / Н. А. Ильенкова, О. С. Тютина, С. В. Бычковсая (и др.) // Актуальные вопросы педиатрии : матер, краевой науч.-практ. конф. - Красноярск : Новые компьютерные технологии, 2011. - С. 80-84.

5. Особенности системной концентрации цитокинов при атопической бронхиальной астме в зависимости от уровня контроля над заболеванием у детей / О. С. Тютина, С. В. Смирнова, М. В. Смольникова, Н. А. Ильенкова // Актуальные проблемы медицины : матер. 15-й межрегион, науч.-практич. конф. с междунар. участием. - Абакан, 2012. - С.159-160.

6. Тютина, О. С. Изменение параметров иммунного статуса и цитокинового спектра при контролируемой/неконтролируемой атопической бронхиальной астме у детей / О. С. Тютина, С. В. Смирнова, М. В. Смольникова //Актуальные вопросы охраны здоровья населения регионов Сибири : матер. 10-й межрегион, науч.-практич. конф. молодых ученых с междунар. участием. - Красноярск, 2012. - С. 63-64.

7. Характер течения атопической бронхиальной астмы у детей в зависимости от уровня контроля над заболеванием / О. С. Тютина, С. В. Смирнова, М. В. Смольникова, Н. А. Ильенкова // Актуальные вопросы охраны здоровья населения регионов Сибири : матер. 10-й межрегион, науч.-практич. конф. молодых ученых с междунар. участием. - Красноярск, 2012. -

С. 106-107.

8. Клинико-иммунологические особенности атопической бронхиальной астмы в зависимости от уровня контроля над заболеванием у детей / О. С. Тютина, С. В. Смирнова, М. В. Смольникова, Н. А. Ильенкова // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. - 2012. -Т. 85, №3. - Ч. 2. - С. 204-207.

9. Tyutina, О. Immunologic parameters at severe bronchial asthma in children of Krasnoyarsk territory (Siberia) / O. Tyutina, S. Smirnova, M. Smolnikova // 15th International Congress on circumpolar Health, 5-10 August, 2012. - Fairbanks,

2012.-p. 178.

10. Tyutina O., Smirnova S., Ilienkova N. Severe bronchial asthma in children of Krasnoyarsk territory: clinical anamnesis peculiarities / // 15th International Congress on circumpolar Health, 5-10 August, 2012. - Fairbanks, 2012. - p. 178

11. Tyutina, O. Anamnesis and clinical peculiarities of severe bronchial asthma in children / O. Tyutina, S. Smirnova, N. Ilienkova // Eur. Resp. J. - 2012. -Vol.40, Suppl. 56. - P. s 75.

12. Полиморфизм генов цитокинов (IL4, IL10) и особенности иммунного реагирования в зависимости от уровня контроля над течением атопической бронхиальной астмы у детей / М. В. Смольникова, С. В. Смирнова, О. С. Тютина, С. В. Бычковская // Рос. аллергол. журн. -

2013. - №. 2 - С. 35-39

13. Смольникова, М. В. Полиморфизм генов цитокинов при атопической бронхиальной астме / М. В. Смольникова, С. В. Смирнова, О. С. Тютина // Сибирское мед. обозрение. - 2013. - № 2. — С. 3-6.

14. Астматический статус у ребенка 10 лет / О. С. Тютина, Н. А. Ильенкова, С. В. Смирнова (и др.) // Врач скорой помощи. - 2013. - №. 5 -С. 37-40.

15. Анамнестические аспекты формирования неконтролируемого течения атопической бронхиальной астмы у детей / О.С. Тютина, Н.А. Ильенкова, C.B. Смирнова, C.B. Бычковская // Актуальные проблемы медицины: материалы 16-й межрегиональной научно-практической конференции с международным участием.- Абакан, 2013.- С.147-152.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АБА - атопическая бронхиальная астма ФР - факторы риска

КАБА - контролируемое течение атопической бронхиальной астмы НАБА - неконтролируемое течение атопической бронхиальной астмы CD3+ - Т-лимфоциты CD4+ - Т-хелперы

CD8+ - Т - цитотоксические/супрессоры Ig Е, А, М, G - иммуноглобулины Е, А, М, G IL - интерлейкин Th - Т-хелперы

TNF - а - фактор некроза опухоли а

Подписано в печать 19.04.2013. Печать ризограф. Бумага офс. 80 гр/м2 Формат 84х108'/32 Усл. печ. л. 1,62. Тираж 100 экз. Заказ № 391 Отпечатано в типографии ООО «Версо». 660079, г. Красноярск, ул. А. Матросова, ЗОк. Тел.: 235-05-89, 235-04-89.