Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Влияние нацеленного на митохондрии производного пластохинона на развитие новообразований, показатели биологического возраста и продолжительность жизни у мышей

На правах рукописи

ЮРОВА Мария Николаевна

4858691

ВЛИЯНИЕ НАЦЕЛЕННОГО НА МИТОХОНДРИИ ПРОИЗВОДНОГО ПЛАСТОХИНОНА НА РАЗВИТИЕ НОВООБРАЗОВАНИЙ, ПОКАЗАТЕЛИ БИОЛОГИЧЕСКОГО ВОЗРАСТА И ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ЖИЗНИ

У МЫШЕЙ

14.01.12 - онкология 14.01.30 - геронтология и гериатрия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 3 ноя 2011

Санкт-Петербург - 2011

4858691

Работа выполнена в ФГБУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова» Минздравсоцразвития России

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Лнисимов Владимир Николаевич Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Иванов Вадим Александрович доктор биологических наук, профессор Арутюнян Александр Вартанович

Ведущее научное учреждение:

Учреждение Российской академии наук «Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова» РАН

Защита диссертации состоится 2011г. в часов на

заседании диссертационного совета Д208.052.01 при ФГБУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова» Минздравсоцразвития России по адресу: 197758, Санкт-Петербург, Песочный-2, ул. Ленинградская, д. 68.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова» Минздравсоцразвития России (197758, Санкт-Петербург, Песочный-2, ул. Ленинградская, д. 68) и на сайте http://www.niioncologM.ru с 4 октября 2011 г.

Автореферат разослан октября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Бахидзе Е.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

В связи с глобальным постарением населения и связанным с ним увеличением заболеваемости злокачественными новообразованиями [Напалков Н.П., 2004] ключевое значение имеет проблема профилактики и предупреждения преждевременного старения и развития ассоциированной с возрастом патологии.

Существует много теорий происхождения рака и развития возрастных изменений в организме [Анисимов В.Н., 2008]. Согласно свободно-радикальной теории, в механизмах старения и ассоциированных с ним заболеваний, включая рак, важную роль играет возрастное накопление окислительных повреждений макромолекул свободными радикалами [Harrnan D., 1956; 1994; Эмануэль Н.М, 1975; Cutler R., 1991; Shigenaga M.K. et al., 1994]. Известно, что свободные радикалы, в частности, активные формы кислорода (АФК) образуются и накапливаются преимущественно в митохондриях. Поэтому перспективным направлением в разработке геропротекторов является использование антиоксидантов, способных целенаправленно проникать внутрь митохондрий, аккумулироваться там и снижать уровень свободно-радикальных процессов [Северин С. Е. и др., 1970; Murphy М.Р., 2001; Skulachev V.P., 2007].

Нацеленные на митохондрии антиоксиданты, такие как MitoQ (на основе убихинона) и MitoVitE (на основе модифицированного витамина Е), уже в микромолярных концентрациях селективно блокируют окислительные повреждения митохондрий и предотвращают апоптоз, индуцируемый перекисью водорода [Tauskela J.S., 2007]. Однако установлено, что разница между концентрациями данных веществ, оказывающих антиоксидантный и прооксидантный эффект, очень мала [Doughan A.K. et al., 2007].

Для снижения риска прооксидантной активности было предложено использовать пластохинон вместо убихинона. Синтезированная молекула ЮЕ(б'-пластохинонил) децилтрифенилфосфоний получила название SkQl [Skulachev V.P., 2007]. Была выявлена хорошая проницаемость SkQl через фосфолипиды мембраны; большая антиоксидантная и меньшая прооксидантная активность, по сравнению с аналогичным препаратом на основе убихинона (MitoQ). Предполагается, что SkQl, инактиви-

руя АФК внутри митохондрии, может замедлять развитие программы старения [Skulachev V.P., 2007].

SkQl тормозил проявление признаков старения и увеличивал продолжительность жизни грибов (P. ansertna), ракообразных (С. affinis), насекомых {D. melanogaster) [Анисимов В.Н. и др., 2008], рыб (N. funzeri) и млекопитающих (мутантных по мтДНК мышей, нокаутных р53"'" мышей, крыс OXYS) [Skulachev M.V. et al., 2011]. Поэтому необходимо дальнейшее исследование геропротекторных свойств SkQl в эксперименте.

Старение связано также с возрастными изменениями регуляторных систем организма - нейроэндокринной и иммунной. Согласно элевацион-ной теории старения В.М. Дильмана [Дильман В.М., 1987], у высших организмов с возрастом повышается порог чувствительности гипоталамуса к регуляторным гомеостатическим сигналам, что приводит к развитию метаболических нарушений, повышающих вероятность злокачественной трансформации клетки и способствующих возникновению рака.

Этот процесс может тормозиться при введении веществ, способных повышать чувствительность тканей к инсулину, улучшать толерантность к углеводам и снижать уровень липидов. В ряде опытов на различных линиях мышей (SHR, HER-2/neu, NMRI и др.) было показано, что антидиабетические бигуаниды (метформин, фенформин, буформин) оказывают выраженное геропротекторное действие и тормозят развитие спонтанных опухолей молочной железы [Anisimov V.N. et al., 2005; 2008; 2010]. Поэтому представляется перспективным исследование сочетан-ного воздействия препарата SkQl и метформина на процессы старения, продолжительность жизни и канцерогенез.

Использование геропротекторов предполагает их длительное введение. В связи с этим, актуальным является всестороннее изучение действия геропротекторных препаратов в эксперименте, позволяющее оценить их безопасность и влияние не только на старение, но и на развитие различных патологических процессов, включая опухоли [Анисимов В.Н., 2008].

В отделе канцерогенеза и онкогеронтологии ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздравсоцразвития России с этой целью используются аутбредные мыши SHR, инбредные мыши 129/Sv, а также трансгенные мыши HER-2/neu. У животных исследуются различные

показатели биологического возраста (масса и температура тела, количество потребляемого корма и воды, эстральный цикл, поведенческие реакции и внешние признаки старения), параметры продолжительности жизни, развитие опухолевой и неопухолевой патологии [Апштоу У.К е! а1, 2007].

Комплексное исследование показателей старения и канцерогенеза под воздействием направленного на митохондрии антиоксиданта 8кС>1 у аутбредных, инбредных, трансгенных мышей, а также сочетания 8кС)1 с метформином позволит оценить возможный геропротекторный и антиканцерогенный потенциал данного препарата.

Цель и задачи исследования

Цель исследования состояла в изучении действия препарата Бк(31 в различных дозах, а также его сочетания с метформином на показатели биологического возраста, продолжительность жизни, развитие опухолевой и неопухолевой патологии у самок мышей различных линий (БИЛ, 129/Яу и НЕ11-2/пеи).

В задачи исследования входило:

1. Оценить влияние 8к<31 в различных дозах на показатели биологического возраста у мышей аутбредной линии БНЯ, инбредной 129/8у и трансгенной НЕЯ-2/пеи.

2. Исследовать влияние различных доз 8к(31 на параметры продолжительности жизни и особенности популяционного старения у мышей трех линий.

3. Исследовать влияние 8к(21 на особенности спонтанного канцерогенеза у мышей различных линий.

4. Оценить влияние 5к(21 на развитие неопухолевой патологии у мышей трех линий.

5. Сравнить эффекты БкС^, антидиабетического бигуанида метфор-мина и их сочетания на старение, продолжительность жизни и развитие новообразований у мышей БНЫ.

Научная новизна исследования

1. Впервые проведено сравнительное исследование влияния длительного применения препарата 8кС>1 на показатели биологического возраста, продолжительность жизни и развитие спонтанных опухолей и

неопухолевых возрастных патологических процессов у мышей различных линий.

2. Впервые проведена сравнительная оценка влияния SkQl, метформина и их сочетания на параметры продолжительности жизни и спонтанного канцерогенеза у самок мышей SHR.

3. Впервые установлено наличие потенциального геропротектор-ного эффекта SkQl у самок мышей SHR и отсутствие токсического и канцерогенного эффекта длительного применения SkQl у самок мышей SHR, 129/Sv и HER-2/neu.

Научно-практическая ценность работы

Результаты имеют теоретическое и практическое значение. Полученные в результате исследования данные подтверждают представления о роли генерируемых в митохондриях свободных радикалов в механизмах канцерогенеза и старения, а также о значении системных изменений в этих процессах.

В практическом плане получены данные о безопасности длительного применения нацеленного на митохондрии пластохинона SkQl у мышей и наличии у SkQl геропротекторных свойств, что свидетельствует о перспективности дальнейших предклинических испытаний препарата для оценки его возможного применения с целью предупреждения преждевременного старения и развития ассоциированной с возрастом патологии, включая опухоли.

Основные положения, выносимые на защиту

1. При введении в дозах 0,5-2500 нмоль/кг/сутки SkQl тормозил возрастные изменения основных биомаркеров старения самок аутбредных мышей SHR, не влияя на старение инбредных мышей 129/Sv и трансгенных HER-2/neu.

2. Применение SkQl в дозах 0,5-50 нмоль/кг значительно (до 45%) увеличивало продолжительность жизни самок мышей SHR.

3. Длительное введение SkQl в широком диапазоне доз не оказывало влияния на спонтанный канцерогенез у мышей SHR, 129/Sv и HER-2/neu.

4. Введение препарата SkQl мышам SHR сопровождалось значительным снижением смертности от неопухолевой патологии преимущественно инфекционного характера.

5. Не выявлено аддитивного действия метформина при его сочетан-иом введении с SkQl на параметры продолжительности жизни, развитие опухолевой и неопухолевой патологии у самок мышей SHR.

Апробация диссертации

Основные результаты работы были представлены на отечественных и международных научных форумах: II международной конференции «Ионы Скулачева» (Суздаль, 2008); IV, V, VI Российских научных конференциях «Фундаментальная онкология. Петровские чтения» (Санкт-Петербург, 2008, 2009, 2010); II Санкт-Петербургском международном экологическом форуме «Окружающая среда и здоровье человека» (Санкт-Петербург, 2008); II международном форуме по нанотехнологиям «Роснанотех 2009» (Москва, 2009); международной конференции "From Homo sapiens to Homo sapiens liberales" (Москва, 2010); VII международной конференции по митохондриальной физиологии "The Many Functions of the Organism in our Cells" (Обергугль, Австрия, 2010).

Основные результаты и положения диссертационного исследования полностью отражены в публикациях.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 160 страницах, иллюстрирована 42 рисунками и 24 таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов исследования (глава 2), изложения результатов собственных исследований (глава 3), их обсуждения (глава 4), выводов и библиографического указателя, включающего 208 источников, в том числе 50 отечественных и 158 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. Опыты проводили на самках мышей низкораковой аут-бредной линии SHR (463 мыши), долгоживущей инбредной линии 129/Sv (156 мышей) и высокораковой гомозиготной трансгенной линии FVB/N, несущей ген HER-2/neu (200 мышей). Линии животных поддерживались в виде разводки в отделе канцерогенеза и онкогеронтологии НИИ

оикологии им. Н.Н. Петрова, что позволяло регистрировать дату рождения мышей.

Животных содержали в полипропиленовых клетках при стандартном режиме освещения (12 часов - свет, 12 часов - темнота) и температуре 22 ± 2°С. Они получали стандартный гранулированный корм для животных ГЖ-120 (производитель ООО «Лабораторкорм») и воду ad libitum.

В возрасте 2-х месяцев мыши каждой исследованной линии были рандомизированы по массе тела и разделены на подопытные и контрольные группы.

Схема экспериментов. В соответствии с задачами исследования было проведено 2 серии экспериментов.

В первой серии опытов на мышах-самках SHR, 129/Sv и HER-2/neu с целью исследования влияния различных доз препарата SkQl на особенности спонтанного канцерогенеза, показатели биологического возраста и продолжительность жизни животные подопытных групп ежедневно на протяжении всей жизни получали в качестве питья растворы SkQl (получен из Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ) в дозах 2500, 250, 50, 5 и 0,5 нмоль/кг/сутки (получены перерасчетом доз, примененных на других биологических объектах). Мыши в контрольных группах получали чистую питьевую воду.

Так, 200 мышей-самок трансгенной линии HER-2/neu были разделены на 4 подопытных группы (по 29-30 животных в каждой), получавших SkQl с питьевой водой в дозах 2500, 250, 50 и 5 нмоль/кг/сутки, и одну контрольную группу (82 мыши).

Самки мышей SHR были разделены на 4 группы по 50 животных в каждой. Животные 1-й, 2-й и 3-й групп получали SkQl в дозах 50, 5 и 0,5 нмоль/кг/сутки, соответственно. Четвертая группа являлась контролем.

Две подопытных группы мышей 129/Sv получали препарат SkQl в дозах 250 (40 мышей) и 5 нмоль/кг/сутки (51 мышь). Контрольная группа составила 65 животных.

Во второй серии экспериментов для сравнения действия SkQl, мет-формина (1,1-диметилбигуанид-гидрохлорид, фирмы MP Biomedicals, США) и их сочетания на старение, продолжительность жизни и развитие возраст-ассоциированной патологии мыши SHR были разделены на 4

группы. В контрольной группе находилось 100 мышей-самок; в подопытных группах, получавших раствор препарата SkQl в дозе 5 нмоль/кг/сутки - 55 мышей-самок; SkQl (5 нмоль/кг/сутки) в смеси с метформином (100 мг/кг) - 54 мыши; метформин (100 мг/кг) - 54 мыши.

Регистрируемые показатели. За животными вели ежедневное наблюдение на протяжении всей жизни. У всех животных оценивали показатели биологического возраста (динамику массы тела, потребления корма и жидкости, температуры тела, параметров эстральной функции и поведения), а также параметры продолжительности жизни, канцерогенеза и неопухолевой патологии.

Ежемесячно всех мышей взвешивали на электронных весах. Один раз в месяц, одновременно с взвешиванием мышей, производили определение суточного количества потребляемого корма из расчета массы съеденного корма в граммах на одну мышь. Также изучали количество выпитой воды и рассчитывали объем выпитой жидкости в миллилитрах на одну мышь в сутки.

Один раз в три месяца проводилось измерение ректальной температуры тела с помощью медицинского электротермометра (ТПЭМ-1). Поскольку температура тела может зависеть от фазы эстрального цикла, параллельно производилась оценка эстрального цикла.

Начиная с 3-мес. возраста, раз в три месяца в течение двух недель ежедневно цитологически исследовали содержимое влагалищных мазков. Определяли следующие параметры эстральной функции: длительность эстрального цикла, соотношение фаз эстрального цикла, рассчитывалось относительное число коротких (менее 5 дней) и длинных (более 7 дней) эстральных циклов, относительное число животных с регулярными и иррегулярными циклами.

У мышей SHR и 129/Sv в возрасте 12 и 15 месяцев проводили исследование двигательной активности в тесте «открытое поле» [Gould T.D., 2009]. Животные помещались по одному в круглую камеру диаметром 50 см, дно которой расчерчено на квадраты 5смх5см. В течение 10 минут наблюдали за перемещениями животного в «открытом поле» и фиксировали следующие параметры: (1) количество пересеченных квадратов поля (горизонтальная двигательная активность); (2) количество вертикальных стоек (вертикальная активность); (3) продолжительность реакции гру-минга (мордочки, тела, гениталий); (4) продолжительность реакции замирания. Для исключения ориентировочной реакции, связанной с запахами,

после каждого животного пол камеры протирали влажной тряпкой [Буреш Я. и др., 1991].

Также изучали поведение самок мышей SHR в условиях переменной стрессогенности (при свободном выборе комфортных условий), используя установку "приподнятый крестообразный лабиринт", которая позволяет оценить уровень тревожности животного (по предпочтению темноты/света, боязни высоты, выраженности и динамике поведения «выглядывания») [Warf A.A. et al., 2007]. Установка представляет собой крест с рукавами 30x7 см (2 открытых рукава с прозрачным дном и 2 закрытых темных рукава), приподнятый на высоту 50 см. В каждой группе тестировали по 4 самки в возрасте 20 месяцев. Животное помещалось центр установки, и наблюдение велось в течение 5 минут. Фиксировалось время нахождения в центре, в закрытых рукавах, количество переходов.

В возрасте 20 месяцев у мышей линии SHR (по 10 животных из каждой группы) проводилась оценка мышечной силы и физической утомляемости [Anisimov V.N. et al., 2001]. Для этого животных подвешивали на струну, натянутую на высоте 70 см, за передние лапки. Регистрировали время до момента падения и через 20 минут повторяли эксперимент. Учитывая вес подвешенных животных, вычисляли отношение массы мыши к продолжительности первого и второго подвешивания. Эти отношения расценивались как показатели мышечной силы, разницу между полученными показаниями рассматривали как показатель восстановления сил.

С целью регистрации возрастных изменений состояния волосяного покрова и вибрис, а также состояния позвоночника проводили регулярное наблюдение за стареющими мышами SHR и 129/Sv, их фотографировали, а павших мышей подвергали рентгенографии (аппарат EDR-750, Венгрия).

При наблюдении за животными регистрировали появление опухолей молочных желез и других видимых новообразований, а также других патологических изменений. Всю информацию заносили в индивидуальные карты. За ростом опухолей и другими патологическими изменениями следили до естественной гибели животного.

Оценивали динамику гибели животных, рассчитывали среднюю продолжительность жизни группы, медиану, максимальную продолжительность жизни и среднюю продолжительность жизни последних 10% выживших животных.

При расчете кинетических параметров популяционного старения

использовали модель Гомперца: s(x) =ежр Ь SteKpCctx> ~ 1]1,

где параметры а и ß связаны с популяционной скоростью старения и начальной силой смертности, соответственно. Для анализа выживаемости использовали метод Кокса [Сох D.R. et al., 1996].

Всех павших или подвергнутых эвтаназии в состоянии крайней слабости животных вскрывали. На аутопсии осматривали кожу и внутренние органы. Выявленные новообразования классифицировали согласно рекомендациям Международного агентства по изучению рака (МАИР) как «фатальные» (то есть, послужившие непосредственной причиной гибели животных) или как «случайные» (основной причиной гибели животных считали неопухолевую патологию) [Gart J.J. et al., 1986]. В индивидуальных картах на животное и соответствующих протоколах вскрытия, помимо основной причины смерти, всегда отмечали наличие сопутствующих заболеваний.

Все опухоли, а также основные внутренние органы (печень, почки, селезенку, легкие) и ткани с макроскопически выявленными изменениями фиксировали в 10% нейтральном формалине. После рутинной гистологической обработки ткани заливали в парафин. Гистологические срезы окрашивали гематоксилин-эозином и изучали микроскопически. Использовали гистологическую классификацию опухолей, предложенную МАИР [Turusov V., Mohr U., 1994]. Определяли следующие показатели канцерогенеза: сроки обнаружения первой опухоли, средний латентный период развития новообразований, общую частоту, размеры и множественность опухолей, частоту, а также сроки развития и размеры метастазов опухолей.

При статистической обработке результатов опытов применяли методы вариационной статистики с использованием пакетов статистических программ STATISTICA (7) и GraphPad Prism 5. Достоверность различий оценивали по критериям t Стьюдента, у?, точному методу Фишера, непараметрическому критерию Фридмана для ANOVA и log-rank тесту Ментеля-Хензеля [Гублер Е.В., 1978].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исследование влияния SkQl на старение, продолжительность жизни и развитие опухолевой и неопухолевой патологии у мышей SHR, 129/Sv и HER-2/neu.

В нашей работе, в целом, не обнаружено существенного влияния SkQl в дозах 0,5-2500 нмоль/кг/сутки на массу тела и потребление корма у самок мышей линии SHR, 129/Sv и HER-2/neu. На ранних сроках эксперимента было отмечено снижение (на 16%-30%, р<0,05) количества потребляемого корма и соответственное незначительное снижение массы тела (на 3%-12%, р<0,05) под воздействием низких (5 и 50 нмоль/кг/сутки) доз SkQl у мышей трансгенной линии HER-2/neu, но в старших возрастах данные различия нивелировались, что может свидетельствовать о случайном характере выявленных изменений.

При анализе потребления жидкости не было выявлено значительного влияния SkQl на этот показатель у мышей SUR и HER-2/neu, однако у мышей 129/Sv введение SkQl в дозах 5 и 250 нмоль/кг/сутки увеличивало среднесуточное потребление жидкости на протяжении большей части жизни животных. Подобное явление, возможно, связано со спецификой данной линии животных и требует дальнейшего изучения. Влияния исследованных доз SkQl на температуру тела мышей трех линий выявлено не было.

Таким образом, отсутствие существенного влияния исследованных доз SkQl на динамику массы и температуры тела, потребление корма и жидкости свидетельствует об отсутствии токсического эффекта длительного применения препарата у самок мышей трех линий. Согласно литературным данным, не удалось также выявить токсических эффектов при пожизненном введении SkQl мухам, рыбам, а также беспородным, нокаутным (р53*'"), мутантным (по мтДНК) мышам [Анисимов В.Н. и др., 2008в; Nedergaard J. et al., 2010; Skulachev M.V. et al., 2011].

При анализе возрастной динамики репродуктивной функции у контрольных самок мышей аутбредной, инбредной и трансгенной линий с возрастом наблюдалось увеличение продолжительности эстрального цикла, преимущественно за счет увеличения доли длинных (более 7 дней) циклов, и увеличение относительной доли мышей с иррегулярными циклами, что согласуется с данными литературы [Анисимов В.Н., 2003; Пискунова Т.С. и др., 2007]. Влияние SkQl на репродуктивную функцию зависело от линии мышей и дозы препарата. SkQl препятствовал разви-

тию возрастных нарушений эстральной функции, выражавшихся в нарастании продолжительности эстрального цикла и увеличении относительного числа мышей с иррегулярными циклами, при введении в дозах 0,5 -250 нмоль/кг/сутки - у самок мышей SHR и 129/Sv (рис.1) и в дозах 2502500 нмоль/кг/сутки - у самок мышей HER-2/neu.

"О" контроль 5 нмоль/кг 250 нмоль/кг 129/Sv

ь b 1$

У У "'"'^■■ixfc-.,. /уГ Í

9 12 15 возраст, мес

12 15 18 возраст, мес

Рис. 1. Возрастная динамика частоты иррегулярных эстральных циклов у самок мышей SHR (слева) и 129/Sv (справа) в опытах с SkQl в дозах 0,5250 нмоль/кг/сутки. Различия с контрольной группой статистически достоверны (р<0,05) в группах: а- 50 нмоль/кг, b - 5 нмоль/кг, с- 0,5 нмоль/кг.

У трансгенной линии мышей, получавших SkQl в дозах 5 и 50 нмоль/кг/сутки, отмечено увеличение частоты иррегулярных циклов в возрасте 6 мес. Полученные нами данные о торможении возрастного выключения репродуктивной функции под влиянием SkQl согласуются с результатами опытов на мутантных по мтДНК мышах, у которых применение SkQl (700-1000 нмоль/кг/сутки) с питьевой водой увеличивало регулярность эстральных циклов [Nedergaard J. et al., 2010].

В тесте «открытое поле» было выявлено возрастное снижение двигательной и локомоторной активности у контрольных животных SHR и 129/Sv, что согласуется с литературными данными, полученными в опытах с крысами Вистар и OXYS [Stefanova N.A. et al., 2010]. Под влиянием SkQl (5 и 250 нмоль/кг/сутки) двигательная активность (оцениваемая по количеству пересеченных квадратов поля и выполненных вертикальных стоек) значительно снижалась (на 23-61%) по сравнению с контролем у мышей обеих линий. Также обнаружено усиление утомляемости и снижение выносливости 20-мес. мышей SHR в тесте с подвешиванием на струне. При исследовании в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» не обнаружено влияния SkQl (0,5-50 нмоль/кг/сутки) на уровень

11

тревожности мышей SUR. В опытах на крысах OXYS и Вистар при введении SkQl (в дозе 250 нмоль/кг/сутки) в возрасте 3 и 14 мес. уровень локомоторной и исследовательской активности в тесте «открытое поле» увеличивался, а уровень тревожности в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» снижался [Stefanova N.A. et al., 2010]. Аналогичные данные о повышении уровня двигательной активности получены у мышей C57BL/6 3- и 24-мес. возраста под воздействием ненацеленного на митохондрии коэнзима Q10 [Sinatra D.S. et al., 2003]. Отличие наших результатов от данных литературы может объясняться видовыми, линейными и тендерными особенностями используемых животных, а также различием выбранных возрастных интервалов [Михеев В.В. и др., 2009].

У самок мышей SHR, получавших SkQl в дозах 0,550 нмоль/кг/сутки, значительно тормозилось развитие таких внешних признаков старения, как облысение, потеря вибрис и кифоз. Аналогичные результаты были получены у мышей, мутантных по мтДНК, при дозе SkQl 700-1000 нмоль/кг/сутки [Nedergaard J. et al., 2010] и на модели ускоренного старения на мышах C57BL/6 при дозе SkQl 5 нмоль/кг [Skulachev M.V. et al., 2011]. В то же время у мышей линии 129/Sv в наших опытах не было выявлено действия SkQl на данные признаки.

За животными наблюдали до их естественной гибели, что позволило изучить выживаемость (рис. 2) и показатели продолжительности жизни. Средняя продолжительность жизни аутбредных мышей SHR была значительно больше (на 33-45%, р<0,05) у животных, получавших SkQl в дозах 0,5-50 нмоль/кг/сутки, без выраженной связи доза-эффект (табл.1). Оптимальной оказалась средняя доза (5 нмоль/кг/сутки). Эффект SkQl был наиболее выражен на ранних и средних этапах старения (медиана продолжительности жизни удваивалась), а максимальная продолжительность жизни увеличивалась в меньшей степени. Аналогичные тенденции были выявлены в опытах на грибах и беспозвоночных [Анисимов В.Н. и др., 2008].

У самок долгоживущей инбредной линии 129/Sv доза SkQl 5 нмоль/кг/сутки, наиболее эффективная для аутбредных мышей SHR, несколько уменьшала среднюю продолжительность жизни (на 6%) и продолжительность жизни последних 10% выживших животных (на 4%). В то же время, большая доза SkQl (250 нмоль/кг/сутки) не влияла на исследованные параметры продолжительности жизни мышей 129/Sv.

\ % \ HER-2/пеи

■ J0«ucxv.r \ V

Рис. 2. Динамика выживаемости самок мышей вНЯ. 129/8у и НЕЯ-2/пеи в опытах с 8к<31

Таблица 1

Показатели продолжительности жизни (сутки) у мышей трех линий в

Линия мышей Доза SkQl, Продолжительность жизни, сутки

нмоль/кг/ сутки средняя медиана последних 10% макс. НП

0 (контроль) 388±22 296 727±22,5 814 326±29,4

Pi 0,5 512±21,1* 524 785±6,9* 802 434±38,Г

(УЗ 5 559±22,7* 569 820 ±9,6* 835 507±41,7*

50 528±31,6* 552 824±13,Г 865 456±43,9*

> СУЗ с? 0 (контроль) 786±18,6 825 924±5,9 945 654±64,7

5 738±20,7" 776 890± 5,0* 905 623±54,2

(N 250 760±22,7 755 972±20,0 1009 600±90,5

3 0 (контроль) 283± 6,3 299 375 -

V с 5 286± 6,9 288 336±3,5 340 -

(N 50 293±9,0 298 359±10,5 380 -

Pi 250 291±8,3 288 340±0,5 340 -

щ 2500 295±9,5 309 363±6,0 380 -

НП~ продолжительность жизни мышей, павших от неопухолевой патологии Различие с контролем статистически достоверно: * - р<0,05

Введение БкС^ не влияло на выживаемость и продолжительность жизни мышей НЕЯ-2/пеи в дозах 5-2500 нмоль/ кг/сутки. Аналогичные случаи линейных различий в чувствительности мышей к геропро-текторам описаны в литературе [Ашнпоу У.К. е1 а!., 2005; 2008; 2010].

Анализ причин смерти мышей БШ. показал, что 8кС>1 продлевал жизнь животных, в основном, благодаря снижению уровня смертности от неопухолевой патологии, преимущественно, инфекционного характера, таких как пневмония, гепатит, нефропатия, колит и др. (до 56% при дозе 8к<31 5 нмоль/кг/сутки) (табл. 1, рис.3). Можно предполагать, что 8к<31 частично предотвращал снижение функции иммунной системы с возрастом. Данное предположение согласуется со сведениями о торможении ассоциированного с возрастом угасания иммунной системы, полученными в опытах на мышах и крысах ОХУЗ под воздействием 8кСИ

Рис. 3. Возрастная динамика смертности мышей 8Ж от неопухолевой патологии в опытах с БкСН

При аутопсии животных обнаруживали опухоли молочной железы, легких, печени, матки и других органов разнообразного гистологического строения, а также злокачественные лимфомы (рис. 4).

Анализ параметров канцерогенеза у мышей-самок 8НЯ показал, что большинство новообразований (14-33%) составили опухоли молочной железы, являвшиеся преимущественно одиночными (табл.2). Все исследованные гистологически опухоли молочной железы представляли собой аденокарциномы различного строения, чаще - лобулярного, реже -папиллярного или солидного. У части мышей с аденокарциномами молочной железы (15-45%) в легких были обнаружены метастазы этих опухолей.

Таблица 2

Сведения о частоте и сроках развития опухолей у мышей-самок БНЯ в опытах с БкС}!

Показатели контроль Суточная доза БкС}!, нмоль/кг

50 5 0,5

Общее количество мышей с опухолями (СЛП) 68% (568±27,7) 61% (610±21,9) 55% (573±26,8) 56% (581±31,2)

Локализация опухолей:

Аденокарцинома молочной железы 14% (575±58,2) 33% (532±39,0.) 29% (513±28,7) 28% (542±38,6)

Злокачественная лимфома 23% (585±42,5) 17% (653±56,2) 14% (556±41,6) 10% (621±51.9)

Опухоль легкого 9% (591±134) 8% (651±112,4) 14% (685±62,2) 13% (648±59,2)

Прочие 24% (519±58,5) 23% (666±28,4) 2% (768) 3% (528)

СЛП - средний латентный период развития опухолей, сутки

В скобках - СЛП опухолей данной локализации, сутки

Второй по частоте группой опухолей являлись злокачественные лимфомы (10-23%). При гистологическом исследовании отмечали диффузную и очаговую инфильтрацию опухолевыми клетками различных органов, в том числе печени. Среди других типов опухолей были обнаружены: аденомы и аденокарциномы легких; сосудистые опухоли печени (гемангиомы и гемангиокарциномы); сосудистые новообразования яичника (кавернозные гемангиомы) и новообразования кожи (папилломы).

Суммарная частота опухолей не менялась у мышей БНЯ, получавших 5к<31, по сравнению с контролем. Отмечена тенденция к незначительному (р>0,05) повышению частоты развития опухолей молочной железы. При введении 8кС}1 в дозах 50, 5 и 0,5 нмоль/кг/сутки она составила 28%, 29%, 33% (в контроле - 14%). Возможно, это являлось следствием продления регулярности эстральной функции под действием Бк(}1 у стареющих самок. У мышей контрольной группы аденокарциномы молочной железы развивались реже, вероятно, благодаря более раннему выключению репродуктивной функции при старении [Берштейн Л.М., 2004; 2010]. Смертность от прочих новообразований (лимфом, опухолей легких, яичников, печени, кожи) не отличалась от контроля в группах мышей БНЯ, получавших БкСИ.

Рис. 5. Основные типы выявленных новообразований у мышей. А - аденокарцинома молочной железы папиллярного строения; В - солидный рак молочной железы; С - метастазы аденокарциномы молочной железы в легкое; Э - злокачественная лимфома, опухолевые инфильтраты в печени; Е -гепатоцеллюлярная карцинома; Б - гемангиоэндотелиома матки. Гематоксилин-эозин. Ув.100.

Влияние на развитие спонтанных опухолей изучалось нами

также на мышах трансгенной линии НЕЯ-2/пеи, основной причиной гибели которых являются аденокарциномы молочной железы. При микроскопическом исследовании опухоли молочной железы имели разнообразное гистологическое строение. Участки с дольчатой структурой состояли преимущественно из очагов солидного рака, в отдельных случаях с развитой гиалинизированной стромой. Участки кистозного строения перемежались с очагами папиллярной и тублуляр-ной карциномы. В целом, отмеченная полиморфная картина соответствовала аденокарциномам типа В. Метастазы опухолей молочной железы в легкие имели, в основном, солидное и кистозное строение, соответствующее первичным опухолевым очагам.

В дозах 5-250 нмоль/кг/сутки БкС>] не оказывал существенного влияния на параметры канцерогенеза трансгенных мышей НЕК-2/пеи (табл. 3). Применение 8кС>1 в дозе 2500 нмоль/кг/сутки замедляло (р=0,004) динамику развития опухолей молочной железы у самок мышей НЕК-2/пеи. Это может свидетельствовать о том, что 8к(}1 в исследованных дозах не ослаблял противораковую защиту организма [Анисимов В.Н. и др., 2008; ЗЫасЬеу М.У. а а!., 2011].

Таблица 3

Сведения о развитии опухолей у мышей-самок НЕ11-2/пеи в опытах с БкС}! _

Показатели контроль Суточная доза 5к<31, нмоль/кг

5 50 250 2500

Количество мышей с ОМЖ' 100% 100% 100% 100% 100%

Срок обнаружения 1 -й ОМЖ (сутки) 154 157 178 161 142

Средний латентный период развития ОМЖ (сутки) 200± 2,5 191± 3,0* 203± 4,8 190± 3,9 218± 6,2*

Среднее число опухолей/ мышь 7±0,2 7±0,3 6±0,4 7±0,6 6±0,4

Средний размер опухолей (см) 1,7± 0,03 1,7± 0,05 1,7± 0,05 1,6± 0,05 1,8± 0,06

Число мышей с метастазами ОМЖ в легкое 64% 63% 70% 45% 73%

ОМЖ- опухоль молочной железы

Различие с контролем статистически достоверно: * - р<0,05

Анализ основных причин гибели мышей \29ISv показал, что большая часть животных (77-80%) погибала от опухолевой патологии

(табл.4), что соответствует литературным данным [Пискунова Т.С. и др., 2007]. Большую часть новообразований составили сосудистые опухоли матки, имевшие вид, преимущественно, множественных опухолевых узлов часто с геморрагическим содержимым (кавернозные гемангиомы и гемангиоэндотелиомы).

Таблица 4

Сведения о развитии опухолей у мышей-самок 129/8у в опытах с БкСН

Показатели контроль Суточная доза БкС}!, нмоль/кг

5 250

Количество мышей с опухолями (СЛП) 80% (823,7±11,9) 77% (773,6± 18,3*) 77% (768,2±20,8)

Локализация опухолей:

Сосудистая опухоль матки 80% , (816±14,6) 67% (787±18,8) 68% (786±24,4)

Сосудистая опухоль яичника 10% (835±45,1) 6% (747±56,3) 13% (757±38)

Опухоль легкого 8% (780±49,2) 8% (788±34,5) 8% (719±Г45)

Опухоль печени 5% (851±40) 2% (541) 5% (807±152)

Прочие 2% (898) 2% (750) 5% (782±39,5)

СЛП - средний латентный период развития опухолей, сутки В скобках - СЛП опухолей данной локализации, сутки Различие с контролем статистически достоверно: * - р<0,05

Вторую по частоте группу новообразований составили опухоли яичников, часто сочетавшиеся с новообразованиями матки, представлявшие собой в большинстве случаев гранулезоклеточные опухоли и гемангиомы. Также в ряде случаев были выявлены опухоли легких (аденомы и аденокарциномы), печени (гемангиоэндотелиомы, гемангиомы и гепатоцеллюляриые карциномы). При анализе изменений параметров канцерогенеза у мышей 129/Бу под влиянием Бк(31 были выявлены следующие закономерности: частота развития опухолей не изменялась, однако средний латентный период обнаружения опухолей незначительно (на 6%), хотя и статистически достоверно (р<0,05), сокращался при дозе БкС^ 5 нмоль/кг/сутки. При этом частота и сроки обнаружения опухолей отдельных локализаций у мышей, получавших 8кС>1, существенно не отличались от контрольных. Возможно, основная причина отсутствия влияния исследованных доз препарата на продолжительность жизни мышей 129/5у заключается в характеризующей линию высокой частоте развития новообразований,

тогда как 8кС?1 оказывает большее влияние на развитие неопухолевой патологии. Так, в хронических опытах добавление в пищу мышам другой инбредной линии С57ВЬ/6 ненацеленного на митохондрии коэнзима <310 в микромолярных концентрациях не влияло на смертность и продолжительность жизни животных [8оЬа111.8. с1 а1., 2006].

Исследование влияния сочетания Бк(21 и метформина на старение, продолжительность жизни, развитие опухолевой и неопухолевой патологии у мышей 51Ш

Во второй серии экспериментов нами было сопоставлено влияние на изучаемые параметры 8кС}1 (в наиболее эффективной по результатам первой серии опытов и литературным данным дозе 5 нмоль/кг/сутки) [БкиксЬеу М.У. е1 а1., 2011], антидиабетического препарата метформина, а также сочетания этих препаратов у мышей 8НЯ.

Как и в первой серии, не было выявлено влияния 8кС>1 на динамику массы тела, количество потребляемого корма и жидкости у мышей 8НЯ. Не было обнаружено изменений в данных показателях у самок мышей 8ЬЖ под действием метформина и его сочетания с БкС)1. Введение метформина приводило к снижению температуры тела, что отразилось и на эффекте сочетанного раствора препаратов.

При анализе действия препаратов на репродуктивную функцию, было показано протективное действие 8кр1, что соответствует данным, полученным в 1-й серии опытов, метформина и их сочетания. Так, замедлялось возрастное увеличение длительности циклов и доли иррегулярных циклов. Не было выявлено усиления эффекта при сочетанном действии двух препаратов.

В тесте «открытое поле» отмечено, что сочетание с метформином нейтрализовало угнетающее действие 8кС)1 па горизонтальную двигательную активность. В ряде других работ, показана нейропротекторная активность метформина [Анисимов В.Н. 2008].

В отличие от первой серии опытов, во второй не было выявлено влияния Бк(31 в дозе 5 нмоль/кг/сутки на выживаемость и параметры продолжительности жизни мышей (табл. 5). Анализ причин смерти мышей 8Ш показал, что 8к(}1 во 2-й серии опытов не оказывал влияния на смертность от неопухолевой патологии, что, возможно, связано с биологической вариабельностью аутбредных мышей БНЯ, отражающейся на их чувствительности к действию геропротекторов. Также не обнаружено

существенного влияния 8кС>1, метформина и их сочетания на параметры канцерогенеза у самок мышей БНЯ. Аналогичные данные были получены в других экспериментах с метформином [Ашб^оу У.К е1 а1„ 2011].

Таблица 5

Показатели канцерогенеза и продолжительности жизни (сутки) у мышей БШ в опытах с БкСН (5 нмоль/кг/сутки) и метформином (100 мг/кг)

Показатели Контроль 8к01+МФ МФ

средняя 559 548±30,1 591±28,9 583±26,7

к а медиана 591 586 615 617

& последних 10% 892±12,4 858±14,6 922±10,6 # 897±27,8

* макс. 941 885 948 972

из НП 536±38,1 542±45,2 595±52,3 577±44,3

Общее количество 59% 50% 60% 54%

мышей с опухолями (584±22,5) (575±36,4) (592±29,1) (590±31,3)

(СЛП)

Локализация опухолей:

опухоль молочной 42% 39% 33% 48%

железы (546±24,9) (558±40,7) (537±35,5) (585±35,3)

злокачественная 7% 9% 13% 4%

лимфома (699±39,9) (645±107) (632±38,5) (650±3,5)

опухоль легкого 4% 2% 4% -

(570±15,0) (601) (628±101,5)

прочие 7% - 8% 2% (589)

(655±82,0) (644±101,2)

ПЖ - продолжительность жизни; МФ - метформин;

НП - продолжительность жизни мышей, павших от неопухолевой патологии; СЛП- средний латентный период развития опухолей, сутки В скобках - СЛП опухолей данной локализации, сутки * - различие статистически достоверно по сравнению с группой, получавшей Бк(21, р<0,05

Результаты наших экспериментов не позволяют определенно судить о целесообразности совместного применения нацеленного на митохондрии антиоксиданта БкСН и антидиабетического бигуанида метформина.

В целом, суммируя собственные и литературные данные об эффекте БкС)1, можно прийти к заключению о том, что, судя по большинству исследованных биомаркеров старения, 8к(}1 тормозит этот процесс. Однако, между эффектами ЭкСН на отдельные биомаркеры, корреляции установить не удалось. Не отмечено также корреляции между изменениями биомаркеров и продолжительности жизни (р>0,05).

20

При изучении влияния на продолжительность жизни мышей

трех линий мы впервые выявили геропротекторную активность препарата 8к<21 (наиболее выраженную при дозе 5 нмоль/кг/сутки) у самок аутбредной линии мышей БНЯ и отсутствие у препарата токсичного и канцерогенного эффекта в диапазоне доз 0,5-2500 нмоль/кг/сутки при длительном применении. Следует отметить, что модели старения на аут-бредных линиях мышей, в отличие от инбредных и генетически модифицированных, вследствие их большей генетической гетерогенности, наиболее полно соответствуют нормальному старению у человека, что важно для экстраполяции полученных данных на человека [Анисимов В.Н., 2008].

Наши результаты согласуются с большинством экспериментальных работ, показывающих геропротекторную активность и отсутствие токсичности нацеленного на митохондрии антиоксиданта БкСН. Как отмечено выше, при введении БкСН в диапазоне доз 0,51000 нмоль/кг/сутки показано увеличение продолжительности жизни ряда видов беспозвоночных, а также млекопитающих - генетически модифицированных мышей [БкиксЬеу М.У. е1 а1., 2011]. Геропро-текторный эффект 8кС>1, полученный у мышей, мутантных по мтДНК [Кес)е^ааг<1 Д. е1 а1., 2010], и торможение развития признаков старения у крыс ОХУ8 [ОЬикЬоуа Ь.А. с! а1., 2009; Stefanova КА. Л а1., 2010] с повышенным уровнем окислительных повреждений подтверждают представления о роли генерируемых в митохондриях свободных радикалов в механизмах старения.

Таким образом, на основании имеющихся экспериментальных данных, можно сделать предположение о перспективности дальнейших предклинических испытаний нацеленного на митохондрии пластохинона 8к(}1 для оценки его возможного применения с целью предупреждения преждевременного старения и развития возраст-ассоциированных заболеваний, включая опухоли.

выводы

1. Длительное введение препарата БкС>1 в дозах 0,52500 нмоль/кг/сутки существенно не сказывалось на таких показателях биологического возраста, как динамика массы и температуры тела, количество потребляемого корма и жидкости, у мышей аутбредной БНИ., инбредной 129/Бу и трансгенной НЕК-2/пеи линии, что свидетельствует об отсутствии токсического эффекта препарата.

2. Введение Бк01 в дозах 0,5-2500 нмоль/кг/сутки замедляло развитие возрастных изменений репродуктивной функции, выражавшихся в нарастании длины циклов и увеличении доли мышей с иррегулярными циклами, у животных всех исследованных линий. У мышей БЫЛ БкСН в дозах 0,5-50 нмоль/кг/сутки существенно угнетал развитие внешних признаков старения (облысения, потери вибрис, развития кифоза).

3. Применение 8кС?1 в дозах 0,5-50 нмоль/кг/сутки значительно увеличивало выживаемость и параметры продолжительности жизни (ПЖ) аутбредных мышей: среднюю ПЖ - максимально на 45% (р<0,05); медиану - на 92% (р<0,05) при дозе БкСН 5 нмоль/кг/сутки; среднюю ПЖ последних 10% выживших - на 13% (р<0,05); максимальную ПЖ - на 6% при дозе 8кС>1 50 нмоль/кг/сутки. Введение БкС>1 не влияло на параметры ПЖ и выживаемость самок мышей инбредной и трансгенной линии.

4. При изучении спонтанного канцерогенеза у интактных самок мышей 8НЕ1 установлено, что у них развиваются преимущественно опухоли молочной железы (14%), злокачественные лимфомы (23%) и опухоли легких (9%). Длительное применение Бк01 в дозах 0,550 нмоль/кг/сутки несколько снижало общую частоту (68% и 55-61%, р>0,05) развития опухолей, но не оказывало влияния на их спектр. У интактных мышей 129/Бу спонтанно возникали, в основном, новообразования матки (80%), яичников (10%), легких (8%) и печени (5%). Бкр) дозах 5 и 250 нмоль/кг/сутки не влиял на частоту и спектр развившихся спонтанных новообразований.

5. У трансгенных мышей НЕ11-2/пеи спонтанные аденокарциномы молочной железы развивались в 100% случаев, в среднем в возрасте 67 мес. Применение 8к(}1 в дозах 5-250 нмоль/кг/сутки существенно не влияло (р>0,05), а в дозе 2500 нмоль/кг/сутки замедляло (р=0,004) динамику развития опухолей молочной железы у трансгенных мышей, несущих онкоген НЕЯ-2/пеи.

6. Введение SkQl сопровождалось значительным снижением смертности мышей SHRot неопухолевой патологии (пневмония, гепатит, нефропатия, колит и пр.), что проявлялось в уменьшении доли животных, основной причиной гибели которых была неопухолевая патология на 2540%, а также увеличении сроков их гибели на 33-56% (р<0,05).

7. При совместном применении SkQl и метформина у мышей SHR не выявлено их аддитивного эффекта в отношении параметров продолжительности жизни и канцерогенеза.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Юрова М.Н., Забежинский М.А., Пискунова Т.С., Попович. И.Г., Тындык М.Л., Анисимов В.Н. Влияние митохондриального антиоксиданта SkQl на старение, продолжительность жизни и спонтанный канцерогенез у мышей трех линий // Успехи геронтол. -2010. - Т. 23, №3-С. 430-441.

2. Анисимов В.Н., Бакеева Л.Е., Егормин П.А., Филенко О.Ф., Исакова Е.Ф., Манских В.Н., Михельсон В.М., Пантелеева A.A., Пасюкова Е. Г., Пискунова Т.С., Попович И.Г., Рощина Н.В., Рыбина О.Ю., Сапрунова В.Б., Самойлова Т.А., Семенченко A.B., Скулачев М.В., Спивак И.М., Цыбулько Е.А., Тындык М.Л., Высоких М.Ю., Юрова М.Н., Забежинский М.А., Скулачев В.П. Производное пластохинона, адресованное в митохондрии, как средство, прерывающее программу старения. 5. SkQl увеличивает продолжительность жизни и предотвращает развитие признаков старения // Биохимия. - 2008. - Т.73, №12. - С.1655-1670.

3. Anisimov V.N., Berstein L.M. Popovich I.G., Zabezhinski M.A., Tyndyk M.L., Egormin P.A., Piskunova T.S., Yurova M.N., Semenchenko A.V., Kovalenko I.G., Poroshina Т.Е. If started early in life, metformin increases life span and postpones tumors in female SHR mice // Aging (Albany, NY). - 2011. - Vol. 3(2). - P.148-157.

4. Юрова M.H., Пискунова T.C., Забежинский M.A., Попович И.Г., Тындык М.Л., Семенченко A.B., Скулачев В.П. Анисимов В.Н. Действие препарата SkQl на показатели биологического возраста и продолжительность жизни у самок аутбредных мышей SHR // Тезисы Росс. конф. по фундаментальной онкологии, апрель 2008 г. - Вопр. онкол. - 2008. - Т.54, № 2. - С.34-35.

5. Юрова М.Н., Пискунова Т.С., Забежинский М.А., Попович И.Г., Скулачев В.П., Анисимов В.Н. Действие препарата SkQl на старение, продолжительность жизни и канцерогенез у самок аутбредных мышей SHR // Вестник Рос. военно-мед. академии. - 2008. - Т.З, № 23,

23

приложение 2. - С. 477.

6. Юрова М.Н., Пискунова Т.С., Забежинский М.А., Попович, И.Г., Тындык M.JL, Семеиченко А.В., Скулачев В.П., Анисимов В.Н. Действие препарата SkQl на параметры продолжительности жизни и канцерогенеза у самок трансгенных мышей HER-2/neu // Тезисы Росс, конф. по фундаментальной онкологии, 17 апреля 2009 г. - Вопр. онкол. -2009. - Т. 55, № 2 (приложение). - С.41.

7. Юрова М.Н., Пискунова Т.С., Забежинский М.А., Попович И.Г., Тындык М.Л., Скулачев В.П., Анисимов В.Н. Действие антиоксиданта SkQl на старение, продолжительность жизни и канцерогенез у самок инбредных мышей 129/Sv // Тезисы Росс. конф. по фундаментальной онкологии, 16 апреля 2010 г. - Вопр.онкол. - 2010. - Т. 56, № 2 (приложение). - С.59-60

8. Yurova M.N., Piskunova T.S., Zabezhinski М.А., Anisimov V.N. Effect of SkQl on life span and spontaneous carcinogenesis in female mice of three various strains II International Workshop "From Homo sapiens to Homo sapiens liberatus", Moscow. May 25-26, 2010. - P. 11-12.

9. Yurova M.N., Piskunova T.S., Zabezhinski M.A., Popovich I.G., Tyndyk M.L., Skulachev V.P., Anisimov V.N. Effects of SkQl on life span and spontaneous carcinogenesis in mice // FEBS Workshop MiP 2010 -7th MiPconference Mitochondrial Physiology "The Many Functions of the Organism in our Cells", Obergurgl, Austria, 27.Sep -1. Oct. 2010. - P.91-92.

Юрова М.Н. Влияние нацеленного на митохондрии производного пластохинона на развитие новообразований, показатели биологического возраста и продолжительность жизни у мышей // Автореф. дис. ... канд. биол.наук: 14.01.12,14.01.30. - СПб., 2011. - 24 с._

Подписано в печать «05» октября 2011. Формат 60484 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Печ. л. 1,0.

_Тираж 100 экз. Заказ_ ■_

Отпечатано с готового оригинал-макета. ЗАО «Принт-Экспресс» 197101, С.-Петербург, ул. Большая Монетная, 5 лит. А.

В связи с глобальным постарением населения и связанным с ним увеличением заболеваемости злокачественными новообразованиями (Напалков Н.П., 2004), ключевое значение имеет проблема профилактики и предупреждения преждевременного старения и развития ассоциированной с возрастом патологии.

Существует много теорий' происхождения рака и* развития возрастных изменений в. организме (Анисимов В.Н., 2008). Согласно свободно-радикальной теории, в, механизмах старения и ассоциированных с ним заболеваний, включая рак, важную роль играет возрастное накопление окислительных повреждений макромолекул свободными радикалами, (НалпапБ., 1956; 1994; Эмануэль Н.М., 1975;СиИег К., 1991; 81%е^а М.К. е1 а1., 1994). Известно, что свободные радикалы, в частности, активные формы кислорода (АФК) образуются и накапливаются преимущественно в митохондриях. Поэтому, перспективным направлением в разработке геропротекторов является- использование антиоксидантов, способных целенаправленно проникать внутрь митохондрий, аккумулироваться, там и снижать уровень свободно-радикальных процессов (Северин С. Е. и др., 1970; МшрЬу М.Р., 2001; БкЫасЬеу У.Р., 2007).

Нацеленные на митохондрии антиоксиданты, такие как МйоС> (на основе убихинона) и МкоУ№ (на основе модифицированного витамина Е), уже в микромолярных концентрациях селективно блокируют окислительные повреждения митохондрий и предотвращают апоптоз, индуцируемый перекисью водорода (ТашкеЬ 1.8., 2007). Однако установлено, что разница между концентрациями данных веществ, оказывающими антиоксидантный и прооксидантный эффект, очень мала (Оои^ап А.К. а1., 2007).

Для снижения риска прооксидантной активности было предложено использовать пластохинон вместо убихинона. Синтезированная молекула 10Е(6'-пластохинонил) децилтрифенилфосфоний получила название SkQl (Skulachev V.P., 2007). Была выявлена хорошая проницаемость SkQl через фосфолипиды мембраны; большая антиоксидантная и меньшая прооксидантная активность, по сравнению с аналогичным препаратом- на основе убихинона (MitoQ). Предполагается, что SkQl, инактивируя АФК внутри митохондрии, может замедлять развитие программы старения* (Skulachev V.P., 2007).

SkQl тормозил проявление признаков старения и увеличивал продолжительность жизни грибов- (Р. anserinä), ракообразных (С. qffinis), насекомых (D. melanogaster) (Анисимов В.Н: и др., 2008), рыб (N.funzeri) и млекопитающих (мутантных по мтДНК мышей, нокаутных р53;/" мышей, крыс OXYS) (Skulachev M.V. et alc., 2011). Поэтому необходимо дальнейшее исследование геропротекторных свойств SkQl в эксперименте.

Старение связано также с возрастными изменениями регуляторных систем организма - нейроэндокринной и- иммунной; Согласно элевационной теории старения В.М. Дильмана (Дильман В.М., 1987), у высших организмов с возрастом повышается* порог чувствительности гипоталамуса к регуляторным гомеостатическим сигналам, что приводит к развитию метаболических нарушений, повышающих вероятность злокачественной трансформации клетки и способствующих возникновению рака.

Этот процесс может тормозиться при введении веществ, способных повышать чувствительность тканей к инсулину, улучшать толерантность к углеводам и снижать уровень липидов. В ряде опытов на различных линиях мышей (SHR, HER-2/neu, NMR Г и др.) было показано, что антидиабетические бигуаниды (метформин, фенформин, буформин) оказывают выраженное геропротекторное действие и тормозят развитие спонтанных опухолей молочной железы (Аш^тоу У.К й а1., 2005; 2008; 2010). Поэтому представляется перспективным исследование сочетанного воздействия препарата БкС)1 и метформина на процессы старения, продолжительность жизни и канцерогенез.

Использование геропротекторов предполагает их длительное введение. В связи с этим, актуальным является всестороннее изучение действия геропротекторных препаратов в эксперименте, позволяющее оценить их безопасность и влияние не только на старение, но и на развитие различных патологических процессов, включая опухоли (Анисимов В.Н., 2008).

В отделе канцерогенеза и онкогеронтологии ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздравсоцразвития России с этой целью используются аутбредные мыши БНЯ, инбредные мыши 129/8у, а также трансгенные мыши НЕ11-2/пеи. У животных исследуются различные показатели г биологического возраста (масса и температура тела, количество потребляемого корма и воды, эстральный цикл, поведенческие реакции и внешние признаки старения), параметры продолжительности жизни, развитие-опухолевой и неопухолевой патологии (АшБтоу У.К et а1., 2007).

Комплексное исследование показателей старения и канцерогенеза под воздействием направленного на митохондрии антиоксиданта 8кС>1 у аутбредных, инбредных, трансгенных мышей; а также сочетания БкСП с метформином позволит оценить возможный геропротекторный и антиканцерогенный потенциал данного препарата.

Цель и задачи исследования

Цель исследования состояла в изучении действия препарата 8кС>1 в различных дозах, а также его сочетания с метформином на показатели биологического возраста^ продолжительность жизни, развитие опухолевой и неопухолевой патологии у самок мьппей различных линий (8Ш1, 129/8у и НЕК-2/пеи).

В задачи исследования входило:

Г. Оценить влияние 8кС>1 в различных дозах на показатели биологического возраста у мышей аутбредной линии 8НЯ, инбредной 129/8у и трансгенной НЕЫ-2/пеи.

2. Исследовать влияние различных доз БкСН на параметры продолжительности жизни и особенности популяционного старения у мышей трех линий. ' ' .!

3. Исследовать влияние 8к(~)1 на особенности спонтанного канцерогенеза у мышей различных линий.

4. Оценить влияние 8кС>1 на развитие неопухолевой патологии у мышей трех линий.

5. Сравнить эффекты 8кС>1, антидиабетического бигуанида метформина и их сочетания? на старение, продолжительность жизни и развитие новообразований у мышей 8ИК.

Научная новизна исследования

1. Впервые, проведено сравнительное исследование влияния длительного применения препарата 8кС>1 на показатели биологического возраста, продолжительность жизни, развитие спонтанных опухолей и неопухолевых возрастных патологических процессов у мышей различных линий.

2. Впервые проведена сравнительная оценка влияния ЭкСИ, метформина и их сочетания на параметры продолжительности жизни и спонтанного канцерогенеза у самок мышей ЭНН.

3. Впервые установлено наличие потенциального геропротекторного эффекта 8к(^1 у самок мышей БНЫ и отсутствие токсического и канцерогенного эффекта длительного применения 8кС>1 у самок мышей 129/8 v и НЕ11-2/пеш

Научно-практическая ценность работы

Результаты имеют теоретическое и практическое значение. Полученные в результате исследования данные подтверждают представления1 о роли генерируемых в митохондриях свободных радикалов в механизмах канцерогенеза и старения, а также о значении системных изменений в этих процессах.

В практическом- плане получены- данные о безопасности длительного применения нацеленного на митохондрии пластохинона 8кС>1 у мышей и наличии у 8кС>1 геропротекторных свойств, что свидетельствует о перспективности дальнейших предклинических испытаний препарата для оценки его возможного применения с целью предупреждения преждевременного старения и развития ассоциированной с возрастом патологии, включая опухоли.

Основные положения, выносимые на защиту

1. При введении в дозах 0,5-2500 нмоль/кг/сутки 8кС>1 тормозил возрастные изменения основных биомаркеров- старения самок аутбредных мышей 8НЕ1, не влияя- на старение инбредных мышей 129/8у и трансгенных НЕК-2/пеи.

2. Применение 8кС>1 в дозах 0,5-50 нмоль/кг значительно (до 45%) увеличивало продолжительность жизни самок мышей 8НЯ.

3. Длительное введение SkQl в широком диапазоне доз не оказывало влияния на спонтанный канцерогенез у мышей SHR, 129/Sv и HER-2/neu.

4. Введение препарата SkQl мышам SHR сопровождалось значительным снижением смертности от неопухолевой патологии преимущественно инфекционного характера.

5. Не выявлено аддитивного действия метформина при его сочетанном введении с SkQl на параметры; продолжительности жизни, развитие опухолевой и неопухолевой патологии у самок мышей SHR.

Апробация диссертации

Основные результаты работы были представлены на отечественных и международных научных форумах: П международной конференции «Ионы Скулачева», (Суздаль, 2008);: IV, V, VI Российских научных конференциях «Фундаментальная онкология; Петровские чтения» (Санкт-Петербург, 2008, 2009, 2010); II Санкт-Петербургском международном экологическом форуме «Окружающая среда и здоровье человека» (Санкт-Петербург, 2008); II международном форуме по нанотехнологиям «Роснанотех 2009» (Москва, 2009); международной конференции "From. Homo sapiens to Homo sapiens liberates" (Москва; 2010); VII международной конференции по митохондриальной физиологии "The Many Functions of the Organism in our Cells" (Обергугль, Австрия, 2010). Основные результаты и положения диссертационного исследования полностью отражены в публикациях.

ВЫВОДЫ

1. Длительное введение препарата БкСН в дозах 0,5-2500 нмоль/кг/сУ1*1* существенно не сказывалось на таких показателях биологического возраста, как динамика массы и температуры тела, количество потребляемого кор]У1а и жидкости, у мышей аутбредной вНЯ, инбредной 129/Бу и трансгенной НЕ^ 2/пеи линии, что свидетельствует об отсутствии токсического1 эффекта препарата.

2. Введение 8к(^1 в дозах 0,5-2500« нмоль/кг/сутки замедляло разв#тие возрастных изменений репродуктивной функции, выражавшихся в нарастании длины циклов и увеличении доли мышей с иррегулярными ЦИКЛаГ^СИ' У животных всех исследованных- линий. У мышей. 8НИ. 8кС>1 в доза?с

50 нмоль/кг/сутки существенно угнетал развитие внешних признаков старенИЯ (облысения, потери вибрис, развития кифоза).

31 Применение 8к(21' в дозах 0,5-50 нмоль/кг/сутки значительно ув&11ичи вало выживаемость и параметры продолжительности жизни (ПЖ) мышей: среднюю ПЖ - максимально на 45% (р<0,05); медиану - на- 92/о (р<0,05) при дозе SkQl 5 нмоль/кг/сутки; среднюю ПЖ последний выживших - на 13% (р<0,05); максимальную ПЖ - на 6% при дозе-50 нмоль/кг/сутки. Введение SkQГ не влияло» на параметры выживаемость самок мышей инбредной и трансгенной линии.

4. При- изучении спонтанного канцерогенеза у интактных самок

8Ш1 установлено, что у них развиваются1 преимущественно оиуг:?сОЛИ молочной железы (14%), злокачественные лимфомы (23%) и опухоли л^:ГКИХ

9%). Длительное применение 8кС>1 в дозах 0,5-50 нмоль/кг/сутки нескк^-г1ЬКО не снижало общую частоту (68% и 55-61%, р>0,05) развития опухолей, оказывало влияния на их спектр. У интактных мышей 129/8у спон"^-^13110 возникали, в основном, новообразования матки (80%), яичников (10%), л<

8%) и печени (5%). SkQl дозах 5 и 250 нмоль/кг/сутки не влиял на частоту и спектр развившихся спонтанных новообразований.

5. У трансгенных мышей HER-2/neu спонтанные аденокарциномы молочной железы развивались в 100% случаев, в среднем в возрасте 6-7 мес. Применение SkQl в дозах 5-250 нмоль/кг/сутки существенно не влияло (р>0,05), а в дозе 2500 нмоль/кг/сутки замедляло (р=0,004) динамику развития опухолей молочной железы у трансгенных мышей, несущих онкоген HER-2/neu.

6. Введение SkQl сопровождалось значительным снижением смертности мышей SHR от неопухолевой патологии (пневмония, гепатит, нефропатия, колит и пр.), что проявлялось в уменьшении доли животных, основной причиной гибели которых была неопухолевая патология, на 25-40%, а также увеличении сроков их гибели на 33-56% (р<0,05).

7. При совместном применении SkQl и метформина у мышей SHR не выявлено их аддитивного эффекта в отношении параметров продолжительности жизни и канцерогенеза.

3.4.7. Заключение

Введение SkQl самкам мышей SHR тормозило развитие возрастных нарушений репродуктивной функции, угнетало двигательную активность животных в тесте «открытое поле», не оказывая- существенного влияния на другие маркеры старения, продолжительность жизни и канцерогенез.

Метформин снижал температуру тела, препятствовал возрастному угнетению астральной функции, не влиял на другие биомаркеры старения и несколько увеличивал продолжительность жизни, не оказывая существенного влияния на развитие опухолевой и неопухолевой патологии.

При совместном действии SkQl снижалась температура тела животных, тормозилось развитие возрастных нарушений астральной функции, сохранялась двигательная активность и увеличивалась продолжительность жизни. При этом не было выявлено значительного эффекта совместного применения препаратов на параметры канцерогенеза и развитие неопухолевои патологии.

ГЛАВА4

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

С возрастом постепенно увеличивается интенсивность продукции АФК в тканях организма (Скулачев В.П., 1997; Ога\уа Т., 1997; Бе ТУ^аШаеэ 1.Р. е1 а1.3 2006), снижается общая антиокислительная защита, и, таким образом, накапливаются продукты окислительного повреждения макромолекул, которые могут способствовать старению и.развитию опухолей (Лю Б.Н:, 2003; Бе М^аШаеБ 1.Р. & а1., 2006). Поэтому обоснованным является предположение, что антиоксидант 8кС>1, проникающий внутрь митохондрий, где генерируются АФК, способен-замедлять развитие программы старения (8ки1ас11еу У.Р., 2007; БкиксЬеу М.У. et а1., 2011).

В, последние годы установлено, что применение БкС)1 в дозах 0,55 - 1000 нмоль/кг/сутки увеличивает продолжительность жизни грибов; насекомых, рыб и мышей (мутантных по мтДНК и нокаутных р53-/-) (Анисимов В.Н. и др., 2008; БкиксЬеу М.У. ег а1., 2011), а также тормозит возникновение и рост опухолей (Агапова Л.С. и др., 2008) (табл. 24). Однако отсутствуют данные о влиянии БкС)1 на старение, продолжительность жизни и канцерогенез у мышей других линий.

Нами было произведено сравнительное исследование показателей гомеостаза и старения, продолжительности жизни и< развития спонтанных опухолей под воздействием 8к(^1 в диапазоне доз 0,5-2500 нмоль/кг/сутки у трех линий мышей-самок: аутбредных 81Ш, инбредных 129/8у и трансгенных НЕЫ-2/пеи (табл. 24).

Данные о влиянии различных доз БкСН на показатели биологического возраста, продолжительность жизни и развитие возрастной патологии у млекопитающих

Животные мыши крысы

Линия 129/8У НЕ11-2/пеи мтДНК1 С57ВЬ/6 р53 БТ2 Вистар ОХУ8

Доза 8кС>1 (нмоль/кг/сутки) 0,5 5 50 .5 250 5 50 250 2500 700-1000 5 5 5 250 250

Масса тела

Потребление корма — — 4 4 = =

Потребление жидкости ' = = = т 1 = = = ■ =

Температура тела = = =" = • = = ■ =. = ' =

Возрастные нарушения астральной функции 1 1 4 = = Т Т 4 4 4

Двигательная активность 1 4 4 4 4 ; Т т

Проявление внешних признаков старения 4 4- = = .4 4

Продолжительность жизни т Т Т 4 — ■ — Т 1

Канцерогенез = = = Т = = = : =- ■ .4. 4 4

Неопухолевая патология 1 4 4- , = = = ■ = = : =

Источник данных наши данные №:с1ег§аагс11. еЫ., 2010 • 8ки1асЬеу М.У. е|: а1.9 2011 Агапова Л.С. и др.,2008 81еГапоуа 1Ч.А. е1 а1., 2010 ю

- мтДНК - мыши с мутацией митохондриальной ДНК 2 - БТ- бестимусные мыши увеличение регистрируемого параметра снижение регистрируемого параметра = -нет существенного эффекта

Изучение процессов старения на протяжении всей жизни животных в хронических экспериментах подразумевает оценку биомаркеров старения.

Подобная оценка позволяет выявить факторы, способствующие преждевременному и/или ускоренному старению (Дильман В.М., 1987; Arking

R., 1991; Белозерова Л.М., 1998; Ingram D.K. et al., 2001; Коркушко О.В. и др., 2002).

Имеются эпидемиологические наблюдения, свидетельствующие об увеличении риска рака и уменьшении продолжительности жизни при-чрезмерно большом весе тела и ожирении (Lee LM. et al., 2001). экспериментах на животных подобная корреляция между весом тела и продолжительностью жизни прослеживается, не всегда, направление корреляции в значительной мере определяется возрастом и генотипом животных (Ingram D.K. et al., 1987; 2001). В наших экспериментах не было выявлено существенного эффекта исследованных доз SkQl на массу тела мышей трех линий (табл. 25). Не было отмечено «влияния, на динамику массы тела и у нацеленного на митохондрии антиоксиданта MitoQ в дозе 5 мг/кг при внутрибрюшинном введении 2 раза в неделю крысам Sprague-Dawley (Chandran К. et al., 2009).

Как известно, ограничение калорийности питания и связанное с ним снижение массы тела животных существенным образом замедляют старение (Walford R.L., 1974; Weindruch R. et al., 1997). Поэтому возрастное изменение потребления корма, так же как и массы тела, может служить значимым критерием старения. В нашей работе, в целом, не обнаружено существенного влияния SkQl' в дозах 0,5-2500 нмоль/кг/сутки на потребление корма у самок мышей исследованных линий. Стоит отметить, что на ранних сроках эксперимента было обнаружено некоторое снижение (на 16%-30%) количества потребляемого корма и соответственное незначительное снижение массы тела (на 3%-12%) под воздействием низких (5 и 50 нмоль/кг/сутки) доз SkQl у мышей трансгенной линии HER-2/neu, но в поздних возрастах данные различия нивелировались, что может свидетельствовать о случайном характере выявленных изменений.

При анализе потребления жидкости не было выявлено значительного влияния 8кС>1 на этот показатель у мышей 81Ж и НЕК-2/пеи, однако у мышей 129/8 v введение БкСН в дозах 5 и 250 нмоль/кг/сутки увеличивало среднесуточное потребление жидкости на протяжении большей части жизни-животных. Подобное явление, возможно связано со спецификой данной линии-животных и требует дальнейшего изучения.

Таким образом, отсутствие значимого влияния исследованных доз 8к()1 на динамику массы тела, потребление корма и жидкости свидетельствует об отсутствии токсического эффекта длительного применения препарата у самок мышей трех линий. Полученные нами данные согласуются с имеющимися литературными'данными. Не удалось также выявить токсического эффекта препарата при» пожизненном^ введении* 8кС>1 мухам, рыбам, беспородным, нокаутным' (р53-/-), мутантным (по мтДНК) мышамг (БкиксЬеу М.У. & а1., 2011).

Одним- из интегральных показателей обменных процессов является температура тела, которая, как показано в ряде опытов на мышах, с возрастом снижается (Попович И.Г. и др., 2004). В наших исследованиях не было выявлено четкого влияния исследованных доз. 8к(^1 на температуру тела мышей трех исследованных линий. В литературе данных по изучению влияния нацеленного на митохондрии антиоксиданта на возрастную динамику температуры тела не представлено.

Важным параметром старения является возрастное изменение состояния репродуктивной системы. При анализе данных о продолжительности жизни и репродуктивной функции у птиц и млекопитающих, живущих в неволе (в условиях зоопарка), была выявлена корреляция между скоростью возрастного снижения фертильности и скоростью соматического старения (Ricklefs R.E. et al., 2003).

У самок грызунов можно отметить две фазы старения репродуктивной функции (Thung P.J. et al., 1956; Holinka C.F. et al., 1977). В первой фазе начинает происходить снижение фертильности у самок, однако регулярность астральных циклов еще не нарушается. Во второй фазе продолжительность циклов увеличивается, и начинают появляться иррегулярные циклы (персистирующий эструс, ложная беременность, анэструс) (Aschheim Р:, 1976; Huang Н.Н. et al., 1975; 1976); В наших экспериментах у контрольных самок мышей аутбредной, инбредной и трансгенной линий с возрастом происходило увеличение-продолжительности астрального цикла, преим)Щ|ественно« за счет увеличения доли длинных (более 7 дней) циклов, и увеличение относительной доли мышей с иррегулярными циклами (табл. 4, 11, 16), что согласуется с данными литературы (Пискунова! T.G и др., 2007; Анисимов В.Н., 2003).

Влияние SkQl на репродуктивную функцию зависело от линии мышей и дозы препарата. SkQl препятствовал развитию возрастных нарушений астральной функции при введении в дозах 0,5 - 250>нмоль/кг/сутки - у самок мышей SHR и 129/Sv и в дозах 250-2500 нмоль/кг/сутки - у самок мышей HER-2/neu. У трансгенной линии мышей, получавших SkQl в дозах 5 и 5 0 нмоль/кг/сутки, отмечено увеличение частоты иррегулярных циклов. Полученные нами данные о торможении возрастного выключения репродуктивной функции под влиянием SkQl согласуются с результатами опытов на мутангных по мтДНК мышах, у которых применение SkQl (7001000 нмоль/кг/сутки) с питьевой водой увеличивало регулярность астральных циклов (Nedergaard J. et al., 2010).

На основании наблюдений в тесте «открытое поле» (в возрасте 12 и 15 мес.) можно сделать заключение, что у контрольных животных SHR и 129/Sv с возрастом двигательная и локомоторная активность уменьшается, что согласуется с литературными данными у крыс Вистар и OXYS (Stefanova N.A. et al., 2010). Под влиянием SkQl (5 и 250 нмоль/кг/сугки) двигательная активность (оцениваемая по количеству пересеченных квадратов поля и выполненных вертикальных стоек) значительно снижалась (на 23% - 61%) по сравнению с контролем у мышей обеих линий. Также обнаружено усиление утомляемости и снижение выносливости 20-мес. мышей SHR в; тесте С подвешиванием на струне. При исследовании в тесте «приподнятый крестообразный, лабиринт» не обнаружено. влияния; SkQl (0,5-;50;нмоль/кгУсугки) на уровень,тревожностшмьшгей^Ш: В'опытах на:крысах OXYS и Вистар при введении SkQl (в дозе 250 нмоль/кг/сугки) в возрасте 3 и 14 мес. уровень локомоторной и исследовательской активности в тесте «открытое поле» увеличивался, а уровень тревожности в тесте «приподнятый крестообразный: лабиринт» снижался, (Stefanova N.A. et al., 20 Ю). Аналогичные данные о повышении уровня двигательной активности получены у мышей C57BL/6 3- й, 24-мес. возраста под; воздействием ненацеленного коэнзима Q10 (Sinatra D.S et al., 2003). Объяснить вышеуказанные различия в результатах можно с нескольких точек зрения. Стоит отметить, что наши эксперименты, в отличие от данных литературы, проводились с меньшей возрастной разницей. Также известно, что различнее линии животных изначально, имеют отличия; в проявлении элементов индивидуального поведения. Само по себе поведение мышей крайне вариабельно и может изменяться под влиянием многих факторов, как-то: возраста, времени суток, степени сытости животных, освещённости в, «открытом поле», уровня шума и т.д. (Михеев. В В. и др., 2009). Всё это свидетельствует о.необходимости продолжения исследования влияния SkQl на поведенческие характеристики различных линий животных.

У самок мышей SHR, получавших SkQl в дозах 0,5- 50 нмоль/кг/сумси, существенно тормозилось развитие таких внешних признаков старения, как облысение, потеря вибрис и возрастные изменения позвоночника.

Аналогичные результаты были получены у мышей, мутантных по мтДНК, при дозе 8к(^1 700-1000 нмоль/кг/сутки (Кесіещаагсі et а1., 2010) и на модели ускоренного старения на мышах С57ВЬ/6 при дозе 8к(^1 5 нмоль/кг (8ки1асЬеу М.У. еі.аі., 2011). В то же время у мышей линии 129/8у в наших опытах не было выявлено действия 8к(-)1 на данные признаки.

Что касае тся других биомаркеров, то в литературе имеются; данные о тормозящем влиянии? 8к(^1 (в дозе 250 нмоль/кг/сутки) на развитие таких признаков; старения; как возрастная инволюция тимуса (ОЬикЬоуа Ь.А. еі аі., 2009); появление катаракты и ретинопатии; карбонилирование белков1 в скелетных мышцах и снижение минерализации костей:- у крыс ОХУ8 (Нероев В:В. и др., 2008).

В наших экспериментах за животными наблюдали до их естественной гибели; что позволило изучить выживаемость и показателш продолжительности жизни. . Средняя- продолжительность жизни; аутбредных мышей 8Н& была значительно- выше (увеличение до 45%) у животных, получавших 8кС)1 в дозах 0,5-50 нмоль/кг/сутки без выраженной связи доза-эффект. Оптимальной оказалась средняя доза (5 нмоль/кг/сутки). Эффект 8кС>1 был наиболее сильно выражен на ранних и средних этапах старения (медиана продолжительности жизни удваивалась), а максимальная' продолжительность жизни, увеличивалась в меньшей степени. Аналогичные тенденции были выявлены, в. опытах на грибах и беспозвоночных (Анисимов В.Н. и др., 2008).

У самок долгоживущей инбредной линии 129/8у доза SkQl 5 нмоль/кг/сутки, наиболее эффективная для аутбредных мышей 8НЯ, несколько уменьшала среднюю продолжительность жизни (на 6%) и продолжительность жизни последних 10% выживших животных (на 4%). Віто же время, большая доза 8к(21 (250 нмоль/кг/сутки) не влияла на исследованные параметры продолжительности жизни мышей 129/8у.

Введение SkQl в дозах 5-2500 нмоль/кг/сутки не влияло на выживаемость и продолжительность жизни мышей HER-2/neu. В отличие от самок SHR, основной причиной гибели мышей 129/Sv и HER-2/neu является развитие новообразований (Пискунова T.G. и др., 2007; Anisimov V.N. et al., 2003): Видимо, препарат должен был бы обладать существенной антиканцерогенной активностью, чтобы значимо увеличить продолжительность жизни мышеи 129/Sv и HER-2/neu. Аналогичные случаи линейных различий в чувствительности мышей к геропротекторам описаны в литературе: Гак, антидиабетический бигуанид метформин существенно (на 38%) увеличивал продолжительность жизни мышей SHR (Anisimov V.N. et al., 2008), но его эффект на продолжительность , жизни самок мышей 129/Sv и HER-2/neu оказался менее значительным (увеличение на 4% и 8%, соответственно) (Anisimov V.N. étal., 2005; 2010). '

В наших опытах не было выявлено связи доза-эффект, при введении

SkQl. 'Гак, с увеличением или снижением; дозы; относительно наиболее оптимальной дозы 5 нмоль/кг/сутки не происходило параллельного усиления или снижения геропротекторного эффекта препарата.; Отсутствие дозозависимого влияния SkQl на продолжительность жизни показано и в опытах с грибами P. anserine (оптимально - 100 нМ) и ракообразными С. qffînis (оптимально - 0,55 нМ) (Анисимов В.Н. и др., 2008). В опытах на мышах (нокаутных р53-/-) эффективной в отношении увеличения продолжительности жизни также была доза SkQl 5 нмоль/кг/сутки (Анисимов В.Н. и др., 2008).

Анализ причин смерти мышей SHR показал, что SkQl продлевал жизнь животных, в основном,- благодаря снижению уровня смертности: от неопухолевой патологии инфекционного характера, таких как пневмония, гепатит, нефрит, колит и др. (до 56% при дозе SkQl 5 нмоль/кг/сутки), что являлось следствием жизни мышей в нестерильных условиях. Можно предполагать, что SkQl частично предотвращал угасание функции иммунном системы с возрастом. Данное предположение согласуется со сведениями ° торможении ассоциированного с возрастом угасания иммунной системы, У мышей и крыс ОХУ8 под воздействием 8кС>1 (ОЬикЬоуа Ь.А. еЬ а!., 2009; ЗЫроипоуа 1.Ы. а1, 2010).

Суммарная частота опухолей не менялась у мышей ЗНЫ, получавших SkQl. Отмечена тенденция к незначительному повышению частоты развития опухолей молочной железы. Возможно, это являлось» следствием; продления регулярности эстральной функции под действием: 8к<31 у- стареющих самок, тогда как в контроле у большинства мышей аденокарциномы молочной железы развивались реже из-за выраженных возрастных нарушений репродуктивной системы при старении (Берштейн Л.М, 2004* 2010). Смертность от прочих новообразований (лимфом, опухолей легких, яичников, печени, кожи) не отличалась в группах мышей 8НК с 8кС>1 и без него.

Возможное влияние 8к(^1 на рост спонтанных опухолей изучалось нами также на мышах трансгенной линии? НЕЯ-2/пеи, основной причиной гибели которых являются; аденокарциномы молочной железы. Ни в одной из исследованных доз 8к(р не влиял на основные параметры канцерогенеза- У самок трансгенных животных. Это может свидетельствовать о том, ^то использованные дозы 8к<51 не ослабляли противораковую защиту организма (Анисимов В;Н. и др., 2008; 8ки1асЬеу М^У. а1., 2011).

Анализ основных причин гибели мышей 129/8у показал, что болыпая часть животных (77%-80%) погибала от опухолевой патологии, ^то соответствует литературньш данньш (Пискунова Т.С. и др., 2007). У мыШеи

• 1 ' • ' •

129/8у обнаруживали опухоли следующих локализаций: матки, яичников, легких, печени, кроветворной системы и надпочечников. При анализе изменений параметров канцерогенеза у мышей 129/8у под влиянием бьгли вьгявлены следующие закономерности: частота развития опухолей не изменялась, однако средний латентный период обнаружения опухолееи незначительно (на 6%), хотя и статистически достоверно, сокращался при дозе 8к(^1 5 нмоль/кг/сутки. При этом частота и сроки обнаружения опухолей отдельных локализаций у мышей, получавших 8кС)1, существенно не отличались от контрольных. Возможно, основная причина отсутствия влияния исследованных доз препарата на продолжительность жизни мышей 129/8у заключается в характеризующей линию высокой частоте развития новообразований, тогда как 8кС>1 оказывает большее влияние на развитие неопухолевой патологии. Так, в хронических опытах добавление в пищу мышам- другой инбредной линии' С57ВЬ/6 ненацеленного на митохондрии коэнзима С>10 в микромолярных концентрациях не влияло на смертность и продолжительность жизни животных (8о11а111.8. ек а1., 2006).

Во второй серии экспериментов нами было сопоставлено влияние наиболее эффективной по результатам- первой серии опытов и литературным данным дозы 8к(^1 (5 нмоль/кг/сутки) (8ки1асЬеу М:У. ек а1., 2011), антидиабетического препарата метформина, а также сочетания этих препаратов.

Один из механизмов действия метформина, как миметика ограниченной по калорийности диеты, состоит в ослаблении интенсивности свободнорадикальных процессов, в частности, замедляется скорость генерации, супероксида и перекиси водорода (Анисимов В.Н., 2007). Вследствие этого было выдвинуто предположение, что действие метформина может усиливать действие нацеленного на митохондрии антиоксиданта 8к(^1.

Как и в первой серии опытов, не было выявлено влияния 8кС>1 на динамику массы тела; количество потребляемого кормами жидкости у мышей 8НК. Не было обнаружено изменений в данных показателях у самок мышей 8НЫ под действием метформина и его сочетания с 8кС>1.

Введение метформина приводило к снижению температуры тела мышей БНЫ, что отразилось и на эффекте сочетанного воздействия препаратов.

При анализе влияния препаратов на репродуктивную функцию, было показано протективное действие БкСН в дозе 5 нмоль/кг/сутки (что соответствует данным, полученным в 1-й серии опытов), метформина и их сочетания. Так, замедлялось возрастное увеличение длительности циклов и доли иррегулярных циклов. Стоит отметить, что не было выявлено усиления эффекта при сочетанном действии двух препаратов.

Полученные нами, результаты* согласуются* с результатами ДРУГИХ экспериментов с введением«метформина> у самок мышей БНЯ (Ашбппоу 2008; 2011).

В тесте «открытое поле» сочетание с метформином нейтрализовало угнетающее действие 8кС>1 на горизонтальную двигательную активность. В ряде работ опубликованы данные о нейропротекторной активности метформина (Анисимов В.Н., 20086).

В отличие от первой« серии, во-второй-не было выявлено действия $кС>1 в дозе 5 нмоль/кг/сутки на параметры продолжительности жизни мышей Анализ причин смерти мышей БНЯ показал, что Бкр1 во 2-й серии опытов не оказывал влияния на смертность от неопухолевой патологии; что, возможно, связано с биологической вариабельностью аутбредных мышей 8НК, отражающейся на их чувствительности к действию геропротекторов. В работах, выполненных в отделе канцерогенеза и старения НИИ'онкологии-им. Н.Н. Петрова в разные годы, показано, что метформин увеличивал продолжительность жизни мышей БНЯ в одном эксперименте на 38% (Ашбипоу У.К е! а1., 2008); тогда как в другом - лишь на-14% (атэтк^ У.И. ега1.',2011).

Также не обнаружено существенного влияния 8к<31, метформина и их сочетания на параметры канцерогенеза у самок мышей 8ЬЖ. Аналогичные данные бьши- получены в других экспериментах с метформином (Ашзшюу У.К ег а!., 2011).

Результаты наших экспериментов свидетельствуют об отсутствии необходимости совместного применения нацеленного на митохондрии антиоксиданта SkQl и антидиабетического бигуанида метформина.

В целом, суммируя собственные и литературные данные об эффекте SkQl (табл. 24), можно прийти к заключению о том, что, судя по большинству исследованных биомаркеров старения, SkQl тормозит этот процесс. Однако корреляции между влияниями SkQl на отдельные биомаркеры установить не. удалось. Не отмечено также: корреляции? между изменениями биомаркеров» и продолжительности жизни; • ,

При изучении влияния5 SkQl на продолжительность- жизни мышей трех линий мы впервые выявили геропротекторную активность препарата SkQl (наиболее выраженную при дозе 5 нмоль/кг/сутки) у самок аутбредной линии мышей SHR и отсутствие у препарата токсичного и канцерогенного эффекта в диапазоне: доз 0,5-2500 нмоль/кг/сутки?при; длительном? применении: Следует отметить,, что модели старения на аутбредных линиях мышей; в отличие от инбредных и генетически модифицированных, вследствие их большей, генетической гетерогенности; наиболее полно соответствуют нормальному старению у человека; что? важно? для? эксраполяции полученных данных на человека (Анисимов В.Н., 2008а).

Наши результаты, согласуются: с большинством» экспериментальных работ, показывающих геропротекторную активность и отсутствие токсичности нацеленного на митохондрии антиоксиданта SkQl. Как отмечено выше, при введении,SkQl в диапазоне доз 0,5-1000 нмоль/кг/сутки показано увеличение продолжительности? жизни ряда, видов, беспозвоночных, а также: млекопитающих - генетически модифицированных мышей (Skulachev 1VI-V. etal., 2011); Геропротекторный эффект SkQl, полученный у мышей, мутантных по мтДНК (Nedergaard J. et al., 2010), и торможение развития признаков старения у крыс OXYS (Obukhova L.A. et al., 2009; StefanovaN.A. et а1., 2010) с повышенным уровнем окислительных повреждений подтверждают представления о важной роли генерируемых в митохондриях свободных радикалов в механизмах старения.

Таким образом, на основании имеющихся экспериментальных данных можно сделать предположение о перспективности дальнейших предклинических испытаний нацеленного на митохондрии пластохинона 5кС>1 для оценки его возможного применения с целью предупреждения преждевременного старения.