Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Особенности сердечно-сосудистого действия слабого нейротоксина (WTX) из яда кобры Naja Kaouthia

На правах рукописи

ОГАИ АЛЕКСЕИ ЯКОВЛЕВИЧ

ОСОБЕННОСТИ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОГО ДЕЙСТВИЯ СЛАБОГО НЕЙРОТОКСИНА ИЗ ЯДА КОБРЫ NAJA KAOUTHIA

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание >ченои степени кандидата фармацевтических наук

Пятигорск, 2004

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА В ФИЛИАЛЕ ИНСТИТУТА БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМЕНИ АКАДЕМИКОВ М.М. ШЕМЯКИНА И

Научный руководитель - кандидат биологических наук, доцент Мурашев Аркадий Николаевич.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Батурин Владимир Александрович кандидат фармацевтических наук, доцент Кулешова Светлана Анатольевна Ведущая организация:

Университет дружбы народов им. П.Лумумбы

Защита состоится года в часов на заседании

диссертационного совета К 208.069.01 Пятигорской государственной фармацевтической академии (357533, Пятигорск, пр. Калинина, 11)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пятигорской государственной фармацевтической академии

Автореферат разослан

ЮА ОВЧИННИКОВА

Ученый секретарь

диссертационного совета

з

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из важнейших задач фармакологии на современном этапе развития является создание новых эффективных лекарственных препаратов для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы. В настоящее время медицина располагает большим арсеналом лекарственных средств, которые широко используются при сердечной недостаточности, аритмиях, нарушениях коронарного и мозгового кровообращения, нарушениях артериального давления (АД), патологических изменениях сосудистых стенок и др. Среди расстройств АД чаще встречаются артериальные гипертензии. Сбалансированность артериального давления обеспечивается многими факторами: работой сердца (ударный и минутный объем), периферическим сопротивлением сосудов, объемом циркулирующей крови и ее реологическими свойствами. Механизм регуляции АД представляет собой сложный многоступенчатый нейро-гуморальный комплекс, функционирующий на основе кибернетических принципов обратной связи. Со стороны нервной системы ведущая роль в регуляции АД принадлежит определенным структурам продолговатого мозга, гипоталамуса, коры больших полушарий и другим отделам ЦНС. Препараты содержащие яды змей нашли-применение в медицине в качестве анальгетических и противовоспалительных средств (мазь «Випросал», р-ры для инъекций «Випраксин» и «Наяксин») за счет нейротропной активности. Помимо этого, в ряде работ была показана способность длинных нейротоксинов снижать АД у кошек (Raina R., Njoroge D., 1977) и крыс (Omran M., Abdel -Nabi I., 1997), вследствие необратимой блокады Н-холинорецепторов, приводящей к гибели животных. Таким образом, изучение активности нейротоксинов из ядов змей in vivo сильно затруднено их высокой токсичностью. В этой связи слабый нейротоксин (VVTX - weak neurotoxin) способный обратимо связываться с рецепторами-мишенями и обладающий низкой токсичностью может рассматриваться как

потенциальное средство, патогенетические

j БИБЛИОТЕКА

механизмы развития артериальной гипертензии (Utkin et al., 2000).

В этой связи изучение сердечно-сосудистой и нейротропной активности слабых нейротоксинов из ядов змей является актуальным. Цель работы:

Основной целью настоящей работы явилось изучение механизма сердечно-сосудистого действия слабого нейротоксина (WTX) из яда кобры Naja kaouthia, а также установление взаимосвязи между гипотензивной и нейротоксической активностью.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- изучить влияние слабого нейротоксина (WTX) на показатели системной гемодинамики у бодрствующих нормотензивных и гипертензивных животных;

- изучить роль М-и-Н-холинорецепторов в реализации гемодинамических эффектов слабого нейротоксина (WTX) при его системном введении;

- определить миотропный компонент действия в реализации гипотензивной активности слабого нейротоксина (WTX) при блокаде синтеза эндогенного оксида азота (N0);

- провести комплексную оценку нейротоксического действия WTX.

Научная новизна:

Впервые проведено подробное фармакологическое изучение слабого нейротоксина (WTX) из яда кобры Naja kaouthia.

Установлено, что слабый нейротоксин (WTX) вызывает снижение артериального давления (АД) и повышение частоты сердечных сокращений (ЧСС).

Получены оригинальные данные об участии NO-синтазной системы и Н-и-М-холинорецепторов в механизме гипотензивного действия слабого нейротоксина (VVTX).

Проведен анализ влияния слабого нейротоксина (WTX) на различные

отделы нервной системы.

Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена целесообразность дальнейших доклинических исследований гипотензивной активности слабого нейротоксина (WTX) из яда кобры Naja kaouthia.

Практическая значимость результатов исследования Представленный в работе экспериментально-теоретический материал послужил основой и подтверждением необходимости дальнейших доклинических исследований гипотензивной активности слабого нейротоксина (WTX). Проведенные исследования позволяют заключить, что слабый нейротоксин (WTX) влияет на показатели системной гемодинамики у бодрствующих нормотензивных и гипертензивных животных. М-и-Н-холинорецепторы вовлечены в реализацию гемодинамических эффектов слабого нейротоксина (WTX). В реализации гипотензивной активности присутствует миотропный компонент действия, при этом слабый нейротоксин (WTX) не обладает выраженной нейротоксической активностью

Уровень внедрений

Получены рекомендации к следующим стадиям доклинических исследований (гранты Российского фонда фундаментальных исследований 0004-48889 и 03-04-48496) - руководитель исследований, доктор химических на>к Ю.Н. Уткин (информационное письмо № 111-214.5-652 от 18.06.2004 г.). Результаты теоретических и практических исследований включены в план НИР кафедры биологии, физиологии и патологии ПятГФА с целью определения влияния слабого нейротоксина (WTX) на реологические показатели крови (акт об использовании результатов НИР).

Апробация работы

Результаты работы докладывались и обсуждались на 7-ой и 8-ой Международной Путинской школе - конференции молодых ученых (г. Пушино, 2003-2004 г.); на третьей всероссийской школе-конференции по физиологии кровообращения (г. Москва. 2004 г.); на 59-й региональной

конференции по фармации и фармакологии (г. Пятигорск, 2004 г.); на Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (г. Москва, 2003 г.); на чтениях памяти академика Ю.Н. Овчинникова (г. Пущино, 2003 г.).

По теме диссертации опубликовано 8 работ.

Положения, выносимые на защиту:

По результатам проделанной исследовательской работы на защиту выносятся следующие положения:

-Слабый нейротоксин (WTX) вызывает снижение АД и повышение ЧСС у бодрствующих нормотензивных животных и гипертензивных животных;

- Н-холинорецепторы вовлечены в реализацию гипотензивного эффекта слабого нейротоксина (WTX);

- NO-синтазная система принимает участие в реализации гипотензивной активности слабого нейротоксина (WTX):

- Слабоый нейротоксин (WTX) обладает нейротропной, а также слабо выраженной нейротоксической активностью.

Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук

Диссертационная работа Огай А.Я. «Особенности сердечно-сосудистого действия слабого нейротоксина (WTX) из яда кобры Naja kaouthia» (Протокол №2 от 17.03.2004 г.) была выполнена в рамках грантов Российского фонда фундаментальных исследований (00-04-48889, "Выделение из ядов змей и структурная характеристика полипептидных соединений с новыми фармакологическими свойствами" и 03-04-48496, "Функциональная протеомика змеиных ядов: структурная и фармакологическая характеристика новых малопредставленных белков"), а также в соответствии с планом НИР Института биоорганической химии (ИБХ) РАН (Тема: "Идентификация в ядах змей и выделение новых полипептидных соединений с низкой токсичностью", План НИР ИБХ РАН на 2002 год, пункт 2, стр. 52; Тема "Идентификация новых минорных компонентов змеиных ядов, представляющих фармакологический

интерес", План НИР ИБХ РАН на 2003 год, п>нкт 3, стр. 55). Структура и объем диссертации

Материал диссертации изложен на 119 страницах машинописного текста, иллюстрирован 6 таблицами и 23 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов исследований, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы содержит 194 источника, в т. ч. 171 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Измерение уровня артериального давления прямым способом За сутки до опытов животным вживляли полиэтиленовые катетеры в грудную аорту через левую сонную артерию, и в яремную вену. Через сутки после операции проводили эксперимент на бодрствующих' животных. Регистрацию АД и ЧСС осуществляли электроманометром.«СР-01» (СТС, США). Обработка сигнала производилась с помощью многоканальной системы «Beat» (Medvedev, 1990). При цифровой обработке сигнала АД„ получали -параметры среднего артериального давления (СрАД) и ЧСС.

Оценка локомоторной активности в тесте «открытое поле» Установка для проведения теста открытое поле (ОП) представляла собой квадрат размером 40x40 см, разделенный равномерно на 9 секторов. Высота окружной стенки составляла 20 см. Над ареной, на высоте 80 см помещали электрическую лампу накаливания мощностью 100 Вт (Маркель А.Л., Хусаинов Р.А., 1976 г.; Титов С.А., Каменский А.А., 1980 г). При испытании животное помещали в центр арены и в течение 3 минут оценивали двигательную активность по числу пройденных секторов. Помимо двигательной активности визуально регистрировали вертикальную активность (число подъемов на задние лапы), общее время актов очищения (умывания, или грумминга) и время нахождения в центре арены фиксировали с помощью секундомеров; также оценивали число дефекаций по числу дефекационных шариков и уренации по количеству лужиц.

Методика оценки нейротоксичности в модифицированном тесте

Ирвина

Для скрининга нейротропной активности вещество вводили в одной дозе (внутривенно), группе животных достаточной для статистической оценки результатов. После введения за животными вели индивидуальное наблюдение с регистрацией определенных показателей функционального состояния животного в различных временных точках. Осмотр состоял из наблюдений за состоянием животного в клетке, на открытой площадке и в руках. Проявление и выраженность признаков оценивали по бальной системе.

Статистическую обработку результатов исследований проводили с использованием t-критерия Стьюдента для независимых рядов (Excel 7.0), двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA-2, используя программу Statistica for Windows 5.0. Изменения исследуемых показателей считали статистически значимыми при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ Изучение гемодинамических эффектов WTX при однократном введении в разных дозах у нормотензивных животных В настоящее время в литературе имеются данные о воздействии а-нейротоксинов на сердечно-сосудистую систему. Однако соединения, обладающие гипотензивной активностью, в этих работах идентифицированы не были. Ранее было показано, что введение WIX в дозах 0,5, 1,0 и 2,0 мг/кг крысам Wistar вызывало дозозависимую гипотензию и тахикардию (Ржевский Д.И.. Мурашев А.Н., Кухтина В.В 2001). Известно, что разные виды животных обладают различной чувствительностью к действию нейротоксинов. Интересным было определить чувствительность сердечно-сосудистой системы к WIX на животных с изначально другими значениями изучаемых параметров (АД и ЧСС). У мышей, уровень ЧСС изначально выше, чем у крыс в 1.5-2 раза, это связанно с особенностями строения и регуляции сердечно-сосудистой системы и может быть отнесено к признакам видовой специфичности. В этой

связи было проведено исследование влияния WTX на параметры системной гемодинамики у мышей NMRI.

В серии предварительных экспериментов на мышах NMRI, также была обнаружена дозозависимая гипотензия и тахикардия. Действительно, мыши оказались менее чувствительны к действию WTX (Рис.1). Доза 2 мг/кг вызывала незначительные изменения исследуемых параметров, так гипотония составила - 7,7%, а рефлекторная тахикардия составила 16,4%. Доза 4 мг/кг вызывала минимальный эффект (снижение АД на- 18,7% и повышение ЧСС на 21,7%), введение 6 мг/кг приводило к более значительному снижению АД и-повышению ЧСС (на - 27,1% и на 29,1%). Введение дозы 8 мг/кг вызывало чрезмерное снижение уровня АД и повышение ЧСС. При введении этой дозы уровень АД снижался на 61,5%, а уровень ЧСС повышался на 51%

-10 I I I | ■ I I ■ I I I | | ■ I ■ ■ | ■ I I I ■ | I I | | ■ ■ I

О 5 10 15 20 25 30

Рис.1. Изменения ЛД (1Л) и ЧСС (1Б) при однократном введении \УТ\ в до ¡е 2 мг/кг, внутривенно (темные квадраты, п=7), в дозе 4 мг/кг, внутривенно (светлые квадраты, п=7), в дозе 6 мг/кг, внутривенно (темные круги, п=7), в дозе 8 мг/кг, внутривенно (светлые круги, п=7) у мышей ММ({|.

*- Р<0,05 по АХО\'А-2 между группами 8 мг/кг и 6 мг/кг.

Холинорецепторы играют значительную роль в регуляции деятельности сердечно - сосудистой системы. Так Н-холинорецепторы отвечают за проведение импульсов на уровне ганглиев симпатической и парасимпатической нервных систем (Харкевич Д.А., 1996). Ацетилхолин через - м-холинорецепторы увеличивает внутри гладкомышечных клеток уровень цГМФ, что приводит к снижению содержания свободного кальция, расслаблению мышц и расширению сосудов. (Филимонов В.И., 2004). Таким образом, от функциональности холинорецепторов напрямую зависит уровень АД и ЧСС, а взаимодействие их с лигандами приводит к изменению данных гемодинамических параметров. В опытах in vitro было показано, что эффекты нейротоксинов выделенных из ядов кобр, могут опосредоваться через Н-холинорецепторы (Johnson D.S., Martinez J., Elgoyhen А.В., 1990; Poh S. L, Mourier G, Thai R, 2002; Antil-Delbeke S., Gaillard C, Tamiya Т., 2000), а в случае мускариновых ядов и через М-холинорецепторы (Ferreira A R.. Furstenau L, Blanco С, 2003). Также известно, что WTX способен блокировать как мышечные, так и нейрональные сс7-Н-холинорецепторы (Utkin Yu. N., Kukhtina V. V., Kryukova E. V., 2001). В этой связи, гипотензия может быть вызвана блокадой вазоконстрикторных импульсов симпатической нервной системы (СНС) на уровне ганглиев. Повышение ЧСС говорит об отсутствии центрального гипотензивного действия WTX, а дозозависимый характер изменений свидетельствует о том, что тахикардия носит барорефлекторный характер, т.е. возникает в ответ на падение АД. Различную чувствительность крыс и мышей к действию WTX. можно объяснить видовыми особенностями, такими как: различное строение, количество и локализация рецепторов -мишеней, что может изменять константы рецепторного связывания.

Относительно высокие дозы WTX показывают его низкую токсичность. Известно, что эффективность связывания WIX с ацетилхолиновыми рецепторами более чем в 300 раз слабее, чем у а-кобратоксина и нейротоксина II из ядов кобр N. Kaouthia. N. Oxiana (Utkin Yu. N., Kukhtina V. V.. Kryukova E.

V., 2001). Низкая токсичность обусловлена малыми значениями констант реиепторного связывания in vitro (Utkin Yu. N., Kukhtina V. V.. Kryukova E. V., 2001). Подобные особенности могут объяснять сердечно-сосудистые эффекты in vivo, а именно не происходит необратимого ингибирования Н-холинорецепторов ганглиев, так как к концу первого часа наблюдается восстановление значений АД и ЧСС. Блокада только а7-субъединицы Н-холинорецептора, не приводит к полному блоку вазоконстрикторных импульсов СНС, т.е. рецептор частично сохраняет свою функциональность. Изучение влияния WTX на параметры гемодинамики у спонтанно-гипертензивных крыс линии SHR-SP при внутривенном введении Результаты предварительных опытов показали способность WTX вызывать дозозависимые изменения АД и ЧСС у нормотензивных-животных. Интересным было определить чувствительность сердечно-сосудистой системы к WTX в норме и в условиях патологии, а именно на модели артериальной гипертонии. В этой связи было проведено исследование влияния WTX на параметры системной гемодинамики у спонтанно-гипертензивных крыс линии SHR-SP.

Внутривенное введение WTX в дозе 2 мг/кг нормотензивным крысам Wistar, приводило к снижению АД на 24,8% и повышению ЧСС на 25,5%, что сопоставимо с эффектом дозы 6 мг/кг для мышей, таким образом, эти дозы являются эквиэффективными. Результаты наших исследований показали, что сердечно-сосудистая система в условиях патологии иначе реагирует на введение WTX. Внутривенное введение WTX в дозе 2 мг/кг крысам линии SHR-SP приводило к снижению уровня АД (19,4%) и повышению ЧСС (15,2%) (Рис.2). Как видно из рисунка спонтанно-гипертензивные крысы SHR-SP оказались менее чувствительными к действию WTX. Незначительные, по сравнению с норматензивными крысами Wistar, изменения АД и ЧСС у гипертензивных крыс SHR-SP объясняются повышенной активностью симпатической нервной системы. Видимо, вазоконстрикторные импульсы

симпатической системы более полно блокируются токсином у нормотензивных животных, что приводит к вазоделатации. В случае гипертензивных животных, на фоне повышенного тонуса симпато-адреналовой системы, частота и интенсивность вазоконстрикторных импульсов выше (Ьипёт 8., Шск^п 8.Е.. ТЬогип Р.. 1983). Частичное подавление симпатической иннервации за счет ганглиоблокирующей активности 'МТХ, не позволяет реализовать гипотензию. Влияние ганглиоблокады на АД и ЧСС при внутривенном введении

WTX у нормотензивных мышей NMШ Для создания экспериментальной модели блокады Н-холинорецепторов, использовали неселективный ганглиоблокатор гексаметоний. Внутривенное введение гексаметония в дозе 20 мг/кг приводило к гипотензии (- 25,7+6,0 %) и брадикардии (15,6+4,8 %). Для оценки эффективности ганглиоблокады было проведено определение тонуса барорефлекса.

При внутривенном введение 'ШХ на фоне эффективной блокады Н-холинорецепторов был обнаружен интересный факт - ганглиоблокада вызывала потенцирование гипотензивной активности (Рис.3). Так, гипотензия вызванная введением ^ТХ на фоне ганглиоблокады составила - 52.5%, а тахикардия 12,1%.

Снижение уровня АД и ЧСС характерно для действия ганглиоблокаторов, так как они блокир)ют проведение вазоконстрикторных импульсов СНС на уровне ганглиев. Проявление гипотензивного действия ^ТХ на фоне действия гексаметония (Рис. 3) можно объяснить наличием в механизме гипотензивной активности компонента действия не связанного с Н-холинорецепторами.

Изучение роли NO-синтазной системы как миотропного компонента в

механизме гипотензивной активности WГX Анализируя возможные механизмы гипотензивной активности ^ТХ. можно предположить, что нейротропный компонент действия не играет центральной роли, так как экспериментально показано, что блокада рецепторов-мишеней не подавляет гемодинамических эффектов.

Среди механизмов действия нейротоксинов есть механизм воздействия на кальциевые каналы, который характерен для так называемых пресинаптических токсинов.

Рис.2. Изменения АД (А) и ЧСС (Б) при введении \М\ в дозе 2 мг/кт, внутривенно (п=6) у крыс БНК-БР. *- Р<0,05 по А\ОУА.

Время, мин

Рис.3. Изменения АД (Л) и ЧСС (Б) при введении WTX в лозе 6 мг/кг (темные круги, п=6) и WTX на фоне гексачетония (светлые круги, n=6) у мышей NMRI. *- Р<0,05 но ANOVA-2.

В этой связи, интересным представлялось изучение возможной миотропной активности, как основного компонента гипотензивной активности. Для этого было изучено влияние WTX на сердечно-сосудистую систему у мышей на фоне неселективного ингибирования синтеза эндогенного N0 -важнейшего фактора регуляции тонуса сосудов.

Блокаду инлуцибельной NО-синтазы осуществляли путем внутривенного введения неселективного блокатора L-NAME в дозе 2,5 мг/кг. При внутривенном введении L-NAME наблюдалось характерное повышение уровня АД и снижение ЧСС на 13,1+3,3 % и - 12.7+4.3 % соответственно. Введение WTX на фоне действия L-NAME вызывало гипотонию, которая составила -16.3+3.0 % и тахикардию 16,8+7,2 % (Рис.4). Эти значения статистически отличаются от изменений АД (- 27.8+3,0 %) и ЧСС (29,1+12,2 %) в контроле.

N0 - мощный вазодилатируюший фактор, обеспечивающий расслабление гладкомышечных клеток стенок сосудов за счет повышения активности аденилатциклазы, увеличения концентрации цАМФ и понижения концентрации кальция. Гипертензия и рефлекторная брадикардия при введении L-NAME возникают вследствие нарушения синтеза эндогенного N0, в результате блокады фермента NO-синтазы.

Уменьшение гипотензивного эффекта (Рис. 4) при введении WTX на фоне действия L-NIAME указывает на присутствие миотропного компонента в реализации WTX-зависимой гипотензии.

Влияние ^ТХ на поведение нормстгензивных мышей СЕУУ в тесте «Открытое поле»

При более детальном рассмотрении возможного механизма действия ^^ на параметры гемодинамики, была определена роль Н-холинорецепторов в реализации гипотензивного эффекта. Ранее было показано, что ^^Х, взаимодействуя с примерно одинаковой эффективностью как с нейрональными а7-холинорецепторами, так и мышечными Н-холинорецепторами, имеет низкую константу рецепторного связывания, что объясняет его низкую токсичность (№кт Уи. N.. КикШпа V. V., Кгуикоуа E. V., 2001). В данной работе нами была определена степень выраженности нейротоксических эффектов ^^ при внутривенном введении мышам.

В тесте «открытое поле» было обнаружено достоверное снижение двигательной активности у мышей опытной группы относительно контроля.

что выражалось в уменьшении количества пересечённых секторов от 113,5±6.5 до 95,5+4,2 (Рис.5). Также была отмечена тенденция к снижению тревожности (латентное время нахождения в центре) у животных в опытной группе (8,7+1,3 с) относительно контрольной группы (19,0±3,7 с) (Рис.6).

Локомоторная активность является отражением функционирования комплекса сенсорных модальностей (проприоцептивной. вестибулярной, визуальной, тактильной), нервно-мышечных рефлексов и ЦНС. Изменение данного параметра служит показателем нейротропного и нейротоксического действия. При этом незначительное изменение локомоторной активности говорит о низкой нейротоксичности слабого нейротоксина(WТХ).

160 i 140 -

а 120 -

Рис. 5. Изменение локомоторной активности в тесте «открытое поле» при однократном введении \УТХ в дозе 6 мг/кг, внутривенно (полосатый столб, п=9) или 0,9% N301 - 100 мкл/кт, внутривенно (светлый столб, п=9). *- Р<0,05 по 1-китерию Стьюдента.

25'

20-

„ 15-

к 2

Рис. 6. Изменение латентного времени нахождения в центре в тесте «открытое поле» при однократном введении \VTX в дозе б мг/кг, внутривенно (полосатый столб, п=9) или 0,9% N'aCI -100 мкл/кг, внутривенно (светлый столб, о=9). *- Р<0,05 по t-китерию Стьюдента.

Влияние VVTX на параметры функциональной батареи тестов по оценке нейротоксичности в модифицированном тесте Ирвина

За контроль движения отвечает согласованная деятельность разных отделов нервной системы, таких как спинной мозг, ствол/мозжечок, базальные ганглии и кортекс. Со стороны соматической нервной системы в регуляцию

локомоторной активности включены кости, суставы, мышцы. Для диагностики участия нервной системы в изменении локомоторной активности использовали модифицированный тест Ирвина. Изучали хватательный и вестибулярный рефлексы, а также визуализацию местонахождения, реакцию на прикосновение и резкий звук. По всем вышеперечисленным параметрам, кроме хватательного рефлекса, который изменился с 15 баллов в контроле, до 12.3 баллов в опытной группе (Рис. 7), не обнаружено достоверных отличий между контрольными и опытными животными. Также было обнаружено изменение состояния животных получавших 'МГХ, что проявлялось в достоверном изменении таких показателей, как нахождение в позе на боку, сгорбленность, облизывание и кусание частей тела (Рис. 8).

Нормальный рефлекторный ответ свидетельствует о том, что периферические нейроны, вовлеченные в тестируемый сенсомоторный рефлекс, не повреждены. Сохранение нормальных реакций на внешние стимулы, говорит о том, что 'МГХ не оказывает выраженного нейротоксического влияния на ЦНС.

Уменьшение силы хватательного рефлекса, может быть связано с нарушением иннервации мышц и быть признаком периферических нейропатий. В нашем случае некоторая подавленность хватательного рефлекса может объясняться взаимодействием 'МГХ с мышечными Н-холинорецепторами, что приводит к слабому миорелаксирующему эффекту.

Нахождение животного в позе на боку, говорит о снижении поведенческой активности животного. При внутривенном введении 'МГХ обнаружено незначительное изменение этого параметра (Рис. 8).

16-1

14-

ш

л

12-

10-

4-

0

6-

8

2-

Рис. 7. Изменение силы хватательного рефлекса при однократном введении \\ТХ в дозе 6 мг/кт, внутривенно (полосатый столб, п=9) или 0,9% >'аС1 - 100 мкл/кг, внутривенно (светлый столб, п=9). *- Р<0,05 по Ькитерию Стьюдента.

Изучение влияния WTX на уровень болевой чувствительности у нормотензивных мышей CFW в тесте «горячая пластина»

Изменение таких параметров, как облизывание и кусание частей тела и сгорбленность (Рис. 8.) указывают на возможную альгезию. Однако альгезия может быть как нейрогенной, так и миогенной этиологии. Для «количественной» оценки состояния болевого рефлекса регистрировали реакцию животного на термальный стимул с применением теста «горячая пластина». По результатам теста не было обнаружено достоверных различий между опытной и контрольной группами по латентному времени облизывания передних (от 9,8+1,2 в контроле до 11,1+1,3 в опытной группе), задних (от 14.4+2,5 в контроле до 16.3+1,7 в опытной группе) лап и подпрыгиваний (от 40,4+1,9 в контроле до 39.6+5.1 в опытной группе) (Рис. 9).

Отсутствие достоверных различий показателей уровня болевой чувствительности, указывает на то, что ТХ не оказывает токсического действия на участки рефлекторной дуги болевого рефлекса. Можно предположить, что альгезия не связана с нейротоксическим действием 1Х

частой тела

Рис. 8. Изменение показателей состояния животных в модифицированном тесте Ирвина при однократном введении \УТХ в дозе б мг/кг, внутривенно (полосатые столбы, п=9) или 0,9% \аС1 -100 мкл/кт, внутривенно (светлые столбы, п=9). *• Р<0,05 по Ькитерию Стьюдента.

передних лап задних лап

Рис.9. Изменение показателей болевой чувствительности в тесте «горячая пластина» при однократном введении \\Т\ в дозе 6 мг/кг, внутривенно (полосатые столбы, п=9) или 0,9% !*аС1 -100 мкл/кг, внутривенно (светлые столбы, п=9). *- Р<0,05 по 1-китерию Стьюдента.

Основные выводы

1. Экспериментальные исследования по изучению активности слабого нейротоксина (МГХ), позволяют рассматривать данное вещество как потенциальное лекарственное средство при лечении сердечнососудистых заболеваний.

2. Показано, что внутривенное введение слабого нейротоксина (^ГХ) вызывает дозозависимое снижение АД и повышение ЧСС у нормотензивных крыс и мышей и гипертензивных крыс. При этом сердечно-сосудистая система крыс оказалась более чувствительной к действию нейротоксина.

3. Определено вовлечение Н-холинорецепторов в механизм гипотензивной активности слабого нейротоксина (^ГХ) как нейротропного компонента. Эффективная ганглиоблокада потенциировала гипотензивн>ю активность у мышей и незначительно подавляла гипотензию у крыс, что связано с различным строением, количеством и локализацией рецепторов-мишеней.

4. Показано, что М-холинорецепторы не участв\ют в реализации 'МГХ-зависимой гипотензии.

5. Установлено участие КО-синтазной системы как миотропного компонента гипотензивного действия слабого нейротоксина (МГХ). Таким образом слабый нейротоксин (^ГХ) способен влиять на разные патогенетические механизмы развития артериальной гипертензии.

6. Показано, что слабый нейротоксин (^ГХ) обладает нейротропной активностью, а также слабо выраженным нейротоксическим действием, что дает возможность создания экспериментальных моделей нейропатологий.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы

1. Влияние неселективной блокады NO-синтазы на гемодинамические эффекты слабого нейротоксина (WTX) из яда кобры Naja kaouthia / А.Я. Огай, Д.И. Ржевский, И.А. Дьяченко и др. // Тез. докл. Российского симпозиума по химии и биологии пептидов.- М., 2003. - С. 83.

2. Влияние слабого нейротоксина (WTX) из яда кобры Naja kaouthia на параметры системной гемодинамики у мышей / А.Я. Огай, Д.И. Ржевский, А.Н. Мурашев и др. // Тез. докл. 7-ой Пушинской конф.-П>щино, 2003.-С.35:

3. Неселективная ганглиоблокада потенцирует гемодинамические эффекты слабого нейротоксина (WTX) из яда кобры Naja kaouthia / А.Я. Огай, Д.И. Ржевский, А.Н. Мурашев и др. // Тез. докл. отчетной конф. ФИБХ РАН. - Пущино, 2004. - С. 23.

4. Роль М-холинорецепторов в реализации гемодинамических эффектов слабого нейротоксина (WTX) из яда кобры Naja kaouthia / А.Я. Огай, Д.И. Ржевский, А.Н. Мурашев и др. // Тез. докл. Третьей всероссийской школы-конференции по физиологии кровообращения. - М., 2004. - С. 7475.

5. Влияние слабого нейротоксина (VVTX) из яда кобры Naja kaouthia на локомоторную активность у мышей / А.Я. Огай, Д.И. Ржевский, А.Н. Мурашев и др. // Тез. докл. XI Российского национального конгресса «Человек и лекарство».- Москва, 2004. - С. 278.

6. Влияние слабого нейротоксина (WTX) из яда кобры Naja kaouthia на болевую чувствительность у мышей / А.Я. Огай, Д.И. Ржевский, А.Н. Мурашев и др. // Тез. докл. 8-ой Путинской конф.- Пущино, 2004. - С. 124.

7. Действие слабого нейротоксина (WTX) из яда кобры Naja kaouthia на гемодинамические параметры у крыс SHR-SP / А.Я. Огай, Д.И. Ржевский, А.Н. Пужалин и др. // Тез. докл. XI международной конф. «Ломоносов

2004». - Москва, 2004. - С. 120-121. 8. Миотропная активность слабого нейротоксина из яда кобры Naja kaouthia в реализации гипотензивного эффекта у мышей / А.Я. Огай, Д.И. Ржевский, И А Дьяченко и др. // Регион. Конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров (59; 2004; Пятигорск): Материалы... -Пятигорск, 2004. - С.300-301.

ОСОБЕННОСТИ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОГО ДЕЙСТВИЯ СЛАБОГО НЕЙРОТОКСИНА ИЗ ЯДА КОБРЫ NAJA KAOUTHIA

»1345!

ОГАЙ АЛЕКСЕЙ ЯКОВЛЕВИЧ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано в печать л06 2004г. формат бумаги 60X84 1/16. \

«

Б>мага кн.-ж>рнальная. Печать ротапринтная. Усл. печ. л. 1.0. ;

Тираж 80 экз. Заказ №

Пятигорская государственная фармацевтическая академия 357533, Пятигорск, пр. Калинина, 11

Актуальность темы

Одной из важнейших задач фармакологии на современном этапе развития является создание новых эффективных лекарственных препаратов для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы. В настоящее время медицина располагает большим арсеналом лекарственных средств, которые широко используются при сердечной недостаточности, аритмиях, нарушениях коронарного и мозгового кровообращения, нарушениях артериального давления (АД), патологических изменениях сосудистых стенок и др. Среди расстройств АД чаще встречаются артериальные гипертензии. Сбалансированность артериального давления обеспечивается многими факторами: работой сердца (ударный и минутный объем), периферическим сопротивлением сосудов, объемом циркулирующей крови и ее реологическими свойствами. Механизм регуляции АД представляет собой сложный многоступенчатый нейро-гуморальный комплекс, функционирующий на основе кибернетических принципов обратной связи. Со стороны нервной системы ведущая роль в регуляции АД принадлежит определенным структурам продолговатого мозга, гипоталамуса, коры больших полушарий и другим отделам ЦНС. Препараты содержащие яды змей нашли применение в медицине в качестве анальгетических и противовоспалительных средств (мазь «Випросал», р-ры для инъекций «Випраксин» и «Наяксин») за счет нейротропной активности. Помимо этого, в ряде работ была показана способность длинных нейротоксинов снижать АД у кошек (Raina R., Njoroge D., 1977) и крыс (Omran М., Abdel -Nabi I., 1997), вследствие необратимой блокады Н-холинорецепторов, приводящей к гибели животных. Таким образом, изучение активности нейротоксинов из ядов змей in vivo сильно затруднено их высокой токсичностью. В этой связи слабый нейротоксин (WTX - weak neurotoxin) способный обратимо связываться с рецепторами-мишенями и обладающий низкой токсичностью может рассматриваться как потенциальное средство, способное влиять на разные патогенетические механизмы развития артериальной гипертензии (Utkin et al., 2000).

В этой связи изучение сердечно-сосудистой и нейротропной активности слабых нейротоксинов из ядов змей является актуальным.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы явилось установление механизма сердечнососудистого действия слабого нейротоксина из яда кобры Naja kaouthia, а также установление взаимосвязи между гипотензивной и нейротоксической активностью.

Для решения поставленных целей, нами были сформулированы следующие задачи:

- изучить влияние слабого нейротоксина (WTX) на показатели системной гемодинамики у бодрствующих нормотензивных и гипертензивных животных;

- изучить роль М-и-Н-холинорецепторов в реализации гемодинамических эффектов слабого нейротоксина (WTX) при его системном введении;

- определить миотропный компонент действия в реализации гипотензивной активности слабого нейротоксина (WTX) при блокаде синтеза эндогенного оксида азота (NO);

- провести комплексную оценку нейротоксического действия слабого нейротоксина (WTX).

Научная новизна

Впервые проведено подробное фармакологическое изучение слабого нейротоксина (WTX) из яда кобры Naja kaouthia.

Установлено, что слабый нейротоксин (WTX) вызывает снижение артериального давления (АД) и повышение частоты сердечных сокращений (ЧСС).

Получены оригинальные данные об участии NO-синтазной системы и Н-и-М-холинорецепторов в механизме гипотензивного действия слабого нейротоксина (WTX).

Проведен анализ влияния слабого нейротоксина (WTX) на различные . v ; .■ отделы нервной системы.

Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена целесообразность дальнейших доклинических исследований гипотензивной активности слабого нейротоксина (WTX) из яда кобры Naja kaouthia.

Практическая значимость результатов исследования

Представленный в работе экспериментально-теоретический материал послужил основой и подтверждением необходимости дальнейших доклинических исследований гипотензивной активности слабого нейротоксина (WTX). Проведенные исследования позволяют заключить, что слабый 1 .• ^ ■ I . С нейротоксин (WTX) влияет на показатели системной гемодинамики у бодрствующих нормотензивных и гипертензивных животных. М-и-Н-холинорецепторы вовлечены в реализацию гемодинамических эффектов слабого нейротоксина (WTX). В реализации гииотензивной активности присутствует миотропный компонент действия, при этом слабый нейротоксин (WTX) не обладает выраженной нейротоксической активностью.

Уровень внедрений

Получены рекомендации к следующим стадиям доклинических исследований (гранты Российского фонда фундаментальных исследований 0004-48889 и 03-04-48496) - руководитель исследований, доктор химических наук Ю.Н. Уткин (информационное письмо № 111-214.5-652 от 18.06.2004 г.). Результаты теоретических и практических исследований включены в план НИР кафедры биологии, физиологии и патологии ПятГФА с целью определения влияния слабого нейротоксина (WTX) на реологические показатели крови (акт об использовании результатов НИР).

Основные положения выносимые на защиту:

По результатам проделанной исследовательской работы на защиту выносятся следующие положения:

- Слабый нейротоксин (WTX) вызывает снижение АД и повышение ЧСС у бодрствующих нормотензивных животных и гипертензивных животных;

- Н-холинорецепторы вовлечены в реализацию гипотензивного эффекта слабого нейротоксина (WTX);

- NO-синтазная система принимает участие в реализации гипотензивной активности слабого нейротоксина (WTX);

- Слабоый нейротоксин (WTX) обладает нейротропной, а также слабо выраженной нейротоксической активностью.

Апробация и публикация результатов исследования.

Результаты работы докладывались и обсуждались на 7-ой и 8-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (2003-2004 г., г. Пущино); на третьей всероссийской школе-конференции по физиологии кровообращения (2004 г., г. Москва); на 59-й региональной конференции по фармации и фармакологии (2004 г., г. Пятигорск); на Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (2003 г., г. Москва); на чтениях памяти академика Ю.Н. Овчинникова (2003 г., г. Пущино).

По теме диссертации имеется 8 публикаций. .

Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук.

Диссертационная работа Огай А.Я. «Особенности сердечно-сосудистого действия слабого нейротоксина (WTX) из яда кобры Naja kaouthia» (Протокол №2 от 17.03.2004 г.) была выполнена в рамках грантов Российского фонда фундаментальных исследований (00-04-48889, "Выделение из ядов змей и структурная характеристика полипептидных соединений с новыми фармакологическими свойствами" и 03-04-48496, "Функциональная протеомика змеиных ядов: структурная и фармакологическая характеристика новых малопредставленных белков"), а также в соответствии с планом НИР Института биоорганической химии (ИБХ) РАН (Тема: "Идентификация в ядах змей и выделение новых полипептидных соединений с низкой токсичностью", План НИР ИБХ РАН на 2002 год, пункт 2, стр. 52; Тема "Идентификация новых минорных компонентов змеиных ядов, представляющих фармакологический интерес", План НИР ИБХ РАН на 2003 год, пункт 3, стр. 55).

Объем и структура диссертации.

Материал диссертации изложен на 119 страницах машинописного текста, иллюстрирован 6 таблицами и 23 рисунками. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов исследований, заключения, выводов и указателя литературы. Указатель литературы содержит 194 источника, в т. ч. 171 иностранных.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ:

1. Экспериментальные исследования по изучению активности слабого нейротоксина (WTX), позволяют рассматривать данное вещество как потенциальное лекарственное средство при лечении сердечнососудистых заболеваний.

2. Показано, что внутривенное введение слабого нейротоксина (WTX) вызывает дозозависимое снижение АД и повышение ЧСС у нормотензивных крыс и мышей и гипертензивных крыс. При этом сердечно-сосудистая система крыс оказалась более чувствительной к действию нейротоксина.

3. Определено вовлечение Н-холинорецепторов в механизм гипотензивной активности слабого нейротоксина (WTX) как нейротропного компонента. Эффективная ганглиоблокада потенцировала гипотензивную активность у мышей и незначительно подавляла гипотензию у крыс, что связано с различным строением, количеством и локализацией рецепторов-мишеней.

4. Показано, что М-холинорецепторы не участвуют в реализации WTX-зависимой гипотензии.

5. Установлено участие NO-синтазной системы как миотропного компонента гипотензивного действия слабого нейротоксина (WTX). Таким образом, слабый нейротоксин (WTX) способен влиять на разные патогенетические механизмы развития артериальной гипертензии.

6. Показано, что слабый нейротоксин (WTX) обладает нейротропной активностью, а также слабо выраженным нейротоксическим действием, что дает возможность создания экспериментальных моделей нейропатологий.