Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Определение функциональной активности компонентов C2, C3 и факторов B и D комплемента человека

ДИССЕРТАЦИЯ
Определение функциональной активности компонентов C2, C3 и факторов B и D комплемента человека - диссертация, тема по медицине
АВТОРЕФЕРАТ
Определение функциональной активности компонентов C2, C3 и факторов B и D комплемента человека - тема автореферата по медицине
Романов, Сергей Владимирович Москва 2004 г.
Ученая степень
кандидата биологических наук
ВАК РФ
14.00.36
 
 

Автореферат диссертации по медицине на тему Определение функциональной активности компонентов C2, C3 и факторов B и D комплемента человека

На правах рукописи

Романов Сергей Владимирович ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ

г

КОМПОНЕНТОВ С2, СЗ и ФАКТОРОВ В и I) КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА

14 00 36 аллергология и 'иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2004

Работа выполнена в Государственном учреждении «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Министерства здравоохранения Российской Федерации»

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор биологических наук,

профессор Л В Козлов

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук,

профессор М А Мягкова,

кандидат биологических наук Е М Гаврилова

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: НИИ геронтологии МЗ РФ

Защита состоится «_» _ 2004 г в _ часов на заседании

диссертационного совета К 208 046 01 Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им Г Н Габричевского Министерства здравоохранения РФ по адресу 125212, Москва, ул Адмирала Макарова, 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МНИИЭМ им Г Н Габричевского Министерства здравоохранения РФ

Автореферат разослан__2004 г

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

Л И Новикова

' ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследования, проводимые в лаборатории молекулярной иммунологии, посвящены разработке современных методов определения функциональной активности компонентов и факторов комплемента человека и применению этих методов для клинических исследований различных заболеваний инфекционной и аутоиммунной природы. Данная работа является частью этих исследований и состоит из разработки иммуноферментных методов определения функциональной активности компонентов С2, СЗ и факторов В и D комплемента человека и использованию этих методов для исследования механизмов действия комплемента и для клинических исследований.

Современные знания об участии комплемента в заболеваниях человека и его биологическом значении в иммунной защите тесно связаны с прогрессом лабораторных диагностических методов анализа комплемента, поскольку комплемент играет решающую роль в патогенезе различных заболеваний. При этом наибольшую диагностическую ценность представляет определение функциональной активности компонентов системы комплемента по сравнению с их количественным содержанием. Это обусловлено, прежде всего, изменением скорости обновления компонентов комплемента, определяемой соотношением процессов биосинтеза и катаболизма, которое нарушается при многих, главным образом, аутоиммунных заболеваниях.

Компоненты С2, СЗ и факторы В, D играют непосредственную роль в формировании С5-конвертаз классического и альтернативного путей. Процесс формирования С5-конвертаз обусловливает силу иммунного ответа ' и воспалительной реакции. Поэтому большой практический интерес представляет анализ функциональной активности этих белков.

Цель исследования. Определить функциональную активность компонентов С2, СЗ и факторов В, D иммуноферментными методами анализа. Изучить ингибирующее и активирующее действия ряда веществ на комплемент.

Задачи исследования.

1) разработать иммуноферментные методы определения активных форм компонентов С2 и СЗ при инициации классического пути;

2) найти удобные и применимые активаторы альтернативного пути для разрабатываемых методов;

I К1<~ НАЦИОНАЛЬНАЯ ЬИБЛИОТЕКА

3 , С Петербург

j

3) разработать иммуноферментные методы определения активностей компонента СЗ и факторов В и D при инициации альтернативного пути;

4) разработать методы анализа для оценки действия веществ, активирующих и ингибирующих систему комплемента;

5) показать применимость разработанных методов для клинических целей и лабораторных исследований.

Научная новизна результатов исследований.

1) разработаны иммуноферментные методы анализа активных форм компонентов СЗ, С2 при инициации классического пути системы комплемента (получено 2 патента РФ и подана одна заявка на получение патента);

2) разработаны иммуноферментные методы анализа активности компонента СЗ и факторов В, D при запуске альтернативного пути системы комплемента (поданы три заявки на получение патентов РФ);

3) разработан способ определения ингибирующего действия различных эффекторов на систему комплемента при образовании С5-конвертазы классического пути (получен патент РФ);

4) с помощью разработанного метода обнаружено декомплементизирующее действие CVF (фактора яда кобры) Naja melanoleuca и показано его количественное отличие от действия фактора яда других видов кобр;

5) определена активность компонента СЗ у пациентов с наличием и отсутствием

антител к вирусу герпеса и Chi. trachomatis.

Практическая значимость результатов исследований

1) Разработаны иммуноферментные методы определения функциональной активности компонентов С2, СЗ и факторов В и D комплемента, которые пригодны для применения в клинике.

2) Предложен способ определения ингибирующего действия веществ на систему комплемента на стадии образования С5-конвертазы, что может быть использовано для оценки противовоспалительного действия лекарственных веществ и иммуногенности вакцин.

3) Предложен способ определения способности веществ активировать альтернативный путь комплемента. Этот способ может найти применение для лабораторных исследований свойств лекарственных веществ и адьювантов.

Практическая ценность работы подтверждена в трех патентах и четырех заявках на патенты.

Положения, выносимые на защиту:

1) Разработаны иммуноферментные методы оценки функционально активных форм компонентов СЗ, С2 при инициации классического пути системы комплемента.

2) Разработаны методы иммуноферментного определения функциональных активностей компонента СЗ и факторов В и D при инициации альтернативного пути комплемента.

3) Разработан метод анализа и исследованы комплемент-ингибирующие свойства веществ на стадии образования С5-конвертазы классического пути. Разработан метод анализа и исследована комплемент-активирующая способность различных веществ при инициации альтернативного пути. Таким образом, показана применимость разработанных методов для лабораторных исследований механизмов функционирования системы комплемента.

4) Проведены анализы активности компонента СЗ в группах людей с наличием и . отсутствием антител к вирусу герпеса и Chi trachomatis, показана

применимость разработанных методов дня клинических анализов.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены и обсуждены на: международной конференции БИ(ЖАТАЛИЗ-2000 (Москва, июнь 2000 г.), V симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, апрель

2002), международной конференции «Цитокины, воспаление, иммунитет» (Санкт-Петербург, июнь 2002), международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы» (Санкт-Петербург, сентябрь

2003), научно-практической конференции «Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения» (Москва, декабрь 2003).

Публикации. Материалы по теме диссертации были представлены в 14 публикациях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы (глава 1 и 2), материалы и методы (глава 3), результаты исследования и их обсуждение (глава 4), выводы и список цитируемой литературы. Работа содержит 128 страницы машинописного текста, 23 рисунка и 10 таблиц. В библиографическом указателе приведено 227 источников.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Основная часть работы (получение анти-СЗ конъюгата, разработка иммуноферментных методов анализа) проводилась самостоятельно Ряд разделов работы выполнен с участием соавторов• Л. В Козлова, В Л. Дьякова, Т Н. Баталовой, В.А. Газовой, В.М. Лахтина, A.M. Бичучер, ЕА Колесниковой, С.С. Андиной.

Современными методами определения концентрации веществ являются сандвич-методы иммуноферментного анализа, в основе которых лежит трехстадийное выявление антигена с помощью специфических антител. На первой стадии анализа происходит сорбция антител, на второй стадии вносится тестируемый образец (предположительно содержащий антиген), на третьей стадии антиген распознается специфическим кокьюгатом. Таким образом, за счет взаимодействия антатела с антигеном происходит определение тестируемого вещества. В тех случаях, когда тестируемым веществом является белок, метод позволяет выявлять количество белка, но не его активность. Белок, потерявший активность, будет выявляться так же, как и активный.

Для определения функциональной активности белка нами было предложено использовать на второй стадии иммуноферментного анализа связывание белка на основе его функциональных свойств. Применительно к системе комплемента это осуществимо благодаря способности активного компонента СЗ связываться с мишенью в результате активации. Поскольку компонент СЗ является общим для обоих путей активации, то при инициации классического и альтернативного пути СЗ способен связываться на активаторе, при этом неактивный СЗ не обладает такой способностью. Это свойство компонента СЗ легло в основу всех методов анализа, описанных в данной работе. Для выявления связавшегося компонента СЗ применялся конъюгат анти-СЗ-антител (IgG) с пероксидазой хрена (ПХ).

1. Получение конъюгата против компонента СЗ человека и проверка его специфичности Для разработки методов анализа требовался специфичный конъюгат против СЗ компонента человека, который был получен из IgG-фракции кроличьих антител и пероксидазы хрена. Чтобы исследовать специфичность полученного конъюгата анти-СЗ-ПХ, конъюгат использовался для количественного определения компонента СЗ методом ИФА по обычной методике.

Результаты, полученные методом ИФА и методом РИД, сопоставили, чтобы найти соответствие между концентрациями компонента СЗ, найденными разными методами. Ниже приведен график корреляции этих результатов По оси абсцисс отложены значения концентрации СЗ, измеренные методом ИФА, по оси ординат - значения, полученные методом РИД, коэффициент корреляции Я характеризует высокую степень соответствия результатов (см. рис 1).

Г--0 25208 М 3356« В=0»8468 Кацшцщ« О. V ни

05 09 07 08 09 1 1 1 1 2 1 3

Рис. 1. Определение кониентпаиии СЗ (мг/мп) в сыворотке методами ИФА и РИП

Таким образом, на данном этапе работы была определена специфичность полученного конъюгата против СЗ компонента. Специфичность была подтверждена хорошим соответствием результатов анализа количества СЗ методами ИФА и РИД.

2. Разработка тест-системы по анализу функциональной активности СЗ

Следующей задачей, которую необходимо было решить в ходе создания тест-системы по анализу функциональной активности СЗ - выбор подходящего активатора. В качестве активатора классического пути был выбран ^ОЗ, который по литературным данным является наилучшим из иммуноглобулинов этого класса. ^вЗ был выделен из человеческой миеломной сыворотки и проверен на иммунохимическую чистоту методом иммуноэлектрофореза. Была подобрана также его оптимальная концентрация для сорбции.

Сорбция СЗ происходит в виде СЗЬ-фрагмента только после активации активного СЗ конвертазой, состоящей из активированных компонентов С2 и С4. Поэтому в системе необходимо присутствие этих компонентов в достаточных количествах, которые не лимитировали бы образование СЗ-конвертазы. В качестве источника этих компонентов был использован комплемент морской свинки. Установлено, что комплемент морской свинки способен образовывать СЗ-конвертазу при активации человеческим ^йЗ и в свою очередь активировать компонент СЗ человека. При этом присутствие избыточного количества компонента СЗ комплемента морской свинки не мешает активации СЗ человека, а также его определению, поскольку СЗ морской свинки не реагирует с кроличьими антителами к человеческому СЗ.

Были подобраны оптимальные разведения образцов сыворотки, при которых наблюдается линейная зависимость оптической плотности продукта ферментативной реакции в ИФА от концентрации определяемого активного СЗ, а также оптимальное разведение конъюгата анти-СЗ-ПХ (1:200). В результате была разработана ИФА тест-система по анализу количества активного СЗ компонента, основаная на способности активного СЗ связываться с активатором. Анализ осуществляется в 3 стадии:

1) в лунки, в которых сорбирован 1(^33, двукратными разведениями раститровывается определяемый образец человеческой сыворотки и вносится комплемент морской свинки, происходит образование СЗ-конвертазы, которая активирует СЗ компонент человека,

2) СЗЬ фрагмент, возникший при расщеплении активного СЗ компонента, связывается с активатором и выявляется конъюгатом анти-СЗ-ПХ,

3) при добавлении субстратного буфера развивается окраска, измеряемая спектрофотометром с вертикальным лучом (ридером).

Проведено сравнение активности компонента СЗ в образцах сывороток, измеренной разработанным методом ИФА, а также гемолитическим методом. Результаты сравнения приведены на рис. 2.

Мютип

1 ' ' 1 1 = 0037484 ♦10254» 1=09998

1 1 1 О

1 ■!

1 \ 1

\ ■ 1

1 . . . . . . 1 . . . 1 . . .

08 1 12 14 1! 19

Генолю, ыгтга

Рис. 2. Функциональная активность СЗ. определенная гемолитическим методом и разработанным методом ИФА

Коэффициент корреляции, близкий к единице показывает, что результаты, полученные данным методом ИФА и гемолитическим методом, имеют высокую степень соответствия.

3. Исследование процесса ингибирования образования С5-конвертазы

На основе разработанной тест-системы по анализу количества активного СЗ был предложен метод определения ингибирующего действия различных веществ на стадии образования С5-конвертазы (на примере адреналина и лизоцима).

Ингибирукмцее действие лизоцима и адреналина основано, на способности активированного СЗ компонента комплемента ковалентно связываться с мишенью (СЗ-конвертазой) или с нуклеофильной группой молекулы ингибитора. Ингибитор связывает образующийся СЗЬ фрагмент в жидкой фазе, не позволяя ему войти в состав С5-конвертазы. В нашем случае связывание СЗЬ фрагмента с ингибитором выявляется по уменьшению количества СЗЬ, иммобилизованного на твердой фазе Таким образом, чем сильнее ингибируется процесс образования С5-конвертазы, тем меньше конъюгата свяжется с подложкой, а, следовательно, тем меньше будет значение оптической плотности.

Для того, чтобы выявлять действие ингибитора непосредственно на стадии образования С5-конвертазы, необходимо было модифицировать описанный метод определения активности СЗ компонента: при добавлении тестируемого образца СЗ-конвертаза морской свинки должна быть уже сформирована, для чего вводится

еще одна стадия инкубации. Однако возникла проблема стабильности образующейся конвертазы, для СЗ-конвертазы морской свинки константа полураспада около двух минут. Чтобы добиться воспроизводимости результатов, необходимо было продлить время существования СЗ-конвертазы. СЗ-конвертаза является невалентным комплексом активированных компонентов С2 и С4 - С2а4Ь, стабилизированного ионами Известно, что если в СЗ-конвертазе

комплемента человека М§2+ заменить на ионы никеля, то период полураспада СЗ-конвертазы существенно возрастает. Проведенные эксперименты показали стабилизацию ионами №2+ также и конвертазы комплемента морской свинки. В ходе экспериментальной работы были найдены оптимальные концентрации комплемента морской свинки и N¡(N03)2 и оптимальное время инкубации этой смеси. Эти параметры были подобраны так, чтобы количество образованной СЗ-конвертазы было наибольшим.

В результате была разработана ИФА тест-система для исследования ингибировання процесса связывания СЗ с его активатором, т.е. процесса образования С5-конвертазы классического пути. Анализ осуществляется в 4 стадии:

1) в лунки, где сорбирован ^вЗ, вносится комплемент морской свинки и соль никеля, происходит образование «долгоживущей» №2+-зависимой СЗ-конвертазы морской свинки,

2) в лунки, где произошло образование СЗ-конвертазы морской свинки, двукратными разведениями раститровываются образцы человеческой сыворотки с добавлением различных количеств ингибитора,

3) СЗЬ фрагмент, возникший при расщеплении активного СЗ компонента и связанный с твердой фазой, выявляется анти-СЗ-конъюгатом.

4) при добавлении субстратного буфера развивается окраска. Активность ингибитора определяется по уменьшению количества связавшегося С'ЗЬ фрагмента.

Адренаттн, мкг-'мп Рис, 3. Ингибгтование связывания СЗЬ с СЗ-конвертазой

На графике, приведенном выше, построена кривая насыщения, аналогичная описываемой уравнением Михаэлиса-Ментен. Данная зависимость имеет следующий физический смысл: большие концентрации ингибитора связывают все количество образующегося СЗЬ фрагмента, и дальнейшее внесение ингибитора не приносит заметного эффекта.

Исходя из полученных данных были вычислены константы ингибирования для адреналина и чизоцима, которые отражают способность этих веществ связывать фрагмент СЗЬ. Для адреналина константа ингибирования совпадает с приведенной в литературе, где указана константа ингибирования, определенная гемолитическим способом. Для лизоцима константа ингибирования СЗ была найдена впервые.

Таблина 1. Константы ингибирования СЗЬ для адреналина и чизоцима

Ингибитор К„мМ (метод ИФА) К„ мМ (гем. метод)

Адреналин 0,32 0,3

Лизоцим 0,26 —

Таким образом, разработанный метод ИФА для анализа функциональной активности СЗ позволяет не только определять активность СЗ в образцах крови, но также применим для использования при исследовании ингибирукяцего действия

веществ на стадии образования С5-конвертазы классического пути По сравнению с гемолитическим методом имеется преимущество: конъюгат напрямую выявляет связавшийся с твердой фазой фрагмент СЗЬ.

4. Определение активности С2 Участие С2 в активации классического пути можно оценить по способности фрагмента С2а (каталитической субъединицы СЗ-конвертазы классического пути) расщеплять СЗ компонент. Чтобы определять активность С2 необходимо было подобрать условия при которых выход продукта ферментативной реакции (количество СЗЬ) линейно зависел бы от концентрации активного С2 в сыворотке. Поэтому все компоненты комплемента, предшествующие расщеплению СЗ, и сам СЗ должны быть в избытке, кроме определяемого компонента С2. В качестве источника этих компонентов был применен реагент Я2, в котором активность С2 практически отсутствует при сохранении активностей других компонентов Условия, подобранные для анализа активности СЗ, сохранялись (количество и тип активатора классического пути, титр конъюгата).

Таким образом, была разработана ИФА тест-система для анализа количества активного С2 компонента, основанная на определении выхода продукта ферментативной реакции (количества фрагмента СЗЬ), который способен связываться с подложкой Анализ осуществляется в 3 стадии:

1) в лунках, где сорбирован ^вЗ, происходит активация системы комплемента по классическому пути в условиях дефицита определяемого компонента С2, при этом связывание активированного СЗ на поверхности лунок прямо пропорционально концентрации активного С2 в анализируемом образце;

2) конъюгат анти-СЗ-ПХ выявляет связанный фрагмент СЗЬ;

3) при добавлении субстратного буфера развивается окраска.

Была определена активность компонента С2 в образцах сыворотки с известной активностью С2, в которых наличие активного С2 было установлено гемолитическим методом (см. таблицу 2). Наблюдалось четкое соответствие результатов, полученных с применением разработанного ИФА метода, и данных по количеству активного С2 в образцах.

Таблица 2. Определение активности компонента С2 (в мкг активного белка) в образиах методом ИФА в сравнении с гемолитическим методом

№ образца Гемолиз ИФА

1 0.020 0.015

2 0.012 0.012

3 0.006 0.006

4 0.004 0.005

5 0.002 0.001

Таким образом, разработанный метод ИФА выявляет активность С2 компонента по выходу продукта ферментативной реакции. Результаты, полученные методом ИФА и гемолитическим методом, хорошо коррелируют.

5. Выбор активатора альтернативного пути Перед нами стояла задача выбрать такие активаторы альтернативного пути, которые были бы удобны для применения in vitro, т.е. доступны, достаточно активны и хорошо сорбирующиеся на полистироле.

В качестве активаторов альтернативного пути были исследованы IgA, IgG, КИП (комплексный иммуноглрбулиновый препарат, содержащий различные классы иммуноглобулинов: IgG - 50-70%, IgM - 15-25%, IgA - 15-25%), Л ПС (липополисахарид из клеточной стенки бактерий), СЗ компонент морской свинки

Для всех перечисленных активаторов альтернативного пути найдены оптимальные концентрации при их сорбции, а затем сопоставлены их активирующие свойства. Высокие значения тангенса угла наклона линейной зависимости оптической плотности от концентрации сыворотки в условиях определения активности СЗ и низкий уровень фона рассматривались как положительные критерии активаторов. Ниже представлены графики, характеризующие свойства различных активаторов.

КИП обозначен на графике CIg, СЗ морской свинки - СЗ, коэффициент корреляции - R. Уравнение вида: у = а + Ах, дает характеристику активатору, где а характеризует фон, а Ь - активирующую способность (тангенс угла наклона).

-у = 029511 +15.522Х 0.93495

--у = 0.322 + 5.2114х Я* 0.99314

--у = 0.65071 + 18.283Х Я= 0.97368

-----у = 0.42823 + 13.514* 14= 0.99773

----у = 0.37879 + 20.191Х 0.98414

-X.

_1_

0.01

0.05

0.02 0.03 0.04

Титр сыворотки

Рис. 4. Сравнительная характеристика активаторов АП

0.06

Таким образом, в ходе экспериментальной работы было установлено, что из рассматриваемых активаторов АП для ИФА тест-систем наилучшим является ^А. Хотя ЛПС и КИП превосходят IgA по активирующей способности, но дают больший фон.

6. Определение активности СЗ по альтернативному пути

Для создания линейной зависимости количества иммобилизованного СЗ от количества активного СЗ в сыворотке необходимо создать избыток СЗ-конвергазы альтернативного пути, для образования которой необходимы факторы В и О. В качестве источника факторов В и О был использован ЯЗ (реагент к СЗ компоненту). В результате ряда экспериментов была найдена оптимальная концентрация ЯЗ (10 мкл/лунку).

Поскольку альтернативный путь по выходу продуктов активации (СЗЬ) значительно уступает классическому пути, оптимальное разведение сыворотки, установленное экспериментально, оказалось на порядок меньше и составило 1:20 в первой лунке.

Таким образом, была разработана ИФА тест-система по анализу количества активного СЗ компонента при инициации альтернативного пу1и. Анализ осуществляется в 3 стадии:

1) в лунках с сорбированным активатором происходит активация комплемента по альтернативному пути в условиях дефицита определяемого компонента СЗ:

2) конъюгат анти-СЗ-ПХ выявляет связанный фрагмент СЗЬ:

3) при добавлении субстратного буфера развивается окраска.

Для определения точности метода брался образец контрольной лиофильно высушенной сыворотки, который содержал нормальное количество активного С'3 (установлено гемолитическим методом). Были приготовлены образцы с различным содержанием активного белка. Ниже приводятся данные по определению активности СЗ при запуске альтернативного пути на различных активаторах.

Таблица 3. Определение активности компонента СЗ по альтернативному пути методом ИФА в образиах с известным содержанием активного белка (мкг)

№ образца Активатор Активность СЗ ИФА

1 0.60 0.60

2 1«А 0.36 0.38

3 0.18 0.19

4 ДО 0.60 0.60

5 0.36 0.33

6 0.60 0.60

7 0.54 0.53

8 КИП 0.48 0.47

9 0.43 0.35

10 0.36 0.34

11 СЗ морской свинки 0.60 0.60

12 0.36 0.40

13 0.12 0.16

Как следует из таблицы, активность СЗ компонента, выявленная данным методом ИФА, соответствует его активности в образцах сыворотки, определенной гемолитическим методом.

7. Определение активности фактора В

Фактор В является каталитической субъединицей фермента - СЗ-конвертазы альтернативного пути. Активность фактора В в составе этого фермента можно определять по выходу продукта ферментативной реакции - активированному СЗЬ, способному ковалентно связываться на активаторе АП. Связанный СЗЬ можно выявить с помощью конъюгата анти-СЗ-ПХ.

Для получения линейной зависимости количества сорбированного фрагмента СЗЬ от количества активного фактора В, необходимо иметь избыток СЗ и фактора О. Источником СЗ и фактора О служил ЯВ (реагент для определения фактора В гемолитическим методом). В ходе экспериментальной работы были подобраны оптимальные количества ЯВ и разбавления исследуемой сыворотки.

Таким образом, была разработана ИФА тест-система по анализу количества активного фактора В при инициации альтернативного пути Анализ осуществляется в 3 стадии:

1) в лунках, где сорбирован активатор, происходит активация комплемента по альтернативному пути в условиях дефицита определяемого фактора В, количество связавшегося с активатором фрагмента СЗЬ линейно зависит от активности фактора В;

2) конъюгат анти-СЗ-ПХ выявляет связанный фрагмент СЗЬ;

3) при добавлении субстратного буфера развивается окраска.

Для выяснения точности метода брался образец контрольной лиофильно высушенной сыворотки, содержащий нормальное количество активного фактора В (активность установлена гемолитическим методом). Были приготовлены образцы с различным содержанием активного белка. Количество связавшегося СЗЬ было прямо пропорционально активности фактора В. Количества активного фактора В в данных образцах, определенные разработанным методом, на различных активаторах альтернативного пути приведены в таблице 4.

Таблица 4. Определение активности Фактора В методом ИФА в образиах с известной кониентраиий активного белка (мкг/мч)

№ образца Активатор Гемолиз ИФА

1 200 200

2 180 176

3 160 165

4 140 156

5 120 117

6 100 91

7 80 79

8 60 58

9 20 24

10 42 42

11 ДО 25 24

12 8 10

13 СЗ морской свинки 11 11

14 5 5

15 3 3

16 2 2

Как следует из таблицы, активность фактора В, выявленная данным методом ИФА, соответствует его активности в образцах сыворотки, где эта характерна ика уже определена гемолитическим методом.

Г

8. Определение активности фактора О

> Участие фактора О в активации альтернативного пути комплемента

выражается в активации комплекса СЗЬВ с превращением его в СЗЬВЬ - СЗ-конвертазу альтернативного пути. Избыток фактора В и СЗ приводит зависимость количества иммобилизованного СЗЬ от активности фактора Г) к линейному виду. Источником СЗ и фактора В являлся ЮЭ (реагент с отсутствием активности фактора О), .получаемый хроматографическим удалением фактора О из сыворотки человека. В ходе экспериментальной работы были подобраны оптимальные количества КО и разбавления исследуемой сыворотки. Таким образом, была

разработана ИФА тест-система для определения количества активного фактора О при инициации альтернативного пути. Анализ осуществляется в 3 стадии:

1) в лунках, где сорбирован активатор, происходит активация комплемента по альтернативному пути в условиях дефицита определяемого фактора И, количество связавшегося с активатором фрагмента СЗЬ линейно зависит от активности фактора В:

2) конъюгат анти-СЗ-ПХ выявляет связанный фрагмент СЗЬ:

3) при добавлении субстратного буфера развивается окраска.

Для выяснения точности метода брался образец контрольной лиофильно высушенной сыворотки, содержащий нормальное количество активного фактора Б (активность установлена гемолитическим методом). Были приготовлены образцы с различным содержанием активного белка. Количество связанного СЗЬ было прямо пропорционально количеству активного фактора О. Количества активного фактора И в данных образцах, определенные новым методом, на различных активаторах альтернативного пути приведены в следующей таблице-

Таблица 5. Определение активности Фактора Р методом ИФА в образиах с известной кониентраиий активного белка (мкг/мл)

№ образца Активатор Гемолиз ИФА

1 2.00 2.20

2 1.80 1.72

3 1.60 1.60

4 1.40 1.39

5 1.20 1.05

6 1.00 0.83

7 0.80 0.77

8 0.60 0.58

9 0.40 0.38

10 0,20 0.12

11 ДО 0.20 0.20

12 0.10 0.14

13 СЗ морской свинки 0.10 0.10

14 0.06 0.05

15 0.02 0.04

Как следует из таблицы, активность фактора D, выявленная данным методом ИФА, соответствует его активности в образцах сыворотки, где эта характеристика уже определена гемолитическим методом.

9. Исследование действия на комплемент человека CVF из Naja naja, Naja kaja и Naja melanoteyca

Разработанные тест-системы для анализа активации альтернативного пути могут быть использованы не только в клинической диагностике, но и для исследования комплемент-активирующей способности различных веществ, например, CVF (фактора яда кобры). Яды кобр давно привлекли внимание исследователей той особенностью, что у млекопитающих в ответ на укус этих змей не возникает отека, а ничтожных количеств нейротоксинов достаточно для летального исхода. Токсическое действие яда кобр обусловлено не только спецификой строения нейротоксинов, но и особой группой белков, обладающих мощным декомплементизирующим действием, что препятствует развитию отека и сцособствует беспрепятственному распространению яда. Поэтому фактор яда кобры (CVF) стал объектом исследования для комплементологов Эти исследования показали, что декомплементизирующая способность CVF объясняется активацией этим фактором альтернативного пути комплемента. Перед нами стояла задача: разработать метод оценки декомплементизирующих свойств CVF-зависимых СЗ-конвергаз на основе разработанных методов ИФА.

Во-первых, были определены константы насыщения для сорбции на полистироловых микропанелях для Naja melanoleyca и Naja naja kaouthia. Для CVF Nn.k константа насыщения сорбционной поверхности составила ÄT=5.5±I .5 мкг/мл, для N.m. К'2.27±\.51 мкг/мл. Поэтому для дальнейших исследований мы брали сорбционную концентрацию для всех CVF 10 мкг/мл, которая заметно превышала сорбционную емкость полистиролового микропланшета, и это дает основания полагать, что последующие результаты не зависят от сорбционных свойств CVF, а зависят только от их способности активировать АП.

В дальнейшем были сопоставлены результаты активации системы комплемента CVF трех видов кобр при одинаковой сорбционной концентрации (10 мкг/мл), CVF (N.m.) представлен двумя формами, выделенными из яда кобры при разных условиях. Начальное разведение сыворотки крови соответствовало 10

мкл сыворотки в первой лунке (общий объем 100 мкл). Оценка активации системы комплемента было основано на определении количества сорбированного фрагмента СЗЬ (см.рис.5).

-у = 015857+ 1 8146Х R=0

--у = 0 08513 + 0 79722Х R= Q 98729 -

' — у = 0 15452 + 2 4В89х R= 0 9658 "--- у = 017398 + 27423х R= 098997 "

004 006 008

Титр сыворотки

Рис. 5. Активаиш комплемента человека CVF разных видов кобр

Тангенс угла наклона прямых на графиках, характеризующих зависимость количества связанного СЗЬ от добавленной сыворотки, отражает декомплементизирующую способность CVF. Таким образом, CVF N.n k превосходит по декомплементизирующему действию CVF N.h., что соответствует литературным данным. А наибольшей декомплементизирующей способностью из исследованных CVF обладает CVF N.m., свойства которого были изучены впервые. По-видимому, свойствам CVF N.m. до сих пор не уделялось внимания по той причине, что яд черно-белой кобры (N.m.) уступает по токсичности ядам других видов кобр. Тем интереснее факт, что по декомплементизирующей способности CVF N.m. превосходит CVF N.n.к. я N.h..

10. Исследование функциональной активности компонента СЗ в сыворотках с наличием и отсутствием антител к различным возбудителям

Были проведены исследования по определению функциональной активности СЗ у пациентов с наличием антител к возбудителям различной природы: в случае хламидии - бактериальной, в случае герпеса - вирусной. Результаты анализа оказались различными для возбудителей бактериальной и вирусной природы.

Обследуемые группы с наличием и отсутствием АТ к вирусу герпеса.

Проблема при подборе обследуемого материала состояла в том, что подавляющее большинство взрослых людей являются носителями антител к вирусу, поэтому группа с отрицательным контролем состояла всего из 5 человек и среди них было 3 детей, однако разброс уровня активности С1 в группе был невелик: менее 12%. Одновременно была исследована группа из 5 человек с наличием IgM антител к вирусу, что является свидетельством недавнего знакомства с возбудителем и предполагает изменения в активности СЗ. В группе с наличием антител только класса такой общей тенденции к снижению активности СЗ обнаружено не было.

Более того, чтобы не ориентироваться на малочисленную и разновозрастную группу с отсутствием АТ (^О, ^М классов), мы разделили группу с наличием ^С/ антител к вирусу на две группы с более высокими и более низкими титрами однако и здесь выявить какой-либо существенной разницы в активности СЗ не удалось. Это, вероятно, говорит о том, что группа с наличием АТ состоит в основном из носителей долговременной иммунологической памяти к вирусу. Результаты представленные в таблице рассчитаны относительно контрольной сыворотки, активность СЗ в которой принята за единицу.

Таблица 6. Активность СЗ в группах с наличием и отсутствием АТ к герпесу

Обследуемые группы Среднее значение активности СЗ в группе (усл. ед.)

Группа с отсутствием АТ (5 человек) 0,981 ±0,111

Группа с наличием ^М АТ (5 человек) 0,894±0,130

Группа с относительно низким титром 1дС АТ (21 человек) 0,94±0,19

Группа с относительно высоким титром АТ (13 человек) 0,938±0,187

Недостоверное (р > 0.1) снижение активности СЗ у группы с ^М АТ относительно группы с отсутствием АТ составляет около 9%. Таким образом, в случае наличия антител класса к вирусу герпеса не выявляется четкая

тенденция к снижению уровня СЗ. Наличие антител IgM класса к вирусу возможно проявляется в снижении уровня активности СЗ в группе обследованных.

Обследуемые группы с наличием н отсутствием AT к Chi. trachomatis В качестве материала для исследования были выбраны сыворотки крови пациентов, сдававших кровь на анализ содержания IgO антител к Chlamidia trachomatis. При этом не проводилась дифференциация пациентов на болевших ранее, вновь заболевших или подозреваемых в заболевании. Не была проведена дифференциация по полу и возрасту. При этом также не учитывалось возможное наличие других заболеваний или других специфических антител. Важно было выявить, имеются ли какие-то общие закономерности, которые можно было бы согласовать с известными in vitro механизмами активации комплемента.

Анализируемые сыворотки были разбиты на две группы- 1 группа (14 сывороток) - серопозитивные с содержанием IgG антител против Chlamidia trachomatis в титрах от 1:50 до 1:400; 2 группа (15 сывороток) - серонегативные, не содержащие специфических антител. В сыворотках определяли функциональную активность компонентов СЗ, комплекса CI r2sj.

Поскольку при активации комплемента in vitro происходит во времени синхронное падение активности компонентов комплемента, в случае активации системы комплемента должна наблюдаться корреляция между активностями отдельных его компонентов. Возникали следующие вопросы: так ли это в случае реальных живых систем и вызывает ли постоянную активацию комплемента наличие в крови антител к патогену, а также есть ли корреляция между функциональной активностью компонентов комплемента и количеством комплемент-активирующих циркулирующих иммунных комплексов.

На первом этапе исследований было проведено сравнение корреляции активностей компонента СЗ - ключевого компонента системы и C1r2s2 -ферментативно активного комплекса субкомпонентов первого компонента комплемента, ответственного за активацию системы, для серопозитивных (рис 6) и серонегативных (рис. 7) сывороток. Следует отметить, что такая корреляция наблюдалась в первом случае и отсутствовала во втором.

-»=07045 •3 5637Х 1 » 0 68032 О

-------

О ---О

( о 1

t О

О

02

04 05

СЗ

Рис. 6. Снижение уровня активных СЗ и С Irs в группе с нштиемАТ 09

ое

07 06 05 04 03 02

-у= 0^5513 О

ивзозх 'R=ooiq

07 08 СЗ

09

Рис. 7. Активности СЗ и Clrs в группе без AT к Chl.trachomatis Для доказательства, что именно специфические к данному патогену иммунные комплексы приводят к активации комплемента, было изучено наличие корреляции между падением функциональной активности СЗ и ростом титров IgO антител к Chlamidia trachomatis (рис.8) Такая корреляция действительно наблюдается. Параллельно проводились исследования зависимости количества активного СЗ от наличествующих в сыворотке циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) (рис.9).

100 200 300 400 Титр антител IgG

Рис.8. Активность СЗ и титр IvG AT к Chi trachomatis

08 0.7 0.6 8 os

04

оз 0.2

-50 0 50 100 150 200 250

СЮ

Рис.9. Корреляиия активности СЗ и количества ЦИК Проведенная работа показывает, что активация комплемента протекает в организме аналогично изученным закономерностям в искусственных системах. Кроме того, следует полагать, что наличие в крови антител к патогену свидетельствует о возможном присутствии соответствующего антигена и существовании специфических иммунных комплексов Таким образом, пониженная функциональная активность ключевых компонентов комплемента, наряду с наличием комплемент-активирунмцих иммунных комплексов и высокими титрами специфических антител могут быть диагностическими критериями бактерионосительства.

Итак, в случае наличия IgG антител к хламидии наблюдается общая тенденция снижения уровня активного СЗ компонента при увеличении концентрации антител. Причем количество активного СЗ симбатно снижается с активностью комплекса С Irs у группы с наличием антихламидийных AT. В контрольной группе такая тенденция не наблюдается.

Для проведения сравнения активности компонента СЗ в крови в зависимости от возраста были использованы группа обследуемых, у которых антихламидийных антител не было обнаружено, и труппы, у которых были обнаружены IgG антитела против Chlamidia trachomatis и против герпеса. Возрастные изменения активности СЗ у этих групп больных обнаруживали некоторые отличия, по-видимому, обусловленные наличием специфических антител.

Проведенные исследования показали применимость разработанных тест-систем для клинических анализов, в частности для исследования активности

компонентов комплемента при наличии инфекционной патологии или возрастных

изменений.

ВЫВОДЫ:

1) Разработаны методы иммуноферментного определения функциональной активности компонентов СЗ, С2 при инициации классического пути системы комплемента (получено 2 патента РФ и подана одна заявка на получение патента).

2) Разработаны иммуноферментные методы оценки функциональной активности СЗ компонента, факторов В, D при инициации альтернативного пути комплемента (поданы три заявки на получение патентов РФ).

3) Определена комплемент-активирующая способность lgA, IgG, КИП, ЛПС, СЗ компонента морской свинки, а также CVF различных видов кобр при инициации альтернативного пути.

4) Разработан метод иммуноферментного анализа для выявления комплемент-ингибирующих свойств веществ на стадии образования С5-конвертазы классического пути. Определено ингибирующее действие адреналина и лизоцима (получен патент РФ).

5) Показана применимость разработанных методов для клинических анализов и лабораторных исследований механизмов функционирования системы комплемента.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1) Козлов JIB, Лахтин ВМ, Романов СВ, Баталова ТН, Дьяков В Л, Гузова В А Способ определения ингибирующего действия веществ на комплемент// Патент РФ № 2195665. 27.12.2002. Бюллетень № 36.

2) Козлов Л В, Романов С В, Баталова TH., Лахтин В.М, Гузова В А , Дьяков В.Л. Способ определения функциональной активности компонента СЗ комплемента человека// Патент РФ № 2195664. 27.12.2002. Бюллетень №36.

3) Козлов Л В., Романов C.B., Дьяков В.Л., Баталова Т.Н., Лахтин В М., Гузова В.А. Способ определения функциональной активности компонента С2 комплемента человека// Патент РФ № 2195670.27.12.2002. Бюллетень № 36.

4) Козлов Л В., Романов СВ., Баталова Т.Н., Лахтин В.М., Гузова В А., Дьяков В.Л. Способ определения функциональной активности компонента СЗ комплемента человека по альтернативному пути активации// Заявка на патент РФ. №2003110060 от 09.04.03.

5) Козлов Л.В., Романов С В, Баталова Т.Н., Лахтин В.М, Гузова В.А., Дьяков В Л. Способ определения функциональной активности фактора В комплемента человека// Заявка на патент РФ № 2003110061 от 09.04.03.

6) Козлов Л.В., Романов C.B., Баталова Т.Н., Лахтин В.М., Гузова В.А., Дьяков

B.Л. Способ определения функциональной активности фактора D комплемента человека // Заявка на патент РФ № 2003110059 от 09.04.03.

7) Козлов Л В., Дьяков ВЛ, Романов C.B., Лахтин ВМ., Бичучер A.M, Андина

C.С., Колесникова Е. А. Функциональная активность компонентов комплемента - новый диагностический критерий// Материалы третьей международной конференции посвященной 80-летию Ин-та им. Пастера. С.-Петербург. 2003, С. 167.

8) Козлов Л.В., Лахтин ВМ., Дьяков В.Л, Романов С.В, Бичучер А.М Действие иммуноглобулинов различных классов на систему комплемента// Сборник материалов научно-практической конференции «Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения». Приложение к журналу «Вестник восстановительной медицины». 2003. С. 10-11.

9) Козлов Л.В., Романов C.B., Дьяков В.Л. Способ определения функциональной активности компонента СЗ комплемента человека по классическому пути активации// Заявка на патент РФ № 2003135511 от 09.12.03.

10)Романов С В, Козлов JI.B., Дьяков В.Л Определение активности протеиназ системы комплемента иммуноферментными методами// Тез. докл. V симпозиума «Химия протеолитических ферментов». М. 2002. С. 123. 1 \) Романов СВ., Козлов Л.В, Дьяков В.Л Применение ИФА для выявления вторичных дефицитов компонентов комплемента// Материалы третьей международной конференции посвященной 80-летию Ин-та им. Пастера. С.Петербург. 2003. С.177.

12) Романов СВ, Козлов Л.В, Дьяков В.Л, Баталова Т.Н., Гузова В А. Определение активности протеиназ системы комплемента иммуноферментными методами// Биомедицинская химия. 2003. Т. 49. № 6. С. 604-612.

13)Kozlov L.V., Lakhtin У.М, Batalova T.N., Gouzova V.A., D'yakov VL, and Romanov S. V Inhibition by an egg lysozyme of three stages of an enzymatic cascade of activation of the classic path of the human complement// International conference Biocatalys-2000, Fundamentale & Application, Abstracts. P. 110-111

14)Kozlov L V., Lakhtin VM, Batalova T.N., Gouzova VA, D'yakov VL, and , Romanov S. V Inhibition by an egg lysozyme of three stages of an enzymatic cascade

of activation of the classic path of the human complement// Vestnik Mosk. Univ., Khimiya. 2000. V. 41. № 6. P. 88-90.

IM

í

/

I

г

РНБ Русский фонд

2007-4 4055

\

О 5 MAP 2004

 
 

Оглавление диссертации Романов, Сергей Владимирович :: 2004 :: Москва

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. СИСТЕМА КОМПЛЕМЕНТА.

1.1. АКТИВАЦИЯ СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА.

1.1.1. Механизм активации классического пути.

1.1.2. Механизм активации альтернативного пути.

1.1.3. Сравнение классического и альтернативного путей активации.

1.1.4. Регуляция системы комплемента.

1.2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА.

1.3. СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИИ СЗ/С5 - КОНВЕРТАЗ.

1.3.1. Конвертазы классического пути.

1.3.2. Конвертазы альтернативного пути.

1.3.3. Ингибирование образования С5-конвертаз.

ГЛАВА 2. КОМПОНЕНТЫ И ФАКТОРЫ СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА.

2.1. СЗ - КЛЮЧЕВОЙ УЧАСТНИК АКТИВАЦИИ.

2.1.1. Биологическая роль СЗ компонента и его фрагментов.

2.1.2. Способы выделения компонента СЗ.

2.1.3. Дефициты СЗ.

2.2. КОМПОНЕНТ С2 - КАТАЛИТИЧЕСКАЯ СУБЪЕДИНИЦА СЗ/С5-КОНВЕРТАЗ КЛАССИЧЕСКОГО ПУТИ.

2.2.1. Биологические функции С2 компонента.

2.2.2. Генетика С2 компонента.

2.2.3 Дефициты С2.

2.3. ФАКТОР В.

2.3.1. Ферментативные свойства фактора В.

2.3.2. Дефициты фактора В (BfD).

2.4. ФАКТОР D.

2.4.1.Ферментативные свойства фактора D.

2.4.2. Дефициты фактора D (DfD).

ЧАСТЬ II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. ОБСЛЕДОВАННЫЕ ГРУППЫ ЛИЦ.

3.2 МАТЕРИАЛЫ.

3.3 ПРОЧИЕ МАТЕРИАЛЫ.

3.4. ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАБОЧИХ РАСТВОРОВ И ПРОЧИХ РАБОЧИХ СРЕД.

3.5. ОБЩИЕ МЕТОДЫ.

3.5.1. Иммунизация животных.

3.5.2. Иммунопреципитация по Оухтерлони.

3.5.3. Иммуноэлектрофорез (ИЭФ) в модификации по Шейреггеру.

3.5.4. Определение концентрации СЗ методом радиальной иммунодиффузии (РИД).

3.5.5. Приготовление реагента R2.

3.5.6. Приготовление R3.

3.5.7. Получение конъюгата к СЗ человека.

3.5.8. Определение количества компонента СЗ методом ИФА.

3.6. МЕТОДИКИ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ.

3.6.1. Получение иммунохимически чистого СЗ человека.

3.6.2. Выделение IgG фракции из кроличьей антисыворотки.

3.6.3. Выделение lgG3 из миеломной сыворотки человека.

3.6.4. Выделение IgA из миеломной сыворотки человека.

3.6.5. Выделение СЗ из сыворотки морской свинки.

3.6.6. Выделение фактора D и получение RD.

3.7. ГЕМОЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.

3.7.1. Эритроциты барана.

3.7.2. Приготовление стандартной взвеси бараньих эритроцитов.

3.7.3. Приготовление сенсибилизированных эритроцитов.

3.7.4. Приготовление комплекса ЕАС14.

3.7.5. Определение активности компонентов гемолитическим методом.

3.7.6. Получение эритроцитов кролика.

3.7.7. Определение активности фактора D гемолитическим методом.

3.7.8. Определение активности участников альтернативного пути гемолитическим методом.

3.8. СОБСТВЕННЫЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАЗРАБОТКИ.

3.8.1. Определение активности СЗ по классическому пути.

3.8.2. Ингибирование функциональной активности СЗ компонента.

3.8.3. Определение активности С2.

3.8.4. Определение активности СЗ по альтернативному пути.

3.8.5. Определение активности фактора В.

3.8.6. Определение активности фактора D.

3.8.7. Исследование действия на комплемент человека CVF из

Naja naja, Naja haja и Naja melanoleyca.

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. ПОЛУЧЕНИЕ КОНЪЮГАТА ПРОТИВ КОМПОНЕНТА СЗ ЧЕЛОВЕКА И ПРОВЕРКА ЕГО СПЕЦИФИЧНОСТИ.

4.1.1. Определение разведения конъюгата.

4.1.2. Анализ количества СЗ в образцах сывороток.

4.2. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ АНАЛИЗА АКТИВНОСТЕЙ КОМПОНЕНТОВ КЛАССИЧЕСКОГО ПУТИ.

4.2.1. Разработка метода анализа функциональной активности СЗ.

4.2.2. Исследование процесса ингибирования образования С5-конвертазы.

4.2.3. Определение активности С2.

4.3. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ АНАЛИЗА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ АКТИВНОСТЕЙ УЧАСТНИКОВ АЛЬТЕРНАТИВНОГО ПУТИ.

4.3.1 Выбор активатора альтернативного пути.

4.3.2 Определение активности СЗ по альтернативному пути.

4.3.3. Определение активности фактора В.

4.3.4. Определение активности фактора D.

4.3.5. Исследование действия на комплемент человека CVF из

Naja naja, Naja haja и Naja melanoleyca.

4.4. ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КОМПОНЕНТА СЗ В СЫВОРОТКАХ С НАЛИЧИЕМ И ОТСУТСТВИЕМ АНТИТЕЛ К РАЗЛИЧНЫМ ВОЗБУДИТЕЛЯМ.

4.4.1. Обследуемые группы с наличием и отсутствием AT к вирусу герпеса.

4.4.2.0бследуемые группы с наличием и отсутствием AT к Chl.trachomatis.

4.4.2. Влияние возраста на активность компонента СЗ в сыворотке крови.

ВЫВОДЫ.

 
 

Введение диссертации по теме "Аллергология и иммулология", Романов, Сергей Владимирович, автореферат

Актуальность проблемы. Исследования, проводимые в лаборатории молекулярной иммунологии, посвящены разработке современных методов определения функциональной активности компонентов и факторов комплемента человека и применению этих методов для клинических исследований различных заболеваний инфекционной и аутоиммунной природы. Данная работа является частью этих исследований и состоит из разработки иммуноферментных методов определения функциональной активности компонентов С2, СЗ и факторов В и D комплемента человека и использованию этих методов для исследования механизмов действия комплемента и для клинических исследований.

Современные знания об участии комплемента в заболеваниях человека и его биологическом значении в иммунной защите тесно связаны с прогрессом лабораторных диагностических методов анализа комплемента, поскольку комплемент играет решающую роль в патогенезе различных заболеваний. При этом наибольшую диагностическую ценность представляет определение функциональной активности компонентов системы комплемента по сравнению с их количественным содержанием. Это обусловлено, прежде всего, изменением скорости обновления компонентов комплемента, определяемой соотношением процессов биосинтеза и катаболизма, которое нарушается при многих, главным образом, аутоиммунных заболеваниях.

Компоненты С2, СЗ и факторы В, D играют непосредственную роль в формировании С5-конвертаз классического и альтернативного путей. Процесс формирования С5-конвертаз обусловливает силу иммунного ответа и воспалительной реакции. Поэтому большой практический интерес представляет анализ функциональной активности этих белков.

Цель исследования.

Определить функциональную активность компонентов С2, СЗ и факторов В, D иммуноферментными методами анализа. Изучить ингибирующее и активирующее действия ряда веществ на комплемент.

Задачи исследования.

1) разработать иммуноферментные методы определения активных форм компонентов С2 и СЗ при инициации классического пути;

2) найти удобные и применимые активаторы альтернативного пути для разрабатываемых методов;

3) разработать иммуноферментные методы определения активностей компонента СЗ и факторов В и D при инициации альтернативного пути;

4) разработать методы анализа для оценки действия веществ, активирующих и ингибирующих систему комплемента;

5) показать применимость разработанных методов для клинических целей и лабораторных исследований.

Научная новизна результатов исследований.

1) разработаны иммуноферментные методы анализа активных форм компонентов СЗ, С2 при инициации классического пути системы комплемента (получено 2 патента РФ и подана одна заявка на получение патента);

2) разработаны иммуноферментные методы анализа активности компонента СЗ и факторов В, D при запуске альтернативного пути системы комплемента (поданы три заявки на получение патентов РФ);

3) разработан способ определения ингибирующего действия различных эффекторов на систему комплемента при образовании С5-конвертазы классического пути (получен патент РФ);

4) с помощью разработанного метода обнаружено декомплементизирующее действие CVF (фактора яда кобры) Naja melanoleuca и показано его количественное отличие от действия фактора яда других видов кобр;

5) определена активность компонента СЗ у пациентов с наличием и отсутствием антител к вирусу герпеса и Chi. trachomatis.

Практическая значимость результатов исследований

1) Разработаны иммуноферментные методы определения функциональной активности компонентов С2, СЗ и факторов В и D комплемента, которые пригодны для применения в клинике.

2) Предложен способ определения ингибирующего действия веществ на систему комплемента на стадии образования С5-конвертазы, что может быть использовано для оценки противовоспалительного действия лекарственных веществ и иммуногенности вакцин.

3) Предложен способ определения способности веществ активировать альтернативный путь комплемента. Этот способ может найти применение для лабораторных исследований свойств лекарственных веществ и адъювантов.

Практическая ценность работы подтверждена в трех патентах РФ: «Способ определения ингибирующего действия веществ на комплемент» (№2195665/С2 от 27.12.2002), «Способ определения функциональной активности компонента СЗ комплемента человека» (№2195664/С2 от 27.12.2002), «Способ определения функциональной активности компонента С2 комплемента человека» (№2195670/С1 от 27.12.2002). Подано четыре заявки на получение патентов РФ: «Способ определения функциональной активности компонента СЗ комплемента человека по альтернативному пути активации» (Заявка на патент РФ. № 2003110060 от 09.04.03.), «Способ определения функциональной активности фактора В комплемента человека» (Заявка на патент РФ № 2003110061 от 09.04.03.), «Способ определения функциональной активности фактора D комплемента человека» (Заявка на патент РФ № 2003110059 от 09.04.03.), «Способ определения функциональной активности компонента СЗ комплемента человека по классическому пути активации» (Заявка на патент РФ № 2003135511 от 09.12.03.).

Положения, выносимые на защиту:

1) Разработаны иммуноферментные методы оценки функционально активных форм компонентов СЗ, С2 при инициации классического пути системы комплемента.

2) Разработаны методы иммуноферментного определения функциональных активностей компонента СЗ и факторов В и D при инициации альтернативного пути комплемента.

3) Разработан метод анализа и исследованы комплемент-ингибирующис свойства веществ на стадии образования С5-конвертазы классического пути. Разработан метод анализа и исследована комплемент-активирующая способность различных веществ при инициации альтернативного пути. Таким образом, показана применимость разработанных методов для лабораторных исследований механизмов функционирования системы комплемента.

4) Проведены анализы активности компонента СЗ в группах людей с наличием и отсутствием антител к вирусу герпеса и Chi. trachomatis, показана применимость разработанных методов для клинических анализов.

Публикации. Материалы по теме диссертации были представлены в 14 публикациях.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены и обсуждены на: международной конференции БИСЖАТАЛИЗ-2000 (Москва, июнь 2000 г.), V симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, апрель 2002), международной конференции «Цитокины, воспаление, иммунитет» (Санкт-Петербург, июнь 2002), международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы» (Санкт-Петербург, сентябрь 2003), научно-практической конференции «Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения» (Москва, декабрь 2003).

Часть I. Обзор литературы

 
 

Заключение диссертационного исследования на тему "Определение функциональной активности компонентов C2, C3 и факторов B и D комплемента человека"

ВЫВОДЫ:

Разработаны методы иммуноферментного определения функциональной активности компонентов СЗ, С2 при инициации классического пути системы комплемента (получено 2 патента РФ и подана одна заявка на получение патента).

Разработаны иммуноферментные методы оценки функциональной активности СЗ компонента, факторов В, D при инициации альтернативного пути комплемента (поданы три заявки на получение патентов РФ). Определена комплемент-активирующая способность IgA, IgG, КИП, ЛПС, СЗ компонента морской свинки, а также CVF различных видов кобр при инициации альтернативного пути.

Разработан метод иммуноферментного анализа для выявления комплемент-ингибирующих свойств веществ на стадии образования С5-конвертазы классического пути. Определено ингибирующее действие адреналина и лизоцима (получен патент РФ).

Показана применимость разработанных методов для клинических анализов и лабораторных исследований механизмов функциионирования системы комплемента.

 
 

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2004 года, Романов, Сергей Владимирович

1. Вавилова Л.М., Горделадзе М.Р., Козлов Л.В., Голосова Т.В., Жуковский М.А. II Педиатрия. 1987. № 3. С.25-29.

2. Голосова Т.В., Вавшова Л.М., Панчеиков Н.Р., Козлов Л.В., Муразян Р.И. II Клиническая медицина. 1985. Т.63. № 2. С.118-122.

3. Егоров A.M. Современный иммунохимический анализ и перспективы его развития. // Жур.Менд.Общ. 1989. Т.З. С.494-501.

4. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.В., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа.// М.: Высшая школа. 1991. С.182-183.

5. Катупцев В.П., Козлов Л.В., Щербакова М.А., Агеев В.П., Сизой М.Н. II Авиакосмическая и экологическая медицина. 1993. №3. С.22-28.

6. Козлов Л.В. Особенности функционирования протеииаз комплемента.// Биоорганическая химия. 1994. Т.20. №3. С.229-241.

7. Козлов Л.В., Агеев В.П., Сизой М.Н., Бескова Н.С., Дедов И.И., Шаталова М.Ш., Абугова И.А. II Проблемы эндокринологии. 1992. Т.38. С.12-14.

8. Козлов Л.В., Агеев В.П., Сизой М.Н., Мелышк Е.И., Дедов И.И., Шашалова М.Ш., Абугова И.А. II Клиническая медицина. 1991. № 3. С.60-64.

9. Козлов Л.В., Дедов И.И., Шамхалова М.Ш. II Проблемы эндокринологии. 1992. Т.38. №6. С.57-60.

10. Козлов Л.В., Крылова Ю.И., Чих В.П., Молчанова Н.Н. Модифицированные методы определения функциональной активности факторов комплемента С2, СЗ, С4 и С5.// Биоорган, химия. 1982. Т.8. №5. С.652-659.

11. Козлов Л.В., Кудряшова Л.П., Иванова И.В. Система комплемента больных ревматоидным артритом в зависимости от проводимой лекарственной терапии. // Клин. Медицина. 1994. Т.5. С.43-47.

12. Козлов Л.В., Лебедева Т.В. Ингибирование образования С5-конвертазы комплемента.// Биоорганическая химия. 1998. Т.24. №5. С.350-355.

13. Козлов Л.В., Ростовцева Л.И., Ломака Т.С., Сутовская Н.С. Связывание активированного компонента СЗЬ с эффекторами комплемента.// Биоорганич. химия. 1985. T.l 1. №6. С.762-768.

14. Козлов Л.В., Соляков Л.С. Возможность участия зимогенных форм фактора В и D в активации альтернативного пути системы комплемента человека.// Биоорг. хим. 1982. Т.8. №3. С.342-48.

15. Козлов Л.В., Соляков Л.С., Зинченко А.А. Новый низкомолекулярный белковый эффектор комплемента человека из яда среднеазиатской кобры Naja Naja Oxiana.// Биоорганич. хим. 1984. Т.10. №3. С.323-332.

16. Ю.Козлов Л.В., Шибанова Е.Д., Зинченко А.А. Образование классической СЗ-конвертазы в ходе активации альтернативного пути комплемента человека.// Биохимия. 1987. Т.52. №4. С.660-5.

17. Козлов Л.В., Шойбонов Б.Б. Фактор яда среднеазиатской кобры Naja Naja Oxiana, инактивирующий компонент С4 комплемента человека.// Мол. биол. 1987. Т.23.№2. С.372-378.

18. Остермап А.Л. Исследование биологических макромолекул олсктрофокусированием, иммуиоэлектрофорезом и радиоизотопиым методами.// М.:Наука. 1983. С.304.

19. Павлова И.С., Любавина И.А., Лунин Ю.В. Определение 2,4-дихлорфенолуксусной кислоты с использованием моноклональных антител и биотин-стрептавидиновой системы детекции.// Биоорганическая химия .1996. Т.22. №4. 269-272.

20. РойтА. Основы иммунологии.// М.: Мир. 1991. С.35-37.

21. Романов С.В., Козлов Л.В., Дьяков В.Л., Баталова Т.Н., Гузова В.А. Определение активности протеиназ системы комплемента иммуноферментными методами.// Биомедицинская химия. 2003. Т.49. №6. С.604-612.

22. Скороходова Т.Г., Козлов Л.В., Баталова Т.Н., Лахтин В.М. Иммуноферментный метод изотииирования компонента С4 комплемента человека и его клиническое применение.// Клиническая лабораторная диагностика. 1999. №9. С.34.

23. Соляков Л.С., Козлов Л.В. Эффективный метод одновременного получения из сыворотки крови человека высокоочищениых факторов В и D альтернативного пути активации комплемента// Биоорг. хим. 1983. Т.9. №4. С.462-69.

24. Терминология белков альтернативного пути системы комплемента.// Бюлл. ВОЗ. 1981, Т.59. №3. С.377-379.

25. Терминология белков системы комплемента.// Бюлл. ВОЗ. 1968. Т.59. №6. С.935.

26. Яршин А. А. Основы иммунологии.// М.: Медицина. 1999. С.451.

27. Екапет ЕЕ, Umotong ЛВ, Raykundalia С, Catty D. Serum C-reactivc protein and СЗ complement protein levels in severely malnourished Nigerian children with and without bacterial infections// Acta Paediatr. 1997. Dcc. V.86. №12. P.1317-20.

28. Adam A., Petit J.F., Lefrartcier P., Lederer E. Muramil peptides. Chemical structure, biological activity and mechanism of action.// Molecular and Cellular Biochem. 1981. V.41. P.27-47.

29. Alper CA, Boenisch T, Watson L. Genetic polymorphism in human glycine-rich beta-glycoprotein.// J Exp Med. 1972 Jan. V.135. №1. 68-80.

30. Amburs G., Gal P. Natural substrates and inhibitors of MASP-1 and 2: a study on recombinant catalitic fragments.//J.Imm. 2003. V.3. P.1374-82.

31. Barnum SR, Niemann MA, Kearney JF, Volanakis JE Quantitation of complement factor D in human serum by a solid-phase radioimmunoassay //J Immunol Methods. 1984 Mar 16. V.67. N2. P.303-9.

32. Becherer J.D., AlsenzJ., Servis C. etc. Cell surface proteins reacting wiht activited complement components.// Complement Inflamm. 1989. V.6. P.142-165.

33. Bentley DR Primary structure of human complement component C2. Homology to two unrelated protein families //Biochem J. 1986 Oct 15. V.239. N.2. P.339-45.

34. Bentley DR, Campbell RD, Cross S.J DNA polymorphism of the C2 locus// Immunogenetics. 1985. V.22. N.4. P.377-90.

35. Bentley DR, Campbell RD C2 and factor B: structure and genetics //Biochem Soc Symp. 1986. V.51. P.7-18.

36. Bentley DR, Porter RR Isolation of cDNA clones for human complement component C2.// Proc Natl Acad Sci USA. 1984 Feb. V.81. N.4. P. 1212-5.

37. Bentley DR. Structural superfamilies of the complement system.//Exp Clin Immunogenet. 1988. V.5. P.69-80.

38. Biesma DH, Hannema AJ, van Velzen-Blad H, Mulder L, van Zwieten R, Kluijt I, Roos D. A family with complement factor D deficiency.//.! Clin Invest. 2001 Jul. V.108. N.2. P.233-40.

39. Biochimestry and functional characterisation of the interaction between pentraxin 3 and С1 q.// E.J. Immun. 2003. V.33. P.465-73.

40. Bouret E., Bardet L. A study of the single radial haemolysis optimization for complement heamolitic activity assay// Clin. Chim. Acta. 1980. Mar. 14. V.102. №1. P. 1-9.

41. Campbell RD, Bentley DR, Morley BJ The factor В and C2 genes //Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci. 1984 Sep 6. V.306. N.l 129. P.367-78.

42. Campbell RD, Bentley DR The structure and genetics of the C2 and factor В genes.// Immunol Rev. 1985 Oct. V.87. P. 19-37.

43. Campbell RD, Porter RR Molecular cloning and characterization of the gene coding for human complement protein factor В.// Proc Natl Acad Sci USA. 1983 Jul. V.80. N.14. P.4464-8.

44. Carroll MC, Campbell RD, Bentley DR, Porter RR. A molecular map of the human major histocompatibility complex class III region linking complement genes C4, C2 and factor B.// Nature. 1984 Jan 19-25. V.307. N.5948. P.237-41.

45. Charlesworth J.A., Peake P.W., Golding J., Mackie J.D., Pussell B.A., Timmermans V., WakefieldD. //Ann. Rheum. Dis. 1989. V.48. P. 153-159.

46. Charlesworth J.A., Peake P.W., Golding J., Pussell B.A., Timmermans V., Wicks I., Wakefield D. II Aust N. Z. J. Med., 1989. V.19. P. 118-124.

47. Cheung AK, Parker CJ, Wilcox L. Effects of two types of cobra venom factor on porcine complement activation and pulmonary artery pressure// Clin Exp Immunol. 1989 Nov. V.78. N.2. P.299-306.

48. Christie DL, Gagnon J, Porter RR. Partial sequence of human complement component factor B: novel type of serine protease.// Proc Natl Acad Sci USA. 1980 Aug. V.77. N.8. P.4923-7.

49. Christie DL, Gagnon J. Amino acid sequence of the Bb fragment from complement Factor B. Sequence of the major cyanogen bromide-cleavage peptide (CB-II) and completion of the sequence of the Bb fragment.// Biochem J. 1983 Jan 1. V.209. N.l. P.61-70.

50. Clarbon R, Sanders PA, Grennan DM. Studies of a C2 DNA polymorphism in RA, Felty's and normal subjects.// Exp Clin Immunogenet. 1990. V.7. N.l. P.64-8.

51. Cooper N.R., Jensen F.C., Welsh R.M., Oldstone M.B.A. Lysis of RNA-tumor viruses by human serum: direct antibody dependent triggering of the classical complement pathway.//J. Exp. Med. 1976. V.144.№4. P.970—984.

52. Cooper N.R., Muller-Eberhard H.J. The reaction mechanism of human C5 in immune homolysis.//J.Exp. Med. 1970. V.132. P.775-793.

53. Cooper NR. Formation and function of a complex of the C3 proactivator with a protein from cobra venom.//J Exp Med. 1973 Feb 1. V.137. N.2. P.451-60.

54. Cross SJ, Thomson W. DNA polymorphism of the C2 and factor В gene. // Exp Clin Immunogenet. 1990. V.7. N.l. P.53-63.

55. Curman В, Sandberg-Tragardh L, Peterson PA. Chemical characterization of human factor В of the alternate pathway of complement activation.// Biochemistry. 1977 Nov 29. V.16. N.24. P.5368-75.

56. Davis AE 3rd, Zalut C, Rosen FS, Alper CA. Human factor D of the alternative complement pathway. Physicochemical characteristics and N-terminal amino acid sequence.// Biochemistry. 1979 Nov 13. V.18. N.23. P.5082-7.

57. Dewald G, Lange CE, Schmeel E, Kreysel HW. HLA-linked complement polymorphisms (C2, BF) in psoriasis.// Arch Dermatol Res. 1983.V.275. N.5. P.301-4.

58. Di Scipio R.G. The binding of human complement protein C5, factor B, piH and properdin to complement fragment C3b on zymosan.// Biochem.J. 1981. V.199. №3. P.485-496.

59. Diefenbeck M, Linke R, Seehofer D, Terajima H, Thiery J, Hammer C. Intravital microscopic investigation of xenogeneic microcirculation and impact of complement depletion by cobra venom factor// Xenotransplantation. 1998 Nov. V.5. N.4. P.262-73.

60. Dyer PA, Thomson W, Sanders PA, Grennan DM. Are major histocompatibility system class III products independent markers for susceptibility to rheumatoid arthritis?//Dis Markers. 1986 Jun. V.4. N.l-2. P. 151-5.

61. Egwang T.G., Befus A.D. The role of complement in the induction and regulation of immune response.// Immunol. 1984. V.51. N.207-224.

62. Fair D.S., Sundsmo J.S., Schwartz B.S., Edgington T.S., Muller-Eberhard H.J. Prothrombin activation by factor B(Bb) of alternative pathway of compIement.//VIII international congress on thrombosis and heamostasis. 1981. Toronto, Canada, (abstr.)

63. Farries T.C., Steuer K.L., Atkinson J.P. The mechanism of activation of the alternative pathway of complement by cell-bound C4b.// Mol. Immunol. 1990. V.27. P. 1155.

64. Fearon D.T. Regulation of the amplification C3 convertase of human complement by an inhibitory protein isolated from from human erythrocyte membrane.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. V.76. P.5867-5871.

65. Fearon D.T., Austen K.F. Initiatoin of C3 cleavage in the alternative complement pathway.//J. Immunol. 1975. V.l 15. №5. P.1357—1361.

66. Fearon DT, Austen KF, Ruddy S. Properdin factor D: characterization of its active site and isolation of the precursor form.// J Exp Med. 1974 Feb 1. V.l39. N.2. P.355-66.

67. Fearon DT, Austen KF. Properdin: initiation of alternative complement pathway.//Proc Natl Acad Sci USA. 1975 Aug. V.12. N.8. P.3220-4.

68. Fredrikson G.N., Truedsson L. and Sjolholm A.G. New procedure for the detection of complement deficiency by ELISA(analysis of activation pathways and circumvention of rheumatoid factor influence).// J. Immunol. Methods. 1993. V.l66. P.263-270.

69. Fujita Т., Tamura N. Interactijn of C4-binding protein with cell-bound C4. A quantitative analysis of binding and the role of C4-binding in proteilysis of cell-bound C4b.//J. Exp. Med. 1983. V.157. P.1239-1251.

70. Funada U, Wada M, Kawata T, Mori K, Tamai H, Isshiki T, Onoda J, Tanaka N, Tadokoro T, Maekawa A Vitamin В-12-deficiency affects immunoglobulin production and cytokine levels in mice// Int J Vitam Nutr Res. 2001 Jan. V.71. N.l. P.60-5.

71. Gagnon J, Christie DL. Amino acid sequence of the Bb fragment from human complement Factor B. Alignment of the cyanogen bromide-cleavage peptides.// Biochem J. 1983 Jan 1.V.209. N.l. P.51-60.

72. Gary N. Douglas, Ph. D. Complement System. Calbiochem-Behring, Division of American Hoechst Corporation. 1983. P.3-26.

73. Ghehrehiwet B. The release of lysosomal enzymes from human polymorphonuclear leukocytes by human C3e.// Clin. Immunol. Immunopathol. 1984. V.30. P.321-329.

74. Gigli I., Nelson R.A. Complement dependent immune phagocytosis.// Exp. Cell Ress. 1968. V.51. P.45-67.

75. Gordon D.L., Hostetter M.K. Complement and host defence against microorganisms.//Pathol. 1986. V.18. P.365-375.

76. Gordon D.L., Jonson G.M., Hostetter M.K. Characteristics of iC3b binding to human polymorphonuclear leucocytes.// Immun. 1987. V.60. P.553-558.

77. Gotze O, Miiller-Eberhard IIJ. The alternative pathway of complement activation. (Review).// Adv Immunol. 1976. V.24. P.l-35.

78. Gotzc О, Miiller-Eberhard HJ. The C3-activator system: an alternate pathway of complement activation.//J Exp Med. 1971 Sep 1. V.134. N.3. P.90-108.

79. Gotze O. Proteases of the properdin system. In: Proteases and biological control. Ed. By Reich E. , Rijkin D.B., Shaw E. И Gold Spring Harbor Laboratory. 1975. V.2. p.:255-272.

80. Grace HJ, Brereton-Stiles GG, Vos GH, Schonland M.S. A family with partial and total deficiency of complement C3// Afr Med J 1976 Jan 31. V.50. N.5. P. 139-40.

81. Hartmann D, Fremeaux-Bacchi V, Weiss L, Meyer A, Blouin J, Hauptmann G, Kazatchkine M, Uring-Lambert B. Combined heterozygous deficicncy of the classical complement pathway proteins C2 and C4.// J Clin Immunol 1997 Mar. V.17. N.2. P. 176-84.

82. Hensley P, O'Keefe MC, Spongier CJ, Osborne JC Jr, Vogel CW. The effects of metal ions and temperature on the interaction of cobra venom factor and human complement factor B//J Biol Chem 1986 Aug 25; V.261. N.24. P.l 1038-44.

83. Hiemstra P.S., Biewenga J., Gorter A. etc. Activation of complement by human serum IgA, secretory IgA and IgAl fragments// Mol.Immunology. 1988. V.25. №6. P.527-533.

84. Hodgetts SI, Grounds MD. Complement and myoblast transfer therapy: donor myoblast survival is enhanced following depletion of host complement C3 using cobra venom factor, but not in the absence of C5// Immunol Cell Biol 2001 Jun; V.79. N.3. P.231-9.

85. Hoeprich P.D., Dahinden C.A., Lachmann P.J. A synthetic nonapeptide corresponding to the NII2-terminaI sequence of C3d-k causes leukocytoses in rabbits.//J. Biol. Chem. 1985, V.260. P.2597-2600.

86. Holmbrg C.A., Ellingsxvorth L., Osburn B.I., Grant C.K. Mesurement of hemolytic complement and the third component of complemnt in nonhuman primates// Lab.Anim.Scien.-1977, V.27. №6. P.993-998.

87. Hoppe HH, Goedde HW, Agarwal DP, Benkmann H-G, Hirth L, Janssen W. A silent gene (C3-) producing partial deficiency of the third component of human complement// Hum Hered 1978; V.28. N.2. P. 141-6.

88. Horiuchi T, Macon KJ, Kidd VJ, Volanakis JE cDNA cloning and expression of human complement component C2// J Immunol. 1989 Mar 15; V.142. N.6. P.2105-11.

89. Ikari N, Hitomi Y, Niinobe M, Fujii S. Studies on esterolytic activity of alternative complement component factor В.// Biochim Biophys Acta. 1983 Jan 26; V.742. N.2. P.318-23.

90. Ikari N, Niinobe M, Fuji S. Proteolysis of factor В by plasma kallikrein and p!asmin.//FEBS Lett. 1981 Aug 17; V. 131. N.l. P. 143-6.

91. Ishikawa N, Nonaka M, Wetsel RA, Col ten HR. Murine complement C2 and factor В genomic and cDNA cloning reveals different mechanisms for multiple transcripts ofC2 and В Hi Biol Chem. 1990 Nov 5; V.265. N.31. P.19040-6.

92. Jin CH, Shinki T, Hong MH, Sato T, Yamaguchi A, Ikeda T, Yoshiki S, Abe E, Suda Т. 1 alpha,25-dihydroxyvitamin D3 regulates in vivo production of the third component of complement (C3) in bone // Endocrinology. 1992 Nov; V.131. N.5. P.2468-75.

93. Katz Y, Singer L, Wetsel RA, Schlesinger M, Fishelson Z. Inherited complement C3 deficiency: a defect in C3 secretion // Eur J Immunol 1994 Jul; V.24. N.7. P.1517-22.

94. Katz Y, Wetsel RA, Schlesinger M, Fishelson Z. Compound heterozygous complement C3 deficiency.// Immunology 1995 Jan; V.84. N.l. P.5-7.

95. Kerr M.A. The human complement system: assembly of the classical pahtway C3 convertase.// Biochem J. 1980. V.189. №1. P. 173—181.

96. Kerr MA, Porter RR. The purification and properties of the second component of human complement.//Biochem J. 1978 Apr 1; V. 171. N.l. P.99-107.

97. Kerr MA. Limited proteolysis of complement components C2 and factor B. Structural analogy and limited sequence homology.// Biochem J. 1979 Dec 1; V.183.N.3. P.615-22.

98. Kirschfmk M. (1998) in The Complement System /Rother K., Till G.O., Hansch G.M., eds., Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York, P.523-547.

99. Kluin-Nelemans HC, van Velzen-Blad II, van Helden HP, Daha M. Functional deficiency of complement factor D in a monozygous twin.//Clin Exp Immunol 1984 Dec; V.58. N.3. P.724-30.

100. Koistinen V., Wessberg S„ LeikolaJ. Common binding region of complement factor В, H and CR1 on C3b revealed by monoclonal anti-C3b.// Complement inflamm. 1989, V.6. P.270-280.

101. Ко lb W.P., Muller-Eberhard H.J. The membrane attack complex of complement: isolation and subunit composition of the C5b-C9 complex.// J. Exp. Med. 1975. V.141. P.724-735.

102. Kozlov L. V., Ageev V.P., Sizoj M.N., Dedov I.I., Shamkhalova M.Sk, Abugova I.A.// Complement and Inflamation, 1990. V.7, P.155-156.

103. Kristensen T, D'Eustachio P, Ogata RT, Chung LP, Reid KB, Tack BF.// The superfamily of C3b/C4b-binding proteins.// Fed Proc. 1987 May 15; V.46. N.7. P.2463-9.

104. Lambris J.D. The multifunctional role of C3. The third component of complement.// Immunole. Today. 1988, V.9, P.387-393.

105. Law Alex S.K., Dodds A. W. The internal thioster and the covalent binding properties of the complement proteins C3 and C4.// Protein Science. 1997. №6. 263-274.

106. Lesavre P, Gaillard MH, Halbwachs-Mecarelli L. Inhibition of alternative pathway factor D by factor B-related synthetic hexapeptides.//Eur J Immunol. 1982 Mar; V.12. N.3. P.252-4.

107. Lesavre P., Gaillard M.H., Halbwachs L. Inhibition of factor D by factor В related peptides.//J.Immunol., 1980, V.124, №3, P. 1528.

108. Lesavre PH, Hugli ТЕ, Esser AF, Miiller-Eberhard H.J. The alternative pathway C3/C5 convertase: chemical basis of factor В activation.// J.Immunol. 1979 Aug; V.123. N.2. P.529-34.

109. Lesavre PH, Miiller-Eberhard HJ. Mechanism of action of factor D of the alternative complement pathway .//J Exp Med. 1978 Dcc 1; V.148. N.6. P.1498-509.

110. Mabbott NA, Bruce ME, Botto M, Walport MJ, Pepys MB. Temporary depletion of complement component C3 or genetic deficiency of Clq significantly delays onset of scrapie //Nat Med 2001 Apr; V.7. N.4. P.485-7.

111. Mancini G., Garbonara A.O., Heremans J.F. Immunochemicalquantitation of antigens by RID.// Immunochemistry.1965. V.2. P.235-254.

112. Mastellos D., Lambris J.D. Complement: more than a "guard" against invading pathogens?//Trends in Immunology 2002, V.23. P.485-491.

113. Matsushita M., Takahashi A., Hatsuse II, Kawakami M., Fujita T. Human mannose-binding protein is identical to a component of Ra-reactive factor.// Biochem. and Biophys. Res. Communs 1992, V.183,№2, P.645-651.

114. Matsuyama W, Nakagawa M, Takashima H, Muranaga F, Sano Y, Osame M. Molecular analysis of hereditary deficiency of the third component of complement (C3) in two sisters//Intern Med 2001 Dec; V.40. N.l2. P. 1254-8.

115. McLean RH, Weinstein A, Chapitis J, Lowenstein M, Rothfield NF. Familial partial deficiency of the third component of complement (C3) and the hypocomplementemic cutaneous vasculitis syndrome//Am J Med 1980 Apr; V.68. N.4. P.549-58.

116. Medicus RG, Gotze O, Muller-Eberhard HJ. Alternative pathway of complement: recruitment of precursor properdin by the labile C3/C5 convertase and the potentiation of the pathway.// J Exp Med. 1976 Oct 1; V.144. N.4. P. 107693.

117. Medicus RG, Gotze O, Muller-Eberhard HJ. The serine protease nature of the C3 and C5 convertases of the classical and alternative complement pathways.// Scand J Immunol. 1976; V.5. N.9. P. 1049-55.

118. Medof M.E., Iida К., Mold С., Nussenzveig V. Uniquue role of the component receptor CR1 in the degradation of C3b associated with the immune complexes.//J. Exp. Med., 1982, V.l56, P.l739-1754.

119. Melchers F., Erdei A., Schulz Т., Dierich M.P. Growth control of activated, synchronized murine B-cells by the C3d fragment of human component.// Nature. 1985, V.317, P.264-267.

120. Minkoff M.S., Wong W. W, Silberstein D.S. Indentification of C3 beta chain as the human serum eosinophyl cytotoxicity inhibitor.// J. Exp. Med. 1991, V.l74, N.5, P.l267-1270.

121. Mole JE, Niemann MA. Structural evidence that complement factor В constitutes a novel class of serine protease.// J Biol Chem. 1980 Sep 25; V.255. N.18. P.8472-6.

122. Mollnes Т.Е., Lachmann P.J. Regulation of complement.// Scand. J. Immunol., 1988, V.27,№2, P.127-142.

123. Morgan E.L., Thoman M.l., Hoeprich P.D., Ilugli Т.Е. Bioactive complement fragments in immunoregulation.// Immunol. Letters. 1985, V.9, P.207-213.

124. Morrison K.M., Aden D.P., Knowles B.B., Cohen H.R. Complement biosynthethesis by the human hepatoma — derived cell line Hep G2.// J. Clin. Invest. 1982, V.70, P.906-913.

125. Muller-Eberhard H.J. Complement.// Ann. Rev. Biochem., 1975, v.44, p.697-723.

126. Muller-Eberhard H.J. Complement: molecular mechanisms, regulation and biological function. In: Molecular basis of biological degradative processes. Ed. by Berlin R. D., Hermann H., Lepow I.H., Tauser J.M. // New York: Acad. Press 1978.

127. Muller-Eberhard H.J. The membrane attack complex of complement.// Ann. Rev. Immunol., 1986, V.4. P. 134-138.

128. Muller-Eberhard H.J., Lepow J.H. CI esterase effect on activity and physico-chemical properties of the fourth component of complement.// J. Exp. Med., 1965, V.121, P.819-833.

129. MUller -Eberhard h.J., Shreeiber R.D. Molecular biology and chemistry of the alternative pathway of complement.// Advanc. Immunol., 1980, v.29, p. 1-53.

130. N. Rawal and M.K. Pangburn C5 Convertase of the alternative pathway of complement (kinetic analisis of the free and surface-bound forms of the enzyme)// // The Jorn. Biol. Chemistry, 1998. V.273, №27. P.16828-16835.

131. N.Rawal and M.K. Pangburn Functional Role of the Noncatalytic Subunit of Complement C5 Convertase//J. of Immunology, 2000, V.164. P.1379-1385.

132. Nelson R.A. The immune adherence phenomenon: an immunologically specific reaction between microorganisms and erythrocytes leading to enhanced phagocytosis.// Science. 1953, V.l 18, P.733-737.

133. Nicholson-Weller A., Burge J., Fearon D.T. et al. Isolation of a human erythrocyte glycoprotein with decay accelerating activity for C3 convertases of the complement system.// J. Immunol. 1982, V.l29, P. 184-189.

134. Niemann MA, Volanakis JE, Mole JE. Amino-terminal sequence of human factor В of the alternative complement pathway and its cleavage fragments, Ba and Bb.//Biochemistry. 1980 Apr 15; V.l9. N.8. P. 1576-83.

135. Opperman M., Baumgarten H., Brandt E. etc. Quantitation of components of the alternative pathway ofv complement (APC) by enzyme-linked immunosorbent assaysW// J.of immunol.Methods, 1990. V.133. P.181-190.

136. Ouchlerlony O., Nilsson L.A. Handbook of experimental Immunology. Oxford: Blackwells, 1978. V. 1., P.83-91.

137. Pangburn M.K., Muller-Eberhard H.J. The alternative pathway of complement. // Springer. Semin. Immunopathol. 1984, V.7, P. 163-192.

138. Pangburn M.K., Miiller-Eberhard H.J. Kinetic and thermodynamic analysis of the control of C3b by the complement regulatory proteins factor H and factor I.// Biochem. 1983, V.22, P. 178-185.

139. Pangburn M.K., Miiller-Eberhard H.J. Relation of the putative thioester bond in C3 to activation of the alternative pathway and the binding of C3b to biological targets of complement. // J. Exp. Med., 1980, V.152, P.102-1114.

140. Pangburn M.K., Shreiber R.D., Miiller-Eberhard H.J. Deficiency of an erythrocyte membrane protein with complement regulatory activity in paroxysmal nocturnal hemoglobiuria.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983, V.80, P.5430-5434.

141. Parker CJ, White VF, Falk RJ Site-specific activation of the alternative pathway of complement. Synthesis of a hybrid molecule consisting of antibody and cobra venom factor//Complement 1986; V.3. N.4. P.223-35.

142. Pesce A.J., Dosekum A.K. Interrelationships between the immune systems, complement, coagulation and inflammation. Cellular and humoral defense against disease.//Nath. Acad. Clin. Biochem. 1983, V.l, P.92-116.

143. Podack Er„ Preissner K.t., Miiller-Eberhard H.J. Inhibition of C9 polymerization within the SC5b-9 complex of complement by S-protein.// Acta. Pathol. Micribiol. Immunol. Scand. (Suppl.284). 1984, V.92, P.89-96.

144. Porter R.R., Reid KB. Activation of complement system by antibody-antigen complexes: the classical pathway.//Adv. Prot. Chem., 1979, v.33, p.1-71.

145. Ramos O.F., Kai С., YefenofE., Klein E. The elevated natural killer sensitivity of targets carrying surface-attached C3 fragments require the availability of the iC3 reccptor (CR3) on the effectors.//J. Immunol. 1988, V.140, P. 1239-1243.

146. Raum D, Donaldson VH, Rosen FS, Alper CA. Genetics of complement.// Curr Top Hematol. 1980; V.3. P.l 11-74.

147. Raum D, Glass D, Carpenter CB, Alper CA, Schur PH. The chromosomal order of genes controlling the major histocompatibility complex, properdin factor B, and deficiency of the second component of compIement.//J Clin Invest 1976 Nov; V.58.N.5. P. 1240-8.

148. Reid R.B.V., Porter R. R. The proteolytic activation system of complement.// Ann. Rev. Biochem., 1981, V.50, P.433-464.

149. Rittner C, Bertrams J. On the significance of C2, C4, and factor В polymorphisms in disease.//Hum Genet. 1981; V.56. N.3. P.235-47.

150. Roebothan BV, Chandra RK Relationship between nutritional status and immune function of elderly people //Age Ageing. 1994 Jan; V.23. N.l. P.49-53.

151. Ross G.D., Medof M.E. Membrane complement receptors specific for bound fragments of C3.// Adv. Immunol. 1985, V.37, P.217-267.

152. Rother K, Rother U. The reactivity of the complement system.// Prog. Allergy, 1986, V.39, P.8-23.

153. Rother K., Till G. O. The Complement system.// Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, 1988.

154. S.Mery, M.K.Pangburg A mechanism of activation of the alternative complement pathway by the classical pathway: protection of C3b from inactivation by covalent attachment to C4b// Eur.J.Immunol.1990, V.20. P.2555.

155. Sansonetti PJ, Halbwachs-Mecarelli L, Lesavre P, Lapresle C. Subacute septicemia caused by Meningococcus of serogroup Y and acquired deficiency of complement C3 fraction//Ann Med Interne (Paris) 1986; V.137. N.7. P.559-61.

156. Schendel DJ, O'Neill GJ, Wank R. МНС-linked class III genes. Analysis of C4 gene frequencies, complotypes and associations with distinct HLA haplotypes in German Caucasians.//Immunogenetics. 1984; V.20. N.l. P.23-31.

157. Schoermark S„ Rauterberg E.W., Roelcke D. Et al. A C8-binding protein on the surface of the human erythrocytes: the inhibitor of lysis in a homologous system.// Immunol. 1984, V.l67, P. 103-108.

158. Schumaker V.N., Zavodsky P., Poon P.H. Activation of the first component of complement.//Ann. Rev. Immunol. 1987, V.5, P.21-42.

159. Servis C„ Lambris J.D. C3 synthetic peptides support growth of CR2 positive limphoblastoid cell lines.//J.Immunol, in press.

160. Shin H.S., Mayer М.М.ИBiochemistry, 1968, v. 10, P.3003-3006.

161. Sigler P.В., Blow D.M., Matthews B.W., Henderson R. Structure of cristalline a-chymotripsin. II. A preliminary report including a hypothesis for the activation mecanism.// J.Mol.Biol. 1968, v.35,№l, p.143-164.

162. Sim E„ Gill E.W., Sim R.B. Drugs that induce systemic Lupus erythematosus inhibit complement component C3.// Lancet. 1984, v.2, P.422-424.

163. Sim R.B., Twose T.M., Paterson D.S., Sim S. BiochemJ., 1981, v. 193, p.l 15

164. Singer L, Cohen HR, Wetsel RA. Complement C3 deficiency: human, animal, and experimental models// Pathobiology 1994; V.62. N.l. P. 14-28.

165. Singer L, Van Нее ML, Lokki ML, Kramer J, Borzy MS, Wetsel RA Inherited complement C3 deficiency: reduced C3 mRNA and protein levels in a Laotian kindred // Clin Immunol Immunopathol 1996 Dec; V.81. N.3. P.244-52.

166. Singer L, Whitehead WT, Akama H, Katz Y, Fishelson Z, Wetsel RA. Inherited human complement C3 deficiency. An amino acid substitution in the beta-chain (ASP549 to ASN) impairs C3 secretion// J Biol Chem 1994 Nov 11; V.269. N.45. P.28494-9.

167. Skeeles J.K., Lukert P.D., De Buysscher E. V. A rapid and simplified technique for the assay of chicken hemolitic complement// J.Vet.Res., 1979, V.40, №3, P.443-445.

168. Smith CA, Vogel CW, Muller-Eberhard HJ. Ultrastructure of cobra venom factor-dependent C3/C5 convertase and its zymogen, factor В of human complement.//Biol Chem. 1982 Sep 10; V.257. N.l7. P.9879-82.

169. Smith L.C., Shin C.S., Dachenhausen S.G. Coelomocytes express SpBf, a homologue of factor B, the second component in the sea urchin complement system//J.ImmunoI. 1998. V. 161. N.(12, P.6784-6793.

170. Sundsmo J.S., Wood L.M. Activated factor B(Bb) of the alternative pathway of complement activation cleaves and activates plasminogen.// J.ImmunoI., 1981, v.127,№3, p.877-880.

171. Tack B.F. The Cys-Gly-thioester bond in human СЗ, C4 and macroglobulin.// Springer Jemin Immunopathol. 1983, v.6, P.259-282.

172. Tack BF, Morris SC, Prahl JW. Third component of human complement: structural analysis of the polypeptide chains of C3 and C3b.// Biochemistry. 1979 Apr 17; V.18. N.8. P. 1497-503.

173. TatsuY., Yoshicawa S. Homogeneous chemiluminescent immunoassay based on complement-mediaed heamolisis of blood cells// Hematology, 1988, v.25, №2, P.140-158.

174. Те Velde A.A., Keizer G.D., Fidgor C.G. Differential function of LFA-l family molecules (CD11 and CD18) in adhesion of human monocytes to melanoma and endothelian cells.// Immunol. 1987, V.61, P.261-267.

175. Thoman M.I., Meuth J.L., Morgan E.L. et al. C3d-k, a kallilrein cleavage fragment of iC3b is a potent inhibitor of cellular proliferation.// J. Immunol. V.133, P.2629-2633.

176. Tomana M, Niemann M, Garner C, Volanakis JE. Carbohydrate composition of the second, third and fifth components and factors В and D of human complement//Mol Immunol. 1985 Feb; V.22. N.2. P.107-11.

177. Ulbrich AG, Florido MP, Nudelman V, Reis ES, Baracho GV, Isaac L. Hereditary human complement C3 deficiency owing to reduced levels of C3 mRNA// Scand J Immunol 2001 Jun; V.53. N.6. P.622-6.

178. Van Dijk IL, Rademaker P.M., Wilier J.M. Estimation of the classical pathway of mouse complement activity by use of sensitized rabbit erythrocytes// J.Immunol. Methods., 1980, v.39, №3, p.257-268.

179. Vogt W, Dames W, Schmidt G, Dieminger L. Complement activation by the properdin system: formation of a stoichiometric. C3 cleaving complex of properdin factor В with C36.// Immunochemistry. 1977 Mar; V.l4. N.3. P.201-5.

180. Vogt. IV., Schmidt G., Buttlar B.V., Dieminger L. A new function of the activated third component of complement binding to C5, an essential step for C5 activation//Immunology, 1978, V.34, P.29.

181. Wada M, Kawata T, Yamada K, Funada U, Kimamori M, Endo M, Tanaka N, Tadokoro T, Maekawa A. Serum C3 content in vitamin B(12)-deficient rats// Int J Vitam Nutr Res. 1998; V.68. N.2. P:94-7.

182. Wahlin В., Perlmann II., Perlmann P. Et al. C3 receptors in human limphocyte subsets adn recruitment of ADCC effector cells by C3 fragment.// J. Immunol. 1983, V.130, P.2831-2836.

183. Wang X, Circolo A, Lokki ML, Shackelford PG, Wetsel RA, Colten HR. Molecular heterogeneity in deficiency of complement protein C2 type I // Immunology 1998 Feb; V.93. N.2. P. 184-91.

184. Weiss S.J., Ahmed A.E., Bonagura V.R. Complement factor D deficiency in an infant first seen with pneumococcal neonatal sepsis.// J Allergy Clin Immunol 1998 Dec; V.l02(6 Pt 1). P. 1043^4.

185. Wilson M.B., Norane P.K. Recent developments in the periodate method of conjugating horse radish peroxidase (HRPO) to antibody.// Immunoflourescence and Ralated Staining Techniques, ed. W.Knapp, K.Holubar and G.Wick, 1978, P.215-224.

186. Wilson WA, Hughes GR, Lachmann PJ. Deficiency of factor В of the complement system in sickle cell anaemia.//Br Med J 1976 Feb 14; V.l N.6006. P.367-9.

187. Wolbink GJ, Brouwer MC, Buysmann S, IJ ten Berg, Hack CE CRP-mediatied activation of complement in vivo: assessment by measuring circulating complement-C-reactive protein complexes.// J.Immunol. 1996. V.l57. №1. P.473-79.

188. Woods DE, Edge MD, Col ten IIR. Isolation of a complementary DNA clone for the human complement protein C2 and its use in the identification of a restriction fragment length polymorphism //J Clin Invest. 1984 Aug; V.74. N.2. P.634-8.

189. Woods DE, Markham AF, Ricker AT, Goldberger G, Colten HR Isolation of cDNA clones for the human complement protein factor B, a class III major histocompatibility complex gene product //Proc Natl Acad Sci U S A. 1982 Sep; V.79. N.18. P.5661-5.

190. Wu LC, Morley BJ, Campbell RD Cell-specific expression of the human complement protein factor В gene: evidence for the role of two distinct 5'-flanking elements.//Cell. 1987 Jan 30; V.48. N.2. P.331-42.

191. Xu Y, Volanakis JE. Contribution of the complement control protein modules of C2 in C4b binding assessed by analysis of C2/factor В chimeras.// J Immunol. 1997 Jun 15; V.158. N.12. P.5958-65.

192. Takata Y., Kinoshita Т., Kozono H etc. Covalent association of C3b with C4b within C5 convertase of the classic complement pathway// J.Exp.Med. 1987, V.l65, P. 1494-1507.

193. Yamamoto K.I. Lytic activity of C5-9 complexes for erythrocytes from the species other than sheep: C9 rather than C5-dependent variation in lytic activity.// J. Immunol. V.l 19, P.1482-1485.

194. Yasmeen D„ Ellerson J.R., Dorrington K.J., Rainter R.H. Structure and function of immunoglobulin domains. The distribution of some effector function among the C2 and C3 homology regions of human immunoglobulin.// J.ImmunoI., 1976, V.l 17, P.518-524.

195. Zabern von I., Przyklenk II., Schmidt G„ Vogt WM Immunobiology, 1980, v.l 57, № 4/5, P.499-514.

196. Zhu ZB, Atkinson TP, Volanakis JE A novel type II complement C2 deficiency allele in an African-American family // J Immunol 1998 Jul 15; V.l61. N.2. P.578-84.

197. Zhu ZB, Volanakis JE Allelic associations of multiple RFLPs of the gene encoding complement protein C2.//Am J Hum Genet. 1990 May; V.46. N.5. P.956-62.

198. ZwirnerJ., Dobos G., Gotze O. A novel ELISA for the assesment of classical pathway of complement activation in vivo by measurement of C4-C3 complexes// J.of Immun. Methods 1995, V.l86. P.55-63.