Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Иммуномодулирующие эффекты ядов змей Туркменистана

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЯ

ПРОМЫШЛЕННОСТИ ТУРКМЕНИСТАНА

ТУРКМЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

РГб ОД

На правах рукописи

1 з МАЙ

УДК 598.126 — 097(375.4)

МУХАМ ЕДОВА Джахан Гельдыевна

ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ ЭФФЕКТЫ ЯДОВ ЗМЕЙ ТУРКМЕНИСТАНА

14.00.16— патологическая физиология 14.00.36 — иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ашгабат — 1998

Работа выполнена в Центральной учебно-исследовательской лаборатории Туркменского государственного медицинского института МЗ и МП Туркменистана.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор А. Т; Бердыеса. доктор медицинских наук С. А. Плескановская.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Е. М. Парцалис.

кандидат медицинских наук Д. К- Бабаева.

Ведущая организация — Самаркандский медицинский институт.

Защита диссертации состоится <<_»_ 1996 г.

в _часов на заседании Специализированного совета

Д.Ч.А.023. при Институте физиологии МЗ и МП Туркменистана по адресу: 744012, ш. Ашгабат, ул. Островского, 30.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеках Института физиологии и ТГМИ МЗ и МП Туркменистана.

Автореферат ¡разослан «_ »__1996 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат медицинских наук

Г. Б, КАРАДЖАЕВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Прогрессивно увеличивающееся количество' иммунодефицитиых и аутоаГрессивных состояний при различной патологии и в результате воздействия окружающей среды диктует особую потребность поиска аффективных иммунокорригирующих .'п0епара>-тов. Условия аридной зоны Туркменистана, несомненно, способствуют нежелательным изменениям иммунного статуса населения, что, приводит к росту заболеваемости аллергией и различными аутоагрессивНыми заболеваниями. В соответствии с этим проблема иммукокоррекции является своевременной и значимой для здравоохранения'Турга-шнистана.'

Выраженными ишунокорригирутадами свойствами обладает ряд препаратов естественного происхождения - от липополисахаридов, полу-' чаемых из стенок прокариотов (бактерий), до Пептидов и гормонов, выделяемых из шмуиокомпегентной ткани. СБужинаева Е.М., Баглаез Т.Н., 1992; Шметкулиез У.А., Далишва М.А., 13913. 8 настоящее вреня к' груше иммуномодуляторов с некоторой осторожностью относят и офидиотоксины, которые характеризуют как препараты,способныэ стимулкроватв неспецифические "реакции иммунитета. В частности,- что . ад среднеазиатской кобры способен увеличивать активность системы комплемента, синтез дизоцима, стимулировать' $агоцитариг/ю активность нейтрсфианых лейкоцитоз. Однако более детальное и глубокое изучение иммуномодулирущей. активности яда среднеазиатской кобры и других змей жаркого региона не было проведено.

Исследование офидиотоксинов проводится, в основном, в кон-, текрте гематологической активности-. данной группы, препаратов. В частности, изучается, и.довольно интенсивно, способность ядов змей стимулировать или угнетать •систему гемостаза организма- позвоночных. Достаточно хорошо изучен патогенез отравления офидиотоксина-

Ни, их ьвияаие на функциональную активность почек [Berdyeva А,, Eatyrov'B, 19SSJ. С.К.Жанабаевой (1992) установлено влияние некоторых- доз яда кобры на иммунный ответ экспериментальных животных на стафилококковый анатоксин и кишечную павочку. Однако не совсем четкие результаты исследования, незначительный диапазон доз не позволяют согласиться с выводом автора об иммуносупрессирующем действии яда кобры на антителогенез в эксперименте, а тем Солее, рекомендовать его в качестве препарата; вывивающего модельную супрессию иммунной системы, поскольку известно, что влияние офидио-токсинЬв ' 'да*к на свертывающую систему крови организма позвоночных .имеет .четкую, дозовую зависимость. '

Данные о влиянии ядов змей на организм позвоночных свидетель-'.ствувт о том, что они обладают выраженной способностью как стиму-.лироЕать, так и угнетать лейкопоэз. Так, яд кобры Еызывает лейкоцитоз,.^ песчаной .эфы_и щитоморрика - лейкопению СЕердыева А.Т., Батыров В.Е..19941. Все яды змей обладают способностью регулировать функциональную ' связь между . цатоплаэматическими мембранами клеток организма и их'рецепторами, проявлять цитостатический эффект..- Вполне возможно, что в основе этого единства действия лежит общая- для ' всех ядов способность модулировать активность циклаз и разобщать процессы дыхания и окислительного фосфорилирования ССахибов Д.И., Юкедъсок Л.Я., Саттыев P.A., 19753. Эти свойства офадиотоксинов делают их потенциальными иммуномодуляторами вироко-го спектра действия. Однако-ро настоящего времени способность' офи-диотоксияов модулировать иммунный ответ позвоночного - животного на ткмусзависимые антигены i á vivo л in.vitro не изучена. Исследования такого рода могут явиться неоспоримым доказательством иммуно-. регуляторной и иммуномодулирующей активности 'Любого препарата, претендующего на данную роль, включая офидиотоксюш. В этой связи

мы поставили перед собой совершенно определенную цель .•

Цель исследования. Изучить способность средних, малых .и сверхмалых доз ядов среднеазиатской кобры (САКб),среднеазиатской гюрзы (САГр) и песчаной эфы' (ГО) модулировать первичный Иммунный ответ экспериментальных животных на тимусзависимый антиген in vivo и in vitro. ' ' -

Для реализации поставленной цели были сформулированы следуют щае задачи исследования: ■ . / .. .

1. Изучить характер влияния следущих, доз: 1/10,1/100. и 1/500 ДД50 (Для шлей) ядов САКб, САГр и Ш на динамику накопления анти- . телопродуцентов, розеткообразуквдх клеток .в 'иммунокомпетектных • тканях шшей в ответ ка иммунизацию. тимусзависимым антигеном • (эритроцитам барана),.' • ' , . '

2. Определить титры ге^лгглютинирующкх; антител _е ответ на'иммунизации эритроцитам Сарана при .условии воздействия на организм • !,!ьпяей указанными дозам: ядов САКб, САГр и ПЗ. • : . ■

3. Выявить степень и направленность влияния сверхмалых доз ядов змей на/функционазьнузо- активность лимфоцитов крови здоровых доноров . (способность ■ к спонтанному розеткообразованига Т-, В- и -д-лимфоцитов), миграционнуюакпгвность лейкодагоз крови. .

■ Научная новзюиа работа. Впервые выявлена способность средних доз ядов змей Туркменистана (САКб,САГр и ПЗ) угнетать'первичный иммунный ответ шшей на эритроциты барана на всех уровнях продукции антител. • . "..■'•

Показана способность малых и сверхмалых доз (1/ЮО и 1/500. ДЦ50) ядов- указанных^ .'шей-ся^лировап»4первичный• иммунный ответ 'шшей на ткмусзанисишй. антиген (эритроцита барана) на уровне ан-■тителопродуцентоз (АОК) селезенки, костного юзга и печени:

Установлено, что сзерхыалые дозы (1/500 ДД5о)ядов гмей стиму-

- б -

лйруюЕ.Вг роаеткообразование, в меньшей степени - Т-розеткообразо-вшше лимфоцитами крови здоровых доноров.

Выявлена способность сверхмалых доз _ядов змей тормозить спонтанную миграцию лейкоцитов кров к здоровых доноров из стеклянного капилляра в инкубационную среду.

. Показана способность ядов змей Туркменистана реализовать им-муностамулируиЕуш эффект как in' vivo, так и in vitro.

."' Практическая значимость работа. Совокупность полученных данных позволяет рекомендовать малые и сверхмалые дозы (1/100 и 1/500 ' ЛД50 для мышей)- ядов САКб, САГр и ПЭ в качестве иммуностимулирующих' препаратов." Способность ядов САКб, САГр стимулировать Т-, В- и Д-роветкообразование может служить тестом для определения функционального' резерва иммунной системы не только здоровых доноров, но и пациентов с подозрением на ишунодефицитаое состояние. Высокая специфичность иммунного- ответа организма на яд змей позволяет использовать ' иммукодогическке тесты для определения вида вмеи при обследовании пострадавших от ее укуса. ■'

Положошы.'вшюсяшко'на защиту.

1. Яды змей Туркменистана (САКО.САГр и ПЭ) обладают дозозавй-. симыы иммуномодулирующим действием на первичный иммунный ответ позвоночного животного на тимуйзависимый антиген (эритроциты барана). • -.2. Иммуномодулирущая активность ядов • реализуется как на экспериментальных животных, тап к иа лимфоцитах здоровых доноров in vitro. •«•.''. .

Лароватя paixriu s Pesyiatértu (йботы доложены:....

-tía И ШздуйарйДйм* конгрессе герпетологов (1995г.);

- т itI съезде #ерайев?оа Туркменистана (Ашгабат, VJ&4 {•,)•,

- na' 55-íf йауШг- й^ййй<wectoñ конференций прбфессорско- ftpefto-

давательского состава ТГШ (Ашгабат, 1995г.); .;

- на объединенном заседании Центральной учебно-исследовательской лаборатории с кафедрами нормальной и патологической физиологии, медицинской биологии/ и генетики, факультетской хирургии и глазных болезней (декабрь, 1995г.); -..'-. '

- на меллабораторном координационном Совете Института 'физио~ ' логии Ш и МП Туркменистана (февраль, 1996г.). ' ' .'-.'.""'

, Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ..'.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста, состоит из введения обзора литера- . туры, 5 глав собственных исследований, выводов, а также практичес- . ких рекомендаций. Указатель цитированной литературы, включает 2И -источников, в том числе 139 - на русском языке и 72 - на иностран- ' ' ном. Диссертация иллюстрирована 12 рисунками, приведено' 11' таблиц.

СОДОТДШЕ РАБОТЫ : .

Материалы и методы исследавзгаш. Материалов исследования являлись яды змеи Туркменистана ; среднеазиатская кобра (Naja охуача Eishw), среднеазиатская гюрза (Vípera Lebetina) и- песчаная зфа (Eshis carinatüs), а также сыворотки крови экспериментальных животных, суспензии кариоцитов селезенки,костного мозга и печени мышей, лейкоциты здоровых доноров.

Объектом исследования служила иммунная система белых нелинейных мышей.

В экспериментах-использованы следущие дозы ядов : 1/10,1/100 и 1/500 ЛД50, которые определяли на мышах с учетом рекомендаций •С.В.Сперанского (1986). ■

Сыворотку крови выделяли обычным способом,'суспензии кариони-

- 8 - -

.тои готовили с учетом, рекомендаций Петрова Р.В. и др. (1992), Ьогепп Е. (1983). ' ,." - .

• ' В экспериментах использовано 137 белых нелинейных мышей самцов массой не менее 20,0г. Обследовано 25 здоровых доноров в ьоз--.раете от-28 до 45 лет.

. Методы исследования: иммунного розеткообразования по Zaalberg О. (1982);' локального гемолиза в геле по Jerne N.K., Nordin А. (1983); прямой гемагглютинации, определение миграционной активнос-

■ ти лейкоцитов из стеклянного; 1сатшмра по Ллвскановскай С. А. г (1982); смешанного розеткообразования по Гришиной (1S36).

'. •■:' Полученные, результаты обрзйотаны методом вариационной статис-

■ тики на IBM 486x2d. За оказанную помощь автор выракает благодарность- зав.отделом ИВЦ ТГМйМезилову К.А., и инженеру-программисту Артыклкеву. К.Г.. - . .

ОбЪем'.вьтолненных-исследований: Всего поставлено 2082 реак-.ции, из них 1056 - nd Zaaíberg; .210 - по Jerne', Kordín; 210 - прямой гемагглютинации; '.ЗОВ - определения миграционной активности, 300смешанного розетксЗобразования. За помошь и поддержку в выполнений этого объема работы автор выражает признательность и бла-. годарность коллективу 1!ммунол0гвдеского и биохимического, отделов ЦУИЛ ТГМИ.

-Егошиие ядов анеЯ на перзлюшй иммуннцЯ отвех мшей на пшус-завкшашй антиген. Первичный .ишдунный -ответ (ШО) .мышей изучали в классическом-эксперименте.с эритроцитами'барана (ЗБ). Мьшей шл-мунизировали внутрибргашитшм введением ,ЗБ>. Через сутки, после иммунизации вводили яды вмёй в "дозах,.'- 1/10,1/100- и 1/500 ДЯ50..

Кммуномодулирующий эффект ядов, оценивали по,, их, способности', изменять число розеткообразующих клеток (РОК),' акйгседообрааующих клеток (АОК) в лимфоидной ткани селезенки, печени и костного моз-

га, а также по величине титров гемагглютивинов в сыворотке крови.

Исследования показали, -что на 5-7 сутки после иммунизации 1в селезенке мышей насчитывается от 13 до 15 тысяч РСК на каждые 10б кариоцитов селезенки, в костном мозге - не более 150 на ю15 карио-цитов костного мозга, в печени мышей насчитывалось более 20- тысяч РОК-на каждые 10е лимфоцитов (таблЛ). . •

Таблица 1

Число розеткообрззущих клеток в лимфаидной ткани ныаей при зтеяепии в индуктивную фазу ПИО ответа 1/10 ддбо ядов змей, (м±и)

I

Розеткообразувдая . клетка

Группа | РОКс (х 10е) t .РОКкы

Контроль . САКб . САГр ПЭ

15,3 ± 1,2 24,3 i 1,2го? 22,7 ±2,1*'., ' 22,18 '± 1,5*

Г'РОКп (хЮ6)

153,3 ±2,5: 23,4 ± 1,4.

107,3 ± 2,1ХХ ' 19,1 ± 0,7х

; 115,6 ± 2,3х 21,3 ± 1.3х

113,0- ± 1,9* 18,8 ±.0,9*

Примечашю : число РОКс и РОКп Дано в тыс. на 10® (кариоцитов) селезенки POiCo - роэеткообразующие клетки селезенки; .PÔKrai - розеткообразувщие клетки костного мозга; РОКп - роэеткообразующие клетки печени.

* - р < 0,01: ** - р < о,оо1

'• . При введении- в индуктивную.фазу Щ0 1/10 ДД50 яд0и змей, независимо от их вида, мы наблюдали выраженную модуляцию иммунного

ответа.Так,' число РСК в селезенке увеличивалось в 1,4 - 1',5 раза в-

зависимости от. вида.яда. максимальное увеличение - в 1,53 раза

наблюдата в группе животных, получивших яд САКб. Число РОК в костном мозге снижалось в 1,3-1,4 раза. • Максимальное снижение ' числа РОК в.коотном мозге произошло опять ке в группе животных,получивших яд САКб. Установлено, что. 1/10 ЛД50 ядов САКб и ПЭ 'заметно : снижают число РОК в печени, но аналогичная доза яда САГр практически не "изменяет их числа.

«При введении в индуктивную фазу иммунного ответа 1/100 ЛД50 ядов .была, получена выраженная стимуляция розеткообразова-шш. Так, число РОК в селезенке увеличилось в 2,3 - 2,7 раза по отношению к контрольной группе животных. При этом различие достоверно (при Р< 0,01) по отношению к группе мышей, получивших в индуктивную фазу 1/10 ЛДбо ядов. Число р0к1а( снижалось в 1,45 раза ■против i,3 раза при введении 1/10 ЛД50. что следует из табл.2.

. •• . . Таблица 2

Число РОК в лимфтадной тишш мышей при кведешш в индуктивную фазу Ш10 1/100 ЛД50 ядов амей, (М±ш)

I

Группа

Роаеткообрааующая клетка

•РОКс

РОКкм

РОКп

Контроль 13,4 ±2,0 148,6 ±. 7,3

САКб 36,9 ± 1,9ХХ. • 97,0 ±. 9.1хх

САГр 37,3 ¿3,1** '100,1 ± 2,7х ■

ПЭ ' 35,0 ± 1,6х* ' 102,7 ± 1,7х ■

24,1 ± 1,2 . 12,.7 ± 0,бхх 14,7 ± 0,7ХХ .13,3 ,± 1,2*х

Примечание : число ЮК дано на '10е кариоцитсв;

* --P < 0,01; ** р < 0,001'

Мы полагаем, что малая доза ядов в большей степени модулирует розеткообразование. Минимальным модулирующим эффектом, для 'костного мозга обладает яд САКб, для селезенки - яд САГр. ■ •

Одновременно с этим в печени наблюдалось еие более резкое,чем в предыдущей серии экспериментов, снижение числа РОК.Макскмальпае угнетение накопления РОК в печени установлено в группе животных-, получивших яд САГр, и минимальное - яд САКб. Дальнзйиее снижение дозы ядов до 1/500 ЛД50 в еще большей степени изменяло ' накопление-РОК в селезенке, костном мозге и печени, тем не менее различие во всех группах не достоверно по отношению к предыдущей (1/100 Д5бо ) дозе ядов (Р< 0,01).

Таким образом, яды змей в малых (1/100 ДД50 ) и сверхмалых (1 /500 Щ50 ) дозах обладав! способность» стимулировать ' накопление' РОК в селезенке и печени,но сткать. гк число в'костном мозге. 31>-фект. является дозозависимым.

Одним из наиболее информативных и известных способов оценки иммуномодулируицай активности того или иного препарата является его способность модулировать число АОК в селезенке иегпе.ЮЭЗ) (табл.3). • • ■ •

, Исследования показали, что яда змей способны,- в зависимости от дозы,' значительно угнетать или Стимулировать процесс накопления АОК в селезенке. В частности, при введении мышам в »индуктивную <£а-зу ю.п.7кного ответа 1/10 ЯЯ50 ядов гчей САКб, САГр и ПЭ наблюдается достоверное сникениэ числа АСК в селезенке (Р< 0,01). Максимальный супрессирущий эффект при этом был достигнут в группе .т::-Еотгшх,. получивших яд ПЭ, а минимальный - яд САГр, • Различия между группами .ядов не достоверны (Р> 0,01). •

Число АОК в селезенке икшей, иикунизированишс

. ЭБ на фоне введения различных лоз ялов змей, (И±т)

*

■ Группа 1 Дозы ядов, ДЦ50

. !------------------------------------------------

• ■ » 1/10 I 1/100 I 1/500

Контроль 306,3 ± 12,0

•САКб-' _ 218,6 ± 8,3х 459,3 ± 12,1х 506,3 ± .10,8ХХ

. САГр> .- 226,3 ± 13,1 507,2 ± 11,2ХХ 510,3 ± 9,8ХХ

ПЭ 213,5 i 17,2х 493,2 ± 9,8х 503,3 ± 2?,1кх

. Примечание : число АОК дано на кавдые 10е. спленоцитов .' .. •■ * - Р < 0,01; ** - р < 0,001

При снижении дозы ядов до 1/100 ЛД50 был получен аффект стимуляции накопления АОК Стабл.З). Так, если при введении 1/10 Щ&о число АОК в селезенке на 7 сутки после шмушгации шией ЗЕ~сниз1*-лось в 1,3 - 1,4 раза по отношения к контрольной группе, то при введении 1/100 ДЦ50 - число АС^К увеличилось в 1,5 - 1,6 раза." Мак-сиыалькое увеличение числа АОК: мы. наблюдали в.группе животных,получавши. яд САГр, мшш^алъное' - яд САКб (Р< 0,01).

Снюсение дозы "до 1/500 ^Щзо привело к дальнейшему, но статистически незначимому,- •увеланешю числа АОК -в .селезенке мышей. И б зтсм случае максимальное число АОК накапливалось в селезенке мышей, получавших .яд САГр (в 1,7 раза),' к минимальное - в группе,-, получавшей яд ПЗ (в 1,6 раза). Как и в предыдущей серии зкспери-■ ментов, различие между группами, в зависимости от вида яда, было

не достоверным (Р >0,01)-.

Таким образом, на 7 сутки после иммунизации мышей ЭБ под действием ядов змей (САКб.САГр и ПЗ) число АОК может как снижаться (при воздействии 1/10 ДД50), так и увеличиваться (при воздействии малых и сверхмалых доз - 1/100 и 1/Б00 ЛД50 ), т.е.проявляется до-' зозависимый иммуномодулирующий эффект. . '■...-

Все виды ядов обладает практически одинаковой икмуномоду-лиру-ющей активностью, однако, в некоторой степени, предпочтение 'можно' отдать яду САГр.

, Как известно, снижение числа АОК в селезенке в ответ на иммунизацию антигеном, свидетельствует об угнетении иммунного ответа. Следовательно, высокие дозы ядов змей Туркменистана обладают иммунасупрессиругащей 'активностью, а малые и сверхмалые - иммуностимулирующей, .что было подтверждено при определении титров гемагглю- -тининов в сыворотке крови мышей'на 7 сутки после иммунизации ЭБ.

При введении мызам в индуктивную.фазу иммунного ответа 1/10 ДЗбо ядов змей достсзерко снижаются титры гемагглютинирующих антител (табл.'4). Различие в значениях титров антител в группах, а зависимости от вида яда, статистически не. достоверно,;го макс:я,:аль- ■ ное угнетение антителообразовзняя выявлено при воздействии яда ПЗ.

1

Все зиды использованных ядов обладает способностью угнетать антителогенез, но в различной степени. Так, если яд САГр сникает титры антител в 1,5 раза, то яд САКб - з 1,6 раза и ПЗ -.в 1,7 раза. Различие между группами достоверно (Р< 0,001). Таким образом, 1/10 ДЦ50 яда ПЗ максимально и яда САГр - минимально угнетаят антителогенез мьшей в ПИО на ЭБ.' ' _ ' ' • -'

Снижение- дозы ядов до 1/100 ДЦ50 приводит к противоположному результату, а именно - ¡^ стимуляция антителогенега (тз5л.4). Необходимо отметить,, что титры гемагглютин'лнов во всея группах зе.пот-

Тигры гвмагглюпгаинов в снворотке мышей, в зависимости от вида и дозы амеиного яда (1ов2 Т), (М ± ш)

_ ] ■ ; :

| Дозы ядов, ЛДбо

- !----:-:-

Труппа 1/10 I 1/100 1 1/500

л.

Контроль 8,3 ± 0,1 -

' СЛК6'■ ' 5,1 ± 0,03 .12,7 ± 0,1хх 13,2 ± 0,01х*

, САГр.'' •■5,5 ± 0,07х 11,3 ± 0,02х 11,5 ± 0,06х

ПЗ . • 4,9 ± 0,01хх 11,9 ± 0,2х 12,6 ± 0,07х

ных достоверно превышают уровень контроля (Р< 0,01). При этом яд СЛГр и..ПЭ стимулирует антителогенез примерно в одинаковой степени .( в 1,25 и-1,4-раза.соответственно), яд САКб - в 1,53, т.е. максимально. Различие ыекду гругшаья 1 и 3 достоверны (Р< 0,01). Дальнейшее снижение дозы Ьводиьш в индуктивную фазу иммунного ответа ядов до 1/500,ЛДбо приводит-к еще более значительному 'повышению , антителогенеза, что особенно выражено в группе животных, получивших яд САКб и ПЗ .(таЗл.4). .

_Именно-в этих группах кнвотных титры гемагглютининов увеличи-'вались максимально по отношевко к предыдущей'дозе (Р< 0,01).

Таким образом, иадые и сверхмалые дозы ядов САГр, САКб и ЛЭ, в отличие от 1/10 ЛДбо, способны стшулшровагь антителогенез в ШО задай на ЭБ при введении ядов в' йнщеишнув Фазу .ишункого ответа.

Влияю» ЭДйв змай пз фуаяд!®яаз!ьадю акзшшесть; дшфоцихав in vitro. Нами представлены результаты изучения влияния различных ядов зыей на осуществление лимфоцитами селезенки, печени к костно-

го мозга мышей феномена иммунного роэеткообразования и лимфоцитгыи крови человека - феномена спонтанного Т-, В- и Д- розеткоойрааова-ния; лейкоцитами крови человека и мышей - миграционной активности из стеклянного капилляра.

Модуляция иммунного розетиообразования при воздействии ядов змей. Яды САКб и САГр добавляли в инкубационную среду при постановке реакций иммунного розеткообразовакия лимфоцитами селезенки, печени и костного мозга далей, как интактных (контрольных), так и получивши* в индуктивную фазу иммунного ответа однократную подкожную инъекцию 1/100 ЛДбо ядов. . '

Исследования показали, что лимфоциты различных тканей не одинаково реагируют на добавление ядов в инкубационную среду. Оба яда при воздействии in vitro достоверно увеличивают число ишунных РОКс у животных контрольной группы, получивших только ЭВ (F< 0,001 и Р< 0,01). Однако яд САКб увеличил число РОК в 3,5 раза, а яд САГр - только в. .1,5 раза. Стимулйрущее влияние ядов распространяется и на лимфоциты селезенки ьашей обеих экспериментальных групп (получавших либо .яд САКб, либо САГр) . Так, при добавлении яда САКб в инкубационную среду сллекоцитов мышей,'получивших in vivo яд САГр, число РОК увеличилось в 2,6 раза, при добавлении к спленоци-'там мышей этой же группы яда САГр - только в 1,8 раза. Такая яе зависимость сохранялась и при добавлении* яда САГр . к спленоцитам мышей, получивших яд САКб.

Для лимфоцитов печени эта зависимость не сохранялась. Исследования показала, что яд CAKS in vitro почти в 2 раза увеличивает число иммунных РОКп, животных .контрольной группы, в то БреШ как яд САГр - в 1,9 раза сникает. При добавлении этого яе количества яда САКб в инкубационную среду лимфоцитов печени экспериментальных животных, получивших яды либо САКб, либо САГр, наблюдался гемолиз

эритроцитов.

При добавлении яда САГр число РОКп не изменялось среди лимфоцитов печени иммунных животных (получивших яд САГр в индуктивную фазу иммунного ответа), но достоверно снижалось их число среди неиммунных лимфоцитов (Р< 0,01).

Лимфоциты костного мозга интактных животных, так же как и лимфоциты селезенки и печени, более чувствительны к яду САКб. Если в присутствии яда САГр число РОК практически не изменяется, то при добавлении в культуральную среду яда САКб число РОК в культуре лимфоцитов костного мозга достоверно увеличивается Р< 0,001).

Таким образом, в системе in vitro яды САКб и САГр стимулируют иммунное розеткообраэование лимфоцитов селезенки, печени и кост.чо--го- мозга, • что, возможно, осуществляется в результате способности ядов модулировать процесс экспрессии мембранных рецепторов. По всей видимости, антитела к ядам, образующиеся в результате однократного -введения последних в индуктивную фазу ГКО животных,.блокируют процесс стимуляции. •

Елнян1я> адов сие/, на способность лимфоцитов крови человека is спонтанному, Т- и В- розвтйообразовшгка. Исследования погсазали, что лимфоциты здоровых доноров высокочувствительны к воздействию ядов змей. При этом степень чувствительности в значительной мере детерминирована видом яда. Так, яд САГр в.некоторой степени снижает способность Т- лимфоцитов к спонтанному розеткообразованию с ЗВ (Р>0,01), но максимально стимулирует способность В- лимфоцитов к розеткообразоЕшпгю с частицами зимозана (Р< 0,001) и довольно заметно угнетает способность к розеткообразованию у Д- лимфоцитов (Р < 0,01), в результате чего в популяций! снижается численность О-лимфоцитов.

ад САКб достоверно стимулирует спонтанное розеткообраэование

Т- лимфоцитами (Р< 0,001), В- лимфоцитами (Р< 0,01), но в два раза снижает способность к роэеткообразоваяию у Д-лимфоцитов. Высокая активизирующая способность яда САКб приводит к еще большему снижению численности 0- лимфоцитов (Р< 0,01). Яд ПЭ по способности к модуляции розеткообразования лимфоцитами здоровых доноров' в значительной степени "похож" на яд САГр. Так, присутствие яда ПЭ в инкубационной' среде приводит к снижению способности Т- лимфоцитов к спонтанному розеткообразовашш с ЭБ (Р < 0,01), снижает розеткооб-разуюцую активность Д- лимфоцитов (Р< 0,01). По способности стимулировать В- розеткообрааозание с-частицами зимозана он более "похож" на яд САКб. Число 0- лимфоцитов в популяции соответствует таковому при воздействии на лимфоциты ядом САГр.

. Таким образом, яд САКб in vitro способствует экспрессии мемб- -бранных рецепторов к ЗВ у Т- лимфоцитов;яд САГр - у В-лимфоцитов с' частицами зшозана, нагруженным комплементом. Все яда угнетают экспрессию мембранных.рецепторов Д- лимфоцитов, как к ЭБ, тач и к частицам зимозана. Максимальной активностью.обладает яд САКб. Данное обстоятельство следует учитывать при дальнейшей разработке вопросов использования ядов змей в качестве ишуномодулято-ров. Так, яд САКб можно рассматривать как активатор Т- системы, а яд-САГр - как активатор В-инстеш иммунитета.

Елиятхе ядов змей на миграционную активность дейкоцдатав кропя ' ншей. Результаты исследования представлены в' табл.5, из данных которой видно, что яды САКб и САГр в значительной степени модулируют миграционную активность лейкоцитов. •

Тач, в лунку, содержащую яд САКб, мигрировало в 1,6 и САГр -в 1,5 раза меньше лейкоцитов здоровых мышей по сравнению с контролем (в лунки был добавлен физиологический раствор). Во второй группе мышей, получивших за неделю до эксперимента 1/100 ЛДзо яда

Таблица 5

Влияние 1/500 ЛД50 ядов САКб и САГр на миграционную активность лейкоцитов кропи мышей, (И±т)

I ВИД ЯДА

Группа животных I----------------—----------------

I фиа. раствор ! ' САКб ! . САГр

Контрольная 1/100 ЛДБО

1/100 ЛД50

Примечание : результаты даны в абсолютном числе меток, определяемых по всей камере Горяева. *"- Р < 0,01; - Р < 0,001

САКб, наблюдали достоверное торможение миграционной активности лейкоцитоз в контрольных лунках (без добавления, ядов) (Р< 0,001). В присутствии "родственного" яда (САКб) миграционная активность не изменялась по отношению к таковой в присутствии физиологического раствора (Р> 0,01), но была достоверно ниже, чем у адоровых ин-тактнык мазей. Б присутствии яда САГр миграционная активность лейкоцитов усиливалась достоверно но'отношению к контролю для данной группы животных (Р<0,01). Другими словами, "родственный" яд не изменяет миграционной активности лейкоцитой крови мышей,, в то время как "чужой" - ее стимулирует.

В третьей группе мышей, получивших за неделю до эксперимента

п-Ю 36,7 ± 2,1 (САКб) ' ~

П-7 12,7 t 3,1ХХ (САГр)'

П-7 14,7 ± 1,1х*

22,1 ± 0,9 23,7 ± 1,2

11.4 ± 1,2ХХ 19,9 ± 0,7х

10.5 ± 0,9ХХ ' 6,3 ± 0,1х*

1/100 ЛДзо САГр, были получены несколько иные результаты. Так. спонтанная миграция из стеклянного 1сапилляра лейкоцитов мышей этой группы была понижена по отношению к интактиому контролю (Р< 0,01). В присуствии "родственного" яда (САГр) она снижалась в 2,3 раза по отношению к лункам с физраствором, в присутствии "чужогб" кда она снижалась в 1,4 раза, в то время как в предыдущей группе мышей -стимулировалась в 1,6 раза (табл.5).

Таким образом, оба яда - САКб и САГр - обладают способностью мoдyляpoвáть миграционную активность лейкоцитов крови мышей, как интактных, так и однократно иммунизированных малыми дозами ядов. Однако степень и характер этого влияния в значительной мере детерминированы видом яда. Тем не менее, совершенно однозначно можно говорить о способности ядов САКС и САГр тормозить миграционную- активность лейкоцитов крови интактных животных in vit.ro и при однократной иммунизации - in vivo.

Влияние различных доз ядов змей на миграционную активность лейкоцитов крови человека. Было установлено, что сверхмалые дозы ядов змей обладают выраженной способностью модулировать миграцию из стеклянного капилляра лейкоцитов, здоровых доноров.

В инкубационную среду лейкоцитов человека добавляли 1/10, 1/100 и 1/500 ЛДбо (Для мышей) ядов САКб, САГр и ГО.

Результаты исследования представлейы в табл.6, из которой следует, что лейкоциты периферической крови человека,' так же как и у "мышей, высокочувствительны к ядам змей в тесте модуляции миграции лейкоцитоз. •, .

Относительно большая доза ядов как САКб, так и САГр приводит к выраженной стимуляции миграции лейкоцитов из капилляра (Р< 0,01). При этом яд САКб в большей степени, чем яд САГр. Увеличение довы ядов в 5 раз привело к достоверной стимуляции спонтанной миг-

Миграционная активность лейкоцитов крови здоровых доноров в присуствии ядов вмвй, (М±ш) ■■

---1------—--:-:-— .

1_ГРУППА

Доза ядов . Физ.раствор САКб -САГр

—-_)_—_—'.. ; ——:

1/10 ЛДбО П-Я51 11,3 ± 0,9 34,8 ± 1,7 28,5 ± 2,1 1/100 ЛД50 П-251 11,3 10,9 ^22,1 1 1,1* 19,7 ± 0,7* 1/500 ЛД50 П-Ё5} 11,3 ± 0,9 -5,8 ± О,!** 8,7 ± 0,3ХХ

■ __I_-'•--" '• 1__ '■■__

Примечание : результаты даны в абсолютном числе лейкоцитов, мигрировавших из стеклянного капилляра в инкубационную среду (на объем камеры Го-ряева); *- Р < 0,01; **--'Р < 0,001

рации лейкоцитов здоровых' доноров,' причен, ЯД САКб был более эффективным - он стимулировал наград® в 1,В5 раза, яд САГр стимулировал миграцию лейкоцитов 8 1,7 раза.

При увеличении-дозы, вдов в 50 раз иаблэдазась ещв более выраженная стимуляция миграорш'^вйюцитов - в 3,1 раза для. яда САКб и в 2,5 раза 7 для яда САГр.

Таким образом;' существует пряшй' доаозааисккый эффект стимуляции миграции лейкоцитов здоровых доноров - чем иетша доза, тем менее выражена Отимуляцкя.-. Следовательно, лейкоциты' крови мыпей и человека одинаково реагируют на присутствие в инкубационной среде ядов змеи, отвечая тормсжениеы спонтгпшой'ииграцки.- Даиное свойство-ядов, по всей видимости,'.-явлается одним из компонентов механизма противовоспалительного действия препаратов, " содержащих . яды

змей.

Совокупность полученных данных позволяет достаточно твердо утверждать, что яды змей обладают выраженными иммуномодулирующими свойствами. В зависимости от дозы и вида яда, можно получить как угнетение, так и стимуляцию первичного иммунного ответа позвоночных на тимусзависимый антиген. По всей вероятности, многообразие эффектов и их дозовая зависимость связаны с различными комг.онента-' ми ядов.

В последние годы появляется все больше препаратов иммунорегу-ляторного действия, нацелешшх на активацию или супрессию конкретного звена иммунной системы'!! не имеющих при этом одного важнейшего качества - они лишены иммунологической специфичности т.е не могут включить или выключить определенный клон.предетерминированный к конкретному антигену. Иначе говоря, проблема иммунокоррекции сделала первый шаг - изыскание средств управления клеточными популяциями иммунной системы, Предстоит сделать второй - управление специфическими клонами, нужными в конкретной ситуации. В этом смысле яды змей имеют огромные перспективы.

ВЫВОДЫ

1. Средние дозы (1/10 ДЦзр ) ядов среднеазиатской кобры, среднеазиатской гюрзы и песчаной эфы обладают .способностью угнетать первичный иммунный ответ шяей на тимусзависимый антиген (эритроциты барана) на уровне антителопродуцентоа селезенки. Одновременно с .этим повышается число антигенраспознащих клеток в селезенке и снижается их число в костйом мозге и ' печени. ' Данное обстоятельство позволяет отнести указанные дозы и виды ядов к истинным супрессорам антительного ответа. В максимальной степени

- 22 -

этим свойством обладает яд среднеазиатской кобры.

2. Малые и сверхмалые (1/100 и 1/500 Jffiso) дозы ядов среднеазиатской кобры, среднеазиатской гюрзы и песчаной эфы обладают выраженной иммуностимулирующей активностью - они повышают антигенный ответ мышей на ткмусзависимый антиген и в первичном иммунном ответе на эритроциты барана. При этом увеличивается как число антите-лопродуцонтов, так и антигенраспознающих лимфоцитов в селезенке при одновременном снижении числа розеткообразующих клеток в костном мозге и печени животных.

3. Сверхмаше (1/500 ДЦ50 ) дозы ядов среднеазиатской кобры и среднеазиатской гюрзы угнетают спонтанную миграцию из стеклянного капилляра лейкоцитов здоровых донороз и мышей.

4. Яды змей в сверхмазых (1/500 ЛД50 ) дозах оказывают- иммуностимулирующий эффект не только .In vivo, но и.in vitro, повышая розетгаэобразуюшую активность как иммунных, так и интактных лимфоцитов человека и животных. Х'лкскмалькой способностью стимулировать экспрессию мембранных рецепторов в эритроцитам барана Т-лимфоцитов человека обладает яд среднеазиатской кобры, В-. лимфоцитов к частицам зимозана - яд среднеазиатской' гюрзы.

5. Средние дозы .(1/10 ДЦ50 )'ядов среднеазиатской кобры и среднеазиатской гюрзы стимулируют миграционную активность лейкоцитов человека и мышей. Наибольшей активностью обладает яд среднеазиатской кобры. ■. 1 .

6. Яды змей Туркменистана в зависимости от вида и дозы способны модулировать функциональную, активность иммунной системы в первичном иммунном ответе на тимусзависиыый антиген, что делает их перспективными в поиске иммуномодуляторов узконаправленного действия и открывает возможность их широкого применения в шл,биофармакологии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОШЩЛЦЕШ

1. Сверхмалые дозы (1/100 и 1/500 ЛДбо ) ядов среднеазиатской кобры, среднеазиатской гюрзы и песчаной эфы можно рекомендовать в качестве иммуностимулирующих препаратов в экспериментальной и клинической иммунологии. •

2. Способность ядов среднеазиатской кобры и среднеазиатской гюрзы стимулировать розеткообразуюиую активность Т- , В- и Д- лимфоцитов можно использовать в клинической иммунологии в качестве инвитрового теста для определения функционального резерва иммунной системы больных с подозрением на .иммунодефицитное состояние.

3. Специфичность иммунного ответа мышей на яды змей позволяет использовать иммунологические тесты для определения .вида вмеи прй обследовании пострадавших хзт ее укуса, а также для идентификации ядов змей in vitro.

СПИСОК РАБОТ, опубликованных по теме диссертации

1. Первичный иммунный ответ мышей на тимусэависимый антиген при воздействии малой дозы яда песчаной эфы // Здравоохранение Туркменистана, 1995, N 1, - С.16-17 (в соавт. о С.А.Плескановской, А.Т.Бердыевой).

2. Влияние малых доз яда песчаной эфы на процессы перекисного окисления липидов у мышей, иммунизированных эритроцитами барана //Здравоохранение Туркменистана. 1995, N 3, - С. 11-15 . (в соавт.о АЛ.Бердыевой,.С.А.Плескановокой).

3. Переспективы использования ядов змей Туркменистана в качестве иммуномодуляторов широкого спектра действия // Материалы "ill съезда терапевтов Туркменистана 17-18 апреля 1995г., Ашгабат, '19Э5 (в соавт. с А.Т.Бердыевой, С.А.Плескановской).

4. Влияние яда гюрзы на розеткообразующую активность лимфоцитов .периферической крови / Материалы 55-й научно-практической конференции проф. преп.г сост, ТГМИ. Ашгабат, 1995, С.65.

5. The Lysosomal Catlonic Proteins (LCP) of Peripheral Blood Neutrophils (PBN) of the different serpents* Venom treated Mice in the Primary Immune , Response (PIR) to the SRBC. //Abstr. ' of the Second Asian Herpetol. Meet. Ashabat,' 1935, 6-10 September, Turkmenistan, P.15-16. (A.T.Berdieva, S.A.Pleskanovskaya, D.G.Mukhame-dova). ."

. 6, The Mad a oxyana venom (NOV) influence on the Щсе Primary Immune Response to Sheep Red Blood.cells (SRBC). // 1 bid, P.47. A.T.Berdieva, S.A.Pleskanovskaya, D.G.Mukhsmedova)

7. tauftmoduiating Influence of Naja Oxiana Venom on Primar Immune Mice Response for. Sheep'Erythrocytes (S.A.'Pleskanovskaya, A.T.Berdieva., D.G.MuIihamedova, ■ в печати).

- 25 -ANNOTATION

of Jakhan Mukhamedova's thesis "Immunomodulating Effects of Turkmenistan Snakes' Venoms" for Candidate of Medicine Oegree in specialities 14.00.16 - . '•Pathologic Physiology" and 14.00.36 - "Immunology"

This work has been devoted to the investigation of the immunomodulating activity of an average, small and supersmall Turmenistan snakes" (Middleasian cobra - Naja oxyana Eichw, Middleasian gurza - Vípera Lebetina turanica and Sandy effa -Eshis carinatus) venoms doses.

The experimental part of this work has'been carried out on white unlined mice.

The influence of indicated venoms doses on the primary immune-response on the thymusdependent antigen was being studied. The number of the rosetteborming cells in the spleen, spinal cord and liver," antibody producán sr cells in the spleen, the lovel of hemagglutinins in the blood serum of the experimental animals were being determined.

The definition results of the in vitro influence of the indicated veneras doses on the functional activity of mice and a human (healthy donors), immunocompetentcells have been presented in this work. ' ,

It has been established that average venoms doses possess the lmmunosuppressing feature and small and. supersmall venoms ones possess the immunostimulating property.

'The use of average, small and supersmall venoms doses of the Middleasian cobra, Middlessian guréa and sandy effa has been recommended as irrmunomodulators of the wide spectrum action.

Ж. Г. Мухаммедованыц "Туркмонистаныц йыланларынын зохерлорипиц иммупомодулнрлойнш эффекти" атлы 14.00.16.- патологнки физиология во 14.00.36. иммунология хунорлерн боюича медицина ылымлэрыныц кандидаты диен алымлык дередооини алмага хедурлон$ви дпссортацнон ишиниц маэмуиы.

Диссертация гирншдон, гысгача 9добнят маглума-тындан, шахсы барлаглардан, барлагларыц нотижелорини хортаранлайын пикнрлонмекден, нотижелерден, практики маслахатла^даи, 211 чишмвни, шол оанда 139 руо ве 72 чот юрт диллеринде, ичине алии эдебият геркоэижндон дуряр.

Иш Туркменистаиыц йыланларынын (орта Азия копжо-башы, орта Азия гоклорсы, орта Азия чогеоеп алахеврени) зэхорнннн орта,, пес ое «уда лес Бшчборлориниц нину помодулирлсйнш актив липши ооронмого багышланяр. Ишиц экспери ментол болсгн ак чыэыксыэ сычанларда гочнрнлдн. - ■ Зохерлори боллибир мочборде гойборыок билон,

тимус баглы антигене нлктнки мммун идегабына твсир етмек хооиоти ввреиилдн.

Дялакда,бойни йулуганде во багырда розетке дородном рЛжуклорин, багырда аитн«исим дородней ейжук-лорин саны оксперимоитал хвйвашгарын гаиыньш лагталан-магыцда гомагпиэтинпплорпц титрлори косгптлоиилдн.

Ишдо зохорлориц беллспилон мочберлоргшвд сычан-ларыц во -адамыц ппыунокомпотеит ойухлориц функционал сктнвлилнгини иивитрли ТОСИрИИИН коспллэянш КОТШХОЛОри горкезидци.

Зохорлериц орта ыочборлори инмуносупрассеш,поо во жуда пес иочборлориц болса »«.'.муностнмулирлоГнзщ хосиетлориниц барды гы аиыклакыдды. Орта Азия кон-хсебгшыныц, орта Азия геклорсуньш во логосов алахосрсшщ орта, пес во »суда пос ыочберлориндокг: гохорлорн гуйчли тосирлн иимуноыодулптор хокмушэ уланылмага ходурлоннлйор.

Заказ № &/Р

Тирам /СО

Индинкдуалшое предприятие сГАРЛЛВАЧ»., 744012 г.'Ашгабат, ул. Советских пограничников, 92а