Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Особенности постинфекционного и поствакцинального гуморального иммунитета к коклюшу

005012367

ЗАЙЦЕВ Евгений Михайлович

ОСОБЕННОСТИ ПОСТИНФЕКЦИОННОГО И ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА К КОКЛЮШУ

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология 03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

1 2 [;]ДР 20 ¡2

МОСКВА-2012

005012367

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно - исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Российской академии медицинских наук Научный консультант:

Доктор медицинских наук, профессор Краснопрошина Людмила Ивановна Официальные оппоненты:

Медуницын Николай Васильевич, доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздравсоцразвития России, главный научный сотрудник Пинегин Борис Владимирович, доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России, заведующий отделом иммунодиагностики и иммунокоррекции

Ястребова Наталия Евгеньевна, доктор медицинских наук, ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН, заведующая лабораторией иммунохимической диагностики

Ведущая организация:

Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный научно - исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора

Защита состоится 19 апреля 2012 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: 105064, Москва, Малый Казенный пер., д. 5а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИВС им. И.И. Мечникова

РАМН

Автореферат разослан « .¿С/» 2012

г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Яковлева Ирина Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Успехи в области вакцинопрофилактики коклюша подтвердили правильность принятых ранее научно-организационных и медицинских решений, направленных на борьбу с коклюшной инфекцией, вызываемой Bordetella pertussis, передающейся воздушно - капельным путем. Тем не менее, коклюш продолжает оставаться актуальной проблемой здравоохранения.

Заболеваемость коклюшем в Европе и других развитых странах мира остается высокой. Несмотря на массовую вакцинацию, ежегодно заболевают около 600 ООО взрослых, растет заболеваемость подростков и детей первого года жизни. Начиная с середины 90-х годов прошлого столетия, во многих странах мира, несмотря на широкий охват прививками населения, начали регистрировать подъём заболеваемости коклюшем (Г.Г. Чистякова и др., 2005; Q. Не et al., 2008; R. UUoa - Gutierrez et al., 2008; F. Zepp et al., 2011), в том числе среди привитых - детей, подростков, а также части взрослых (A.K. Leung et al., 2007; N. Guiso et al., 2011). Достаточно высоким во всех странах мира остаётся уровень скрытой заболеваемости, серологические маркёры инфицирования выявляют у 13 - 32% подростков и взрослых (J.D. Cherry et al., 2005; В.К.Таточенко, 2010).

В России охват прививками выше 95% привел к снижению заболеваемости с 19,06 на 100000 населения в 1998 г до 2,51 на 100000 в 2008 г. Однако, публикуемые данные не отражают истинного положения по заболеваемости коклюшем. В связи с тем, что в России исследования по иммунологическому мониторингу коклюша часто проводятся в неполном объёме, установить истинный уровень заболеваемости в стране не представляется возможным. Для серологической диагностики коклюша и оценки напряженности гуморального иммунитета в отечественной медицинской практике традиционно используется, главным образом, реакция агглютинации, а отсутствие на рынке более информативных иммуноферментных (ИФА) тест-систем отечественного производства существенно обостряет данную проблему (И.В.

Ч

/

Фельдблюм и др., 2005; М.В. Сухинин, 2005). Кроме того, сведения о состоянии иммунитета к коклюшу в России у детей имеют ограниченный характер, а у взрослых практически отсутствуют. При этом известно, что определяемые различия в спектрах антител к антигенам вакцинных и циркулирующих (диких) штаммов В. pertussis у больных коклюшем и здоровых, привитых против коклюша детей, являются одним из ключевых факторов понимания механизмов формирования постинфекционного и поствакцинального гуморального иммунного ответа.

Одним из наиболее эффективных методов слежения за эпидемическим процессом коклюша, в том числе на фоне стертых и атипичных форм болезни, является иммунологический мониторинг, позволяющий оценить реальный уровень заболеваемости. За рубежом постоянно совершенствуется серологическая диагностика коклюша (D. Xing et al., 2009; M.L. Tondeila et al., 2009; N.Guiso et al., 2011; Bock J.M. et al., 2012), проводятся исследования, отражающие распространённость данной инфекции в популяции (A.M. Kapaskelis et al., 2008; M.Vincent et al., 2011), изучается иммунологический статус привитых против коклюша (Н.О. Hallander et al., 2009; T. Dalby et al., 2010). Однако, несмотря на широкое применение в борьбе с коклюшной инфекцией новых диагностических средств, в том числе ИФА, в области диагностики существуют определённые проблемы.

В настоящее время назрела необходимость в увеличении информативности иммуноферментного анализа (Г.Я. Ценева и др., 2003; S.L. Menzies et al., 2009). Стала очевидной важность исследований по определению диагностической значимости антител различных изотипов/субизотипов к антигенам В. pertussis. Проведение подобных исследований при коклюшной инфекции и вакцинации против коклюша невозможно без создания новых ИФА тест-систем, предназначенных для углублённого изучения гуморального иммунитета, процесса антителообразования при инфекции и вакцинации. Можно полагать, что подобный серологический анализ позволит определить критерии, необходимые, в частности, для надёжной дифференцировки постинфекционного и поствакцинального иммунитета. Таким образом, в борьбе с коклюшной инфекцией необходимо использовать приёмы современной лабораторной диагностики, которые в сочетании с мерами по активной иммунопрофилактике бо-

4

лезни среди восприимчивых контингентов, включая подростков и взрослых, позволят значительно увеличить эффективность противоэпидемических мероприятий и существенно снизить уровень заболеваемости (L.J. Scott, 2010; S.C. de Greeff et al., 2010; N. Guiso et al., 2011; H.O. Hallander et al., 2011).

К настоящему времени устанавливают генотипические и антигенные различия между вакцинными и дикими штаммами коклюшного микроба (DJ. Litt et al., 2009; F.R. Mooi et al., 2010), проводится мониторинг антигенных профилей циркулирующих штаммов коклюшного микроба. Эти результаты необходимы для обоснования штаммового и антигенного состава новых коклюшных вакцин (Б.Ф. Семенов и др., 2003; А. Advani et al., 2007.

Таким образом, эффективные меры по борьбе с коклюшной инфекцией, включая повышение уровня управления эпидемическим процессом коклюша, возможны лишь при активном совершенствовании иммунологического контроля с использованием наиболее современных лабораторных методов изучения особенностей формирования постинфекционного и поствакцинального иммунитета у населения.

Имеющиеся в литературе данные не дают полного представления об особенностях антигенного состава вакцинных и циркулирующих штаммов В. pertussis, специфичности и изотипе антител, продуцирующихся при коклюшной инфекции и вакцинации против коклюша, уровне популяционного иммунитета разных возрастных групп населения в условиях высокого охвата прививками и продолжающейся циркуляции возбудителя. Решение этих вопросов позволит найти новые подходы к обоснованию штаммового и антигенного состава вакцин для профилактики коклюша, повысить эффективность лабораторной диагностики коклюшной инфекции, определить возрастные «группы риска» с низким уровнем противококлюшного иммунитета, подлежащих ревакцинации против коклюша.

Цель работы - выявление особенностей формирования постинфекционного и поствакцинального гуморального иммунитета к коклюшу, разработка подходов к созданию высокоинформативных методов серологической диагностики коклюшной инфекции и контроля напряжённости популяционного иммунитета к коклюшу.

5

Задачи исследования:

1. Исследовать антигенный профиль вакцинных и свежевыделенных (диких) штаммов В. pertussis для обоснования включения бактериальных антигенов в состав новых диагностических ИФА тест- систем.

2. Разработать и сконструировать ИФА тест-системы, предназначенные для выявления антител изотипов - IgG, IgM, IgA и субизотипов - IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 к антигенам В. pertussis.

3. Провести сравнительный анализ процессов IgG-, IgM- и IgA-антителообразования у экспериментальных животных при различных способах их иммунизации антигенами В. pertussis.

4. Оценить процесс продукции антител основных изотипов/субизотипов к антигенам В. pertussis у пациентов с коклюшной инфекцией, изучить закономерности динамики антителообразования в разные фазы заболевания.

5. Провести популяционный анализ формирования антител основных изотипов/субизотипов к антигенам В. pertussis в различных возрастных группах населения.

Научная новизна

Впервые установлены закономерности в динамике образования антител различных изотипов и субизотипов к антигенам В. pertussis при развитии коклюшной инфекции, а также формировании поствакцинального иммунитета в различных возрастных группах населения. Предложен новый перспективный подход к серологической диагностике коклюша и оценке поствакцинального иммунитета, учитывающий особенности выработки антикоклюшных антител различных изотипов и субизотипов в разные фазы коклюшной инфекции и при иммунизации.

Впервые показано, что коклюшная инфекция сопровождается нарастанием титров сывороточных антител изотипов IgM, IgA, IgG и IgGl-, IgG2-, IgG3-, IgG4-субизотипов к белковым антигенам (коклюшному токсину, филаментозному гемагг-лютинину, агглютиногенам 1,2,3) и липополисахариду (ЛПС) В. pertussis. При кок-

6

люшной инфекции динамика образования антител к липополисахариду В. pertussis отличается от динамики антителообразования к белковым антигенам возбудителя, при этом, в фазу реконвалесценции отмечается снижение титров специфических IgG - и IgA - иммуноглобулинов.

Впервые показано, что для острой фазы коклюшной инфекции характерно:

- нарастание титров IgM-антител к коклюшному токсину, филаментозному гемагтлютинину, агглютиногенам 1,2,3 и липополисахариду В. pertussis с последующим снижением их уровня в фазе реконвалесценции.

- титры IgG-, IgGl-, IgG2-, IgG4- и IgA-антител к белковым антигенам В. pertussis достигают максимальных значений в конце острой фазы заболевания с последующей стабилизацией показателей до конца фазы реконвалесценции.

- нарастание титра IgG3 - антител к антигенам В. pertussis с 3 - 4 недель от начала коклюшной инфекции с последующим снижением их уровня в фазу реконвалесценции, позволяет дифференцировать острую фазу коклюша от периода реконвалесценции, что важно для проведения адекватных противоэпидемических мероприятий, особенно при стёртых формах этой инфекции.

Впервые, с учётом определения титра IgG3 - антител к антигенам В. pertussis, разработан перспективный серологический метод лабораторной диагностики коклюша, позволяющий дифференцировать острую фазу заболевания от фазы реконвалесценции, а также иммунный ответ вследствие текущего заболевания и вакцинации.

Показано, что увеличение титра IgM-антител к антигенам В. pertussis у больных коклюшем отмечено как у категории лиц, не привитых против коклюша, так и у пациентов, иммунизированных АКДС - вакциной.

Поствакцинальный гуморальный иммунный ответ к антигенам В. pertussis у детей младшего возраста, привитых АКДС вакциной, характеризуется низким уровнем IgM- и IgA-антител, а также узким спектром субизотипов IgG антител (IgGl и IgG2).

У детей 2 - 5-летнего возраста, привитых АКДС вакциной, уровень IgG- антител к антигенам В. pertussis - максимальный и постепенно снижается, достигая ми-

7

нимальных значений у детей 9 лет и старше, без существенного изменения динамики антителообразования у подростков и взрослых. Нарастание титра антител изоти-па А к антигенам В. pertussis наблюдается преимущественно у лиц старшего возраста, что может быть обусловлено перенесенной стертой формой инфекции. Это подтверждается данными по аэрозольной вакцинации экспериментальных животных антигенами В. pertussis , при которой происходит стимуляция продукции сывороточных IgG-, IgM- и IgA-антител. Инъекционные способы иммунизации вызывают активную выработку антител IgG- и IgM-изотипов, но не вызывают процесс IgA-антител ообразования.

Впервые показано, что антигенные профили вакцинных и свежевыделенных (диких) штаммов В. pertussis имеют сходные характеристики, однако, для диких штаммов характерен более широкий диапазон содержания коклюшного токсина в надосадочной жидкости при культивировании. Концентрация коклюшного токсина в культурах вакцинных и свежевыделенных диких штаммов В. pertussis не связана со структурой гена ptxA, кодирующего ферментативно активную S1 субъединицу.

Материалы работы включены в Национальное руководство «Вакцины и вакцинация».

Практическая значимость

Разработанная ИФА тест-система для определения антител основных изотипов (IgG, IgM, Ig А) и субизотипов (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4) к комплексу антигенов В. pertussis (коклюшному токсину, филаментозному гемагглютинину, липополисаха-риду, агглютиногенам 1, 2, 3) может быть использована:

- для серологической диагностики коклюша;

- для проведения адекватных противоэпидемических мероприятий, особенно при стертых формах этой инфекции, по оценке уровня нарастание титра IgG3-антител к антигенам В. pertussis с 3 - 4 недель от начала коклюшной инфекции с последующим снижением их уровня в фазу реконвалесценции, позволяя дифференцировать острую фазу коклюша от периода реконвалесценции;

- при оценке иммунологической эффективности вакцин для профилактики коклюша;

8

- при оценке напряженности популяционного иммунитета к коклюшу, включающей определение IgG- и IgA-антител к комплексу антигенов В. pertussis, в разных возрастных группах населения;

- для определения интенсивности циркуляции возбудителя в старших возрастных группах населения и их значимости как резервуара и источника инфекции, обоснования разработки программ ревакцинации против коклюша детей старше 9 лет, подростков и взрослых.

В результате проведенных исследований получен патент на изобретение «Способ серологической диагностики коклюша» № 2424530 от 20.07. 2011 г. Разработан проект инструкции по изготовлению и контролю иммуноферментной тест -системы для выявления антител к антигенам В. pertussis «ИФА - В. р. - IgG, IgA, IgM» и проект инструкции по её применению, изготовлены и испытаны на клиническом материале 3 опытные серии тест - наборов.

Разработаны ИФА тест-системы, которые могут быть использованы для количественного определения антигенов В. pertussis: коклюшного токсина, филаментоз-ного гемагглютинина и агглютиногенов 1, 2, 3, а также для мониторинга антигенного состава вакцинных и циркулирующих штаммов В. pertussis и контроля антигенного состава коклюшных вакцин.

С помощью разработанной ИФА тест-системы можно определять уровень экспрессии коклюшного токсина и других антигенов вакцинными и свежевыделен-ными штаммами В. pertussis.

Отобранный штамм В. pertussis, отличающийся от вакцинных штаммов высокой способностью к токсинообразованию, в перспективе может быть использован для создания новой коклюшной вакцины. Штамм депонирован в коллекции штаммов ГИСК им JI.A. Тарасевича (Свидетельство № 01-12/27 от 08.06.2009 г.). Получен патент на изобретение «Свежевыделенный штамм бактерий Bordetella pertussis -продуцент коклюшного токсина» № 2407788 от 27.12. 2010 г.

Материалы диссертации использованы при разработке технологии получения комплекса антигенов В. pertussis, включающего коклюшный токсин, филаментоз-ный гемагглютинин, липополисахарид и агглютиногены 1, 2, 3. Получены патенты

9

на изобретение «Способ получения анатоксина Bordetella pertussis» (№ 2227746 от 27.04.2004 г., № 2285540 от 20.10.2006 г.). Показана перспективность использования комплекса антигенов для создания препаратов для вакцинопрофилактики и диагностики коклюша. На основе комплекса антигенов разработана технология изготовления и контроля бесклеточной коклюшной вакцины. На базе ОАО «Биомед» им. И.И Мечникова изготовлены опытно - промышленные серии препарата для проведения доклинических испытаний, разработаны проекты фармакопейной статьи и опытно - промышленного регламента.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Анализ генотипических, иммунобиологических и антигенных свойств возбудителя коклюша выявил сходство антигенного состава вакцинных и свежевыде-ленных штаммов В. pertussis при более широким диапазоне содержания коклюшного токсина в супернатантах культур свежевыделенных штаммов. Наличие в современной популяции В. pertussis штаммов с повышенным уровнем продукции коклюшного токсина указывает на необходимость мониторинга уровня токсинооб-разования циркулирующими штаммами возбудителя и селекции таких штаммов для усовершенствования вакцинных препаратов.

2. Использование комплекса антигенов В. pertussis (коклюшный токсин, фила-ментозный гемагглютинин, липополисахарид, агглютиногены 1, 2, 3) в качестве специфического лиганда в иммуноферментном анализе и антивидовых пероксидаз-ных коньюгатов к основным изотипам и субизотипам иммуноглобулинов человека обеспечивает выявление широкого по специфичности и изотипу спектра противо-коклюшных антител у больных коклюшем и здоровых лиц разного возраста в ИФА.

3. Определены показатели уровня изотипов (IgM, IgA, IgG) и субизотипов (IgG3) антител к антигенам В. pertussis, имеющие диагностическую значимость при коклюшной инфекции с 3 - 4 недель от начала заболевания и позволяющие дифференцировать острую фазу коклюша от периода реконвалесценции, что важно для проведения адекватных противоэпидемических мероприятий, особенно при стертых формах этой инфекции.

10

4. Показано, что у вакцинированных АКДС - вакциной детей и иммунизированных инъекционными способами животных не происходит значимого IgA ответа, развивающегося при поступлении антигенов В. pertussis через слизистые органов дыхания при коклюшной инфекции у людей или аэрозольной иммунизации экспериментальных животных, в связи с чем выявление антител этого класса у здоровых лиц можно рассматривать как серологический признак перенесенной инфекции, позволяющий оценить распространенность коклюша в популяции.

5. Выявленное снижение популяционного иммунитета к коклюшу в возрастных группах населения старше 8 лет сопровождается нарастанием частоты выявления IgA антител к антигенам В. pertussis, что указывает на интенсивность циркуляции возбудителя в старших возрастных группах населения и их значимость как резервуара и источника инфекции и свидетельствует о необходимости разработки программ ревакцинации против коклюша детей старше 8 лет, подростков и взрослых.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены и обсуждены на VII, VIII и XV Российских национальных конгрессах « Человек и лекарство» (Москва, 2000, 2001, 2008); VII съезде эпидемиологов, микробиологов, паразитологов (Москва, 2002); первой Всероссийской конференции по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций» (Москва, 2004); Fourth World Congress on Vaccines and Immunization (Tsukuba Science city/Tokyo, Japan, 2004); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); Всероссийской научно-практической конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008); VII Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2008); Научно - практической конференции с международным участием «Вакцино-логия 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, ди-

11

агностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2008); Всероссийской научно - практической конференции «Вакцинология 2010» (Москва, 2010); XIII и XIV Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009, 2011).

Апробация диссертации состоялась 26 мая 2011года на заседании Ученого совета НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.

Работа выполнена в рамках подпрограмм «Вакцинопрофилактика» и «Совершенствование методов диагностики заболеваний, контролируемых средствами спецпрофилактики: дифтерии, коклюша, краснухи» Федеральной целевой программы «Предупреждение и борьба с социально-значимыми заболеваниями (2007 - 2011 годы)», Международного проекта №1439 Международного научно-технического центра (МНТЦ).

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 37 печатных работ, из них 18 в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Получено 4 патента РФ на изобретения.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, «Обзора литературы», главы «Материалы и методы», 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, содержащего 372 источника, из которых 49 отечественных и 323 зарубежных. Материалы диссертации отражены на 258 страницах компьютерного текста, иллюстрированы 49 рисунками и 36 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы В. pertussis. В работе использованы вакцинные и свежевыделенные штаммы В. pertussis. Вакцинные штаммы, используемые в производстве коклюшного компонента АКДС - вакцины: серовара 1.0.3 № 267, серовара 1.2.0 № 305 и се-ровара 1. 2 .3 № 475. 25 свежевыделенных штаммов В. pertussis получены от боль-

12

ных коклюшем детей в возрасте от 2 месяцев до 14 лет в период с 2001 по 2005 г.г. в г. Москве из ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

Антигены. Очищенные препараты коклюшного токсина, филаментозного гемагглютинина, агглютиногенов 1, 2 и 3 получены из Уфимского НИИ вакцин и сывороток, Института биоорганической химии АН Украины (Киев, Украина), Национального института биологических стандартов и контроля (Великобритания). Липополисахарид коклюшного микроба получен методом водно - фенольной экстракции в лаборатории биохимии НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова. Дифтерийный и столбнячный анатоксины получены из ООО «Биомед» им. И.И. Мечникова. Препарат, выделенный из штамма Klebsiellla pneumoniae № 204 с помощью гидроксиламина, получен из лаборатории терапевтических вакцин НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН.

Сыворотки животных. Использованы коммерческие антисыворотки к иммуноглобулинам G, А и М человека, агглютиногенам I, 2, 3 коклюшного микроба, коклюшная агглютинирующая сыворотка (Предприятие НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН). В работе использованы пероксидазные коньюгаты антивидовых антител к IgM, IgA, IgG белой мыши и IgM, IgA и IgG кролика, пероксидазные коньюгаты антисывороток к IgG человека (Предприятие НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН РАМН и фирмы «Sigma», США), пероксидазные коньюгаты моноклональных антител мыши к IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4 человека (ООО «Полигност, Санкт-Петербург).

Сыворотки людей. Всего было исследовано 2388 сывороток детей и взрослых для определения антител к коклюшу: из них 1256 сывороток детей и 1132 сыворотки взрослых.

Сыворотки 208 детей в возрасте от 3 месяцев до 15 лет с диагнозом коклюш, установленным на основании клинико - эпидемиологических и лабораторных данных, получены из ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н Габричевского, городской клинической инфекционной больницы № 1 г. Москвы, консультативно - поликлинического отделения НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН.

Заболевшие были обследованы в сроки от 1 до 10 недель от начала заболевания (установления кашля). В первые 5 недель, соответствующих преимущественно

13

острой фазе заболевания, было обследовано 142 ребенка. В последующие 5 недель, преимущественно соответствующих фазе ранней реконвалесценции, было обследовано 66 детей. Количество привитых АКДС - вакциной составляло 96 человек (46%), 112 человек (54%) не были привиты против коклюша.

Бактериологическое обследование проводили у 79 (38%) больных коклюшем, результаты бактериологического анализа были положительными у 23 (29%) бактериологически обследованных. Клиническое и бактериологическое обследование больных проводили сотрудники клинического отдела ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора на базе Клинической инфекционной больницы № 1 г. Москвы.

Сыворотки 75 здоровых не привитых против коклюша детей в возрасте от 3 до 14 лет и сыворотки 728 здоровых привитых АКДС - вакциной детей и подростков в возрасте от 2 до 17 лет были получены в организованных детских коллективах (сады - ясли, школы) г. Москвы, Московской, Калужской и Брянской областей для оценки напряженности иммунитета к дифтерии и столбняку, а также у детей и подростков, обратившихся в консультативно - поликлиническое отделение НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН для оценки аллергологического и иммунного статуса и не имевших признаков острых заболеваний респираторного тракта. Сыворотки 245 детей в возрасте от 2 до 18 лет с хроническими заболеваниями (ювенильный ревматоидный артрит, системная красная волчанка, сахарный диабет 1 типа) были получены из Нижегородской областной детской клинической больницы.

Сыворотки взрослых получены из поликлиники №1 Российской академии наук (г. Москва). Из них 910 сывороток взрослых обоего пола: женщин - 480 человек (53%), мужчин - 430 человек (47%) в возрасте от 18 до 56 лет, обратившихся за медицинской помощью по причинам, не связанным с заболеваниями органов дыхания; сыворотки 102 клинически здоровых беременных женщин (1-2 триместры беременности) в возрасте от 18 до 43 лет (средний возраст 29 ± 5 лет); сыворотки 120 взрослых пациентов: женщин - 82 (68%), мужчин - 38 (32%) с малопродуктивным или непродуктивным кашлем, длительностью от 2 до 8 недель. Клиническое

14

обследование и лечение пациентов проводили на базе поликлиники № 1 Российской академии наук.

Животные. Кролики породы «Шиншилла» массой 2 - 2, 5 кг и мыши гибриды F1(CBA/C57BL6) массой 12 - 14 г получены из питомника НЦ биомедицинских технологий РАМН (филиал «Андреевка»),

Генотипирование штаммов, изучение культурально - морфологических и серологических свойств проводили совместно с сотрудниками лаборатории иммуно-модуляторов НИИВС им. И.И. Мечникова, а также сотрудниками лаборатории диагностики дифтерийной инфекции ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского. Штаммы В. pertussis выращивали на среде Борде - Жангу с кровью в микробиологических матрасах при 35 - 36° С. Проведение полимеразной цепной реакции для идентификации гена S1 субъединицы коклюшного токсина (ptxA) и гена пертакти-на (ргп) проводили в соответствии с ранее описанными методами (И. К. Мазурова и др., 2005).

Комплекс антигенов коклюшного микроба выделяли из супернатанта культур штамма № 475 методом кислотного осаждения.

Для оценки вирулентности штаммов В. pertussis мышей заражали интраце-ребрально двукратными дозами микробных взвесей в объеме 0,03 мл с последующим наблюдением в течение 14 дней, учетом количества павших животных и расчетом LD50.

Для получения гипериммунных сывороток к коклюшному токсину, филамен-тозному гемагглютинину и комплексу антигенов В. pertussis кроликов иммунизировали 4-5 кратно с интервалом в 30 дней. Иммунный ответ на введенные антигены оценивали по уровню антител в ИФА.

Иммуноферментный анализ проводили в 96-луночных полистироловых планшетах производства фирмы «Nunc» (Дания) и «Биомедикал» (Россия,), оптическую плотность субстратной смеси измеряли с помощью многоканального спектрофотометра вертикального сканирования «Униплан» (фирма «Пикон», Россия) при длине волны 450 нм. Пероксидазные коньюгаты гамма-глобулиновых фракций антисывороток к IgA, IgM человека, пероксидазные коньюгаты гамма - глобулиновых

15

фракций антисывороток к коклюшному токсину, филаментозному гемагглютинину и комплексному антигену коклюшного микроба готовили двухэтапным глютараль-дегидным методом (Н.Ф. Янкина, 1985).

Антигенную активность штаммов В. pertussis оценивали в реакции микробной агглютинации, радиальной иммунодиффузии (РИД) и иммуноэлектрофорезе (ИЭФ).

Исследование системного и мукозального иммунитета к антигенам В. pertussis. Системный иммунитет исследовали при внутривенной 7 - кратной иммунизации кроликов 10 - кратно замороженными и оттаявшими культурами штамма № 475 в дозе на цикл 25,5 х 109 м.к. и внутрибрюшинной иммунизации белых мышей комплексом антигенов В. pertussis в дозе 25 мкг на мышь.

Исследования по аэрозольной вакцинации выполнены совместно с сотрудниками Научно - исследовательского центра токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов при Минздраве РФ (НИЦ ТБП, г. Серпухов, Московская обл.). Аэрозольную вакцинацию проводили в статико-динамической аэрозольной камерной установке с ультразвуковым генератором «Альбедо» в три цикла с интервалом в 3 дня. Длительность каждого цикла составляла 25 - 30 мин. В этих условиях суммарная прививочная доза составляла 1,5 мкг на мышь. Иммунный ответ оценивали по уровню антител в ИФА. Положительными считали образцы бронхоальвеоляр-ных смывов иммунизированных мышей, в которых значения оптической плотности в 2 и более раз превышали средние значения оптической плотности неиммунных мышей.

Протективную активность комплекса антигенов В. pertussis оценивали в тесте развития менингоэнцефалита у иммунизированных мышей, вызванного внутримоз-говым введением нейротропной коклюшной культуры штамма В. pertussis №18323.

Содержание липополисахарида в препаратах комплекса В. pertussis определяли в количественном хромогенном ЛАЛ - тесте по конечной точке с использованием наборов фирмы «Cambrex» (США).

Статистические методы обработки данных. Статистический анализ проводили с использованием пакета прикладных программ Excel (Microsoft, США) с примене-

16

нием параметрических методов сравнения при нормальном распределении (t- критерий Стьюдента). Достоверными считали различия при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Характеристика культуралыю - морфологических, генотипических и антигенных свойств вакцинных и свежевыделенных штаммов В. pertussis

Исследованные нами свежевыделенные штаммы имели характерные для В. pertussis культурально - морфологические признаки. Микробные клетки представляли собой грамотрицательные, овоидной формы мелкие палочки (коккобактерии), которые образовывали типичные для В. pertussis мелкие (диаметром до 1 мм), выпуклые, блестящие с «жемчужным» оттенком колонии. По данным ИФА и ИЭФ, вакцинные и свежевыделенные штаммы экспрессировали белковые антигены (коклюшный токсин, филаментозный гемагглютинин, агглютиногены 1,2, 3) и ЛПС (по данным ИЭФ). Большинство (22) свежевыделенных штаммов имели серовар 1.0.3, два штамма имели серовар 1.2, один штамм относился к серовару 1.2.3. По структуре гена ptxA, кодирующего ферментативно активную S1 субъединицу коклюшного токсина, все свежевыделенные штаммы относились к аллельной вариации ptxAl. Нуклеотидная последовательность гена ргп, кодирующего пертактин, у большинства свежевыделенных штаммов характеризовалась как ргп2, два штамма имели аллели prnl и ргпЗ. Вакцинные штаммы отличались от свежевыделенных по аллель-ным вариациям генов коклюшного токсина и пертактина и имели профили ptxA4 -prnl (штамм №475) и ptxA2 - prnl (штаммы № 267 и № 305).

Для количественного определения коклюшного токсина, филаментозного ге-магглютинина и агглютиногенов В. pertussis разработаны ИФА тест-системы с гам-ма-глобулиновыми фракциями гипериммунных сывороток к этим антигенам в составе иммуносорбента и пероксидазных коньюгатов. Чувствительность определения коклюшного токсина составляла 5-10 нг/мл, филаментозного гемагглютинина 10 -20 нг/мл, агглютиногенов 1, 2 и 3 20-40 нг/мл. Перекрестные реакции между антигенами коклюшного микроба и гетерологичными антигенами (дифтерийным и столбнячным анатоксинами, паракоклюшным диагностикумом, антигенами некап-сульных форм К. pneumoniae) регистрировали при высокой концентрации препара-

17

тов в исследуемых образцах (> 50 - 100 мкг/мл), что указывало на высокую специфичность тест-систем. Коэффициенты вариации значений оптической плотности при определении антигенов коклюшного микроба варьировали от 6,6% до 7,8, что свидетельствовало о высокой воспроизводимости результатов.

В радиальной иммунодиффузии в геле сыворотки больных коклюшем формировали с супернатантами культур вакцинных и свежевыделенных штаммов линии идентичности, что указывает на взаимодействие с идентичными или близкими по строению антигенными структурами (рис.1).

6 5

Рис.1. Радиальная иммунодиффузия сыворотки больного коклюшем с препаратами вакцинных и свежевыделенных штаммов В. pertussis.

Примечание. Центральная лунка - сыворотка больного; периферические лунки - препараты штаммов: 1 - № 475 (вакцинный, серовар 1.2.3), 2 - № 211 (свежевы-деленный, серовар 1.2.3), 3 - № 305 (вакцинный, серовар 1.2), 4 - № 178 (свежевыде-ленный, серовар 1.2), 5 - № 267 (вакцинный, серовар 1.3), 6 - № 162 (свежевыделен-ный, серовар 1.3).

Содержание филаментозного гемагглютинина и агглютиногенов в суперна-тантах культур свежевыделенных штаммов варьировало в широком диапазоне, однако средние значения не отличались от показателей вакцинных штаммов (Рис.2).

18

ш 30

о S

< 25

о и

20

15

I ■

* * * * * * * * * *

г*» IT) LT) 0) IX) in 0) LTI in * *

1£> О ГЧ О r-s 2 О rv 00

rr> «d- fM PO <* ГО «H 00 r-i

Ol Ol Ol $ Ol Ol Ol Ol Ol

Z Z Z 1Л PJ II с z Z z un Oi II с Z Z Ol z Ol z

IM

Ol

Z

ФГА

Аггл.1

Аггл. 2

Аггл.З

Рис. 2. Содержание филаментозного гемагглютинина (ФГА), агглютиногенов 1, 2, 3 в супернатантах культур вакцинных и свежевыделенных штаммов В. pertussis.

Примечание.* - вакцинные штаммы, **- свежевыделенные штаммы, *** -Международные оптические единицы мутности микробной взвеси, Ме - медиана содержания антигенов.

Содержание коклюшного токсина в супернатантах культур вакцинных и свежевыделенных штаммов В. pertussis варьировало в широком диапазоне и не зависело от структуры гена ptxA. Содержание коклюшного токсина в препаратах вакцинных штаммов соответствовало медиане показателей свежевыделенных штаммов, однако 9 (36%) свежевыделенных штаммов отличались более высоким содержанием коклюшного токсина (Рис.3).

19

1 I I

1—

I I I

Рис. 3. Структура гена S1 субъединицы коклюшного токсина (KT) и содержание KT в супернатантах культур вакцинных и свежевыделенных штаммов В. pertussis.

Примечание. * - Ме (медиана) содержания KT в супернатантах культур свежевыделенных штаммов В. pertussis; ** - Международные оптические единицы мутности микробной взвеси.

Полученные результаты свидетельствуют о наличии в популяции свежевыделенных штаммов В. pertussis штаммов с повышенным уровнем токсинообразова-ния. В связи с этим, важное практическое значение имеет селекция циркулирующих штаммов с высоким уровнем токсинопродукции для использования их в качестве новых вакцинных штаммов. В ходе работы селекционирован штамм (№ 162) серо-вара 1.3, имеющий типичные для циркулирующих штаммов генотипические характеристики, но отличающийся высоким уровнем токсинообразования. Штамм депонирован в коллекции штаммов ГИСК им. JI.A. Тарасевича, получен патент на изобретение.

Приведенные данные позволяют считать, что вакцинные и свежевыделенные штаммы В. pertussis имеют сходные антигенные профили, однако некоторые свеже- i выделенные штаммы характеризуются более широким диапазоном содержания коклюшного токсина в супернатантах культур.

Разработка и характеристика ИФА тест-систем для выявления антител к антигенам В. pertussis

Для оценки гуморального постинфекционного и поствакцинального иммунитета к коклюшу разработаны методы выявления антител к антигенам В. pertussis с учетом антигенного состава вакцинных и выделенных от больных коклюшем штаммов возбудителя.

В качестве штамма-продуцента комплекса антигенов коклюшного микроба выбран вакцинный штамм №475 В. pertussis, имеющий все три основных агглюти-ногена, отличающийся стабильным уровнем продукции антигенов и обладающий также стабильными ростовыми характеристиками. Нами разработана технология выделения из среды культивирования этого штамма комплекса основных протек-тивных антигенов коклюшного микроба, включающего коклюшный токсин, фила-ментозный гемагглютинин, агглютиногены 1, 2 , 3 и ЛПС. Обезвреженный формалином комплекс антигенов является основой разработанной в НИИВС им. И.И. Мечникова бесклеточной коклюшной вакцины (Н.С. Захарова и др., 2008). Наличие в составе комплексного антигена основных протективных антигенов коклюшного микроба позволило сделать предположение о перспективности использования этого препарата в качестве лиганда в ИФА для выявления противококлюшных антител. По данным ИФА антигенный состав разных серий комплекса антигенов был стабильным (табл. 1).

Специфичность тест - систем определяли при анализе сывороток здоровых детей в возрасте 3-5 лет, привитых АКДС - вакциной. Чувствительность тест-систем определяли при анализе сывороток больных коклюшем детей с положительными результатами бактериологического анализа (табл. 2). В качестве положительных результатов (диагностических титров) антител принимали титры антител в 2 и более раз превышающие средние титры сывороток здоровых привитых детей.

Титры антител к комплексу антигенов В. pertussis варьировали в широком диапазоне как у больных коклюшем, так и у здоровых, привитых АКДС - вакциной детей, однако средние титры антител у больных коклюшем были достоверно выше.

21

Таблица 1.

Содержание отдельных антигенных компонентов в комплексных препаратах В. pertussis_

Серия Содержание антигенов (% от общего белка препарата)

Коклюшный токсин Филаментозный гемагглютинин Агглютиногены

1 2 3

№36 11,7 31,7 12,7 3,3 3,7

№37 11,9 29,4 14,3 3,2 3,9

№38 13,6 30,5 13,6 3,4 4,2

№42 12,4 31,3 10,6 3,8 3,8

№43 12,1 27,4 12,0 3,4 4,4

№44 12,0 31,5 12,2 2,9 4,1

№45 10,1 29,0 11,0 2,8 4,0

М±м 12,0 ±1,0 30,1 ± 1,6 12,3 ±1,3 3,3 ± 0,3 4,0 ± 0,24

кв* 8,3% 5,3% 10,5% 9,1% 6%

Примечание: * - коэффициент вариации.

Таблица 2.

Чувствительность и специфичность ИФА тест-системы на основе комплекса антигенов В. pertussis.___

Изо- Привитые здоровые дети Диаг- Больные коклюшем

тип (n=240) нос- (п = 23)

анти- Диапазон Титр Специ- тиче- Диапазон Титр ан- Чувстви-

тел титров ан- антител фич- скии титров тител М±м тель-

тител (М±м) ность** титр антител ность***

(%±т) (%±т)

Ij?M 1:10-1:200 32±12 97,9± >100 1 20- 210 ±70* 61±10,2

0,9 1 800

IgA 1:10-400 34±8 96,7± >100 1 40-1600 320 ±100* 78±8,6

0,96

IgG 1:50-1:1600 640±150 92,1± >1600 1 100- 2200±700* 87±7,0

1,7 1 12800

irgi 1:10-1:320 75±25 95± >200 1 20- 250± 80* 83±7,8

1,4 1 640

IgG2 1:10-1:160 40±10 96,7± >100 1 20- 160 ±50* 74±9,1

1,2 1 320

IgG3 1:10-1:80 15±5 99,2± >40 1 20- 120 ±40* 70±9,6

0,6 1 320

IgG4 1:10-1:80 14± 5 98,8± >40 1 20- 100 ±30* 65±9,9

0,7 1 320

Примечание:* - различия достоверны с показателями здоровых привитых детей (р<0,05); ** - частота отрицательных результатов у здоровых, привитых АКДС-вакциной детей; *** - частота положительных результатов у больных коклюшем.

22

При разработке ИФА тест-систем для определения противококлюшных антител в качестве иммуносорбента, наряду с комплексом антигенов, использованы очищенные антигены В. pertussis: коклюшный токсин, филаментозный гемагглюти-нин, липополисахарид, агллютиногены 1,2, 3.

Специфичность реакции при определении антител к комплексу антигенов В. pertussis превышала 90%, однако от 0,8% до 7,9% здоровых привитых детей имели титры антител, соответствующие средним значениям показателей больных коклюшем.

Чувствительность реакции была значительно ниже и варьировала от 61±10,2% при определении IgM антител, до 87±7% при определении IgG антител. У остальных больных коклюшем титры антител не отличались от показателей здоровых привитых против коклюша детей. Таким образом, у части больных коклюшем с бактериологическим подтверждением диагноза заболевание не сопровождалось выраженными серологическими сдвигами. Коэффициенты вариации значений оптической плотности при определении IgG, IgA и IgM антител не превышали 8%, что является свидетельством высокой надежности тестов. Аналогичные результаты получены при исследовании чувствительности и специфичности ИФА тест - систем на основе отдельных антигенов В. pertussis.

Характеристика гуморального постинфекциоиного иммунитета к коклюшу С помощью разработанных ИФА тест-систем мы исследовали уровень и динамику гуморального иммунитета у больных коклюшем в разные фазы заболевания. Результаты исследований показали, что коклюшная инфекция сопровождается выраженными сдвигами в содержании антител к антигенам возбудителя. Средние титры антител у больных коклюшем превышали показатели здоровых привитых детей, однако у части из них были выявлены антитела в диагностических титрах. При использовании ИФА тест-систем на основе отдельных антигенов частота положительных результатов была ниже, чем в ИФА с комплексом антигенов коклюшного микроба. Наиболее низким количество положительных результатов было при определении антител к агглютиногену 2, что можно объяснить низким удельным весом циркулирующих штаммов В. pertussis сероваров 1.2 и 1.2.3. Агглютиноген 2 имели

23

только 3 из 25 исследованных нами штаммов. С остальными антигенами серологические признаки коклюшной инфекции имели от 40% (^М антитела к коклюшному токсину) до 82% (^С антитела к комплексу антигенов) больных с клиническим диагнозом коклюш (Табл. 3).

Таблица 3.

Уровень IgM, IgA и IgG антител к антигенам В. pertussis у больных коклюшем и здоровых, привитых АКДС - вакциной детей___

Антигены Изо- Больные коклюшем Диагно- Здоровые приви-

тип (n= 208) стиче- тые дети

анти- ский (п=240)

тел Титры анти- Положи- титр Титры Поло-

тел, M±m тельные результаты (% ± ш) антител, М±т жительные результаты (%±т)

Коклюшный IgM 85 ±25 40 ± 3,4* >50 18±5 1,7±0,8

токсин IgA 98 ±26 63 ± 3,8* >50 29±6 1,7±0,8

IgG 540±160 72 ±3,1* >400 180± 50 7,1±1,7

Филаментозный IgM 96 ±28 42 ± 3,4* >50 19±6 2,1 ±0,9

гемагтлютинин IgA 105 ±35 65 ±3,8* >50 17± 8 2,5±1,0

IgG 570±190 75 ± 3,0* >400 190±60 9,1±1,9

Агглютиноген 1 IgM 92 ±27 44 ±3,4* >50 18±4 2,1±0,9

IgA 112± 34 62 ± 3,4* >50 20±5 2,1±0,9

IgG 550 ±190 67 ± 3,3* >400 170±40 6,2±1,6

Агглютиноген 2 IgM 25 ±10 6 ±1,6* >50 15 ± 7 0,4±0,4

IgA 29 ±11 7± 1,8* >50 19±5 0,8 ±0,6

IgG 150 ±70 10 ± 2,1* >400 130± 40 0,8±0,6

Агглютиноген 3 IgM 73 ±22 29 ± 3,1* >50 18 ±4 0,8±0,6

IgA 110±30 56 ±3,4* >50 20±5 1,7±0,8

IgG 510 ±150 64 ±3,3* >400 150±50 3,3 ±1,2

Липополисаха- IgM 95 ±25 45 ± 3,4* >50 18±6 1,3 ±0,7

рид IgA 84 ±24 54 ±3,5* >50 16±6 1,7±0,8

IgG 560 ±170 65± 3,3* >400 150±60 11,3±2,0

Комплекс анти- IgM 230 ±80** 51 ±3,5* >100 32 ±12 2,1±0,9

генов IgA 360±120** 75 ± 3,0* >100 34 ±8 3,3±1,2

IgG 2350±840** 82 ± 2,7* >1600 640±15 7,5 ± 1,7

Примечание. * - различия по частоте положительных результатов между больными коклюшем и здоровыми привитыми детьми достоверны (р<0,05); ** -различия по уровню антител между комплексом антигенов и отдельными антигенам В. pertussis достоверны (р<0,05).

24

Средние титры IgM антител к комплексному антигену В. pertussis нарастали с 1 недели и достигали максимальных значений к 3 неделе заболевания. В более поздние сроки уровень IgM антител постепенно снижался и достигал минимальных показателей к 8 неделе от начала заболевания (рис. 4).

"♦■"Больные коклюшем 'Диагностический титр

"^^Здоровые привитые дети

500

ч

С 400 ! § 300 I §1 20О

; jL 100

15 о ¿i IÜ Ú Ú Ú ú ü ú

123456789 10

Недели от начала заболевания

Рис.4. Динамика IgM антител к комплексному антигену у больных коклюшем.

Примечание. Диагностический титр 1:100.

Средние титры IgA антител нарастали в течение 3 первых недель заболевания, достигали максимальные значений к 5 неделе и сохранялись на этом уровне до 10 недели (рис. 5).

—♦-Больные коклюшем Диагностический титр

—Л— Здоровые привитые дети

Ч 700 Р

Se 600

в 500 400 £> 300

3 200 а,

С 100

Н о........Д.......,........й.............й...............й.......: &..............й..........А...........й.......ú............&......

123456789 10

Недели от начала заболевания

Рис. 5. Динамика IgA антител к комплексному антигену В. pertussis у больных коклюшем.

Примечание. Диагностический титр 1:100.

25

Средние титры антител достигали максимальных значений к 4 - 5 неделям и оставались постоянными до конца срока наблюдения (рис. 6).

Больные коклюшем -¿г-Здоровые привитые дети

К 3500 <и

g 3000

£ 2500

у 2000

¿Р 1500

3 1000 в.

¡- 500

S

Н о ■

Диагностический титр

23456789 Недели от начала заболевания

10

Рис. 6. Динамика IgG антител к комплексному антигену В. pertussis у больных коклюшем.

Примечание. Диагностический титр 1:1600. Динамика IgM, IgA и IgG антител к коклюшному токсину, филаментозному ге-

магглютинину и агглютиногенам 1, 2, 3 у больных коклюшем соответствовала динамике антител к комплексному антигену В. pertussis и характеризовалась сохранением высокого уровня IgA и IgG в период реконвалесценции и резким снижением уровня IgM антител (рис. 7, 8).

U Острая фаза Реконвалесценции

80%

u S

§ ^

J о

X 2

Л Я-

ч S

с

е §

х а.

sr в

^ et

IgM* IgA IgG IgM* IgA IgG IgM* IgA IgG KT ФГА ЛПС

Puc. 7. Динамика IgG, IgA и IgM антител к коклюшному токсину, филаментозному гемагглютинину и ЛПС B.pertussis у больных коклюшем.

Примечание. * - различия достоверны между острой фазой и фазой реконвалесценции (р<0,05).

26

■ Острая фаза В Реконвалесценция

2 а р лив

i » Р

J ' t

5 £ 55

® о ;

ее ч

в.

4S?

• П Г1

IgM* IgA IgG IgM* IgA IgG IgM* igA IgG Аггл. 1 Агл.2 Аггл.З

Рис. 8. Динамика ^А и ^М антител к агглютиногенам В.регШя515 у больных коклюшем.

Примечание. * - различия достоверны между острой фазой и фазой реконва-лесценции (р<0,05).

Динамика уровня антител к ЛПС у больных коклюшем отличалась от динамики уровня антител к комплексному антигену, коклюшному токсину, филаментоз-ному гемагглютинину и агглютиногенам, и характеризовалась отчетливой тенденцией к снижению уровня IgA и IgG антител в фазу реконвалесценции (см. рис.7). По данным ИЭФ, антитела к ЛПС были выявлены у 23 из 70 (32,9%) больных коклюшем. Большинство из них (19 человек) составляли больные, обследованные в течение первых 5 недель заболевания.

Известно, что в ходе иммунного ответа содержание антител разных субизоти-пов в зависимости от характера антигена и типа иммунизации может изменяться. Нами впервые исследована динамика субизотипов IgG антител к антигенам В. pertussis в ходе развития заболевания.

27

-O-IgGl -6-IgG2 —IgG3 —*—IgG4

23456789 Недели от начала заболевания

10

Рис. 9. Динамика субизотипов IgG антител к комплексному антигену В. pertussis у больных коклюшем.

Количество больных с диагностическими титрами IgGl, IgG2 и IgG4 антител достигало максимальных значений к 4 неделе заболевания и существенно не изменялось в течение последующих 6 недель (рис. 9).

Больные коклюшем Здоровые привитые дети Диагностический титр

О

о- а я 5 Н

200 150 100 50 0

1 т

- гт

23456789 Недели от начала заболевания

Рис. 10. Динамика IgG3 антител к комплексному антигену В. pertussis у больных коклюшем.

Примечание. Диагностический титр 1:40.

Динамика ^БЗ антител характеризовалась быстрым нарастанием их уровня в острой фазе заболевания и отличалась выраженным снижением титров антител в фазе реконвалесценции (рис 9, 10). Снижение уровня ^03 антител в фазе реконва-лесценции может быть обусловлено особенностями катаболизма этого 28

подкласса иммуноглобулинов, отличающегося от других подклассов IgG самым коротким периодом полураспада (Б.А.Никулин, 2007). Установленные особенности динамики IgG3 антител позволяют рассматривать их в качестве маркера острой фазы коклюшной инфекции. Выявленное нами нарастание уровня IgG3 и IgM антител уже с 3 недели заболевания позволяет выявлять серологические признаки коклюша не только в фазу реконвалесценции, но и в конце острой фазы заболевания.

Показатели противококлюшного гуморального иммунитета были также определены у 120 взрослых пациентов, у которых единственным или основным признаком заболевания был непродуктивный или малопродуктивный кашель в течение 2 -8 недель. Наличие IgG антител в диагностическом титре выявлено у 23 (19±3,6%) обследованных. IgM и IgA антитела обнаружены у 13 (11±2,9%) и 20 (17±3,4%) пациентов соответственно. Титры IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4 антител были повышенными соответственно у 22 (18±3,5%), 18 (15±3,3%), 20 (17%± 3,4) и 16 (13±3,1%) больных. Эти данные позволяют считать, что при таких признаках заболевания у взрослых в 11±2,9% - 19±3,6% случаев этиологическим фактором заболевания может быть В. pertussis.

Характеристика титров антител к антигенам В. pertussis при аэрозольном и инъекционных методах введения на экспериментальной модели

В связи с воздушно-капельным путем передачи коклюша, важным является вопрос о механизме формирования мукозального и системного иммунитета при этой инфекции. С этой целью мы исследовали антительный ответ при инъекционных (внутривенном и внутрибрюшинном) и аэрозольном способах введения антигенов В. pertussis экспериментальным животным.

Приведенные данные указывают на выраженное нарастание уровня IgM и IgG антител и отсутствие динамики IgA антител в сыворотках кроликов при внутривенной иммунизации и в сыворотках мышей при внутрибрюшинной иммунизации (Табл. 4).

29

Таблица 4

Титры ^М, 1§А и антител в сыворотках крови животных к антигенам В. реНт-■ш при внутривенной и внутрибрюшинной иммунизации_

Вид животных Изотип антител Средние обратные значения титров антител (M±m)

Контроль** Сутки от начала иммунизации

14-15 23-28 31-42

Кролики (внутривенная иммунизация***) IgM 29 ±7 115 ± 29* 460 ± 114* 102 ±35*

IgA 35±17 29 ± 7 51 ± 17 26 ± 8

IgG 205±70 282 ±140 1843 ±458* 3686 ±916*

Мыши (внутрибрю-шинная иммунизация****) IgM 40 ± 16 320±130* 640 ±260* 160 ±65*

IgA 38 ±17 40±16 46 ± 18 42±23

IgG 168 ±59 1280 ±523* 4352±1236* 4224 ± 1484*

Примечание. * - различия с контрольной группой достоверны (р<0,05); **- контрольные группы: кролики до начала иммунизации, интактные мыши; *** - антитела к коклюшному токсину; **** - антитела к комплексу антигенов В. pertussis.

Таблица 5

Титры IgM, IgA и IgG антител в сыворотках крови мышей к антигенам В. pertussis при внутрибрюшинной и аэрозольной иммунизации комплексом антигенов В. pertussis

Способы иммунизации Кол-во мышей Сутки после иммунизации Количество серопозитивных мышей абс (%±ш)

Сыворотки крови Бронхоальве-олярные смывы

IgM IgA IßG IgA

Внутри-брюшинный 12 14 9 (75±12,5) 0(0) 12 (100) 0(0)

12 28 3 (25±12,5) 0(0) 12 (100) 0(0)

Аэрозольный 12 14 4 (33±13,6) 4 (33±13,6)* 4 (33±13,6) 6 (50±14,4)*

12 28 3 (25±12,5) 3 (25±12,5)* 6i50±14,4) 3 (25±12,5)*

Интактные 10 14 0(0) 0(0) 0(0) 0(0)

10 28 0(0) 0(0) 0(0) 0(0)

Примечание. * - различия достоверны между группами мышей, вакцинированных внутрибрюшинно и аэрозольно.

30

При однократном внутрибрюшинном ведении комплекса антигенов сывороточные IgG антитела были выявлены у 100% мышей на 14 и 28 сутки после иммунизации, а IgM антитела у 75±12,5% и 25±12,5% мышей соответственно. IgA антитела не были обнаружены ни в сыворотках, ни в бронхоальволярных смывах.

При аэрозольной вакцинации сывороточные IgM и IgA антитела были обнаружены на 14 сутки у 33±13,6%, а на 28 сутки у 25±12,5% вакцинированных мышей. Сывороточные IgG антитела были выявлены на 14 и 28 сутки соответственно у 33±13,6% и 50±14,4% мышей. В бронхоальвеолярных смывах IgA антитела были обнаружены на 14 сутки и 28 сутки соответственно у 50±14,4% и 25±12,5 % иммунизированных мышей (табл.5). Полученные результаты свидетельствуют о том, что при поступлении антигена через слизистые дыхательных путей при аэрозольной вакцинации индуцируется местный иммунный ответ с продукцией мукозальных IgA антител и системный ответ с продукцией сывороточных IgM, IgG и IgA антител. При инъекционных способах вакцинации стимулируется развитие системного ответа с продукцией сывороточных IgM и IgG антител и отсутствием мукозальных и сывороточных IgA антител.

Характеристика популяционного противококлюшного иммунитета.

Разработанные иммуноферментные тест-системы позволили провести комплексное исследование гуморального иммунитета к антигенам В. pertussis у различных возрастных групп населения. Частота выявления IgM антител к комплексу антигенов и отдельным антигенам В. pertussis в разных возрастных группах варьировала от 0,9% до 2,7% и не зависела от возраста обследованных.

31

н н

н

я

«

О оч

1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0

I

J~

/

Возраст обследованных

Рис. 11. Популяционные титры IgG антител к комплексу антигенов В. pertussis в различных возрастных группах населения.

Примечание. * - привитые АКДС - вакциной.

Титры IgG антител к комплексу антигенов В. pertussis в обследованной популяции колебались в широком диапазоне: от 1:50 до 1:3200. Наиболее высокими титры IgG антител были у детей в возрасте от 2 до 5 лет. В старших возрастных группах происходило постепенное снижение титров IgG антител. Самые низкие показатели у детей были зарегистрированы в старших возрастных группах: 9-11 лет и 12 - 14 лет. У подростков и взрослых титры IgG антител оставались без динамики на низком уровне (рис. 11).

Динамика возрастного снижения уровней IgG антител к коклюшному токсину, филаментозному гемагглютинину и агглютиногенам с минимальными показателями, начиная с детей 9 лет и старше, имела сходный характер и соответствовала динамике снижения IgG антител к комплексному антигену В. pertussis {рис. 12,13).

32

300 250

1 II

я1Ш ! _ Н 1 - Р{Г 1 1

Непривитые 2-5 лет* 6-8 лет* 9-17 лет* 18 - 56 лет дети

Рис. 12. Титры антител к коклюшному токсину, филаментозному гемагг-лютинину и ЛПС в различных возрастных группах населения. Примечание. * - привитые АКДС - вакциной.

■ Аггл.1 ЙАггл.2 ВАггл.З

250 200 150 100 50 0

__1

I

Т

ж

ш

Непривитые 2 - 5 лет* 6-8 лет* 9 -17 лет* 18 - 56 лет дети

Рис. 13. Титры IgG антител к агглютиногенам В. pertussis в различных возрастных группах населения.

Примечание. * - привитые АКДС - вакциной.

Исключение составляли антитела к ЛПС, минимальный уровень которых был зарегистрирован уже у детей 6-8 лет (рис. 12).

Субизотипы IgG антител к комплексу антигенов В. pertussis в обследованной популяции были представлены IgGl и IgG2 антителами. При этом титры IgGl и IgG2

33

антител у здоровых, привитых АКДС - вакциной детей в возрасте от 3 до 5 лет, были достоверно выше, чем в старших возрастных группах (рис. 14).

■ Непривитые дети »Привитые дети а Взрослые

120 -г———---

100

IgGl IgG2 IgG3 IgG4

Рис. 14. Титры субизотипов IgG антител к комплексу антигенов В. pertussis.

Уровень IgA антител к комплексу антигенов и отдельным антигенам В. pertussis был самым низким у детей 2-5 лет, достоверно увеличился у детей 9-11 лет и оставался на этом уровне в старших возрастных группах (табл. 6).

Динамика IgA антител к антигенам В. pertussis имела отрицательную корреляцию (г = - 0,963) с возрастным снижением популяционного уровня противококлюшных IgG антител (рис. 15).

Полученные результаты подтверждают значимость IgA антител как ключевого эффектора мукозального иммунитета, в связи с чем у вакцинированных АКДС -вакциной детей не было обнаружено значимого увеличения уровня IgA антител. Выраженный IgA ответ развивался при поступлении антигенов В. pertussis через слизистые органов дыхания, что происходит при коклюшной инфекции у людей или аэрозольной иммунизации экспериментальных животных. В связи с этим выявление антител этого класса у здоровых лиц можно рассматривать как серологический признак перенесенной инфекции, позволяющий оценить распространенность коклюша в популяции.

34

Таблица 6

Частота выявления IgA антител к антигенам В. pertussis в популяции

Категория Возраст, кол-во Количество серопозитивных абс. (% ± т)

Комплекс антигенов Коклюшный токсин Филамен-тозный ге-магглюти-нин ЛПС

Непривитые против коклюша дети 3-14 п= 75 9 (12±3,8) 4 (5,3±2,6) 5 (6,6±2,9) 4 (5,3± 2,6)

Привитые АКДС -вакциной дети и подростки 2-5 п= 240 8 (3,3±1,2)* 4 (1,7±0,8)* 6 (2,5±1,0)* 4 (1,7±0,8)*

6-8 п= 136 9 (6,6±2,1) 5 (3,8±1,6) 6 (4,4±1,8) 4 (2,9±1,4)

9-11 п= 118 15 (12,7±3,3) 6 (5,1 ±2,0) 8 (6,8±2,3) 6 (5,1±2,0)

12-14 п= 125 17 (13,6±3,1) 7 (5,6±2,1) 9 (7,2±2,3) 6 (4,8±1,9)

15 -17 п= 90 12 (13,3±3,6) 5 (5,5±2,4) 6 (6,7±2,6) 5 (5,5± 2.4)

Взрослые 18-56 п= 635 88 (13,8±1,4) 35 (5,5±0,9) 51 (8,0±1,1) 25 (3,9±0,8)

Примечание. *- Различия достоверны с непривитыми детьми, привитыми детьми старше 8 лет , и взрослыми (р<0,05).

Проведенные исследования определили показатели спектра и уровня антител к антигенам В. pertussis, имеющие диагностическую значимость и позволяющие дифференцировать острую фазу коклюша от периода реконвалесценции, что важно для проведения адекватных противоэпидемических мероприятий, особенно при стертых формах этой инфекции.

35

ШЭ |£<^т1тела_-*- IgA антитела

Возраст

Рис. 15. Возрастная динамика IgG и IgA антител к комплексному антигену В. pertussis.

Важное значение также имеет возможность определения интенсивности циркуляции В. pertussis в старших возрастных группах, которые являются важным резервуаром возбудителя коклюша. Полученные данные указывают на необходимость разработки программ ревакцинации против коклюша детей старше 8 лет, а также подростков и взрослых.

ВЫВОДЫ

1. С помощью разработанных тест - систем к различным антигенным компонентам В. pertussis выявлены особенности формирования постинфекционного и поствацинального гуморального иммунитета к коклюшу, разработаны подходы к созданию высокоинформативных методов серологической диагностики коклюшной инфекции и контроля напряженности популяционного иммунитета к коклюшу.

2. Показано, что вакцинные и свежевыделенные (дикие) штаммы В. pertussis при культивировании имеют сходные антигенные профили, однако рост свежевыде-ленных штаммов сопровождается более широким, по сравнению с вакцинными 36

штаммами, диапазоном содержания в культуре коклюшного токсина. Не установлено коррелятивных связей между структурой гена ptxA, кодирующего фермента-тивно активную S1 субъединицу, и разницей в концентрации коклюшного токсина в культурах вакцинных и свежевыделенных штаммов В. pertussis.

3. Разработанная технология выделения и контроля комплекса антигенов вакцинного штамма В. pertussis обеспечивает получение препаратов со стандартным содержанием коклюшного токсина, филаментозного гемагглютинина, липопо-лисахарида, агглютиногенов 1, 2, 3. Использование в иммуноферментном анализе в качестве лиганда комплекса антигенов вакцинного штамма В. pertussis обеспечивает выявление широкого по специфичности спектра противококлюшных антител и позволяет оценивать показатели поствакцинального и постинфекционного иммунитета к коклюшу.

4. Установлено, что постинфекционный иммунитет у больных коклюшем людей характеризуется повышением уровня основных изотопов (IgG, IgA и IgM) и субизотипов (IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4) антител к белковым антигенам и липополиса-хариду В. pertussis. Особенности динамики образования IgM- и ^ОЗ-антител к антигенам В. pertussis у больных коклюшем с нарастанием их титров в острую фазу и снижением в фазу реконвалесценции позволяют рассматривать их в качестве характерного признака (маркёра) острой фазы инфекции.

5. Определение уровней IgM-, IgA-, IgG- и IgG3-anxnTen к комплексу антигенов В. pertussis обеспечивает выявление серологических признаков коклюшной инфекции, начиная с 3-й недели заболевания, позволяет проводить дифференци-ровку постинфекционного и поствакцинального иммунитета, дифференцировать острую фазу коклюша от периода реконвалесценции.

6. Выявление в диагностическом титре IgG-, IgG3-, IgA- и IgM-антител к комплексу антигенов В. pertussis у взрослых больных с длительным кашлем может рассматриваться как серологический признак стертых форм коклюшной инфекции.

7. Показано, что аэрозольная иммунизация экспериментальных животных антигенами В. pertussis индуцирует выработку сывороточных IgG-, IgA- и IgM-антител, в то время как инъекционные способы иммунизации вызывают синтез сы-

37

вороточных IgG- и IgM-антител, но не стимулируют продукцию антител класса IgA.

8. Продемонстрировано, что гуморальный иммунитет к коклюшу у привитых АКДС вакциной детей 2-5 лет не связан с продукцией IgM- и IgA-антител, преимущественно связан с образованием антител IgGl и IgG2 субизотипов, а также с высоким уровнем антителообразования к белковым антигенам В. pertussis.

9. Показано, что связанное с увеличением возраста снижение популяционных титров IgG- антител к антигенам В. pertussis сопровождается нарастанием частоты выявления специфических IgA-антител у здоровых лиц, что является косвенным индикатором распространенности скрытых форм коклюшной инфекции.

10. Снижение уровня противококлюшного гуморального иммунитета у детей старше 8 лет указывает на необходимость разработки программ ревакцинации против коклюша детей старшего возраста, подростков и взрослых.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Захарова Н.С. Поливалентный комплекс антигенов Bordetella pertussis как основа бесклеточной коклюшной вакцины / Шмелева Е.И., Ремова Т.Н, Бажанова И.Г., Озерецковская М.Н., Мерцалова Н.У., Брицина М.В., Ермолова Е.В., Зайцев Е.М. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии - 1997. -№3. - С. 70 - 72.

2. Зайцев Е.М. Фракционный состав и иммунохимические свойства бесклеточной коклюшной вакцины / Бажанова И.Г., Захарова Н.С. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии - 1998. - № 6. - С. 83 - 84.

3. Захарова Н.С. Протективная активность бесклеточной коклюшной вакцины при пероральной иммунизации /Зайцев Е.М., Брицина М.В., Озерецковская М.Н., Ремова Т.Н., Бажанова И.Г., Ермолова Е.В., Шмелева Е.И., Мерцалова Н.У. // Тезисы докладов VII Российского национального конгресса « Человек и лекарство», Москва. - 2000. - С. 356.

4. Захарова Н.С. Гуморальный ответ на введение бесклеточной коклюшной вакцины / Ремова Т.Н., Брицина М.В., Шмелева Е.И., Мерцалова Н.У., Зайцев

38

Е.М., Озерецковская М.Н., Бажанова И.Г., Ермолова Е.В. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии - 2001,- №6,- С. 40-44.

5. Зайцев Е.М. Оценка состояния антитоксического иммунитета к дифтерии, столбняку и коклюшу методом ИФА // Тезисы докладов VIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва. - 2001. - С. 416.

6. Захарова Н.С. Сравнительное изучение иммуногенных свойств корпускулярной и бесклеточной коклюшных вакцин / Ремова Т.Н., Брицина М.В., Зайцев Е.М. // Материалы 8 съезда эпидемиологов, микробиологов, паразитологов, Москва. -2002. том 2,- С. 175- 176.

7. Захарова Н.С. Разработка бесклеточного коклюшного препарата для профилактики коклюша / Брицина М.В., Озерецковская М.Н., Мерцалова Н.У., Бажанова И.Г., Зайцев Е.М. // Тезисы первой Всероссийской конференции по вакцино-логии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций», Москва. - 2004. - С.23 - 24.

8. Denisov A. Aerosol vaccination against Bordetella pertussis using acellular pertussis vaccine / Intse S., Zakharova N., Karpova O., Mikhina L., Melnikov V., Tretyakova A., Zaytsev E., Borovick R., Dyadishchev N. // Fourth world congress on vaccines and immunization. 30 September - 3 october 2004. Tsukuba science city, Tokyo, Japan. -2004. - P. 97.

9. Тарасова A.A. Оценка состояния гуморального иммунитета к коклюшу детей с сахарным диабетом 1 типа / Костинов М.П., Зайцев Е.М. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии - 2006. - № 3. - С. 53-57.

10. Захарова Н.С. Протективная активность АК(б)ДС- вакцины с бесклеточным коклюшным компонентом и полиоксидонием / Брицина М.В., Озерецковская М.Н., Бажанова И.Г., Мерцалова Н.У., Поддубиков A.B., Зайцев Е.М., Ермолова Е.В. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии - 2006. - № 2. - С. 46 - 49.

11. Шинкарев A.C. Генотипические и иммунобиологические свойства циркулирующих и вакцинных штаммов B.pertussis / Мерцалова Н.У., Борисова О.Ю., Зайцев Е.М., Озерецковская М.Н., Захарова Н.С., Мазурова И.К., Поддубиков A.B.,

39

Бажанова И.Г., Скачкова В.Г. // Аллергология и иммунология. - 2006. - том 7. - № 3. - С. 343.

12. Зайцев Е.М. Уровень противококлюшных антител у привитых и непривитых больных коклюшем детей / Мазурова И.К., Петрова М.С., Захарова Н.С. // Материалы IX Съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва. - 2007. - том 1. - С. 64 - 65.

13. Захарова Н.С. Иммуногенная активность бесклеточной коклюшной вакцины / Бажанова И.Г., Брицина М.В., Зайцев Е.М., Ермолова Е.В., Мерцалова Н.У., Озе-рецковская М.Н., Поддубиков A.B., Шинкарев A.C. // Материалы IX Съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва. - 2007. - том 1. - С. 65.

14. Шинкарев A.C. Современные штаммы В. pertussis: иммунобиологические свойства и совершенствование вакцин / Мерцалова Н.У., Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Захарова Н.С., Озерецковская М.Н., Зайцев Е.М., Поддубиков A.B., Брицина М.В., Бажанова И.Г. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии - 2007. - № 4. - С. 20 - 25.

15. Костинов М.П. Содержание антител к антигенам Bordetella pertussis у пациентов с ревматическими заболеваниями / Тарасова A.A., Зайцев Е.М. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии - 2007. - № 6. - 61-64.

16. Зайцев Е.М. Серологические признаки коклюша у взрослых больных с длительным кашлем / Лаур E.H., Комарова O.A., Астахова Т.И., Захарова Н.С. // Сборник материалов XV Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва. - 2008. - С. 434.

17. Зайцев Е.М. Распределение подклассов специфических IgG антител у больных коклюшем и здоровых детей / Краснопрошина Л.И., Захарова Н.С. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний». Вестник Российской военно - медицинской академии. С-Петербург. - 2008. - №2 (22). - Часть 2. - С. 390 -391.

40

18. Захарова Н.С. Отечественная бесклеточная коклюшная вакцина / Брицина М.В., Мерцалова Н.У., Бажанова И.Г., Озерецковская М.Н., Зайцев Е.М., Поддуби-ков A.B., Семенов Б.Ф. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии - 2008 - № 1. - С. 35 - 41.

19. Краснопрошина Л.И. Участие иммуноглобулина А в формировании системного и местного иммунитета / Андреева И.А., Зайцев Е.М., Сходова С.А., Фо-шина Е.П., Захарова Н.С. // Российский иммунологический журнал. - 2008. - том 2(11).- №2-3,- С. 143.

20. Зайцев Е.М. Диагностическое значение специфических антител разного изотипа при коклюше // Сборник материалов VII Российского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии», Москва. - 2008. - С. 102 -103.

21. Зайцев Е.М. Диагностическое значение IgG, IgA и IgM антител к различным антигенам Bordetella pertussis у больных коклюшем / Мазурова И.К., Петрова М.С., Краснопрошина Л.И. , Захарова Н.С. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии - 2008. - №6. - С. 23 - 26.

22. Зайцев Е.М. Антигенные профили и серологическая характеристика све-жевыделенных и вакцинных штаммов коклюшного микроба / Мазурова И.К., Мерцалова Н.У., Шинкарев A.C., Захарова Н.С. // Тезисы научно-практической конференции с международным участием «Вакцинология 2008». Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва. - 2008. - С. 53 - 54.

23. Зайцев Е.М. Изотипы специфических антител при коклюше и поствакцинальном коклюшном иммунитете / Мазурова И.К., Краснопрошина Л.И., Астахова Т.И., Захарова Н.С. // Тезисы научно-практической конференции с международным участием «Вакцинология 2008». Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва. - 2008. -С. 54.

24. Зайцев Е.М. Гуморальный противококлюшный иммунитет и распространенность коклюша в популяции /Мазурова И.К. , Краснопрошина Л.И., Астахова

41

Т.И., Захарова Н.С. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии- 2009,- №1,- С. 56-58.

25. Зайцев Е.М. Совершенствование диагностики коклюша у взрослых с длительным кашлем / Мазурова И.К., Петрова М.С., Краснопрошина Л.И. , Астахова Т.Н., Лаур E.H., Комарова O.A., Захарова Н.С. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии -2009.- №2.- С. 70-75.

26. Зайцев Е.М. Распределение подклассов специфических IgG антител у больных коклюшем и здоровых людей / Мазурова И.К., Петрова М.С., Краснопрошина Л.И., Астахова Т.И., Захарова Н.С. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии -2009. -№ 2,- С. 57-61.

27. Зайцев Е.М. Антигенный состав и серологические свойства отечественной бесклеточной коклюшной вакцины / Поддубиков A.B., Брицина М.В., Мерцалова Н.У., Бажанова И.Г., Озерецковская М.Н., Назиров М.Р. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии - №6. - 2009. - С. 76 - 80.

28. Зайцев Е.М. Иммунологический мониторинг коклюшной инфекции / Краснопрошина Л.И., Мазурова И.К., Петрова М.С., Астахова Т.И., Лаур E.H., Комарова O.A., Захарова Н.С. II Материалы XIII Всероссийского научного форума с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» - Медицинская иммунология. - 2009. - том 11. - № 4 - 5. - С. 384-385.

29. Зайцев Е.М. Гуморальный иммунитет к дифтерии, коклюшу и столбняку у взрослых / Краснопрошина Л.И., Харламов И.В., Захарова Н.С. // Инфекционные болезни. - 2010. - №2. - С. 93 - 94.

30. Зайцев Е.М. Мониторинг противодифтерийных, противостолбнячных и противококлюшных антител у беременных женщин / Краснопрошина Л.И., Астахова Т.И., Захарова Н.С. И Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии -2010.-№ 1,-С. 32-35.

31. Зайцев Е.М. Иммуноферментная тест-система для серологической диагностики коклюша / Озерецковская М.Н., Брицина М.В., Бажанова И.Г., Мерцалова Н.У., Краснопрошина Л.И., Мазурова И.К., Петрова М.С., Попова О.П., Захарова

42

Н.С. // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2010», Москва. - 2010,- С.48.

32. Зайцев Е.М. Продукция коклюшного токсина выделенными от больных коклюшем штаммами Bordetella pertussis / Мерцалова Н.У., Шинкарев A.C., Мазурова И.К., Захарова Н.С. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии - 2011. - №1. - С. 76 - 79.

33. Зайцев Е.М. Серологическая активность вакцинных и циркулирующих штаммов Bordetella pertussis / Краснопрошина Л.И., Мерцалова Н.У., Мазурова И.К., Захарова Н.С. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии-2011.-№ 2. - С. 78-82.

34. Зайцев Е.М. Изотипы противококлюшных антител у больных коклюшем на разных сроках заболевания / Краснопрошина Л.И., Мазурова И.К., Петрова М.С., Попова О.П., Захарова Н.С. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии - 2011. - № 3. - С. 53 - 56.

35. Зайцев Е.М. Особенности инфекционного и поствакцинального иммунитета к коклюшу / Краснопрошина Л.И., Мазурова И.К. // Материалы XIV Всероссийского научного форума с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт - Петербурге» - Медицинская иммунология. - 2011. том 13. - №4-5,- С. 388-389.

36. Мерцалова Н.У. Токсические и сенсибилизирующие свойства вакцин из вакцинных и циркулирующих штаммов Bordetella pertussis / Шинкарев A.C., Баженова И.Г., Озерецковская М.Н., Зайцев Е.М. // Материалы XIV Всероссийского научного форума с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт - Петербурге» - Медицинская иммунология, -2011.- том 13.-№ 4 - 5. - С. 400.

37. Малеев В.В. Вакцины для профилактики дифтерии, столбняка, коклюша / Таточенко В.К., Зайцев Е.М. // Национальное руководство «Вакцины и вакцинация» под ред. В.В. Зверева, Б.Ф. Семенова, P.M. Хаитова. - М.: «ГЭОТАР - Медиа» -2011,- Гл. 21-С. 446-455.

43

Патенты на изобретения.

1. Захарова Н.С., Бажанова И.Г., Ремова Т.Н., Брицина М.В., Шмелева Е.И., Мерцалова Н.У., Озерецковская М.Н., Ермолова Е.В., Зайцев Е.М. «Способ получения анатоксина Bordetella pertussis». Патент РФ на изобретение, № 2227746 от 27.04.2004 г.

2. Захарова Н.С., Бажанова И.Г., Брицина М.В., Мерцалова Н.У., Озерецковская М.Н., Ермолова Е.В., Зайцев Е.М., Валякина Т.Н., Комалева P.JI., Несмеянов В.А.. Андронова Т.М. «Способ получения анатоксина Bordetella pertussis». Патент РФ на изобретение, № 2285540 от 20.10.2006 г.

3. Шинкарев A.C., Мерцалова Н.У., Захарова Н.С., Бажанова И.Г., Брицина М.В., Озерецковская М.Н., Зайцев Е.М., Мазурова И.К., Борисова О.Ю. «Свежевы-деленный штамм бактерий Bordetella pertussis - продуцент коклюшного токсина». Патент РФ на изобретение № 2407788 от 27.12.2010 г.

4. Зайцев Е.М., Бажанова И.Г., Брицина М.В., Краснопрошина Л.И., Мазурова И.К., Мерцалова Н.У., Озерецковская М.Н., Петрова М.С., Попова О.П., Захарова Н.С. «Способ серологической диагностики коклюша». Патент РФ на изобретение № 2424530 от 20.07. 2011 г.

44

Заказ № 116-П/02/2012 Подписано в печать 22.02.2012 Тираж 110 экз. Усл. п.л.2,3

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-тай:info@cfr.ru

Актуальность проблемы

Успехи в области вакциноирофилактики коклюша подтвердили правильность принятых ранее научно-организационных и медицинских решений, направленных на борьбу с коклюшной инфекцией, вызываемой Bordetella pertussis, передающейся воздушно-капельным путем. Тем не менее, коклюш продолжает оставаться актуальной проблемой здравоохранения.

Заболеваемость коклюшем в Европе и других развитых странах мира, остается высокой. Несмотря на массовую вакцинацию, ежегодно заболевают около 600 ООО взрослых, растет заболеваемость подростков и детей первого года жизни. Начиная с середины 90-х годов прошлого столетия, во многих странах мира, несмотря на широкий охват прививками населения, начали регистрировать подъем заболеваемости коклюшем (47,169, 311, 327, 370), в том числе среди привитых детей, подростков, а также части взрослых (153, 225). Достаточно высоким во всех странах мира остаётся уровень скрытой заболеваемости, серологические маркёры инфицирования выявляют у 13 - 32% подростков и взрослых (39, 49, 95).

В России охват прививками выше 95% привел к снижению заболеваемости с 19,06 на 100000 населения в 1998 г до 2,51 на 100000 в 2008 г. Однако публикуемые данные не отражают истинного положения по заболеваемости коклюшем. В связи с тем, что в России исследования по иммунологическому мониторингу коклюша часто проводятся в неполном объеме, установить истинный уровень заболеваемости в стране не представляется возможным. Для серологической диагностики коклюша и оценки напряженности гуморального иммунитета в отечественной медицинской практике традиционно используется, главным образом, реакция агглютинации, а отсутствие на рынке более информативных иммуноферментных (ИФА) тест-систем отечественного производства, существенно обостряет данную проблему (37, 42). Кроме того, сведения о состоянии иммунитета к коклюшу в России у детей имеют ограниченный характер, а у взрослых практически отсутствуют. При этом известно, что определяемые различия в спектрах антител к антигенам вакцинных и циркулирующих (диких) штаммов В. pertussis у больных коклюшем и здоровых, привитых против коклюша детей, являются одним из ключевых факторов понимания механизмов формирования постинфекционного и поствакцинального гуморального иммунного ответа.

Одним из наиболее эффективных методов слежения за эпидемическим процессом коклюша, в том числе на фоне стертых и атипичных форм болезни, является иммунологический мониторинг, позволяющий оценить реальный уровень заболеваемости. За рубежом постоянно совершенствуется серологическая диагностика коклюша (70, 152, 226, 317), проводятся исследования, отражающие распространенность данной инфекции в популяции (112, 202, 342), изучается иммунологический статус привитых против коклюша (109, 160, 161). Однако, несмотря на широкое применение в борьбе с коклюшной инфекцией новых диагностических приёмов, в том числе ИФА, в области диагностики существуют определённые проблемы.

В настоящее время назрела необходимость в увеличении информативности иммуноферментного анализа (46, 240). Стала очевидной важность исследований по определению диагностической значимости антител различных изоти-пов/субизотипов к антигенам В. pertussis. Проведение подобных исследований при коклюшной инфекции и вакцинации против коклюша невозможно без создания новых ИФА тест-систем, предназначенных для углублённого изучения гуморального иммунитета, процесса антителообразования при инфекции и вакцинации. Можно полагать, что подобный серологический анализ позволит определить критерии, необходимые, в частности, для надёжной дифференцировки постинфекционного и поствакцинального иммунитета. Таким образом, в борьбе с коклюшной инфекцией необходимо использовать приёмы современной лабораторной диагностики, которые в сочетании с мерами по активной иммунопрофилактике болезни среди восприимчивых контингентов, включая подростков и взрослых, позволят значительно увеличить эффективность противоэпидемических мероприятий и существенно снизить уровень заболеваемости (111,162, 296).

К настоящему времени устанавливают генотипические и антигенные различия между вакцинными и дикими штаммами коклюшного микроба (227, 255), проводится мониторинг антигенных профилей циркулирующих штаммов коклюшного микроба. Эти результаты необходимы для обоснования штаммового и антигенного состава новых коклюшных вакцин (33, 51). Таким образом, эффективные меры по борьбе с коклюшной инфекцией, включая повышение уровня управления эпидемическим процессом коклюша, возможны лишь при активном совершенствовании иммунологического контроля с использованием наиболее современных лабораторных методов изучения особенностей формирования постинфекционного и поствакцинального иммунитета у населения.

Имеющиеся в литературе данные не дают полного представления об особенностях антигенного состава вакцинных и циркулирующих штаммов В. pertussis, специфичности и изотипе антител, продуцирующихся при коклюшной инфекции и вакцинации против коклюша, уровне популяционного иммунитета разных возрастных групп населения в условиях высокого охвата прививками и продолжающейся циркуляции возбудителя. Решение этих вопросов позволит найти новые подходы к обоснованию штаммового и антигенного состава вакцин для профилактики коклюша, повысить эффективность лабораторной диагностики коклюшной инфекции, определить возрастные «группы риска» с низким уровнем противококлюшного иммунитета, подлежащих ревакцинации против коклюша.

Цель работы - выявление особенностей формирования постинфекционного и поствакцинального гуморального иммунитета к коклюшу, разработка подходов к созданию высокоинформативных методов серологической диагностики коклюшной инфекции и контроля напряженности популяционного иммунитета к коклюшу.

Задачи исследования:

1. Исследовать антигенный профиль вакцинных и свежевыделенных (диких) штаммов В. pertussis для обоснования включения бактериальных антигенов в состав новых диагностических ИФА тест- систем.

2. Разработать и сконструировать ИФА тест-системы, предназначенные для выявления антител изотипов - IgG, IgM, Ig А и субизотипов - IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 к антигенам В. pertussis.

3. Провести сравнительный анализ процессов IgG-, IgM- и IgA-антителообразования у экспериментальных животных при различных способах их иммунизации антигенами В. pertussis.

4. Оценить процесс продукции антител основных изотипов/субизотипов к антигенам В. pertussis у пациентов с коклюшной инфекцией, изучить закономерности динамики антителообразования в разные фазы заболевания.

5. Провести популяционный анализ формирования антител основных изотипов/субизотипов к антигенам В. pertussis в различных возрастных группах населения.

Научная новизна

Впервые установлены закономерности в динамике образования антител различных изотипов и субизотипов к антигенам В. pertussis при развитии коклюшной инфекции, а также формировании поствакцинального иммунитета в различных возрастных группах населения. Предложен новый перспективный подход к серологической диагностике коклюша и оценке поствакцинального иммунитета, учитывающий особенности выработки антикоклюшных антител различных изотипов и субизотипов в разные фазы коклюшной инфекции и при иммунизации.

Впервые показано, что коклюшная инфекция сопровождается нарастанием титров сывороточных антител изотипов IgM, IgA, IgG и IgGl-, IgG2-, IgG3-, IgG4- субизотипов к белковым антигенам (коклюшному токсину, филаментоз-ному гемагглютинину, агглютиногенам 1, 2, 3) и липополисахариду (ЛПС) В. pertussis. При коклюшной инфекции динамика образования антител к липопо-лисахариду В. pertussis отличается от динамики антителообразования к белковым антигенам возбудителя, при этом, в фазу реконвалесценции отмечается снижение титров специфических IgG - и IgA - иммуноглобулинов.

Впервые показано, что для острой фазы коклюшной инфекции характерно:

- нарастание титров IgM-антител к коклюшному токсину, филаментозному гемагглютинину, агглютиногенам 1, 2, 3 и липополисахариду В. pertussis с последующим снижением их уровня в фазе реконвалесценции.

- титры IgG-, IgGl-, IgG2-, IgG4- и IgA-антител к белковым антигенам В. pertussis достигают максимальных значений в конце острой фазы заболевания с последующей стабилизацией показателей до конца фазы реконвалесценции.

- нарастание титра IgG3 - антител к антигенам В. pertussis с 3 - 4 недель от начала коклюшной инфекции с последующим снижением их уровня в фазу реконвалесценции, позволяет дифференцировать острую фазу коклюша от периода реконвалесценции, что важно для проведения адекватных противоэпидемических мероприятий, особенно при стёртых формах этой инфекции.

Впервые, с учётом определения титра IgG3 - антител к антигенам В. pertussis, разработан перспективный серологический метод лабораторной диагностики коклюша, позволяющий дифференцировать острую фазу заболевания от фазы реконвалесценции, а также иммунный ответ вследствие текущего заболевания и вакцинации.

Показано, что увеличение титра IgM-антител к антигенам В. pertussis у больных коклюшем отмечено как у категории лиц, не привитых против коклюша, так и у пациентов, иммунизированных АКДС - вакциной.

Поствакцинальный гуморальный иммунный ответ к антигенам В. pertussis у детей младшего возраста, привитых АКДС вакциной, характеризуется низким уровнем IgM- и IgA-антител, а также узким спектром субизотипов IgG антител (IgGl и IgG2).

У детей 2 - 5-летнего возраста, привитых АКДС вакциной, уровень IgG- антител к антигенам В. pertussis - максимальный и постепенно снижается, достигая минимальных значений у детей 9 лет и старше, без существенного изменения динамики антителообразования у подростков и взрослых. Нарастание титра антител изотипа А к антигенам В. pertussis наблюдается преимущественно у лиц старшего возраста, что может быть обусловлено перенесенной стертой формой инфекции. Это подтверждается данными по аэрозольной вакцинации экспериментальных животных антигенами В. pertussis , при которой происходит стимуляция продукции сывороточных IgG-, IgM- и IgA-антител. Инъекционные способы иммунизации вызывают активную выработку антител IgG- и IgM-изотипов, но не вызывают процесс IgA-антителообразования.

Впервые показано, что антигенные профили вакцинных и свежевыделенных (диких) штаммов В. pertussis имеют сходные характеристики, однако, для диких штаммов характерен более широкий диапазон содержания коклюшного токсина в надосадочной жидкости при культивировании. Концентрация коклюшного токсина в культурах вакцинных и свежевыделенных диких штаммов В. pertussis не связана со структурой гена ptxA, кодирующего ферментативно активную S1 субъединицу.

Материалы работы включены в Национальное руководство «Вакцины и вакцинация».

Практическая значимость

Разработанная ИФА тест-система для определения антител основных изотопов (IgG, IgM, IgA) и субизотипов (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4) к комплексу антигенов В. pertussis (коклюшному токсину, филаментозному гемагглютинину, ли-пополисахариду, агглютиногенам 1, 2, 3) может быть использована:

- для серологической диагностики коклюша;

- для проведения адекватных противоэпидемических мероприятий, особенно при стертых формах этой инфекции, по оценке уровня нарастание титра IgG3-антител к антигенам В. pertussis с 3 - 4 недель от начала коклюшной инфекции с последующим снижением их уровня в фазу реконвалесценции, позволяя дифференцировать острую фазу коклюша от периода реконвалесценции;

- при оценке иммунологической эффективности вакцин для профилактики коклюша;

- при оценке напряженности популяционного иммунитета к коклюшу, включающей определение IgG- и IgA-антител к комплексу антигенов В. pertussis, в разных возрастных группах населения;

- для определения интенсивности циркуляции возбудителя в старших возрастных группах населения и их значимости как резервуара и источника инфекции, обоснования разработки программ ревакцинации против коклюша детей старше 9 лет, подростков и взрослых.

В результате проведенных исследований получен патент на изобретение «Способ серологической диагностики коклюша» № 2424530 от 20.07. 2011 г. Разработан проект инструкции по изготовлению и контролю иммунофермент-ной тест - системы для выявления антител к антигенам В. pertussis «ИФА - В. р. - IgG, IgA, IgM» и проект инструкции по её применению, изготовлены и испытаны на клиническом материале 3 опытные серии тест - наборов.

Разработаны ИФА тест-системы, которые могут быть использованы для количественного определения антигенов В. pertussis: коклюшного токсина, фи-ламентозного гемагглютинина и агглютиногенов 1, 2, 3, а также для мониторинга антигенного состава вакцинных и циркулирующих штаммов В. pertussis и контроля антигенного состава коклюшных вакцин.

С помощью разработанной ИФА тест-системы можно определять уровень экспрессии коклюшного токсина и других антигенов вакцинными и свежевыде-ленными штаммами В. pertussis.

Отобранный штамм В. pertussis, отличающийся от вакцинных штаммов высокой способностью к токсинообразованию, в перспективе может быть использован для создания новой коклюшной вакцины. Штамм депонирован в коллекции штаммов ГИСК им JI.A. Тарасевича (Свидетельство № 01-12/27 от 08.06.2009 г.). Получен патент на изобретение «Свежевыделенный штамм бактерий Bordetella pertussis - продуцент коклюшного токсина» № 2407788 от 27.12. 2010 г. J

Материалы диссертации использованы при разработке технологии получения комплекса антигенов В. pertussis, включающего коклюшный токсин, фила-ментозный гемагглютинин, липополисахарид и агглютиногены 1,2,3. Получены патенты на изобретение «Способ получения анатоксина Bordetella pertussis» (№ 2227746 от 27.04.2004 г., № 2285540 от 20.10.2006 г.). Показана перспективность использования комплекса антигенов для создания препаратов для вакцинопрофилактики и диагностики коклюша. На основе комплекса антигенов разработана технология изготовления и контроля бесклеточной коклюшной вакцины. На базе ОАО «Биомед» им. И.И Мечникова изготовлены опытно - промышленные серии препарата для проведения доклинических испытаний, разработаны проекты фармакопейной статьи и опытно - промышленного регламента.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Анализ генотипических, иммунобиологических и антигенных свойств возбудителя коклюша выявил сходство антигенного состава вакцинных и све-жевыделенных штаммов В. pertussis при более широким диапазоне содержания коклюшного токсина в супернатантах культур свежевыделенных штаммов. Наличие в современной популяции В. pertussis штаммов с повышенным уровнем продукции коклюшного токсина указывает на необходимость мониторинга уровня токсинообразования циркулирующими штаммами возбудителя и селекции таких штаммов для усовершенствования вакцинных препаратов.

2. Использование комплекса антигенов В. pertussis (коклюшный токсин, филаментозный гемагглютинин, липополисахарид, агглютиногены 1, 2, 3) в качестве специфического лиганда в иммуноферментном анализе и антивидовых пероксидазных коньюгатов к основным изотипам и субизотипам иммуноглобулинов человека обеспечивает выявление широкого по специфичности и изо-типу спектра противококлюшных антител у больных коклюшем и здоровых лиц разного возраста в ИФА.

3. Определены показатели уровня изотипов (IgM, IgA, IgG) и субизотипов (IgG3) антител к антигенам В. pertussis, имеющие диагностическую значимость при коклюшной инфекции с 3 - 4 недель от начала заболевания и позволяющие дифференцировать острую фазу коклюша от периода реконвалесценции, что важно для проведения адекватных противоэпидемических мероприятий, особенно при стертых формах этой инфекции.

4. Показано, что у вакцинированных АКДС - вакциной детей и иммунизированных инъекционными способами животных не происходит значимого IgA ответа, развивающегося при поступлении антигенов В. pertussis через слизистые органов дыхания при коклюшной инфекции у людей или аэрозольной иммунизации экспериментальных животных, в связи с чем выявление антител этого класса у здоровых лиц можно рассматривать как серологический признак перенесенной инфекции, позволяющий оценить распространенность коклюша в популяции.

5. Выявленное снижение популяционного иммунитета к коклюшу в возрастных группах населения старше 8 лет сопровождается нарастанием частоты выявления IgA антител к антигенам В. pertussis, что указывает на интенсивность циркуляции возбудителя в старших возрастных группах населения и их значимость как резервуара и источника инфекции и свидетельствует о необходимости разработки программ ревакцинации против коклюша детей старше 8 лет, подростков и взрослых.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ВЫВОДЫ

1. С помощью разработанных тест - систем к различным антигенным компонентам В. pertussis выявлены особенности формирования постинфекционного и поствацинального гуморального иммунитета к коклюшу, разработаны подходы к созданию высокоинформативных методов серологической диагностики коклюшной инфекции и контроля напряженности популяционного иммунитета к коклюшу.

2. Показано, что вакцинные и свежевыделенные (дикие) штаммы В. pertussis при культивировании имеют сходные антигенные профили, однако рост свеже-выделенных штаммов сопровождается более широким, по сравнению с вакцинными штаммами, диапазоном содержания в культуре коклюшного токсина. Не установлено коррелятивных связей между структурой гена ptxA, кодирующего ферментативно активную S1 субъединицу, и разницей в концентрации коклюшного токсина в культурах вакцинных и свежевыделенных штаммов В. pertussis.

3. Разработанная технология выделения и контроля комплекса антигенов вакцинного штамма В. pertussis обеспечивает получение препаратов со стандартным содержанием коклюшного токсина, филаментозного гемагглютинина, липополисахарида, агглютиногенов 1, 2, 3. Использование в иммунофермент-ном анализе в качестве лиганда комплекса антигенов вакцинного штамма В. pertussis обеспечивает выявление широкого по специфичности спектра противококлюшных антител и позволяет оценивать показатели поствакцинального и постинфекционного иммунитета к коклюшу.

4. Установлено, что постинфекционный иммунитет у больных коклюшем людей характеризуется повышением уровня основных изотипов (IgG, IgA и IgM) и субизотипов (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4) антител к белковым антигенам и липополисахариду В. pertussis. Особенности динамики образования IgM- и IgG3-антител к антигенам В. pertussis у больных коклюшем с нарастанием их титров в острую фазу и снижением в фазу реконвалесценции позволяют рассматривать их в качестве характерного признака (маркёра) острой фазы инфекции.

5. Определение уровней IgM-, IgA-, IgG- и IgG3-антител к комплексу антигенов В. pertussis обеспечивает выявление серологических признаков коклюшной инфекции, начиная с 3-й недели заболевания, позволяет проводить дифференцировку постинфекционного и поствакцинального иммунитета, дифференцировать острую фазу коклюша от периода реконвалесценции.

6. Выявление в диагностическом титре IgG-, IgG3-, IgA- и IgM-антител к комплексу антигенов В. pertussis у взрослых больных с длительным кашлем может рассматриваться как серологический признак стертых форм коклюшной инфекции.

7. Показано, что аэрозольная иммунизация экспериментальных животных антигенами В. pertussis индуцирует выработку сывороточных IgG-, IgA- и IgM-антител, в то время как инъекционные способы иммунизации вызывают синтез сывороточных IgG- и IgM-антител, но не стимулируют продукцию антител класса IgA.

8. Продемонстрировано, что гуморальный иммунитет к коклюшу у привитых АКДС вакциной детей 2-5 лет не связан с продукцией IgM- и IgA-антител, преимущественно связан с образованием антител IgGl и IgG2 субизотипов, а также с высоким уровнем антителообразования к белковым антигенам В. pertussis.

9. Показано, что связанное с увеличением возраста снижение популяцион-ных титров IgG- антител к антигенам В. pertussis сопровождается нарастанием частоты выявления специфических IgA-антител у здоровых лиц, что является косвенным индикатором распространенности скрытых форм коклюшной инфекции.

10. Снижение уровня противококлюшного гуморального иммунитета у детей старше 8 лет указывает на необходимость разработки программ ревакцинации против коклюша детей старшего возраста, подростков и взрослых.