Автореферат и диссертация по медицине (14.00.17) на тему:Исследование роли энкефалиназы в механизмах морфинной и акупунктурной резистентности

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

НОРМАЛЬНОЙ ФИЗИОЛОГИИ РГб ОД имени П.К.АНОХИНА

2 1 АВГ 1985 На правах рукописи

КОЗЛОВ Алексей Юрьевич

ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ЭНКЕФАЛИНАЗЫ В МЕХАНИЗМАХ МОРФИННОЙ И АКУПУНКТУРЫОй РЕЗИСТЕНТНОСТИ

Специальность 14.00.17-Нормальная физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1995

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте нормальной физиологии им. II. К. Анохина РАМН

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор медицинских наук, профессор Л. Е Калюжный

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

член корреспондент РАМН, доктор медицинских наук В. Г. Зилов доктор медицинских наук А. Н. Громов

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ - Институт общей патологии и патологической физиологии РАМН

Защита диссертации состоится •• 1995г. в

"/О" часов на заседании Специализированного Ученого Совета Д. 001.03. 01 при Научно-исследовательском институте нормальной Физиологии им. П. К Анохина РАМН ( Москва,103009,ул. Герцена, д. 6).

■' диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан " & " , 1995г.

Ученый секретарь

Специализированного Ученого Совета, кандидат медицинских наук

В. А. Гумешск

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Согласно статистическим данным до 70% листов нетрудоспособности в нашей стране выдавалось по поводу хронических болевых синдромов,что является серьезной экономической и социальной проблемой для государства. Борьба с болью, которая является второй задачей врача после спасения жизни человека, тем самым, продолжает оставаться одной из актуальнейших проблем практической медицины, для осуществления которой необходимо понимание ее физиологических и нейрохимических механиз-мов( А. В. Вальдман, Ю. Д. Игнатов, 1976).

В последнее время, наряду с давно апробированными методами обезболивания,какими являются применение аналгетиков, в частности морфина и его производных, получают все большее распространение немедикаментозные методы, в частности акупунктура,которая за короткий промежуток времени перешла из эмпирического раздела медицины в физиологически обоснованное направление (Ю. Д. Игнатов, А. Т. Качан, Ю. Е Васильев, 1990). Как выяснилось на конференциях, проведенных в последние годы как в нашей стране (Ленинград,1990, Новгород,1992, Москва,1994), так и зарубежом (Paris, 1993, Kyoto,1994) изучению теоретических, фундаментальных проблем механизма боли и аналгезии - этой сложной области, лежащей на стыке многих дисциплин, придается особо важное значение, т. к. именно они являются основой для изыскания новых эффективных средств для борьбы с болью.

Одним из направлений фундаментальных физиологических и биохимических проблем механизмов боли и аналгезии является изучение индивидуальных особенностей данного механизма у человека или животных, определяющего индивидуальный подход для применения обезболивающих средств. В практической медицине хорошо известно широкая индивидуальность в эффективности обезболивающих эффектов различных фармакологических препаратов, в частности морфина и его производных, а также акупунктурного воздействия, при применении которых наблюдались как четко выраженный аналгетический эффект, так и более слабый или полное его отсутствие.

В настоящее время установлено,что и при введении морфина и при акупунктурной стимуляции у животных и человека имеет место усиление выделения эндогенных опиоидов (Kachur A. et al. ,1985,Zou P. et al. ,1980 и др. ),что и приводит к блокаде проведения ноцицеп-тивной импульсации (А. В. Вальдман,Ю. Д. Игнатов, 1976, Л. В. Калюжный,

- С, -

1984, Ю. Д. ИгнатоЕ с соавт. ,1990 и др.). Однако, и у жизотных и у людей существуют индивидуумы, которые являются одновременно и морфин- и акупунктуро-нечувствительнымиСTakeshige С. et al. ,1976, Kalyushnyi Let al. ,1985 и др. ) и у которых имеет место значительно меньшее содержание эндогенных опиоидов(ТакезЬ1ве С.,1992) Можно думать,что эти генетические факторы,определяющие активность эндогенных болеутоляющих систем,по-видимому,и играют существенную роль в индивидуальной вариабильности болеутоляющих эффектов и опиоидов и акупунктуры.

В то же время известно, что содержание эндогенных опиоидов е организме является относительно постоянной величиной (Terenius L. ,1934) .т.е. своего рода жизненно Еажной константой, полезным приспособительным результатом функциональной системы (П. К. Анохин, 1968) .определяющей порог боли(&В. Калюжный, 1984). Данная генетическая функционально подвижная константа поддерживается на определенном уровнем как за счет синтеза эндогенных опиоидов (Kosterlitz Н. ,Huges О. ,1975),так и счет их инактивации,осуществляемых пептидгидролазами (А. В. Азарян,1989). Отсюда можно предполагать, что одним из механизмов морфинной и акупунктурной резистентности, определяющим низкое содержание эндогенных опиоидов в организме, является высокий уровень активности эндопенти-даз,обусловливающий высокую скорость их инактивации, вследствие Ч(-го даже увеличение выделения эндогенных опиоидов под воздействием введения морфина или акупунктурной стимуляции не приводит к блокаде проведения ноцицептивной импульсации.т. е. к аналитическому эффекту.

Кроме того,энкефалиназный механизм инактивации эндогенных опиоидов , по-видимому,может играть существенную роль и в действии напокоона,блокирующего морфинную и акупунктурную аналгезию, т.е. щ'^вращающих чувствительных животных в морфин- и акупунктуро-ре-зистентных, и в механизмах нивелирования избытка эндогенных опиоидов после акупунктурной стимуляции, т. е. в механизмах восстановления болевой чувствительности,что,однако,в настоящее время остается пока еще гипотетическим.

Цель исследования состояла в изучении роли активности энкефа-лнназы в механизмах морфинной и акупунктурной резистентности,а также в механизмах восстановления болевой чувствительности после акупунктурной аналгезии и действия налоксона.

Задачи исследования.

1. Исследовать эффекты снижения активности энкефалиназы, путем введения ее ингибитора, на пороги ноцицепции у морфин- и аку-пунктуро-чувствительных и морфин- и акупунктуро-резистентных животных.

2. Исследовать эффекты снижения активности энкефалиназы на эффекты введения морфина и акупунктурной стимуляции у морфин- и акупунктуро-резистентных животных.

3. Исследовать эффекты снижения активности энкефалиназы на эффекты налоксона,вызывающих блокаду морфинной аналгезии.

4. Исследовать эффекты снижения активности энкефалиназы на стадии восстановления ноцицепции у животных после акупунктурной аналгезии.

5. Провести сравнительное исследование действия ингибитора энкефалиназы и налоксона у акупунктуро-чувствительных и акупунктуро-резистентных животных.

Положения, выносимые на защиту.

1. У морфин- и акупунктуро-резистентных животных имеет место более высокая активность энкефалиназы,по-видимому,в структурах эндогенной антиноцицептивной системы,что и блокирует аналитические эффекты морфина и акупунктуры.

2. В действии налоксона,блокирующего морфинную аналгезию, принимает участие механизм повышения активности энкефалиназы.

3. Восстановление ноцицепции после акупунктурной аналгезии происходит с участием энкефалиназного механизма.

4. У морфин- и акупунктуро-резистентных животных введение налоксона вызывает эффекты аналогичные эффектам ингибитора энкефалиназы.

Научная новизна работы. В работе получены оригинальные данные, впервые показывающие, что:

1. У морфин- и акупунктуро-резистентных животных, в отличии от юрфин- и акупунктуро-чувствительных, введение ингибитора энкефалиназы вызывает аналитический эффект,после которого у этих кивотных проявлялась морфинная и акупунктурная анапгезия. Это юяет свидетельствовать, что у данных животных имеет место более зысокий уровень активности энкефалиназы,по-видимому, в структурах эндогенной антиноцицептивной системы,что и является сущест-5енным компонентом механизмов морфинной и акупунктурной резис-

тентности.

2. Введение налоксона, блокирующего морфинную аналгезию у морфин-чувствительных животных, сопровождается проявлением аналитического эффекта ингибитора энкефалиназы, что указывает на повышение ее активности. Это может свидетельствовать об участии энкефалиназного механизма в блокирующих эффектах налоксона.

3. Введение ингибитора энкефалиназы до акупунктурной стимуляции не изменяет пороги ноцицепции у акупунктуро-чувствительных животных, а на стадии восстановления ноцицепции после акупунктурной аналгезии вызывает аналгетический эффект,что пролонгирует ее действие. Это может свидетельствовать об участии энкефалиназного механизма в процессах восстановления болевой чувствительности после акупунктурной аналгезии.

4. У морфин- и акупунктуре-резистентных животных, а также на стадии восстановления ноцицепции после акупунктурной аналгезии у акупунктуро-чувствительных животных, т. е. в случаях, где предполагается увеличение активности энкефалиназы, введение налоксона вызывает аналгетический эффект. Это может свидетельствовать о различиях механизмов действия налоксона в зависимости от уровня активности эндопептидаз.

Теоретическое и практическое значение работы. Установлены новые данные, расширяющие понимание фундаментальных нейрохимических механизмов боли и обезболивания, в частности механизмов мор-финнэй и акупунктурной резистентности, а также действия налоксона. Это дает теоретическое и практическое обоснование селективного подхода к изысканию способов борьбы с болью с учетом индивидуальных свойств организма, в частности его чувствительности к ониоидам и акупунктуре.

Апробация работы. Результаты экспериментальных исследований данной работы были доложены на Всесоюзной конференции "Синтез, Фармакология и клинические аспекты новых обезболивающих средств'Ч Новгород, 1991);. на конгрессе международного общества патофизиологов (Москва,1991); на 1 ой конференции Российской Ассоциации по изучению боли "Патофизиология и фармакология боли" (Москва,1993); на международной конференции по изучению O-ring теста (Kuryme, Japan,1993); на Первом конгрессе Европейской Ассоциации по акупунктуре (.Кишинев,1994); на 1ом международном научном конгрессе "Традиционная медицина и питание: теоретические

и практические аспекты" (Москва,1994); на конференции молодых ученых России, посвященной 50-ти летию РАМН (Москва,1994); на 2-й Конференции Российской Ассоциации по изучению боли (Новгород, 1995); на совместном заседании лаборатории физиологии эмоций НИИ НФ им. П. К. Анохина РАМН и кафедры нормальной физиологии Московской Медицинской Академии им. И. М. Сеченова (Москва, 1995).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методики экспериментов, полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на/ЗЭ страницах машинописного текста, содержит

2/ рисунков и таблиц. Список литературы включает s-AS~ источников, из них -^¿"отечественных и /^¿^иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве показателей изменений ноцицепции у крыс использовались изменения латентного периода (Ж) tail-flick теста (D'Amour F. , Smith D., 1941) - реакции отведения хвоста (РОХ) в ответ на термальный ноцицептивный раздражитель (ТНР), увеличение которого свидетельствовало об увеличении порогов, а уменьшение - о снижении порогов болевой чувствительности (ноцицепции) у животных С Aki 1 A. et al. , 1975).

Животные размешались в специальных горизонтально расположенных плексиглазовых камерах, ограничивающих их движения, за исключением движения хвоста. Световой пучок определенной интенсивности, подаваемый либо через аналгезиметр с автоматической регистрацией значений ЛП (Harward, USA), либо от лампы самодельного прибора, фокусировался на хвосте до тех пор, пока не происходила реакция отведения хвоста. В последнем приборе сфокусированный пучок света диаметром 1 см от лампы мощностью 100 Вт размешался над фотодиодом, связанным с усилителем сигналов, и имел достаточно высокую температуру, чтобы вызвать болевые ощущения кожной поверхности руки человека в течение 5-7 секунд действия. Хвост животного размещался над фотодиодом, и при выполнении РОХ свет попадал на фотодиод, что влекло за собой автоматическое выключение источника света и остановку счета времени на частотомере-хронометре Ф 5080, на световом индикаторе которого фиксировалось значение ЛП РОХ.

Перед началом экспериментов на 5-ти животных, находившихся под

нембуталовым наркозом, ■ было установлено время возникновения термического повреждения кожной поверхности хвоста. Для избежания ожога тканей хвоста Ж РОХ на первом приборе не должен был превышать 15 сек, а на втором - 30 сек, по истечении которых действие ТНР принудительно отключалось. Поскольку мощность ТНР различалась на вышеупомянутых приборах, что проявлялось на времени появления ожога тканей, то и значения ЛП РОХ в фоновых опытах также были различны, и эксперименты одной и той же серии выполнялись только на одном из этих приборов.

Эксперименты проводились на крысах-самцах линии Вистар весом 200-300 г. Всего было использовано 30 крыс.

После размещения животных в экспериментальных боксах они в течение часа прм постоянной температуре воздуха адаптировались к условиям эксперимента. Исходный фоновый ЛП РОХ определялся на основе вычисления среднего ЛП РОХ по 6-ти последовательным предъявлениям ТНР после стабилизации этого показателя и принимался за 100%. После введения фармакологических веществ величины ЛП РОХ выражались в процентах к величине среднего фонового латентного периода РОХ.

Показателем изменений ноцицепции у кроликов служили изменения амплитуд негативно-позитивного компонента (Н1П2) вызванных потенциалов (ВП) соматосенсорной области коры в ответ на электродентальное раздражение ОДР) - электростимуляцию пульпы верхних резцов (Калюжный Л. В. , 1984).

Эксперименты выполнялись на 21 бодрствующих кроликах-самцах породы Шиншилла весом 3-3,5 кг, мягко фиксированных за конечности в специальном станке, что позволяло животному производить незначительные движения лапами и свободные головой.

За два-три дня до проведения экспериментов животные скальпировались под местной новокаиновой анестезией с последующей дезинфицирующей обработкой раневой поверхности мягких тканей головы. Одновременно с этим в верхней трети верхних резцов с двух противоположных сторон просверливались отверстия диаметром 1-1,5 мм. В последующем е эти отверстия вставлялись игольчатые стальные электроды, служившие для . электродентальной стимуляции. Спуст? 20-30 мин после установления раздражающие электроды не вызывал! какого-либо выраженного беспокойства животных.

В качестве ноцицептивного воздействия в этой серии эксперимен-

тов использовалось электродентальное раздражение ОДР), осуществляемое одиночными прямоугольными импульсами тока (0,1 мсек, 1-20 мА) с интервалом в 1-3 сек, подаваемыми от электростимулятора "Nihon Kohden" (Япония).

Регистрация ВП осуществлялась с поверхности черепа животных в области сенсомоторной коры. Для этого игольчатые регистрирующие электроды диаметром 0,8 мм фиксировались в костях черепа самоотвердевающей пластмассой "Норакрил". При монополярном отведении активный электрод располагался в проекционной области соматосен-сорной коры на 1-5 мм каудальнее и на 1-6 мм латеральнее "брег-мы", а индифферентный - в области переднего шва. Выбор точной локализации активного электрода осуществлялся непосредственно в эксперименте по той точке, в которой регистрировалось наиболее четкое проявление вторичных компонентов ВП на ноцицептивное ЭДР.

Регистрация ВП проводилась с помощью усиления биоэлектрической активности через отечественный усилитель УБФ-4-03 (полоса пропускания от 2 до 100 Гц) и электромиографа "DISA"14A11 (Дания). Усреднение и суммирование ВП осуществлялись на венгерском ампли-туднофазовом анализаторе NTA-1024 фирмы "Орион" по 10 предъявлениям. Запись ВП проводили на X-Y рекордере той же фирмы.

Эксперименты проводились по следующей схеме: животные размещались в станке и последующе манипуляции осуществлялись через 30-ти минутный период адаптации. Первоначально определялась оптимальная локализация активного регистрирующего электрода в области соматосенсорной коры. Затем регистрировались изменения ВП в ответ на ноцицептивное электродентальное раздражение с прогрессивно увеличивающейся или снижающейся силой тока. В дальнейшем использовали значение силы тока, превышающее в 1,5 p'u-а значение пороговой силы тока, при которой наблюдалась поведенческая реакция облизывания раздражающих электродов.

При постоянной силе тока производили регистрацию ВП через 10-15 минутные интервалы в течение часа. Значения амплитуды вторичного негативно-позитивного компонента (НПК) ВП с латентным периодом 20-40 мсек считали фоновыми значениями, усредненная величина которых принималась за 100%. В дальнейшем по отношению к фоновой величине амплитуды ВП высчитывали изменения амплитуды Н1П2 в процентах.

После регистрации фоновых значений амплитуды ВП осуществляли

либо аурикулярную электропунктуру, либо введение фармакологических веществ.

Аурикулярная электропунктурная стимуляция (АЭ) осуществлялась с помощью аппарата для дентальной аналгезии "Аналгедента" предприятия "РИСС". Прямоугольные импульсы тока длительностью 100 мкс, силой до 25 мкА с частотой 15 Гц в течение 25 минут подавались биполярно на активные чашечные электроды, прикрепляемые клипсами к козелку уха кролика. Индифферентный игольчатый электрод при этом располагался в области верхней десны.

Интенсивность стимуляции подбиралась в каждом случае индивидуально, до появления небольших фибрилляций ушей. Сразу после включения электрической стимуляции у животных возникала своеобразная реакция, проявляющаяся поворотами головы, обнюхиванием и замиранием. Через 3-5 мин после начала стимуляции животные, как правило, принимали удобную позу с полузакрытыми глазами и не меняли своего положения в течение всего последующего периода электропунктуры.

Регистрация Ш соматосенсорной коры у кроликов в ответ на ЭДР не производилась непосредственно во время АЭ, а до и после ее применения.

Статистическую достоверность изменений значений ЛП РОХ в ответ на ТНР у крыс и амплитуды ШП2 компонентов ВП соматосенсорной коры кроликов в ответ на ЭДР определяли по непарному критерию Стьюдента

В опытах использовались следующие фармакологические препараты:

1. Морфин-гидрохлорид в дозах 1,5-2,0 мг/кг при подкожном введении у крыс и внутривенном введении у кроликов в объеме 0,3 мл.

2. Д-фенилаланин(д-ФА) ("Serva") в дозах 300-600 мг/кг при внутрибрюшинном введении у крыс и кроликов в объеме 1-5 мл соответственно.

3. Налоксон ("Sigma".) в дозах 0,3 мг/кг при внутрибрюшинном■ введении у крыс и 0,15 мг/кг при внутривенном введении, у кроликов в'объеме 0,3 мл.

4. Физиологический раствор (в ампулах) для' контрольных введений в соответствующих объемах.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕЖАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУВДЕНИЕ

I. ИССЛЕДОВАНИЕ РОЖ ЭНКЕФАЛИНАЗЫ В МЕХАНИЗМАХ МОРФИННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ.

(Эффекты введения морфина,налоксона и д-фенилаланина у крыс)

1.1. Эффекты введения морфина Морфин-чувствительные и морфин-

-резистектные животные.

В настоящем исследовании ке ставилась задача определения процентных соотношений морфин-чувствительных и -нечувствительных животных. По данным Takeshi ge С. (1992), С. R Литвиновой (1993) и других авторов у крыс линии Вистар примерно до ЗОХ особей являются морфин-резистентными.

Как показали проведенные опыты у 15-и крыс введение морфина вызывало аналитический эффект достоверного увеличения значений ЛП РОХ в среднем на 82 + 6% от исходных значений,что наблюдалось уже на 10-15-й минутах после введения, с максимумом увеличения на 88-98% на 35-45 минутах и постепенным восстановлением величин ЛП РОХ до исходных значений к 75-90 мин. после инъекции (морфин-чувствительные крысы).

У 10-и крыс введение той же дозы морфина не вызывало достоверных изменений значений ЛП РОХ в течении 60 мин регистрации. Значения ЛП РОХ у данных морфин-резистентных крыс колебались в пределах +7%.

Поскольку введение морфина вызывает увеличение выделения эндогенных опиоидов в спинно-мозговую жидкость и плазму крови (Кас-hur A. et al. ,1985), что при прежнем уровне активности эндопепти-даз приводит к блокаде ноцицептивной импульсации.т. е. аналитическому эффекту у морфин-чувствительных животных (Kayzer V. , 1993), то отсутствие такового у морфин-резистентных особей заставляет предполагать у них либо снижение синтеза эндогенных опиоидов, либо более высокий уровень активности эндопептидаз,приводящий к высокой скорости их инактивации.

1.2. Эффекты введения д-фенилаланина у морфин-чувствительных

и морфин-резистентных крыс.

Проведенные опыты показали,что введение д-фенилаланина морфин-чувствительным крысым (п=5) в целом не вызывало достоверных изменений значений ЛП РОХ по сравнению с исходными на протяжении 60 минут регистрации после введения данного фармакологического

- iU -

вещества. Значения ЛП РОХ колебались в пределах +15%, а на 40-45 минутах после инъекции наблюдалось даже достоверное снижение значений ЛП РОХ до 85+7% и 80+15% исходных величин,что свидетельствовало о некотором гипералгетическом эффекте д-фенилалани-на.

У морфин-резистентных крыс (п=10) введение д-фенилаланина вызывало аналитический эффект достоверного увеличения значений ЛП РОХ в целом на 37+4% от исходных значений,регистрируемый с 15-й по 35-ю мин после инъекции с максимумом увеличения на 40-50% от исходных значений,наблюдаемого на 20-25 минутах после введения д-фенилаланина.

Таким образом, введение д-фенилаланина, снижающего активность энкефалиназы на 35% (Takeshige С. ,1992) и,тем самым, увеличивающего выделение эндогенных опиоидов (Balagot R. et al. ,1983) .вызывало аналитический эффект у морфин-резистентных животных и практически не изменяло ноцицепцию у морфин-чувствительных. Это может свидетельствовать о более высоком уровне выделения эндогенных опиоидов при сходном уровне торможения активности энкефа-линазы после введения ее ингибитора у первых животных. В то же время отсутствие достоверных различий в порогах ноцицепции у морф«н-чувствительных и -резистентных крыс свидетельствует,что исходно более высокий уровень выделения эндогенных опиоидов у последних животных,и еще больший уровень их выделения при введении морфина (Kaclmr A. et al.,1985), полностью нивелируется имеющимся у них уровнем активности энкефалиназы.что предполагает ее '.'и лее высокий исходный уровень,чем у морфин-чувствительных жи-

iu.'3'hux.

1.3. Эффекты комбинированного введения.д-фенилаланина и морфина у морфин-резистентных крыс.

Как показали результаты проведенных опытое введение морфин-ре-ьистентным крысам (п=10). д-фенилаланина вызывало аналитический эффект достоверного увеличения ЛП РОХ, который исчезал к 40-45 минутам после инъекции (п. 1.2. ).• Введение данным животным (.п-5) морфина через 45 мин после инъекции д-фенилаланина вызывало через 10 мин после инъекции морфина (т. е. после исчезновения аналитического эффекта д-фенилаланина) аналгетический эффект достоверного увеличения ЛП РОХ в среднем на 45-60% .регистрируемого

начиная с 10-й по 35 минуты после последней инъекции. Контрольное же введение вместо морфина физиологического раствора в том же объеме морфин-резистентным крысам (п=5) не вызывало достоверных изменений значений ЛП РОХ в течении 40 мин регистрации.

Можно предполагать,что после окончания аналитического эффекта д-ФА, вызывающего снижение активности энкефалиназы, имеет место постепенное восстановление ее исходного уровня,и на данном этапе имеющийся уровень (больший, чем при действии д-ФА и меньший, чем исходный) позволяет инактивировать то количество эндогенных опи-оидов,которое вызывает собственный аналгетический эффект,что и приводит к его исчезновению. Однако введение морфина, увеличивающего выделение эндогенных опиоидов (Kachur A. et al. ,1985), при данном, меньшем чем исходном, уровне активности энкефалиназы,вызывает у морфин-резистентных крыс аналгетический эффект. Примечательно, что при введении в 2 раза меньшей дозы д-фенилаланина морфин-резистентным крысам, собственный аналгетический эффект ингибитора не проявлялся, но проявлялся аналгетический эффект морфина (Takeshige С. ,1992). Следовательно, искусственное снижение уровня активности энкефалиназы вызывает проявление аналгети-ческого эффекта морфина у морфин-резистентных животных, превращая их в морфин-чувствительных. Данные результаты также свидетельствуют в пользу предположения, что механизм морфинной резистентности может быть обусловлен более высоким исходным уровнем активности эндопептидаз.в частности энкефалиназы,у морфин-нечувствительных животных.

1.4. Эффекты введения налоксона у морфин-чувствительных крыс.

Как показали проведенные эксперименты, изолированное введение налоксона морфин-чувствительным крысам (п=5) в целом не вызывало достоверных изменений значений Ж РОХ за 60 мин регистрации: ЛП РОХ в среднем составлял 97+6% исходных значений.

Как было показано выше(п. 1.1.), введение морфин-чувствительным крысам морфина вызывало четкий аналгетический эффект достоверного увеличения Ж РОХ, регистрируемого в течении 80-90 мин после инъекции. Предварительное введение налоксона данным животным (п=5) за 10 мин до введения морфина полностью блокировало аналгетический эффект последнего: значения Ж РОХ колебались в пределах 92-99% исходных значений на протяжении 60 мин регистрации

после введения морфина. Это подтверждает многочисленные опыты,показывающие блокирующее действие налоксона на морфинную аналгезию (Teremus L. ,1984), и,в частности, при введении данной дозы налоксона у крыс с использованием tail-flick теста( Vaccarino A. et al.,1989). Таким образом, введение налоксона превращало морфин-чувствительных животных в морфин-резистентные.

1.5. Эффекты введения д-фенилаланина у морфин-чувствительных крыс после введения налоксона.

Как показали проведенные эксперименты у морфин-чувствительных крыс изолированное введение д-фенилаланина практически не вызывало достоверных изменений ноцицепции (п. 1.2.).Однако,введение морфин-чувствительным крысам (п=5) д-фенилаланина через 10 мин после введения налоксона вызывалс аналитический эффект достоверного увеличения величин' ЛП РОХ до 123+7% исходных . значений через 15 мин,до 145+9% через 20 мкн.до 150+12% через 25 мин,до 162+12% через 30 мин и до 133+20% через 35 мин после введения д-ФА. В последующее время значения ЛП РОХ не имели достоверных различий с исходными величинами. Следовательно,введение ингибитора энкефалиназы морфин-чувствительным крысам после предварительного введения им налоксона вызывало аналитический эффект в период с 15-й по 35-ю мин после инъекции,что было аналогично как по степени,так и по продолжительности аналгезии у морфин-резистентных крыс после введения им д-фенилаланина.

Таким образом, можно думать, что механизм действия налоксона, блокирующего морфинную аналгезию, может быть аналогичным тому, что имеет место при морфинной резистентности и связан с увеличением уровня активности эндопептидаз, в частности энкефалиназы.

1.6. Эффекты комбинированного введения д-фенилаланина и морфина у морфин-чувствительных крыс после введения налоксона.

Как показали вышеприведенные эксперименты (п. 1.4.) введение морфин-чувствительным крысам налоксона вызывало блокаду аналитического действия морфина,а последующее введение д-фенилаланина вызывало аналитический эффект(п. 1.5.). В данной серии опытов у морфин-чувствительных крыс (п=5) через 10 мин после введения налоксона производилось введение д-фенилаланина и еще через 15 мин производилось введение морфина Как следует из предыдущей серии

опытов (п. 1.5.), если введение д-фенилаланина после введения на-локсона морфин-чувствительным крысам вызывало аналгетический эффект достоверного увеличения значений ЛП РОХ в среднем до 130-140% исходных значений,наблюдавшихся с 15-й по 35-ю мин после инъекции,то последующее,после д-ФА, введение морфина данным животным вызывало аналитический эффект достоверного увеличения значений ЛП РОХ до 163+13% уже через 5 мин после инъекции морфина (т. е. через 30 мин после введения налоксона и через 20 мин после введения д-ФА),до 179+15% через 15 мин,до 195+8% через 25 мин после инъекции морфина. Только через 30 мин после введения морфина,т. е. через 40 мин после введения д-ФА,наблюдалось постепенное снижение значений Ж РОХ, которые достоверно не отличались от фоновых лишь через 55-60 мин после введения морфина,т. е. через 75 мин после введения д-ФА и через 85 мин после введения налоксона.

Следует подчеркнуть,что после введения д-ФА аналгетический эффект морфина наблюдался через 30 мин после введения налоксона в течении последующих 30 мин, в течении которых в контрольных экспериментах аналгетический эффект морфина без предварительного введения д-ФА полностью блокировался налоксоном (п. 1. 4.). Однако, в целом аналгетический эффект морфина у последних животных был достоверно ниже,чем у контрольных морфин-чувствительных крыс после изолированного введения той же дозы морфина (п. 1.1.).

Таким образом,введение ингибитора энкефалиназы морфин-чувствительным крысам полностью нивелировало блокирующий морфинную аналгезию эффект действия налоксона. Следовательно,введение ингибитора энкефалиназы восстанавливало аналгетический эффект морфина как у морфин-резистентных крыс,так и у морфин-чувствительных крыс при блокирующем действии налоксона,что также указывает на аналогичность их пептидных механизмов.

Характерно, что у морфин-резистентных,а также у морфин-чувствительных крыс после введения налоксона, наблюдается аналогичное и достоверное увеличение уровня активности энкефалиназы в среднем мозге (где расположено ЦСВ) и гипоталамусе (Л. Ф. Панченко с соавт. ,1995),т. е. в структурах,нейроны котор2ых активируются при введении морфина(Cheng F. et al. ,1986). Примечательно, что у морфин-резистентных крыс отсутствовал также аналгетический эффект электростимуляции ЦСВ (Takeshige С. ,1992). В то же время, как по-

казапи настоящие опыты,снижение уровня активности энкефалиназы при введении ее ингибитора, вызывающего ,в частности, увеличение содержания энкефалинов в гипоталамусе и среднем мозге (Yuan Н. , Han J. ,1985).приводило к проявлению аналитического эффекта морфина, а также аналитического эффекта электростимуляции ЦСВ (Takeshi ge С. ,1992). Данные результаты вызывают предположение,что в основе механизмов морфинной резистентности и блокирующего действия налоксона лежит высокий уровень активности эндопептидаз, в частности энкефалиназы, в основных структурах эндогенной антино-цицептивной системы, что и приводит к блокаде действия эндогенных опиоидов.

II. ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ЭНКЕФАЛИНАЗЫ В МЕХАНИЗМАХ АКУПУНКТУРНОЙ

РЕЗИСТЕНТНОСТИ (Эффекты электропунктурной аурикулостимуляции,введения морфина,д-фенилаланина и налоксона у кроликов).

2.1. Корреляционные изменения амплитуды негативно-позитивного компонента ВП соматосенсорной коры кролика в ответ на электростимуляцию пульпы зуба с различной силой тока.

У всех кроликов элктрораздражение пульпы зуба одиночными импульсами тока вызывало проявлеение ВП в соматосенсорной коре,который был представлен первичным ответом с ЛП 11.0+0. 8мс, последующим негативным отклонением с ЛП в 21.1+2.6 мс и последующим позитивным отклонением с ЛП 35. 7+6.1мс. Пиковые значения амплитуды негативного и вторичного позитивного компонента ВП четко коррелировали с силой раздражающего тока: при градуальном увеличении силы тока с 2-3 мА до 8-10 мА наблюдалось также градуальное увеличение значений амплитуды данного негативно-позитивного компонента ВП с 20.1+3.1 мкв до 117. 8+4. 4мкв. При уменьшении силы раздржающего тока наблюдалось градуальное снижение амплитуды данного компонента ВП

Данные корреляционные изменения ВП совпадают с результатами исследований других авторов, полученных в опытах на кроликах при регистрации ВП соматосенсорной коры в ответ не только на элект-рорагдражение пульпы зуба (О.С.Раевская с соавт. 1989, 0. В. Федосеева, 1989 и др.), но и в ответ на ноцицептивное электрокожное раздражение (Е. В. Голанов, 1979,В. В. Яснецов 1980 и др.). Данные из-

менения глшлитуды негативно-позитивного компонента ВП соматосен-еорной коры у кроликов, коррелирующие с силой раздражающего тока и позволили использовать его в качестве показателя ноцицепции у кроликов (Л. В. Калюжный, 1984 и др.)

2.2. Эффекты аурикулярной электропунктуры у кроликов. Акупункту-ро-чувствительные и акупунктуро-резистентные животные.

В настоящих опытах не ставилась задача выяснения процентных соотношений между акупунктуро-чувствительными и -резистентными животными. Однако известно,что у кроликов примерно до 30% особей являются акупунктуро-резистентными (Rabischang P. et. al. ,1975, Kalyuzhnyi l.et al. ,1985, О. В. Федосеева, 1989).

В проведенных опытах у 10-и кроликов применение АЭ вызывало аналитический эффект достоверного (р<0.01) снижения амплитуды НГЖ ВП в ответ на одну и ту же по силе тока электростимуляцию пульпы зуба в среднем до 41+17%. исходных ее значений сразу после выключения АЭ, до 48+9% через 10 мин, до 54+12% и 60+5% через 20 и 30 мин, до 67+5% через 40 мин,до 70+9% через 50 мин после выключения АЭ. Только через 60-70мин после выключения АЭ величины амплитуды НПК ВП в ответ на то же электродентальное раздражение восстанавливались до значений,не имеющих достоверных различий с исходными. В течении последующего часа наблюдений колебания значений амплитуды НПК ВП в ответ на ЭДР не имели достоверных различий с исходными величинами и колебались в пределах +10%.

Таким образом, применение АЭ у данных животных вызывало анал-гетический эффект, наблюдаемый в течении 50-60 мин после выключения АЭ (акупунктуре-чувствительные животные).

У 11-и кроликов применение АЭ не вызывало достоверных изменений амплитуды НПК ВП в ответ на одно и то же по силе тока ЭДР, что прослежено в течении 60-70 мин после выключения АЭ. Величины амплитуды НПК ВП колебались в пределах +10%, что свидетельствовало об отсутствии аналитического эффекта АЭ( акупунктуро-резистентные животные).

Известно,что при АЭ имеет место увеличение выделения эндогенных опиоидов(2ои P. et al. ,193 .Zhang An-Zhong, 1980,Han J.Terem-us L. 1982 и мн. др. ),что и приводит к блокаде ноцицептивной им-пульсации, а аналитический эффект АЭ блокируется налоксоном. В то же время у акупунктуро-резистентных животных при АЭ не наблю-

далось увеличения эндогенных опиоидов в перфузате мозга (Zhang An-Zhong,1980) и у них же имеет место низкое их исходное содержание по сравнению с акупунктуро-чувствительными особями (Takeshige С. ,1992), что и приводит к отсутствию аналитического эффекта АЭ.

2.3. Эффекты введения морфина у акупунктуро-чувствительных и акупунктуро-резистентных кроликов.

Проведенные опыты показали,что изолированное введение морфина акупунктуро-чувствителъным кроликам (п=5) вызывало аналгетический эффект достоверного (р<0.001) снижения значений амплитуды НПК ВП соматосенсорной коры в ответ на ЭДР постоянной силы тока до 42+5% - 65+5% исходных значений через 10-35 мин после инъекции, до 73+10% - через 45 мин после введения морфина с восстановлением до величин, не имеющих достоверных различий с исходными, через 50-55 мин после инъекции.

Введение морфина акупунктуро-резистентным кроликам (п=5) не вызывало достоверных изменений значений амплитуды НПК ВП соматосенсорной коры в ответ на ЭДР с постоянной силой тока в течении 60 мин регистрации после инъекции морфина. Величины амплитуды НПК ВП колебались в пределах 90-108% исходного уровня.

Таким образом,данные эксперименты показали,что акупунктуро-резистентные кролики являются в то же время морфин-резистентными животными, что подтверждает данные других авторов с применением и других ноцицептивных раздражителей, в частности электрокожного и при применении злектроакупунктурной стимуляции корпоральных точек (Takeshige С. 1992,Калюжный JL В. с соавт. ,1985). Поскольку аналгетический эффект морфина, также как и аналгетический эффект АЭ связывается с блокадой ноцицептивной импульсации эндогенными опиоидами,увеличение выделения которых имеет место при введении морфина (Kachur A. et al. ,1985),то можно предполагать,что именно недостаток эндогенных опиоидов у акупунктуро-резистентных животных определяет у них отсутствие аналитического эффекта как акупунктуры, так и введения морфина. Примечательно,что у акупунктуро-резистентных мышей установлена низкая чувствительность к морфину in vivo, и низкая рецепторная активность к нему in vitro (Померанц Б. ,1981).

2. 4. Эффекты введения д-фенилаланина у акупунктуро--чувствительных и -резистентных кроликов.

Изолированное введение д-фенилаланина акупунктуро-чувствительным кроликам (п=5) не приводило к достоверным изменениям значений амплитуды НПК ВП соматосенсорной коры в ответ на ЭДР с постоянной силой тока в течении 60 мин регистрации после инъекции данного ингибитора энкефалиназы. Значения амплитуды данного показателя ноцицепции колебались в пределах 89-108 % исходных величин.

Изолированное введение д-фенилаланина акупунктуро-резистентным кроликам (п-5) вызывало аналгетический эффект достоверного (Р< 0.01) снижения значений амплитуды НПК ВП соматосенсорной коры в ответ на ЭДР с постоянной силой тока до 82+5% исходных величин через 10-15 мин, до 75+8% - через 20-30 мин и 30-40 мин и до 79+ 9% через 40-50 мин после введения данного вещества. Восстановление значений амплитуды НПК ВП до значений, не .имеющих достоверных различий с исходными, наблюдалось к 50-60 мин после введения д-фенилаланина.

Таким образом, также как у морфин-чувствительных и морфин-резистентных крыс, введение ингибитора энкефалиназы не 'вызывало аналитического эффекта у акупунктуро- и морфин-чувствительных кроликов и вызывало аналгетический эффект у акупунктуро- и морфин-резистентных. Можно думать,что данные различия эффектов действия ингибитора энкефалиназы основаны,также как и у соответствующих особей крыс, на различиях уровня активности энкефалиназы у данных животных в основных структурах эндогенной анти-ноцицептивной системы, в частности более высоким уровнем выделения эндогенных опиоидов у акупунктуро-резистентных животных,что однако,нивелируется исходно более еысоким уровнем активности эндопептидаз, в частности энкефалиназы,обеспечивающей большую скорость инактивации эндогенных опиоидов.

*

2. 5. Эффекты комбинированного действия д-фенилаланина и аурикулопунктурной стимуляции у акупунктуро-резистентных кроликов.

У акупунктуро-резистентных кроликов (п-6) применение АЭ не вызывало аналитического эффекта снижения амплитуды НПК ВП соматосенсорной коры в отЕег на ЭДР в течении 50 мин регистрации после выключения АЭ, после чего производилось введение д-фенилаланина,

вызывающего аналитический эффект достоверного (Р<0. 01) снижения значений амплитуды НПК ВП.в среднем до 71+5% исходных значений через 15 мин,до 62+5% - через 30 мин и до 78+5% - через 40 мин, с восстановлением до 89+9% исходных величин через 50 мин после инъекции д-фенилаланина. Применение АЭ у данных животных через 60 мин после введения д-фенилаланина,т. е. после исчезновения его аналитического эффекта, вызывало аналитический эффект достоверного (РсО. 01) снижения значений амплитуды НПК ВП соматосенсорной коры в ответ на ЭДР до 65-70% исходных ее значений в течении 40-45 мин и до 82+6% -через 50-55 мин после выключения АЭ с восстановлением величин,не имеющих достоверных различий с исходными (94+8%) через 60 мин после АЭ.

Таким образом,после введения д-фенилаланина и исчезновения его аналитического эффекта, применение АЭ у акупунктуро-резистент-ных кроликов вызывало аналитический эффект. Следовательно, введение ингибитора энкефалиназы превращало акупунктуро-резистент-ных животных в акупунктуро-чувствительные.

Можно думать, что, поскольку акупунктурная стимуляция вызывает увеличение в структурах гипоталамуса и ЦСВ мет- и лей-энкефали-нов (Zou 1980), что не наблюдалось у акупунктуро-резистентных крыс (Zhah An-Zhorig, 1980), а введение д-фенилаланина вызывало увеличение в 3 раза содержание энкефалина в гипоталамусе и стволе мозга. (Yin et al. ,1986), именно это обстоятельство объясняет проявление аналгетического эффекта АЭ у акупунктуро-резистентных кроликов после введения ингибитора энкефалиназы, а также вызывает предположение о существенной роли высокого уровня активности энкефалиназы в структурах эндогенной антиноцицептивной системы в механизмах акупунктурной резистентности.

2.6. Эффекты комбинированного введения д-фенилаланина и морфина у акупунктуро-резистентных кроликов. ,

Как показали вышеприведенные эксперименты, у акупунктуро-резистентных кроликов введение морфина не вызывало аналгетического эффекта (п. 2. 3), введение д-фенилаланина вызывало аналитический эффект (п. 2. 4). В данной серии опытов введение акупунктуро-ре-зистентным кроликам (п=5) д-фенилаланина и через 30 мин после введения ингибитора энкефалиназы,т. е. после окончания его аналгетического эффекта, морфина вызывало аналитический эффект дос-

товарного (р-.О. 01) снижения значений амплитуды НПК ВП соматосен-сорной коры в ответ на ЭДР в среднем до 75+15% через 10 мин,до 50-58+10% через 20-25 мин и до 72-78+7% через 30-40 мин после введения морфина, а через 45 мин значения амплитуды НПК ВП не имели достоверных отличий от фоновых..

Таким образом, также как у морфин-резистентных крыс,у акупунктуре- резистентных кроликов введение морфина сразу после окончания аналитического действия ингибитора энкефалиназы вызывало аналитический эффект, что не наблюдалось при контрольном введении Физиологического раствора. Следовательно,после введения ингибитора энкефалиназы акупунктуро- и морфин-резистентные животные становились морфин-чувствительными.

Данные результаты опытов также указывают на то,что акупунктур-ная резистентность, также как и морфинная резистентность, может быть связана с высоким уровнем активности эндопептидаз,с высокой скоростью инактивациих эндогенных опиоидов, через выделение которых и опосредуется аналитический эффект акупунктуры и морфина, и содержание которых значительно ниже у акупунктуро-резистентных особей (Takeshiке С. ,1992). Известно,что акупунктурнал аналгезия сопровождается усилением нейронной активности'в основных структурах эндогенной антиноцицептиной системы - гипоталамусе и центральном сером веществе ( Е. В. Голанов, 1979, Takeshi-ge.C. 1992),а микроинъекция морфина в последнюю структуру вызывает активацию нейронов ¡Cheng Z. et al.,1936). Вероятно, что высокий уровень активности эндопептидаз, и в частности энкефали-нззн, при ачулунктурной резистентности имеет м~сто г данных структурах - гипоталамусе и центральном е«ром веществе, кяк ••тг. показано у морфин-резистентных крыс t Л. ■!>. Панч^нко о с-:-авт. ,1995).

Р. 7. Эффекты введения налокеона у акупунктуре -рлзистрнтннх

кроликов.

Известно, что предварительное введение налокеона акупункту-ро-чувотвительным животным блокирует аналитический эффект акупунктуры!. Zhang An-Zhong, 1980, Ю. Д. Игнатов с соавт. ,1990 ¡.Изолированное же введение налокеона животным, без проверки их морз-и-но- или акупунктуро-чувствительности,вызывало либо гиперапгети-ч^ский эффект (Jacob J. et al. ,1974 и мн. др. ). либо не изменяло

показатели ноцицепции (Kocher L. ,1987),или, в зависимости от линии животных,типа ноцицептивного раздражителя и дозы налоксона вызывало аналитический эффект (Kayser V. et al. ,1981, Attal N. et al., 1989, Vaccarino A. et al. ,1989). В то же время установлено, что у акупунктуро-чувствительных кроликов изолированное введение налоксона (0.15 мг/кг) вызывало гипералгетический эффект, а у акупунктуро-резисгентных - аналитический, оцениваемый по показателю изменения амплитуды НПК ВП соматосенсорной коры в ответ на ЭДР ( 0. С. Раевская, Г. Г. Гришанин, 1990) и на электрокожный ноци-цептивный стимул ( 0. С. Раевская, 1992).

Как показали проведенные опыты у акупунктуро-резистентных кроликов (п=7) A3 не вызывала аналгетического эффекта,а введение налоксона сразу после выключения неэффективной A3 вызывало анал-гетический эффект достоверного (Р<0.01) снижения значений амплитуды НПК ВП соматосенсорной коры в ответ на ЭДР в среднем до 83+ 7% исходных величин через 10 мин, до 63+5% - через 20 мин, до 57+5% - через 30 мин, до 73+6% - через 40 мин после введения налоксона, а через 50 мин после введения значения амплитуды НПК ВП не имели достоверных различий от фоновых.

Таким образом, введение налоксона акупунктуро-резистентным кроликам вызывало аналгетический эффект не только при его изолированном введении ( О. С. Раевская,Г. Г. Гришанин, 1990), но при его введении сразу после неэффективной АЭ. Примечательно,что в отличии от контрольных животных,у морфин-резистентных и морфин-толерантных крыс введение налоксона в дозах 0.1-0. 7 мг/кг вызывало также аналгетический эффект (С. В. Литвинова с соавт., 1993),что, возможно, связано с тем,что в отличии от контрольных, налоксон у последних животных вызывал увеличение выделения эндорфинов в плазму (Gudehithlu К. et al. ,1991). Следует отметить,что у морфин-толерантных животных, также как и у морфин-резистентных,имеет место снижение содержания эндогенных опиоидов в структурах мОвга (Gudehithlu К. et al. ,1991), отсутствие аналгетического эффекта при стимуляции ЦСВ (Морозова А. Л. , 1984) и повышение активности эндопептидаз (Malfroy В. et al. ,1978) и у данных животных наблюдается противоположный эффект налоксона не только на болевую чувствительность (С: В. Литвинова с соавт. ,1993),но и на vas deferens и ileum реакции (Killian A. et al. ,1981,Vargas M. et al., 1987).

III. ИССЛЕДОВАНИЕ РОЖ ЭНКЕФАЛИНАЗЫ В МЕХАНИЗМАХ ВОССТАНОВЖНИЯ БОЛЕВОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ПОСЛЕ АКУПУНКТУРНОЙ АНАЛГЕЗИИ.

3.1. Эффекты введения д-фенилаланина при восстановлении ноцицепции после акупунктурной аналгезии у акупунктуро--чувствительных кроликов.

Как указывалось выше,механизм акупунктурного обезболивания опосредуется через увеличение выделения эндогенных опиоидов,блокирующих проведение ноцицептивной импульсации. В то же время обратный захват эндогенных опиоидов не установлен и их избыток инактивируется эндопептидазами (Азарян А. В. ,1989). Это вызывает предположение, что восстановление исходной болевой чувствительности после акупунктурной аналгезии происходит за счет инактивации избытка эндогенных опиодов,связанного с увеличением уровня активности эндопептидаз,в частности знкефалиназы.

Как показали вышеприведенные опыты, у морфин-чувствительных кроликов восстановление ноцицепции до исходных величин происходило в среднем через 50-60 минут после выключения применяемой аурикулярной электропунктуры,после чего 'не наблюдалось достовер- ' ных изменений значений применяемого, в"опытах показателя ноцицепции на протяжении 60 минут его регистрации (п. 2.J> ) Изолированное введение ингибитора энкефалиназы акупунктуро-чувствительным кроликам не вызывало аналгетического эффекта (п. 2.4.).

Как показали проведенные опыты, у акупунктуро-чувствительных кроликов введение д-фенилаланина через 55-60 мин после выключения АЭ.т. е. на стадии практического восстановления ноцицепции после акупунктурной аналгезии, когда значения амплитуды НПК ВП соматосенсорной коры в ответ на ЭДР восстанавливались до 97+11% исходных значений, вызывало последующее снижение данного показателя ноцицепции до 77+10% через 15-20 мин, до 66-67+10% через 30-45 мин и до 73+5% через 50-55 мин после инъекции ингибитора знкефалиназы. Через 60-65 мин после инъекции д-ФА значения амплитуды НПК ВП не имели достоверных отличий от фоновых.

Таким образом, введение ингибитора энкефалиназы акупункту-ро-чувствительным кроликам на стадии восстановления ноцицепции

после акупунктурной аналгезии вызывало, в отличии от его изолированного введения,четкий аналитический эффект в течении 45-55 минут после инъекции. Примечательно, что и в опытах других авторов изолированное введение д-фенилалннина акупунктуро-чувствительным особям не изменяло порог боли ,но усиливало и пролонгировало акупунктурную аналгезию у людей и животных (Нуо<1о М,1981, 1992). Это свидетельствует в пользу предположения об увеличении уровня активности.энкефалиназы на данной стадии восстановления болевой чувствительности после акупунктурной аналгезии.

3. 2. Эффекты введения морфина на стадии восстановления ноцицепции после акупунктурной аналгезии у акупунктуро-- чувствительных кроликов.

Предположение об увеличении уровня активности энкефалиназы на стадии восстановления болевой чувствительности после акупунктурной аналгезии, имеющей опиоидный механизм, предполагает что на данной стадии возникает состояние морфинной и акупунктурной резистентности. Как показали настоящие опыты введение морфина акупунктуро-чувствительным кроликам через 50-00 мин после выключения АЭ.т.е. на стадии восстановления ноцицепции, не вызывало изменений ноцицепции, оцениваемой по применимому электрофизиологи чк' кому показателю в течении 60 минут регистрации после инъекции. Значения амплитуды НПК БП соматосенсорной коры в ответ на нДР колебались в пределах 5-15% и не имели достоверных отличий от фоновых величин. То есть на данной стадии после акупунктуры акупунктуро- и морфин-чувствительные животные становились мор-■Ь'м резистентными.

Г; то жг- время известно,что повторная акупунктурная стимуляция у животных и человека вызывает аналитический эффект. Однако, в этим случае весьма показательны результаты опытов Ротегапг В. и Маг па N. (1988), в которых аналгетический эффект повторной акупунктурной стимуляции не блокировался налоксоном, хотя первичная стимуляция вызывала налоксонозависимый аналгетический эффект. Авторы считают, что повторная акупунктурная аналгезия опосредуется не через опиоидный механизм. Отсутствие аналгетического эффекта морфина и проявление аналгетического эффекта д-фенилаланина на стадии восстановления болевой чувствительности после акупунктурной аналгезии может свидетельствовать о связи этих эффектов с

- £у -

увеличением уровня активности эндопептидаз,в частности энкефали-назы и ее существенной роли в механизмах восстановления исходной ноцицепции.

3. 3. Эффекты введения налоксона у акулунктуро-чувствительных кроликов на стадии восстановления ноцицеции после акупунктурной

аналгезии.

Известно,что предварительное введение налоксона блокирует аку-пунктурную аналгезию у акупунктуро-чувствигельных животных,что, в частности, показано у кроликов при применяемых в настоящих опытах параматрах АЭ, оценки ноцицепции в ответ на ЭДР и введении той же дозы налоксона (О. В. Федосеева, 1989).

Как показали настоящие опыты введение налоксона акупункту-ро-чувствительным кроликам (п=7) через 60-70 мин после выключения АЭ.т.е. на стадии полного восстановления исходных значений амплитуды НПК ВП соматосенсорной коры в ответ на ЭДР, вызывало достоверное (р<0. 01) снижение данных значений показателя ноцицепции до 80+41% исходных величин через 10 мин, до 60-63+3% через 20-40 мин, до 70+6% через 50 мин и до 82+11% через 60 мин после введения. Введение же в контрольных опытах(п=2) физиологического раствора через 60 мин после выключения' АЭ не приводило к достоверным изменениям величин данного показателя ноцицепции в течении 70 мин регистрации.

Следовательно,введение налоксона акупунктуро-чувствительным кроликам на стадии восстановления ноцицепции, также как введение ингибитора энкефадиназы, вызывало аналгетический эффект и,тем самым, пролонгировало акупунктурную аналгезию. Характерно, что в опытах Ротегапз В. и Warna N.(1988) введение налоксона через 60 мин после первой АЭ не только не блокировало,но даже усиливало аналгетический эффект повторной АЭ.

Таким образом,введение налоксона животным, у которых име^т место более высокая активность эндопептидаз,в частности энкефа-линазы, в дозах,блокирующих морфинную и акупунктурную аналгезии у контрольных животных, вызывает аналгетический эффект. Характерно, что у людей налоксон также вызывает аналгетический эффект, если порог боли был ниже,чем в предыдущие дни (Davis G. er al.,1979),что коррелирует с функциональным более низким содержанием эндогенных опиоидов (Terenius L. 1979), а это в сбою очередь

моют быть связано с увеличением уровня активности эндопептидаз. Следует отметить,что низкие дозы налоксона вызывают аналитический эффект у людей и животных(Ьеуте J. .Gordon N. ,1986,Guil-boud G. et. al. ,1987,Taiwo Y. et al. ,1989),a более высокие вызывают блокаду морфинной аналгезии, как правило не изменяя пороги ноци-цепции или вызывая гипералгетический эффект (Woolf С. ,1980,Ueda II. et al. ,1986). Однако, как видно из приведенных опытов,последние дозы налоксона также вызывают аналгетический эффект,но у организмов с более высоким уровнем активности эндопептидаз и только еще большие дозы вызывают гипералгетический эффект ( С. В. Литвинова с соавт. ,1993). Можно думать,что налоксон,также как и налор-фин, является не просто антагонистом, а агонистом-антагонистом эндогенных опиоидов и механизм его действия каким-то образом связан с уровнем активности эндопептидаз, что пока еще остается во многом неизвестным.

ВЫВОДЫ:

1. У морфин- и акупунктуро-чувствительных животных (крысы,кролики) введение ингибитора энкефалиназы - д-фенилаланина (300-600 мг/кг)не вызывает изменений параметров ноцицепции в ответ на термальный и электродентальный ноцицептивные раздражители. У морфин- и акупунктуро-резистентных животных введение ингибитора энкефалиназы вызывает аналгетический эффект.

П. У морфии- и акупунктуро-резистентных животных введение морфина (1.5-2.0 мг/кг) или применение аурикулоэлектропунктуры сразу после окончания аналитического эффекта ингибитора энкефалиназы вызывает аналгетический эффект.

3. У морфин- и акупунктуро-резистентных кроликов введение налоксона (0.15 мг/кг) вызывает аналгетический эффект при электродентальном нодицептивном раздражении.

4. У морфин- и акупунктуро-чувствительных животных введение налоксона ( 0.15-0. 3 мг/кг) не вызывает изменений параметров ноцицепции в ответ на термальный и электродентальный ноцицептивные раздражители. Предварительное введение налоксона морфин-чувствительным крысам блокирует морфинную аналгезию. Введение ингибитора энкефалиназы после инъекции налоксона у морфин-чувствительных крыс вызывает аналгетический эффект и отменяет блокирующий эф-

фект налоксона на аналитическое действие морфина.

5. У акупунктуро-чувствительных кроликов введение морфина на стадии восстановления ноцицепции после аурикулоэлектропунктурной аналгезии не вызывает аналитического эффекта, а введение ингибитора энкефалиназы или налоксона приводит к аналитическому эффекту, т. е. пролонгирует электропунктурную аналгезию.

6. Энкефалиназный механизм является существенным компонентом механизмов морфинной и акупунктурной резистентности, восстановления болевой чувствительности после акупунктурной аналгезии, а также действия налоксона, блокирующего морфинную и акупунктурную аналгезию, его аналитических эффектов у морфин- и акупунктуро- резистентных животных.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Роль энкефшшназных механизмов в акупунктурном обезболивании. //Тезисы докладов Всесоюзной конференции: Синтез, ¡фармакология и клинические аспекты новых обезболивающих средств, Новгород, 1991, с. 28-30 (совместно с Калюжным JL В. , Торговановой Г. В. ).

2. Влияние блокатора энкефалиназы 'на эффекты акупунктуры у акупунктуро-чувствительных и -резистентных кроликов. // Бюлл. экеперим. биол. и мед., 1991, т. 112, N 12, с. 571-573 (совместно с Калюжным Л. В. ).

3. Энкефалиназные механизмы резистентности и толерантности к аналгетическому эффекту морфина у крыс. Различия эффектов действия д-фенилаланина у морфин-чувствительных, -толерантных и -резистентных крыс.// Бюлл. экеперим. биол. и мед., 1993, т. 110, N7, с. 54-56 (совместно с Литвиновой C.B. , Калюжным Л.В. ).

4. Энкефалиназные механизмы резистентности и толерантности к аналгетическому эффекту морфина у крыс. Различия эффектов налоксона у морфин-чувствительных, -резистентных и -толерантных крыс.// Бюлл. экеперим. биол. и мед. , 1993, т. 116, N7, с. 0-9 ( совместно с Калюжным Л. В. , Литвиновой C.B.).

5. Энкефалиназные механизмы морфинной резистентности. // Тезисы 1-ой конференции Российской Ассоциации по изучению боли: Патофизиология и фармакология боли, Москва, 1993, с. 137 (совместно с Калюжным Л. В. , Литвиновой С. В. , Аристовой В. В. ).

6. Enkephalina-зе mechanisms of morphine-tolerance m rat.:"-.//

Abstracts of the International Confer. Bi-digital O-ring test, Karume, Japan, 1993, p. 46-48 (with Kalyuzhnyi L. V. , Litvinova 3. V.).

7. Enkephalinase in the mechanisms of acupuncture and morphine insensitivity.// Abstracts of the third World Confer, on Acupuncture, W. F. A. S. , Kyoto, Japan, 1993, p. 112 (with Kalyuzhnyi L. V. ).

8. Enkephalinase in the mechanism of acupuncture analgesia and acupuncture resistence.// Abstracts of the First congress of the Europian Association of Acupuncture, Kishinev, 1994, p.66-67 (with Kalyuzhnyi L. V. ).

9. Энкефалиназный механизм акупунктурорезистентности. // Тезисы докладов научной конференции молодых ученых России, Москва, 1994, с. 73-74.

10. К механизмам акупунктурной резистентности: эффекты д-фени-лаланина и налоксона при акупунктурной стимуляции у акупункту-ро-чувствительные и -резистентных кроликов. // Тезисы докладов 1-го Международного научного конгресса: Традиционная медицина и питание: теоретические и практические аспекты, Москва, 1994, о. 43. ( совместно с Калюжным JL В. ).