Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Особенности кардиотонического действия сердечных гликозидов на патологически измененный миокард

РГЗ од

- ' - • ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ПО БЕЗОПАСНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

На правах рукописи

ИСАЕВА СВЕТЛАНА АЛЕКСАНДРОВНА

ОСОБЕННОСТИ КАРДИОТОНИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ СЕРДЕЧНЫХ ГЛИКОЗИДОВ НА ПАТОЛОГИЧЕСКИ ИЗМЕНЕННЫЙ МИОКАРД

14. 00. 25 - Фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

КУПАВНА - 1994

Работа выполнена в АО "Биотехнология".

Научный руководитель: Доктор биологических наук М. Р. Мукумов

Официальные

Доктор медицинских Доктор медицинских

оппоненты:

наук С. Ю. Бердяев наук Л. Н. Сернов

Ведущая организация: Российский государственный

медицинский университет РАМН

Защита состоится " " 1994 г. в часов

на заседании Специализированного совета Д 098.01.02 при Всероссийском научном центре по безопасности биологически активных веществ по адресу: 142440, Московская обл., п. Старая Купавна, ул. Кирова, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научного центра по безопасности биологически активных веществ.

Автореферат разослан " " 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

Т. Н. Робакидзе

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Несмотря на значительное расширение арсенала лекарственных препаратов для кардиологической практики сердечные гликозиды остаются основным средством для лечения сердечной недостаточности (Ботчал Б.Е., Слуцкий Ü Б. , 1973; Чазов Е. И. и др., 1977, 1992; Мухарлямов H. М., Мареев В. Ю. , 1985; Мареев В. Ю., 1991). В то же время показано, что сердечные гликозиды (СГ) имеет узкий диапазон безопасного применения и относительно Еысокую токсичность. В связи с этим во многих лабораториях мира продолжаются интенсивные работы по созданию новых СГ и по оптимизации их способов применения. Для решения этих задач необходимо иметь четкое представление о механизмах действия СГ на сердечную мышцу. В последнее десятилетие в этом вопросе достигнут значительный прогресс, главным сбразом, благодаря успехам клеточной физиологии, электронной и вычислительной техники (Изаков В. Я. и др., 1979; Чекман U.C. и ,-?. , 1984, 1992; Langer G. А., 1975, 1981; Akera T. et al., 5.931, 1990; Lederer H.J. et al., 1990; Gibbons W. R., Zygnunt A.C., 1S92).

Особенности влияния СГ на патологически измененный миокард до сих пор являются предметом оживленных дискуссий (Чазов Е. И. и др., 1977; Генденштейн Э. И. и др., 1981, 1982, 1985; 1'ацура В. В. , 1980, 1983; Сернов Л. H., 1S82; Мареев В. Ю., 1991; Schwartz А., 1977; Nirasawa Y., Akera T., 1987). Остается открытым вопрос как различные патогенные факторы (гипоксия, ишемия, гипертрофия и т. д. ), приводящие к сердечной недостаточности, модифицируют, в частности, кардиотонический эффект СГ; каковы особенности в реакции различных отделов недостаточного сердца на СГ; как влияют СГ на звенья электромеханического сопряжения в патологически измененном кардиомиоците. Этот перечень вопросов может быть продолжен. В связи с тем, что продвижение в понимании любого из них необходимо для современной практической кардиологии, сформулированная в работе проблема представляется актуальной.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось изучение у.леточного механизма особенностей действия СГ на патологически измененный миокард человека и экспериментальных животных.

- г -

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Изучить изменение влияния дигоксина на внутриклеточные потенциалы и сократительную активность папиллярной мышцы морской свинки и крысы в зависимости от степени ишемического повреждения миокарда.

2. Исследовать корреляции между положительным инотропным эффектом дигоксина. активностью сарколеммальной N8, К-АТФазы и ритмоинотропными отношениями в миокарде морской свинки и крысы в норме и после нормотермической ишемии.

3. Исследовать влияние дигоксина, коргликона, строфантина К на сократительную активность ушка предсердия и папиллярной мышцы сердца больных с приобретенными пороками сердца.

4. Изучить пространственную однородность в реакции на ди-гоксин ушка предсердия и папиллярной мышцы сердца собаки и больных с приобретенными пороками сердца.

5. Разработать экспериментальную модель дозированного ишемического повреждения фрагмента сердца экспериментальных животных и способ количественной оценки функционального состояния фрагмента миокарда.

Научная новизна. Обнаружена пространственная гетерогенность ушка предсердия больных с приобретенными пороками сердца к действию СГ. Доказано, что гетерогенность является неотъемлемым свойством ушка предсердия и не обусловлена патологическими процессами протекающими в сердце.

Впервые показано, что несмотря на угнетение сарколеммальной На, К-АТФазы в миокарде крысы и морской свинки под влиянием ишемии различной продолжительности усиления сократительной активности папиллярной мышцы не возникает. Кроме того, дополнительное ингибирование Иа,К-АТФазы при действии дигоксина также не приводит к усилению силы сокращения этих мышц.

Установлен новый факт, что сарколеммальная Иа, К-АТФаза ишемически поврежденного сердца крысы становится (в отличие от нормы) чувствительной к дигоксину.

Обнаружено, что снижение концентрации ионов К во внеклеточной среде, приводящее к ингибированию Ыа, К-АТФазы, вызывает усиление сократительной активности не только миокарда морской свинки, но и крысы.

Впервые показано, что ишемия наряду с предотвращением кардиотонического действия СГ на миокард приводит к снижению крутизны ритмоинотропной зависимости в папиллярной мышце морской свинки и крысы.

На основании полученных данных впервые выдвинуто и доказано предположение, что для проявления положительного инотроп-ного эффекта СГ необходимо не только угнетение На, К-АТФазы, но и требуется нормальное функционирование саркоплазматического ретикулума. Снижение функции последнего под влиянием ишемии является основной причиной уменьшения чувствительности патологически измененного миокарда к СГ.

Практическая ценность работы. На клеточно-тканевом уровне экспериментально доказано, что СГ не эффективны на ишемически поврежденном миокарде. Для корректирования их действенности могут быть использованы препараты, восстанавливающие функцию саркоплазматического ретикулума кардиомиоцитов.

Показана ошибочность использования гребенчатых мышц ушка предсердия больных с приобретенными пороками сердца для тестирования новых соединений на кардиотоническуп активность.

Предложен новый подход к разработке способа индивидуального подбора СГ для кардиохирургических больных (авторское свидетельство N 1301414).

Разработан количественный способ тестирования новых химических соединений на противоишемическую активность (авторское свидетельство N 1309955). Выдано свидетельство участника ВДНХ СССР.

Разработан способ испытания биологически активных веществ на папиллярную мышцу больных с приобретенными пороками сердца (авторское свидетельство N 1320744).

Апробация работы. Основные результаты работы представлялись на 1 Всесоюзном биефизическомй сьезде (М«сква, 1982), 1У Научной конференции молодых ученых и специалистов "Хирургическое лечение заболеваний сердца и сосудов" (Москва, 1983), I Всесоюзном симпозиуме "Фармакологическая коррекция кислородза-висимых патологических состояний" (Москва, 1984), У1 Объединенной конференции молодых ученых и специалистов "Актуальные вопросы хирургии" (Тбилиси, 1985), I Школе-семинаре "Регуляция тканевого гомеостаза. Нетоксическая профилактика и терапия

хронических патологий" (Кобулети, 1987), Constituent Congress INTERNATIONAL SOCIETY for PATHOPHYSIOLOGY (Moscow, 1991), Отчетной конференции НПО "Биотехнология" (Москва, 1992).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 работ, из них 3 авторских свидетельства на изобретение.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных теоретических и экспериментальных результатов, заключения и выводов. Работа содержит 146 страниц машинописного текста, 11 таблиц и 27 рисунков. Список цитируемой литературы включает 201 наименование.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы. Проведен анализ опубликованных теоретических и экспериментальных данных о влиянии СГ на электромеханическое сопряжение в нормальном и патологически измененном миокарде человека и животных.

МАТЕРИАЛЫ И НЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объектов исследования использовали ушко предсердия и папиллярную мышцу (ПМ) сердца крысы, морской свинки, собаки, кардиохирургических больных с приобретенными пороками сердца. Удаление ушка предсердия и ПМ у больных было обусловлено ходом хирургического вмешательства.

Всего в диссертационной работе было поставлено 740 экспериментов.

Применяли полоски миокарда длиной 3 - 5 мм и диаметром О, 9 - 1,2 мм. Фрагмент миокарда помещали в камеру объемом 0, 55 мл, которая постоянно перфузировалась физиологическим оксиге-нированным раствором. Один конец полоски миокарда закрепляли неподвижно, другой - лигатурой к механоэлектрическому датчику. Мышцу растягивали примерно на 30% исходной длины, добиваясь максимальных сокращений. Сердечную мышцу раздражали через 2 массивных серебряных электрода, расположенных вдоль всей длины камеры, прямоугольными электрическими импульсами продолжительностью 5 мс, амплитудой 1,5-2 раза выше пороговой с базовой

частотой 0,3 Гц для миокарда человека или 0,5 Гц для миокарда экспериментальных животных. Перед каждым экспериментом полоску миокарда "срабатывали" не менее 60 мин, добиваясь стабильных сокращений.

Электрическая активность. Внутриклеточные мембранные потенциалы отводили с помощью стеклянных плавающих микроэлектродов с диаметром кончика 0,5 мкм, заполненных 3 М раствором KCL по стандартной методике. Параметры, подвергавшиеся обработке, представлены на рис. 1. А.

Сократительная активность. Регистрировали сокращения полоски миокарда в условиях, близких к изометрическим, с помощью механотрона 6ÜX1C. Параметры сократительного ответа, подвергавшиеся обработке, представлены на рис.1.Б. Расчеты производили для установившихся значений указанных параметров (при выходе амплитуды сокращений на стационарный уровень). Все значения представляли в относительных единицах (%) путем их нормирования на соответствующие параметры при базовой частоте раздражения сердечной мышцы или до введения в физиологический раствор химического соединения.

Определение активности сарколеммальной иа.К-АТФазы сердца. Для оценки Na,К - АТФазной активности использовали стандартный метод. Работа выполнялась совместно с Институтом физиологии АН Казахстана.

Модель "хирургической" ишемии сердца. Для осуществления глобальной тотальной ишемии сердце иссекали из организма животного и помещали в сухой стеклянный бюкс с герметично притертой крышкой. Затем бюкс устанавливали в ультратермостате, поддерживая температуру 36 + 0,5°С. Степень ишемического повреждения дозировали продолжительностью пребывания сердца в указанных условиях (15, 30, 45, 60 мин).

Функциональное состояние сердечной мышцы оценивали по крутизне ритмоинотропных отношений (РИ0), которые регистрировали, изменяя частоту раздражения миокарда в диапазоне (0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 1 Гц).

В работе сравнивали влияние на электрическую и сократительную активность миокарда человека трех сердечных гликози-дов: дигоксина, коргликона, строфантина К в концентрации

_7

4x10 г/мл. Влияние дигоксина на интактный и ишемически

£

Рис. 1. Измеряемые параметры изолированного фрагмента миокарда.

А - параметры внутриклеточных потенциалов; Б - параметры сократительного ответа.

поврежденный миокард экспериментальных животных исследовали в концентрации 5x10 М. Препарат вводили в физиологический раствор после "врабатывания" сердечной мышцы при непрерывной стимуляции с постоянной частотой.

Осуществлялась автоматизированная обработка полученных результатов с помощью системы "КАНАК" фирмы Schlumberger (Франция). Программа обработки экспериментальных данных была написана на языке CAS1С.

Достоверность полученных результатов оценивали по критерию Стыэдента (Бейли Н.. 1970). Коэффициент корреляции вычисляли по стандартной формуле для малых выборок (Яакин Г. Ф., 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Основная задача первого этапа исследований состояла в изучении влияния дигоксина, коргликона и строфантина К на сократительную активность различных отделов сердца больных с приобретенными пороками сердца.

Проведенные исследования показали, что дигоксин во всех экспериментах вызывал в той или иной степени увеличение амплитуды сокращений фрагментов патологически измененного миокарда. В среднем максимальный положительный инотропный эффект (ПИЭ) дигоксина на упхо предсердия оказался в 2 раза больше (314 + 31,4%), чем на ПИ (147 + 5,3%). В отличие от того, что имело место в опытах на ПМ, на ушке предсердия был обнаружен значительный разброс в кардиотоническом действии дигоксина от О% до 475% (в ПМ от 14% до 101%) , который, хах удалось установить, отчасти, обусловлен значительной гетерогенностью ушка предсердия по инотропной реакции на дигоксин. С учетом этого обстоятельства сравнение ПИЭ дигоксина с действием других СГ было проведено только на ПМ сердца больных. Эти исследования показали, что дигоксин, коргликон и строфантин К в среднем вызывали одинаковый максимальный ПИЭ -161+12,3%, 159 + 6,6%, 164+16,0%, соответственно. Однако, кардиотоническое действие строфантина К развивалось в среднем в 2 раза быстрее. В процессе работы были выявлены больные с относительно повышенной и относительно сниженной чувствительностью миокарда к СГ. Кроме того, было показано, что в ПМ сердца пациента, проявившей высокую реактивность к одному из испытанных СГ, с большей степенью вероятности (коэффициент корреляции составлял 0,906) и другие СГ вызывали значительное повышение сократительной активности.

Особый интерес представляют данные, согласно которым существует значительная корреляция между неоднородностью инотропной реакцией патологически измененного миокарда человека на дигоксин и на изменение ритма стимуляции. Значение этого выявленного факта становится понятным, если учесть, что РИО в миокарде отражают функциональное состояние сердечной мышцы, точнее состояние клеточных процессов, обеспечивающих электромеха-

ническое сопряжение в кардиомиоците.

Неожиданным представляется установленный в опытах с двумя полосками миокарда из одного отдела сердца феномен значительной гетерогенности ушка предсердия по инотропной реакции на дигоксин и изменение ритма стимуляции и отсутствие таковой в ПМ сердца больных с приобретенными пороками. Так, разница в максимальном приросте силы сокращения под влиянием дигоксина в двух гребенчатых мышцах из одного ушка предсердия составила 104+17,9%, в то время как эта величина для двух полосок из одной ПМ.была равна.в среднем 20+5,8%. Коэффициент неоднородности для ушка предсердия составил 40+13,9%, для ПМ -12+4,5%. Логично было предположить, что определенные патологические процессы, приводящие к обнаруженной инотропной гетерогенности у данного контингента больных затрагивают преимущественно ушко предсердия. Для проверки этой гипотезы была выполнена серия экспериментов на сердце здоровыз: собак. С этой целью в парах полосок миокарда из ушка предсердия и ПК собак после снятия кривых РИО оценивали ПИЭ дигоксина. Исследования показали, что усредненный разброс максимального ПИЭ дигоксина и коэффициент неоднородности в пара:: для ушка предсердия составили 50 + 14, 3% и 39 + 7,1%, соответственно, а для ПМ - 20 + 9, 3% и 16 + 4,2%, соответственно. Сравнение представленных данных с результатами, полученными на сердцах кардиохирургических больных, указывает на то, что относительно высокая гетерогенность по инотропной реакции к дигоксину ушка предсердия больных не результат патологических процессов, а особенность этого отдела сердца.

Следующий этап настоящей работы заключался в изучении влияния дигоксина на ишемически поврежденный миокард. Проведение такого исследования было обусловлено следующими причинами.

Выше были представлены данные о влиянии дигоксина и других СГ на миокард больных с приобретенными пороками сердца. По сути дела были продемонстрированы эффекты, вызываемые СГ в полоске миокарда, обладающего рядом индивидуальных характеристик, присущих сердечной мышце данного больного, и претерпевших необратимые изменения под влиянием различных патогенных факторов. Выяснение вклада каждого из этих факторов в потенцирование или в ослабление кардиотонического действия СГ ка миокард

представляется проблемой, решение которой имеет большой практический и теоретический интерес. Особое внимание в указанной проблеме отзодится ишемии как одной из основных причин, приводящих к сердечной недостаточности при заболеваниях различной этиологии.

Принимая во внимание тот факт, что среди всего исследованного контингента больных были выявлены пациенты, сердечная мышца которых обладала относительно повышенной или относительно сниженной чувствительностью к СГ, в дальнейшей работе в качестве тест-объекта использовали ПМ сердца морских свинок и крыс. Эти животные, как известно, имеют, соответственно, относительно высокую и относительно низкую чувствительность сердечной мышцы к СГ (Erdmann Е. et al., 1980; Brown L. et al., 1983; Anner B.M., 1985).

Проведенные исследования показали, что дигоксин в концентрации 5x10 М вызывает значительное ингибирование активности На,К-АТФазы сарколеммы интактного и ишемически поврежденного сердца морской свинки (табл.1). В той же концентрации дигохсин проявлял хорошо выраженное кардиотоническое действие на интактную и ишемически поврежденную (30 мин) ПМ (рис. 2, диаграмма 1,2). Эти результаты свидетельствуют в пользу широко распространенной точки зрения, согласно которой основным фармакологическим рецептором для кардиотонического действия СГ является Na,К-АТФаза, а соответствующая цепочка клеточных событий, приводящих к росту силы сокращений, связана с ингибированием фермента, с последующим повышением внутриклеточной концентрации Na+, которое вызывает дополнительное поступление в кардиомиоцит ионов Ca (Чекман И. С. и др., 1992; Langer G.A., 1981; Lee С.0.,1985; Rasmussen H.H. et al., 1990).

Полученные результаты указывают, однако, на то, что само по себе ингибирование Na,К-АТФазной активности в определенных условиях недостаточно для роста силы сокращений кардиомиоци-тов. Так, на базовой частоте стимуляции амплитуда сократительных ответов после 30, 45, 60 мин ишемии составляла по сравнению с контролем 100%, 50-60%, 25-50%, соответственно, хотя при этом наблюдалось достоверное снижение Na, К-АТФазной активности (табл.1). Более того, ПИЭ дигоксина не проявлялся на ПМ сердца морской свинки, предварительно подвергнутой ишемии, продолжи-

Таблица 1

_*7

Влияние ишемии и дигоксина (5x10 Ш на Иа,К-АТФазную активность миокарда морской свинки

Продолхитель ность ишемии, мин N8,К-Атфазная активность Ингибирование активности, в V. от контроля Иа,К-Атфазная активность при дигоксине Ингибирование по сравнение с исходными значениями, 7.

Контроль 13,4 ± 1,6 0 10,0 1 1.3 25

30 8.3 + 1.3* 39 6.4 ± 1.0* 23

45 6.4 + 0.8* 52 4.7 + 0.6* 26

60 5.0 ± 0,2* 63 3.8 ± 0.6* 24

Примечание:

* - отмечены достоверные изменения (Р < 0,05)

- и -

частота стимуляции (Гц)

Рис. 2. Изменение кардиотонического эффекта дигоксина и ритмоинотропных отношений в папиллярной мышце морской свинки под влиянием ишемии различной продолжительности.

По оси абсцисс - частота стимуляции ПМ (в Гц), по оси ординат - нормированная амплитуда сократительного ответа ПМ (в У.). На диаграмме - кар-

_7

диотонический эффект дигоксина (5 х 10 М). 1 - контроль; 2. 3, 4 - ишемия соответственно 30, 45 и 60 мин.

тельностью 45 минут (рис. 2 , диаграмма 3). В то же время способность дигоксина дополнительно ингибировать Na, К-АТФазу сохранялась (табл.1). Все это указывает на то, что ингибирование Na, К-АТФазы дигоксином, приводящее к повышению внутриклеточной концентрации Na+, лишь создает предпосылки для реализации кар-диотонического эффекта другими клеточными механизмами транспорта ионов. В этом плане наиболее существенную роль могут играть процессы секвестрации и освобождения Ca саркоплазыати-ческим рстикулумом (СР) и Na-Ca обмен сарколеммы кардиомиоцк-тов.

С целью поиска возможных корреляций между особенностями электромеханического сопряжения и механизмом действия СГ исследовали влияние дигоксина на внутриклеточные потенциалы и сократительные ответы в интактной и ишемически поврежденной ПМ.

Как показали эксперименты, дигоксин (5x10 М) в контроле не изменял параметров внутриклеточных потенциалов ПМ, в частности, потенциала покоя . Это, по всей видимости, было обусловлено тем, что электрогенный вклад Na-K насоса в потенциал покоя кардиомиоцитов морской свинки составляет всего 6-8 мВ (Daut J., Rudel R., 1982) и обнаруженное в настоящей работе 25% ингибирование Na, К-АТФазной активности дигоксином

_*7

(5x10 Ю могло практически не сказываться на его величина. После 30-ти минутной ишемии наблюдали небольшое (20%) падение величины сократительных ответов при базовом ритка стимуляции миокарда. Повышение силы сокращений ПМ с укорочением мгхик-пульсного интервала раздражения, характерное для ПМ морской свинки, сохранялось (рис.2, кривая 2). Как и в контроле, проявлялся хорошо выраженный ПИЭ дигоксииа (рис. 2 , диаграмма 2). В этой серии экспериментов ни 30-ти минутная ишемия, ни последующее действие дигоксина не вызывали достоверных изменений электрогенеза.

Увеличение продолжительности периода ишемии сердца до 45 мин приводило к отсутствию кардиотонического действия дигоксина, изменению характера РИО ("положительная лестница" превращалась в "отрицательную"), а также к прогрессирующему уменьше--нию продолжительности потенциала действия (ПД) (рис.2, кривая 3). Активность Na, К-АТФазы при этом снижалась на 52-63% (табл.

1). Добавление дигоксина в раствор, омывающий ишемически поврежденную ПМ (45 мин ишемии), не вызывало статистически значимых изменений внутриклеточных потенциалов кардиомиоцитов. После 60-ти минутного периода ишемии наблюдали достоверное уменьшение амплитуды и продолжительности ПД, а также величины потенциала покоя. Дигоксин (5x10 Ш приводил лишь к небольшому снижению огаериута ПД .

Представленные результаты указывают на то, что послэ длительного периода ишемии (более 30 мин), в кардиомиоцитах морской свинки необратимо нарушается рогуляция ионного гонеостаза. Одной из причин всех этих событий является прогрессирующий спад ферментативной активности Na,К-АТФазы ! табл.1). Вероятно, параллельно происходит и существенное снижение Са-секвестриру-пцай способности СР П'агаг .1. Т. и ;_р. , 1900; Krause S., Hess M. L., 1934; Yoslüda Y. et al., 1900), котсриЯ становится не

способным по мере роста ритма раздражения восстанавливать за-2+

пас Ca за кэжиипулъский интервал (рис. 2, крлрчз 3,4). Дополнительное понижение Са-сэкзестрирующэй способности СР кожет быть связано с усилением "утачки" Са*"+ в киоплазму в условиях ишемии (Chien K.P.. et al., 1901). Яаблвдаемую корреляцию между кардиотоническнк действие:', днгсг.сит:а на миокард и характером РИО можно рассматривать гак указанна на наличие взаимосвязи квг.ду это;«1 двумя эффекта::,;. 3 зтсх случае рост силы сокращений при действии СГ должен быть связан с ростом скорости сек-2+ 2+ вестрацпи Ca в СР и увеличением количества Ca , высвобождаемого в ответ на каждый стимул. Таки.\! образом, кардиотоничес-кому эффекту дигоксина в первую очередь должно сопутствовать увеличение скорости фазы сокращения и расслабления сердечной мышцы.

Полученные данные указывают на то, что ПИЭ дигоксина на интактную ПМ действительно сопровождается увеличением максимальной скорости сокращения и расслабления, соответственно, на 94+35, 87. и 134+49, 8%. В необратимо поврежденном миокарде морской свинки, подвергшемся 45 и 60 мин ишемии, кардиотонический эффект отсутствовал (рис.2 , диаграмма 3,4). При этом не было обнаружено статистически достоверных изменений максимальной скорости сокращения и расслабления, а также продолжительности соответствующих фаз.

Далее представлены данные, полученные в аналогичных экспериментах на сердце крысы.

Добавление дигоксина в концентрации 5x10""7 М в физиологический раствор на 10-12 мин приводило к постепенному повышенно амплитуды сокращений ПИ интактного сердца крысы, которая достигала максимума в среднем через 50-60 минут после начала действия вещества и составила 11615,7% (п=8) (рис.3, диаграмма 1). Усредненная по всем экспериментам максимальная скорость сокращения при действии дигоксина составляла 110+3,5%, а максимальная скорость расслабления - 120+6,9%. Продолжительность соответствующих фаз сократительного ответа достоверно не изменялась.

ПИЭ дигоксина (5x10 М) на ПН сердца крысы не сопровождался статистически значимыми изменениями параметров внутриклеточных потенциалов.

Существенно, что дигоксин в указанной концентрации не изменял активности сарколеммальной Иа,К-АТФазы миокарда крысы (табл.2).

Выдерживание сердца крысы в течение 15 мин в условиях ишемии не приводило к увеличению порога возбуждения и статистически достоверному изменению амплитуды вызванных сокращений ПМ при базовой частоте стимуляции 0,5 Гц. Абсолютные значения продолжительности фазы сокращения и расслабления после этого срока ишемии статистически значимо не отличалось от контрольных значений.

Ишемия 15-ти минутной продолжительности не отражалась и на внутриклеточных потенциалах кардиомиоцитов.

В то же время было зарегистрировано достоверное (Р<0,05) по сравнению с контролем смещение кривой ритмоинотропной зависимости в ПМ (рис.3, хривая 1 и 2).

Одновременно в специальной серии экспериментов было установлено статистически достоверное более чем на 17% снижение по сравнению с контролем активности На,К-АТФазы (табл.2).

Кардиотоническое действие дигоксина

(5x1О"7 М> на ПН, выделенную из сердца крысы после 15-ти минутного периода ишемии, сохранялось и составляло 112 + 8,2% (рис.3, диаграмма 2).

Время достижения максимума ПИЭ было таким же как и в ин- . тактной мышце. Все параметры сократительного ответа ПМ крысы

Рис. 3. Изменение кардиотонического эффекта дигоксина и ритмоинотропных отношений в папиллярной мышце крысы под влиянием ишемии различной продолжительности.

По оси абсцисс - частота стимуляции ПН (в Гц), по оси ординат - нормированная амплитуда сократительного ответа ПМ (в '/.). На диаграмме - кар-диотонический эффект дигоксина (5 х Ю-7 М) 1 - контроль; 2, 3 - ишемия соответственно 15, 30 мин.

Таблица 2

_7

Влияние ишемии и дигоксина (5x10 41) на №,К-АТФазную активность миокарда крысы

Продолжитель ность ишемии, мин На,К-Атфазная активность Ингибирование активности, в '/. от контроля N8,К-Атфазная активность при дигоксине Ингибированне по сравнению с исходными значениями, X

Контроль 9,3 1 0,2 0 9,2 +0,3 0

15 7,8 ± 0,3* 17 6,3 ± 0,3* 20

30 5,8 + 0,8* 38 4,2 1 0,6* 27

45 4,5 + 0,5* 53 3,2 + 0,4* 28

Примечание:

* - отмечены достоверные изменения (Р < 0,05)

также не изменялись.

Описанные эффекты дигоксина на сократительную активность ПН сердца крысы не сопровождались статистически значимыми изменениями параметров внутриклеточных потенциалов. При этом было обнаружено достоверное почти на 20% ингибирование под влиянием дигоксина (5x10 Ш активности N8, К-АТФазы (табл.2).

Сократительная активность ПН сердца крысы после 30-ти минутной ишемии в 50 % экспериментов не восстанавливалась. В тех опытах, в которых была зарегистрирована сократительная активность, аггалитуда сокращений была 2 раза ниже, а порог возбуждения в 4 раза выше, чем у интактней кьещы.

Наблюдали также достоверное уменьшение (на 187.) длительности фазы расслабления на 50% уровне.

Параметры внутриклеточных потенциалов статистически значимо не изменялись.

После 30-ти минутного пребывания сердца крысы в условиях ишемии ГШ теряла способность реагировать изменением амплитуды установившихся сокращений на варьирование ритма стимуляции (рис.3, кривая 3).

Одновременно с описанными выше эффектами было обнаружено ингибирование активности сарколеммальной Иа, К-АТФазы сердца крысы на 38% (табл.2).

Как следует из рис. 3 (диаграмма 3), кардиостимулирующий эффект дигоксина на миокард крысы, подвергнутого 30-минутной ишемии, составлял 113+5,0% и достоверно не отличался от контроля; тоже самое относится к параметрам сократительного ответа. Время достижения максимума ПИЭ было таким же как и в ин-тактной мышце.

Следует отметить, что после 30-минутной ишемии, дигоксин

_7

(5x10 М) не вызывал статистически значимых изменений параметров внутриклеточных потенциалов ПМ.

Вместе с тем, 'было обнаружено ингибирование активности На, К-АТФазы миокарда крысы в указанных условиях на 27% (табл.2).

Ишемия продолжительностью 45 минут приводила к значительному повреждению миокарда крысы. После этого сроки ишемии развивалась стойкая контрактура миокарда.

Уровни N3, К-АТФазной активности сердца крысы после 45-ми-

нутной ишемии и под влиянием на этом фоне дигоксина (5x10 Ш представлены в табл.2.

Для получения дополнительной информации, необходимой для понимания механизма действия дигоксина на нормальный и ишеми-чески поврежденный миокард крысы были выполнены исследования с гипокалиевой средой, приводящей, как известно, к угнетение Na,K - АТФазной активности.

Было обнаружено, что снижение концентрации К+ в среде от 4,5 мМ до 0, 45 мМ приводило через 40-60 мин к возрастание потенциала покоя до 65+5,3 мВ (в контроле - 52,3+5 мВ) и увеличение амплитуды ПД до 76,8+4,5 мВ (в контроле - 65,7+4,2 мВ). При этом величина сокращений временно (20-30 мин) возрастала до 134+11,IX от исходной. Это сопровождалось увеличением максимальной скорости сокращения и расслабления, соответственно, до 126+10,4% и 123+11,5% от исходной.

Далее были выполнены эксперименты с ПН, выделенной из сердца, предварительно подвергнутого 30-мин нормотермической ишемии. Было установлено, что 10-ти кратное снижение концентрации ионов К в среде не вызывает достоверный ПИЭ. В то же время степень угнетения Na,К-АТФазы в гипокалиевой среде при всех сроках ишемического воздействия практически не отличалось от соответствующих значений в контроле.

Сопоставление данных, полученных в опытах с дигоксином и гипокалиевой средой, указывает на то, что в сердце крысы реализуется тот же механизм инотропного действия СГ, что и в миокарде морской свинки. Однако, в норме эффект дигоксина не проявлялся из-за превалирования (90 %), как известно, в сердечной мышце крысы низкоаффинной изоформы Na,К-АТФазы (Adams K.J. et al., 1982). После ишемии это соотношение явно изменяется в пользу высокоаффинной изоформы. Несмотря на отчетливое ингиби-рование фермента дигоксином и снижением ионов К в среде ПИЭ в миокарде крысы не наблюдался. Причина, видимо, как и в случае с миокардом морской свинки, связана с нарушением депонирующей функции CP под влиянием ишемии.

Таким образом, результаты диссертационной работы подтверждают широко принятую концепцию о клеточных механизмах действия СГ на миокард, согласно которой ПИЭ СГ обусловлен до-

полнительным поступлением ионов Са из внеклеточной среды по Иа-Са механизму в обмен на избыточные ионы Иа, накопившиеся в клетке в результате ингибирования N8, К-АТФазы сердечными гли-козидами. Исходя из этой гипотезы относительно высокий кардио-тонический эффект СГ на ПМ морской свинки в норме связан со значительным снихением N8,К-АТФазной активности. Напротив, относительно низкая чувствительность интактного миокарда крысы к СГ объясняется практически полным отсутствием чувствительности этого фермента к дигиталису. 1

Нормотермическая ишемия угнетает активность Ыа, К-АТФазы I

как в миокарде крысы, так и в миокарде морской свинки. Однов- [

ременно возникает парадоксальная чувствительность N8, К-АТФазы сердца крысы к дигоксину. В тоже время после продолжительной ишемии ни в миокарде крысы, ни в миокарде морской свинки, не- I

смотря на значительное угнетение Иа, К-АТФазы, ПИЭ не наблюдалось. Анализ изменения параметров сократительного ответа и РИО в миокарде испытуемых животных под влиянием ишемии, показал, что отсутствие ПИЭ в этих условиях связано с нарушением функции СР, а именно со снихением или полной утратой способности СР захватывать и высвобождать ионы Са после относительно продолжительной ишемии. В пользу такого заключения говорят дан- I ные, полученные в опытах с понижением концентрации ионов К в 1 среде. Сделан вывод, что угнетение Иа,К-АТФазы миокарда явля- / ется необходимым, но недостаточным условием проявления кардио-тонического эффекта СГ. Непременным условием должна быть нормальная функция СР. I В свете сказанного можно утверждать, что одной из причин I вариабельности ПИЭ СГ, обнаруженной в ПМ сердца больных с при- I обретенными пороками сердца является различная, в зависимости от тяжести патологического процесса, способность СР захваты- , вать и высвобождать ионы Са. Значительная пространственная гетерогенность на ПИЭ дигоксина в ушке предсердия сердца этого I контингента больных не связана с заболеванием, а является не- , отъемлемым свойством ушка предсердия. I

ВЫВОДЫ

1. Кардиотоническое действие дигоксина (5x10 М) на ПМ сердца морской свинки уменьшается по мере усугубления ишеми-ческого повреждения. При этом ингибирующее действие дигоксина на сарколеммальную На,К-АТФазу сохраняется.

2. Кардиотоническое действие дигоксина

(5x10"7 М) на ПМ

сердца крысы по мере усугубления ишемического повреждения не изменяется и не превышает величину положительного инотропного эффекта для интактного миокарда.

3. После выдерживания сердца крысы в условиях нормотерми-ческой ишемии На,К-АТФаза, не чувствительная к дигоксину в норме, ингибируется.

4. Десятикратное снижение концентрации ионов К во внеклеточной среде, приводит к положительному инотропному эффекту в ПМ крысы. После ишемического воздействия на миокард угнетение Иа, К-ЛТФазы в условиях гипокалиемии сохраняется, однако, положительный инотропный эффект отсутствует.

5. Нормотермическая ишемия приводит к снижение крутизны рптмоинотропных отношений в миокарде крысы и морской свинки. При этом внутриклеточные потенциалы в ПМ сердца крысы не изменяются. После относительно продолжительной ишемии (более 45 мин) в сердце морской свинки наблюдается уменьшение потенциала покоя, а также амплитуды и длительности потенциала действия.

6. Угнетение Иа, К-АТФазной активности миокарда является необходимым, но недостаточным условием проявления кардиотони-ческого действия дигоксина. Существенное значение для механизма положительного инотропного эффекта СГ имеет способность саркоплазматического ретикулума секвестрировать и освобождать ионы Са. Ишемия необратимо нарушает эту функцию саркоплазматического ретикулума, что и обуславливает утрату дигоксином кар-диотонического действия.

7. Положительные инотропные эффекты дигоксина, коргликона и строфантина К на ПМ сердца больных с приобретенными пороками сердца не имеют статистически достоверных различий. Однако, скорость развития кардиотонического эффекта строфантина К в среднем в 2 раза выше, чем у коргликона и дигоксина. В ПМ сердца больного, проявившей относительно высокую или низкую

чувствительность к одному из трех испытуемых СГ, наблюдается сходная по величине реакция и на два других препарата.

8. ГШ сердца больных с приобретенными пороками сердца обладают относительно высокой однородностью к положительному инотропному эффекту дигоксина. Пространственная гетерогенность к действию дигоксина является неотъемлемым свойством ушка предсердия и не связана с патологическими процессами.

9. Предложен способ поиска химических соединений, обладающих противоишемической активностью; способ индивидуализации применения СГ для кардиохирургических больных; способ тестирования кардиотропных соединений на миокарде больных с приобретенными пороками сердца.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ

1. Клеточный механизм зависимости кардиотонического действия дигоксина от степени ишемического повреждения миокарда // ] Хим-фарм. журнал. - 1989.- N6,- С.656-659 (соавт. Мукумов М. Р., Лазарев А. В., Ким Э. А., Даниленко М. П., Есырев 0. В.).

2. Влияние дигоксина на активность Иа, К-АТФазы, трансмем- | бранный потенциал и сократительную активность ишемически пов- ! режденного сердца крысы // Хим-фарм. журнал. - 1992.- N6.-С.12-1'5 (соавт. Даниленко М. П., Ким Э. А., Есырев 0. В., Мукумов

М. Р. ).

3. Влияние ишемии на сопряжение возбуждения и сокращения I в папиллярной мышце крысы // Патологическая физиология и экс- I пер. терапия. - 1984.- N5.- С.27-31 (соавт. Мукумов М. Р., Ляхович

Ю. С., Малина Н. В., Портной В. Ф. ).

4. Ионный механизм лестницы Вудворса // Биофизика.-1983.- Т. 28, N1. - С. 108-113 (соавт. Мукумов М. Р.. Сорокин ■ Л. В., Паутов В. А. ).

5. Исследование изменения ритмо-инотропной зависимости в | миокарде морской свинки под влиянием ишемии различной продолжительности // Патологическая физиология и экспериментальная , терапия.- 1985.- N1.- С. 19-23 (соавт. Мукумов М. Р. .Ляхович | Ю. С. .Портной В. Ф. ).

6. Исследование неоднородности патологически измененного ,

ушка предсердия человека и собаки по ритмоинотропной реакции // Патологическая физиология и экспериментальная терапия.-1988,- N6,- С. 34-36 (соавт. Мукумов М. Р., Истарова Л. Г., Ходо-рова А. Б. ).

7. Исследования ионного механизма феномена отрицательной лестницы в миокарде // 1 Всесоюзный биофизический съезд: Тез. докл.- М., 1982,- Т. 3. - С. 96 (соавт. Мукумов М. Р., Паутов

B. А., Пратусевич В. Р., Сорокин Л. В. ).

8. Исследование хроноинотропной реакции гипертрофированного миокарда с помощью математической модели электромеханического сопряжения // Биофизика,- 1991.- Т.36,N4.- С.676-680 (соавт. Мукумов М. Р., Белая М. Л., Пратусевич В. Р., Васильева Е. М., Смирнов И. Е. ).

9. Heterogeneity of human auricle chronoinotropic reaction: normal or pathology? // Constituent Congress INTERNATIONAL SOCIETY for PATHOPHYSIOLOGY: Тез. докл. - M., 1991.- P.81. (соавт. Mukumov H. R., Khodorova А.В.).

10. Force-frequency relations in hypertrophic heart muscle: a mathematical model for excitation-contration coupling // Gen.Physiol.Biophys.- 1992.- N11.- P.523-533 (соавт. Mukumov M.R., Belaya M.L., Pratusevich V.R.).

11. Экспериментальная модель для исследования ионного механизма противоишемического действия кардиоплегических растворов // Хирургическое лечение заболеваний сердца и сосудов: Тез. докл. IY Научной конференции молодых ученых и специалистов. - М., 1983,- С. 19-20 (соавт. Ляхович Ю. С., Малина Н. В. ).

12. Сопоставление необратимых изменений ритмо-инотропной зависимости и концентрации АТФ в миокарде крысы после нормо-термической ишемии различной продолжительности // Фармакологическая коррекция кислородзависимых патологических состояний: Тез. докл. I Всесоюзного симпозиума,- М., 1984.- С. 136 (соавт, Мукумо» М. Р., Ляхович С. С., Черкащенко Л. Н., Портной В. Ф. ).

13. Критерии оценки эффективности противоишемического действия фармакологических препаратов // Регуляция тканевого гомеостаза. Нетоксическая профилактика и терапия хронических патологий: Тез. докл. I Школы-семинара. - Кббулети, 1987. -

C. 83-85 (соавт. Ляхович Ю. С., Мукумов М. Р. ).

14. Исследование зависимости инотропного действия дигок-

сина на миокард от степени его ишемического повреждения // Регуляция тканевого гомеостаза. Нетоксическая профилактика и терапия хронических патологий: Тез.докл. I Школы-семинара.- Ко-булети, 1987,- С. 49-53 (соавт. Мукумов М. Р. ).

15. Скрининг кардиотропных веществ на полоске миокарда лягушки // Хим-фарм. журнал. - 1985.- N12.- С. 1440-1444 (соавт. Дмитриева Н. В., Штрасгейм Е. И., Китайгородская Г. М. и др. ).

16. Исследование влияния сердечных гликозидов на электромеханическое сопряжение в миокарде больных с приобретенными пороками сердца // Актуальные вопросы хирургии: Тез.докл. У1 Объединенной конференции молодых ученых и специалистов. - Тбилиси, 1985. - С. 98 (соавт. Истарова Л. Г., Баум П. Б.).

17. Способ определения индивидуальной чувствительности к кардиотропному препарату: Авторское свидетельство N 1301414, 1986 (соавт. Мукумов М. Р., Истарова Л. Г., Авруцкий М. Я. ).

18. Способ определения кардиотонической активности соединений: Авторское свидетельство N 1320744, 1987 (соавт. Мукумов М. Р., Истарова Л. Г., Баум П. Б. ).

19. Способ оценки противоишемического действия биологически активных веществ: Авторское свидетельство N 1309955, 1987 (соавт. Мукумов М. Р., Ляхович Ю. С., Годин Е. А., Портной В. Ф. ).

Соискатель

С. А. Исаева