Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Особенности канцерогенеза и старения у самок мышей с выключенным геном поли(АДФ-рибоза) полимеразы-1

На правах рукописи

ПИСКУНОВА Татьяна Сергеевна

ОСОБЕННОСТИ КАНЦЕРОГЕНЕЗА И СТАРЕНИЯ У САМОК МЫШЕЙ С ВЫКЛЮЧЕННЫМ ГЕНОМ ПОЛ И(ДД Ф-РИБ ОЗ А) ПОЛИМЕРЛЗЫ-1

14 00 14 - онкология

14 00 53 - геронтология и гериатрия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2008

003446841

Работа выполнена в ФГУ «НИИ онкологии им Н.Н Петрова Росмедтехнологий»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Анксимов Владимир Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Беспалов Владимир Григорьевич

доктор биологических наук, профессор Арутюнян Александр Вартанович

Ведущее научное учреждение: Институт цитологии РАН

Защита диссертации состоится «__»_2008 г. в «_» часов на

заседании диссертационного совета Д 208.052 01 при ФГУ «НИИ онкологии им. Н Н Петрова Росмедтехнологий» по адресу. 197758, Санкт-Петербург, п Песочный-2, ул. Ленинградская д 68

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «НИИ онкологии им. НН Петрова Росмедтехнологий» (197758, Санкт-Петербург, п Песочный-2, ул. Ленинградская д.68) и на сайте (www.niioncologii.ru)

Автореферат разослан «_»_2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Р.В Орлова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В механизмах старения и ассоциированных с ним заболеваний, включая рак, важную роль играет возрастное накопление генетических нарушений, обусловленных эндогенными, в том числе наследственными факторами, и действием экзо- и эндогенных повреждающих ДНК агентов (Vijg J , 2000, 2004, Burkle A et al, 2004, Анисимов В H , 2003; Хавинсон В X и др, 2003). Нарушение систем репарации ДНК и геномная нестабильность могут способствовать многостадийному канцерогенезу, особенно на ранних стадиях (Masutam M et al, 2003, Имянитов E H , Хансон К П, 2007) Поэтому большое значение придается возрастным изменениям эффективности систем репарации ДНК, защищающих геном клетки от подобных воздействий (Butler RN et al, 2003).

Одним из важных участников системы репарации ДНК является поли(АДФ-рибоза) полимераза (PARP) - семейство ферментов, восстанавливающих структуру ДНК в местах одно- или двуцепочечнцх разрывов, вызываемых алкилирующими агентами, ионизирующей радиацией или оксидативным стрессом (Tong W -M et al, 2001, Wang M et al, 2006) Наиболее изучена поли(АДФ-рибоза) полимераза-1 (PARP-1) В ряде работ показана роль этого фермента во многих клеточных процессах, включая репликацию ДНК, репарацию, рекомбинацию, генную транскрипцию, клеточную пролиферацию и гибель (Herceg Z, Wang Z-Q , 2001, D'Amours D et al, 1999, Beneke S., Bürkle A, 2007) Выявлена прямая корреляция между продолжительностью жизни разных видов млекопитающих и способностью их клеток к поли(АДФ-рибоз)илированию (Grube К, Burkle А , 1992, Beneke A et al, 2000)

Для изучения функции PARP-1 применяют экспериментальные модели in vitro и in vivo, где ингибируется активность PARP-1 или нокаутируется ген PARP-1 В качестве ингибиторов PARP-1 используют бензамид, 3-аминобензамид, никотинамид и другие соединения (Woon Е С, Threadgill MD, 2005) Созданы линии мышей, нокаутных по гену PARP-1, в которых инактивация гена производилась по 1-му, 2-му или 4-му экзону (Wang Z-Q et al, 1995, de Murcia J M et al, 1997; Masutam M et al, 1999; Tong W.-M. et al, 2000)

В опытах in vitro снижение активности PARP (путем добавления к культурам клеток лабораторных грызунов ингибиторов PARP или использования культур клеток нокаутных мышей PARP-l7) вызывало геномную нестабильность (анеуплоидию, генную амплификацию и делецию, увеличение частоты сестринских хроматидных обменов) (Simbulan-Rosenthal CM et al, 2000, Masutam M. et al, 2003, Wang Z-Q. et al, 1997) и увеличивало чувствительность клеток к действию мутагенов (Meyer R et al., 2000)

В экспериментах in vivo влияние ингибиторов PARP на продолжительность жизни и спонтанный канцерогенез не изучалось В ряде работ отмечено, что подавление PARP может стимулировать химический и радиационный канцерогенез у лабораторных грызунов (Epstein J Н, Cleaver J Е , 1992, Tsutsumi М et al, 2001, Nozaki T et al, 2003)

У нокаутных по гену PARP-1 мышей детальное изучение особенностей спонтанного канцерогенеза ранее не проводилось Лишь в одной работе у нокаутных мышей линии 129/Sv, дефектных по 2-му экзону гена PARP-1 была выявлена более высокая частота спонтанных опухолей в возрасте 12-24 месяцев, по сравнению с потомством мышей дикого типа PARP-1+/+ (Tong W-M et al, 2001) Однако авторы не представили данных о сроках обнаружения, частоте, локализации и множественности новообразований различного гистологического строения

Сведения об индукции опухолей у мышей PARP-l7" немногочисленны и противоречивы Так, в опытах с канцерогенами Ы-нитрозобис(2-гидроксипропил)амином и азоксиметаном частота и множественность опухолей у нокаутных животных была выше, чем у мышей дикого типа (Tsutsumi М, 2001, Nozakj Т et al, 2003), тогда как в экспериментах на нокаутных мышах с 4-нитрохинолин 1-оксидом и 2-амино-З-метилимидазо [4,5-f] хинолином не отмечено влияния выключения гена PARP-1 на канцерогенез, вызванный этими соединениями (Gunji А et al, 2006, Ogawa К et al, 2006) Чувствительность нокаутных мышей ко многим широко распространенным канцерогенам окружающей среды, в частности, к диэтилнитрозамину (ДЭНА), не изучалась

С учетом представленных выше данных о наличии корреляции между поли(АДФ-рибоз)илированием и продолжительностью жизни млекопитающих, актуальными представляются исследования динамики гибели и скорости популяционного старения у нокаутных мышей PARP-Г'" Однако, подобные сведения в литературе отсутствуют Для изучения особенностей старения у животных в качестве биомаркеров используются такие показатели, как возрастная динамика веса тела, потребления корма и воды, температуры тела, эстральной функции, биохимических показателей крови и т д (Anisimov VN et al, 2007) Эти параметры у нокаутных мышей PARP-l7" также не изучались Исследования особенностей канцерогенеза и старения у мышей PARP-1"'" позволят расширить представления о роли системы репарации ДНК в этих процессах

Цель исследования

Целью диссертационного исследования является изучение особенностей канцерогенеза и старения у самок мышей с выключенным геном лоли(АДФ-рибоза) полимеразы-1

Задачи исследования

В сравнительных экспериментах на нокаутных мышах-самках РАЯР-1"/' и мышах-самках дикого типа РАШМ+/+ изучить.

1 Показатели гомеостаза и биологического возраста (масса тела, потребление корма и воды, температура тела, астральная функция, биохимические показатели сыворотки крови)

2 Параметры продолжительности жизни и скорости популяционного старения

3 Особенности спонтанного канцерогенеза

4 Чувствительность мышей к канцерогенному действию ДЭНА

Научная новизна

Исследована возрастная динамика биомаркеров старения (масса тела, потребление корма и воды, температура тела, эстральная функция, биохимические показатели сыворотки крови) у нокаутных мышей РАКР-Г', по сравнению с животными дикого типа, изучены параметры продолжительности жизни у мышей РАКР-1'а; детально исследованы особенности спонтанного канцерогенеза у нокаутных мышей РАШМ"Л; изучен канцерогенез у нокаутных мышей РАЯР-1 А, вызванный ДЭНА

Практическая значимость работы

Впервые выявленные в работе особенности канцерогенеза (более раннее развитие спонтанных опухолей и их большая злокачественность) и старения (уменьшение продолжительности жизни, увеличение скорости старения, более выраженные возрастные изменения массы тела, нарушения эстральной функции и метаболического гомеостаза) у нокаутных мышей свидетельствуют о важной роли поли(АДФ-рибоза) полимеразы-1 в механизмах канцерогенеза и старения. Полученные данные могут быть использованы для обоснования формирования групп риска преждевременного старения и развития рака среди лиц со снижением активности фермента поли(АДФ-рибоза) полимеразы-1.

Положения, выносимые на защиту

1. У нокаутных мышей РАКР-1выявлены более ранние и более выраженные возрастные изменения ряда биомаркеров гомеостаза и старения, таких как масса тела, эстральная функция, метаболические показатели сыворотки крови. 2 У нокаутных мышей РАЯР-Г'" отмечено уменьшение продолжительности жизни и увеличение скорости популяционного старения

3 У нокаутных мышей PARP- Г7", по сравнению с мышами дикого типа PARP-1+/+, выявлена стимуляция спонтанного канцерогенеза, выражающаяся в сокращении латентного периода обнаружения новообразований, увеличении относительной частоты злокачественных опухолей и более агрессивном характере роста злокачественных опухолей, приводящих к смерти животных

4 При канцерогенезе, вызванном ДЭНА, у нокаутных мышей и контрольных животных не было выявлено различий в частоте опухолей и среднем латентном периоде их обнаружения, однако микроскопически отмечен более агрессивный характер новообразований преджелудка и печени у мышей PARP-Г-'

5 Полученные данные в совокупности свидетельствуют о том, что дефицит поли(АДФ-рибоза) полимеразы-1 приводит к ускорению старения, укорочению продолжительности жизни и повышению чувствительности мышей к возникновению спонтанных и индуцированных новообразований, что подтверждает представления о важной роли репарации ДНК в механизмах старения и канцерогенеза

Апробация диссертации

Основные результаты работы были представлены на отечественных и международных научных форумах VI научно-практической конференции с международным участием «Санкт-Петербургские научные чтения» (Санкт-Петербург, 2004), Региональной научно-практической конференции СевероЗападного федерального округа «Геронтология от кардиологии к социально-экономическим аспектам» (Сыктывкар, 2005), Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» (Санкт-Петербург, 2005), Российской конференции по фундаментальной онкологии (Санкт-Петербург,

2005), XII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2005), XVIII Всемирном конгрессе Международной ассоциации геронтологии и гериатрии (МАГГ) (Рио-де-Жанейро, 2005); IX Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2006), Всероссийской конференции «Перспективы фундаментальной геронтологии» (Санкт-Петербург, 2006), Научной конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы геронтологии» (Киев,

2006), Научной конференции молодых ученых с международным участием «Биологические основы развития старческой патологии» (Киев, 2007), VI Европейском конгрессе МАГГ (Санкт-Петербург, 2007), Втором Санкт-Петербургском международном экологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008) Основные результаты и положения диссертационного исследования полностью отражены в публикациях

Публикации

По теме диссертации опубликовано 15 научных работ Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 158 страницах, иллюстрирована 59 рисунками и 16 таблицами Работа состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов исследования (глава 2), изложения результатов собственных исследований (глава 3), их обсуждения (глава 4), выводов и библиографического указателя, включающего 260 источников, в том числе 14 отечественных и 246 зарубежных

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования Животные. В экспериментах использованы подопытные мыши линии 129/8у, нокаутные по гену РАШМ в результате разрыва 2-го экзона в этом гене (Топд \У -М & а1, 2001), а в качестве контроля - мыши «дикого типа» РАШМ+/+. Животные, первоначально поступившие из МАИР (Лион, " Франция), поддерживались в виде разводки в отделе канцерогенеза и онкогеронтологии НИИ онкологии им Н Н. Петрова

Животных содержали по 6-10 особей в полипропиленовых клетках размером 35x22,5x10 см при стандартном режиме освещения (12 часов -свет, 12 часов - темнота) и температуре 22 ± 2°С Они получали стандартный гранулированный корм для животных, а также водопроводную воду без ограничений Во время разводки мышей изучали фертильность самок в возрасте от 3 мес до 8 мес

Схема экспериментов. В соответствии с задачами исследования было проведено 2 серии экспериментов на 127 нокаутных мышах РА11Р-1и 157 мышах «дикого типа» РАЛР-1+/+

В первой серии в основном эксперименте у 73 подопытных мышей-самок и 103 контрольных животных, прослеженных до конца жизни, исследовали биомаркеры гомеостаза и старения (массу тела, поглощение корма и воды, половое созревание, репродуктивную функцию, температуру тела), динамику гибели животных, продолжительность жизни и различные параметры канцерогенеза В дополнительных исследованиях нокаутных мышей и животных «дикого типа» убивали в разном возрасте для изучения связи РАЕ1Р-1 с метаболическим гомеостазом и генетическими перестройками При этом оценивали биохимические показатели сыворотки крови у 40 самок мышей (по 10 подопытных и 10 контрольных животных 4-и 20-мес возраста) и 60 самцов (по 10 нокаутных и 10 мышей «дикого типа», в возрасте 3-7 мес, 8-13 мес. и 16-23 мес) Изучали также хромосомные аберрации у 8 самцов (4 нокаутных мышей и 4 животных «дикого типа») в возрасте 18 мес.

Во второй серии экспериментов сравнивали чувствительность подопытных и контрольных мышей к канцерогенному действию ДЭНА 16 самкам мышей PARP-l ' и 37 самкам PARP-1f/+, начиная с 2 мес возраста, на протяжении всей жизни вводили с питьевой водой ДЭНА, синтезированный в лаборатории органического синтеза НИИ онкологии им НН Петрова, в концентрации 0,01 мг/мл По данным ИН Швембергер (1965), такая доза канцерогена достаточна для индукции опухолей у значительной части животных Свежеприготовленный раствор разливали в поилки из темного стекла, раствор препарата меняли раз в неделю На протяжении опыта изучали динамику гибели животных и различные показатели канцерогенеза

Методика исследований. Ежемесячно взвешивание животных проводили на электронных весах В каждой группе находили среднее значение массы тела животных и ошибки среднего Один раз в месяц, одновременно с взвешиванием мышей, производили определение суточного количества потребляемого корма из расчета массы съеденного корма в граммах на одну мышь Также изучали количество выпитой воды и рассчитывали объем выпитой жидкости в миллилитрах на одну мышь в сутки

Время полового созревания мышей оценивали по сроку открытия влагалища Один раз в три месяца у животных, начиная с возраста 2-3 месяцев, в течение 2 недель ежедневно цитологически исследовали содержимое влагалищных мазков Определяли следующие параметры эстральной функции длительность эстрального цикла, соотношение фаз эстрального цикла, рассчитывалось относительное число коротких (менее 5 дней) и длинных (более 7 дней) эстральных циклов, относительное число животных с регулярными и иррегулярными циклами

Измерение температуры тела производили с помощью медицинского электротермометра (ТПЭМ-1), вводимого в прямую кишку мышей Регистрация температуры проводилась 1 раз в 3 месяца Поскольку температура тела может зависеть от фазы эстрального цикла, параллельно производилась оценка эстрального цикла с помощью влагалищных мазков

В дополнительных экспериментах при биохимическом исследовании сыворотки крови у самок изучались концентрации общего белка, альбумина, глюкозы, холестерина, триглицеридов, мочевины, креатинина, мочевой кислоты, кальция, аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, лактатдегидрогеназы, гамма-глутамилтрансферазы, альфа-амилазы, щелочной фосфатазы Исследование проводили с помощью анализаторов Flexor Vitalab (Vital Scientific, Нидерланды) и Копе 20 (Thermo Electron, Labsystems, Финляндия) В сыворотке крови у самцов определяли уровень инсулина - иммуноферментным методом (ELISA), с помощью наборов фирмы Diagnostic Systems Lab Inc, США, уровни тироксина (Т4) и трийодтиронина (ТЗ) - радиоиммунолошческим методом RIA (I125), с помощью наборов фирмы Immunotech, Чехия, содержание холестерина -

энзимоколориметрнческим методом, с помощью наборов фирмы «Ольвекс», Санкт-Петербург

При цигогенетическом анализе частоты хромосомных перестроек в клетках костного мозга и спсрматоцитах L типа у самцов фиксацию и обработку материала проводили по модифицированной методике Форда (Ford С Е , Hamerton I L , 1956)

В процессе наблюдения за животными на протяжении всей их жизни регистрировали сроки обнаружения опухочеи и выживаемость

Продолжительность жизни оценивалась по следующим параметрам средняя продолжительность жизни всех и последних 10% долгоживущих животных, максимальная продолжительность жизни, медиана При расчете кинетических параметров цопуляционного старения использовали модель Гомперца для функции выживания

Параметры ß и а интерпретировались как начальный риск смерти и скорость популяционного старения Время удвоения смертности (MRDT) рассчитывали, как log(2)/a Для анализа выживаемости использовали также регрессионную модель Кокса (Сох D R, Oakes D, 1996)

Всех павших или забитых в состоянии крайней слабости мышей вскрывали На аутопсии осматривали кожу, молочные железы и все внутренние органы Выявленные новообразования классифицировали согласно рекомендациям Международного агентства по изучению рака (МАИР) как "фатальные" (то есть, послужившие непосредственной причиной гибели животных) или как «случайные» (в случаях, когда жипотпое погибло от других причин) (Gart J J et al, 1986)

Все опухоли у мышей, а также другие паюлогические изменения и основные внутренние органы, подозрительные на наличие опухолевого роста, вырезали и фиксировали в 10% нейтральном формалине После обычной гистологической обработки ткани заливали в парафин Гистологические срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилин-эозином и изучали микроскопически Использовали гистологическую классификацию опухолей, предложенную МАИР (Turusov V S., Mohr U, 1994) Определяли следующие показатели канцерог енеза сроки обнаружения первой опухоли, средний латентный период развития новообразований, общую частоту и множественность опухолей, развитие опухолей различных гистологических типов

При статистической обработке результатов опытов использовали чеюды вариационной статистики с использованием пакетов статистических программ STATGRAPH, STATISTICA (5 5) и STADIA Достоверность различий оценивали по критериям t Стыодента, /2, Вилкоксона-Манна-Уитни, точному методу Фишера и непараметрическому критерию Фридмана дчя ANOVA (Гублер ЕВ, 1978) Различия по частоте опухолей оценивали, используя лог-раик тест Ментеля-Хензеля Оценка параметров модели

Гомперца проводилась методом максимального правдоподобия с использованием нелинейной оптимизационной процедуры (Fîetcher R., 1987),

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Старение, продолжительность жизни и спонтанные опухоли у мышей-самок PARP-1 и РАНР-Г/+ 1.1. Показатели гомеостаза и старения В наших экспериментах в поздние сроки опыта, в возрасте 21- и 22 мес. у мышей PARP-Г'" выявлено более интенсивное увеличение массы тела (р<0,05), а при аутопсии в 2 раза чаще отмечалось ожирение, по сравнению с животными PARP-Г' . Это согласуется с данными Z.-Q. Wang и соавт. (1995), отметивших ожирение у нокаутных мышей уже после 15 месяцев, по сравнению с животными дикого типа. Обнаруженное увеличение массы тела в поздние сроки жизни у нокаутных мышей, скорее всего, обусловлено более выраженными возрастными нарушениями гомеостаза. При этом мы не отметили существенных различий между группами по потреблению корма и воды.

При исследовании температуры тела у мышей обеих групп было выявлено снижение данного показателя с возрастом (рис. 1).

39

2 5 8 11 14 17 20

Возраст, мес.

Рис. 1. Температура тела у мышей PARP-1"'" и PARP-1 +'+ разного возраста Различия с мышами PARP-i+/+ статистически достоверны: * - р<0,05; ** - р<0,01.

У мышей PARP-Г", по сравнению с животными PARP-1+/+, была выявлена тенденция, носившая статистически достоверный характер в отдельные сроки эксперимента (5, 8, 20. мес.), к увеличению температуры тела, что может указывать на ускорение метаболических процессов и подавление аутоиммунного ответа у подопытных животных (Sohnie P.G., Gambert S.R., 1982; Walford R.L., 1974; McClearn O.E., 1997).

При изучении репродуктивной функции было обнаружено несколько более раннее половое созревание у мышей PARP-Г", по сравнению с животными PARP-I + + (средний возраст открытия влагалища 24±0,2 суток и 25±0,3 суток, соответственно, р<0,05).

Сравнительное изучение фертильности у самок обеих групп (82 помета мышей РАКР-1Д и 80 пометов мышей РАЯР-1,/+) показало статистически достоверное уменьшение среднего количества мышей п помете у нокаушых животных, по сравнению с мышами дикого типа (3,5±0,16 и 4,7±0,21, соответственно, р<0,001) Аналогичные данные продемонстрированы в работах I Меш551ег-с1е \fursia и соавт (1997) и М ЬеЬе1 и соавт (2003) Уменьшение количества мышей в помете подопытных животных, возможно, связано с переходом в гомозиготное состояние летальных мутаций, обусловленных нестабичьностыо 1енома и хромосомными нарушениями, приводящих к гибели мышей в эмбриональном периоде С этим предположением согласуется обнаруженное нами в дополни 1ельных экспериментах снижение частоты хромосомных перестроек в спсрмагоцитах I порядка у мышей-самцов РА11Р-1 по сравнению с животными РАЯР-1Ч/+ (14,7% и 16,9%, соответственно, р<0,001)

При исследовании возрастной динамики продолжительности и регулярности эстрального цикла, установлено, что а 1руппе РАЯР-Г'" в возрасте 17 мес происходит увеличение продоллштсльности эстрального цикла, и в возрасте 20 мое - увеличение частоты иррегулярных циклов, по сравнению с группой РАШМ+/+ (табл 1), что характерно для старения и, скорее всего, связано с более выраженным возрастным нарушением эндокринного баланса у нокаугных животных

Таблица 1

Возрастная динамика эстральной функции у мышей РАКР-Г'" и РАКР-1+/+

Возраст, мес Длительность ЭЦ" Соотношение коротких и длинных ЭЦ (%) Количесию мышей с иррегулярными циклами(%)

<5 дней | 5-7 дней | >7дней

РАКР-1+"

2 6,7 ± 0,34 14 52 34 18

5 5,6 ± 0,50 41 36 23 22

8 6,1 ±0,42 33 42 25 35

14 7,3 ± 1,03 20 50 30 50

17 7,4 3: 0,41 13 45 42 23

20 6,1 ±0,35 19 65 16 30

РЛКРГ

2 7,4 ±0,49 5 59 36 13

5 6,6 ± 0,45 23 50 27 17

8 6,6 ± 0,56 32 36 32 27

14 7,9 ± 0,86 27 18 55 44

17 8,7 ± 0,50* 17 28 55 11

20 5,7 ± 0,56 14 72 14 72**

Примечание " - ЭЦ - астральный цикл

Различия с мышами РАНР-1+/+ статистически достоверны * - р<0,05, ** - р<0,001

Таким образом, у мышей РАКР-Г'" по сравнению с животными РАИМ+/+ снижена фертильность, ускорено половое созревание, более выражены возрастные изменения эстралыюй функции

При исследовании биохимических показателей сыворотки крови было установлено, что у нокаутных мышей, по сравнению с животными дикого типа, снижен уровень общего белка (снижение с 45 до 42 г/л в 4 мес и с 48 до 45 г/л в 20 мес , соответственно, р<0,01), частично, за счет уменьшения уровня альбумина (с 22 до 19 г/л и с 22 до 21 г/л, соответственно, р<0,05) Гипокальциемия, выявленная в подопытной группе (в 4 мес возрасте - 1,87 ммоль/л в контроле и 1,43 ммоль/л в подопытной группе, р<0,01, в 20 мес - 2,09 ммоль/л и 1,98 ммоль/л, соответственно, р<0,05) была обусловлена, скорее всего, снижением уровня белковосвязанной фракции общего кальция С нарушением белкового обмена, по-видимому, связаны изменения пуринового обмена, отразившиеся в снижении содержания мочевой кислоты у старых нокаутных мышей, по сравнению с животными дикого типа (66,3 и 133,9 мкмоль/л, соответственно, р<0,001) У молодых подопытных мышеи была ниже, чем в контроле, активность альфа-амилазы (на 64%, р<0,002) и лактатдегидрогеназы (на 31%, р<0,05), отмечена также тенденция к уменьшению активности других ферментов, что подтверждает предположение о снижении общего уровня обменных процессов у нокаутных мышей У старых нокаутных мышей-самок, по сравнению с контрольными животными, обнаружена тенденция к увеличению уровня глюкозы (с 6,89±1,33 до 8,31±1,57 ммоль/л), и уровня триглицеридов (с 0,88±0,08 до 1,00±0,29 ммоль/л, соответственно), а у подопытных самцов РАШМ"' уровень холестерина был статистически достоверно выше, чем у контрольных животных РА11Р-1+/+ (4,2±0,1 против 3,3±0,2 ммоль/л, р<0,001) Что касается исследуемых гормонов у самцов, то однозначных возрастных различий между группами выявлено не было

В целом, на основании исследования биохимических показателей сыворотки крови можно сделать вывод о более выраженных возрастных нарушениях метаболизма у мышей РАЯР-Г7, характерных для ускоренного старения (Анисимов В Н , 2003)

1.2. Выживаемость и продолжительность жизни мышей

При наблюдении за животными обеих групп была выявлена более ранняя гибель нокаутных мышей по сравнению с мышами дикого типа, о чем свидетельствовало смещение влево кривой выживаемости у мышей Р А11Р-1 (рис 2)

Рис. 2. Выживаемость мышей-самок PARP-Г" и PARP-Г" По оси абсцисс - продолжительность жизни, сутки; по оси ординат - количество выживших мышей, %.

Таблица 2.

Сведения о продолжительности жизни и развитии спонтанных опухолей у самок мышей PARP-1 Л и PARP-Г "

Показатели PARP-1+/+ PARP-1"'"

Число мышей 103 73

СПЖ*, сутки (М±8.Е.М.) 678 ± 14,2 588 ± 14,4**

Медиана, сутки 686 597

СПЖ последних 10% выживших, сутки 919 ±11,6 778 ± 14,3**

МПЖ**, сутки 983 822

ах 10 1 (сутки"') 7,71 (7,60; 7,82) 9,32* (9,26; 9,56)

МРБТ, сутки 89,88 (88,6; 91,22) 74,36* (72,53; 74,89)

Число мышей-опухоленосителей (%) 79 (77%) 53 (73%)

Число мышей со злока-чссл венными опухолями (%) 48 (47%) 49 (67%)*

СПЖ мышей-опухоленосителей, сутки 706 ± 17,6 612 ± 19,2**

Общее количество опухолей 119 81

- из них злокачественных (%) 59 (50%) 59 (73%)**

Примечания:

" - СПЖ - средняя продолжительность жизни; ''" - МПЖ - Максимальная продолжительность жизни; а - скорость популяционного старения;

МИЭТ - время удвоения смертности (в скобках - 95% доверительный интервал) Различие с РАЯР-1т/+ статистически достоверно: * р < 0,05; ** - р<0,001.

Средняя продолжительность жизни (СПЖ) нокаутных мышей была на 13% меньше (р<0,001) (табл 2), СПЖ последних 10% животных - на 15%, а максимальная продолжительность жизни - на 16% меньше, чем у животных дикого типа При этом, скорость популяционного старения а у нокаутных животных была больше на 17% (р<0,05), а показатель времени удвоения смертности - меньше, чем в контроле (р<0,05)

1.3 Особенности спонтанного канцерогенеза у мышей PARP-1"'" и

PARP-1

Опухоли были обнаружены у 53 из 73 нокаутных мышей (73%) и у 79 из 103 контрольных животных (77%) (табл ?) У нокаутных мышей PARP-1"'" сравнительно чаще возникали злокачественные новообразования, чем у мышей PARP-l+/+ Всего у мышей PARP-1+/+ выявлено 119 случаев, а у нокаутных мышей-самок PARP-1"'" - 81 случай опухолей различного гистологического типа, среди которых злокачественные новообразования в подопытной группе составили 73%, в контроле - 50%

У нокаутных мышей первые новообразования обнаруживали раньше, чем у животных дикого типа (208 и 350 сут, соответственно), средняя продолжительность жизни мышей-опухоленосителей была короче на 13% (612±19,2 против 706±17,6 сут, соответственно, р<0,001)

У мышеи обеих групп, в основном, развивались опухоли матки, яичников, легких, печени и кроветворной системы (табл 3) Среди прочих опухолей выявили новообразования молочной железы, подкожной клетчатки, кожи и толстой кишки В целом, спектр новообразований у изученной нами линии мышей 129/Sv дикого типа соответствовал описанному в литературе (Ward J М , et al, 2000)

Что касается отдельных видов злокачественных новообразований, то у нокаутных мышей отмечена тенденция к повышению частоты аденокарциноМ легкого, гепатоцеллюлярных карцином и злокачественных лимфом Средний латентный период развития гепатоцеллюлярных карцином и злокачественных лимфом у мышей PARP-1"'" был статистически достоверно короче, чем в контроле

При анализе морфологического спектра опухолей рассчитывали долю разных гистологических типов новообразований в каждом органе по отношению к числу мышей с опухолями этого органа

В обеих группах животных превалировали опухоли матки Эти новообразования статистически достоверно чаще встречались у мышей дикого типа (63,7% — в контроле и 50,7% - в подопытной группе) В то же время, среди опухолей этого органа у нокаутных мышей, по сравнению с животными дикого типа, несколько чаще встречались злокачественные новообразования саркомы (75,7% и 53,8%, р=0,02) и аденокарциномы (13,5% и 10,8%) Соответственно, у мышей PARP-l'" было меньше доброкачественных опухолей матки (8,1% против 41,5%, р<0,001), которые были представлены гемангиомами (2,7% и 29,2%, соответственно, р<0,001) и полипами (5,4% и 12,3%)

Таблица 3

Сведения о развитии опухолей различного гистологического типа у мышей РАЯР-^и РАЯР-Г/+

Локализация и гистологический тип опухолей РАЯР-Г'+(п=103) РА1*Р-1'/" (п=79)

Количеств о мышей с опухолями (%) Средний латентный периода Количеств о мышей с опухолями (%) Средний латентный период1

Матка Саркома Гемангиома Гемангиоэндотелиома Аденокарцинома Полип 35 (34%) 713 ±21,0 28 (38%) 659 ± 22,9

19(19%) 761 ±29,9 1(1%)*** 679

3 (3%) 635 2 (3%) 664

7 (7%) 799 ± 41,2 5 (7%) 709 ± 33,5

8 (8%) 718 ±65,6 2 (3%) 601

Яичники Гранулезо-текаклеточная опухоль Гемангиома Цистаденома Аденокарцинома 12(12%) 692 ± 52,0 1 (1%) ** 734

5 (5%) 798±71,8 6 (8%) 668 ±55,1

2 (2%) 878±43,8 1 (1%) 534

1 (1%) 961 - -

Легкие Аденокарцинома Аденома 4 (4%) 596 ± 54,8 7(10%) 480 ± 26,9

8 (8%) 702 ± 72,5 4 (6%) 749 ± 12,7

Печень Гемангиома Гемангиоэндотелиома Гепатоцеллюлярная карцинома 3 (3%) 923 ± 53,8 2 (3%) 628

- 2 (3%) 630 ±35,6

3 (3%) 810 ±20,6 6 (8%) 664 ±21,4 ***

Злокачественная лимфома 5 (5%) 711 ±37,1 7(10%) 538±65,5*

Молочная железа Аденокарцинома 3 (3%) 748± 163,4 3 (4%) 462 ± 36,3

Прочие опухоли 1 (1%) 788 4 (6%) 445 ± 45,4

а- средний возраст животных при обнаружении опухолей, сутки

Различие с контролем статистически достоверно *-р<0,05, ** — р<0,01, *** — р<0,001

Следующую по частоте группу опухолей составили новообразования яичников, в основном, гранулезо-текаклеточные опухоли и гемангиомы Выраженных различий в относительной частоте данных видов новообразований между группами не отмечено

При изучении соотношения различных гистологических типов новообразований легких было обнаружено, что у мышей РАЯР-Г'", по сравнению с животными РАЛР-1+/+, почти в 2 раза чаще (63,6% и 33,3%) возникали злокачественные опухоли (аденокарциномы) и, соответственно, реже - доброкачественные опухоли (аденомы)

Суммарная частота опухолей печени у нокаутных животных была выше, чем в контрольной группе (13,7% и 4,9%, соответственно, р<0,05) В печени у нокаутных мышей было идентифицировано два типа злокачественных новообразований (гепатоцеллюлярные карциномы - у 60%

и гемангиозндотелиомы - у 20%), а в контроле - один (гепатоцеллюлярные карциномы - у 60%). Следует отметить, что относительная частота доброкачественных опухолей печени (гемангиом) в контрольной группе была в 3 раза больше, по сравнению с подопытными животными (60% и 20%, соответственно).

Что касается прочих опухолей, то, помимо злокачественных лимфом и аденокарцином молочной железы, у животных обнаружены единичные новообразования: в контроле - ангиосаркома подкожной клетчатки; в подопытной группе - ангиосаркома и гемангиоэндотелиома подкожной клетчатки, а также по одному случаю базальноклеточной карциномы и аденокарциномы толстой кишки.

При анализе причин гибели иокаутных животных и мышей дикого типа отмечено, что фатальные злокачественные опухоли у мышей РАЯР-Г" развивались раньше и чаще (67,1% и 46,6%, р<0,01), чем в контроле (рис. 3).

-в— РЛК1М+/+ О - ¡'Л«.!'-!-'-

Рис. 3. Динамика гибели мышей PARP-l"'" и PARP-l' от злокачественных _ опухолей. По оси абсцисс - продолжительность жизни, сутки; по оси ординат -количество павших мышей, %.

В целом, полученные данные свидетельствуют о большей предрасположенности нокаутных животных PARP-l"'" к развитию агрессивных злокачественных спонтанных опухолей.

2. Чувствительность мышей к канцерогенному действию ДЭНА

При хроническом воздействии ДЭНА опухоли развились у 88% нокаутных мышей и у 95% животных дикого типа, средний латентный период их развития составил, соответственно, 253±3,1 и 248±4,1 суток. Были выявлены, в основном, опухоли преджелудка и новообразования печени (табл. 4). Полученные данные сопоставимы с результатами работы И.Н. Швембергер (1965), которая при введении мышам линии СЗНА ДЭНА с питьевой водой в течение 30 недель в концентрации 0,01 мг/мл отмечала возникновение у 78% (14/18) животных плоскоклеточного ороговевающего

рака пищевода или желудка У мышей возникали также опухоли печени, которые автор описывала как печеночноклеточные аденомы и аденокистомы (Швембергер И Н 1965) В наших опытах у животных, кроме того, отмечали опухоли легких и яичников, не обнаруженные у мышей линии СЗНА.

Таблица 4

Частота, локализация и сроки обнаружения опухолей у мышей РАИМ^'и РАЯР+/+ при воздействии ДЭНА

Число мышей с опухолями рамичнои локализации PARP-l+'+, п=37 PARP-1"'*, п=15

Количество мышей с опухолями (%) Средний латентный период, сутки Количество мышей с опухолями (%) Средний латентный период, сутки

Преджелудок 31(84%) 249 ±4,4 13 (87%) 256 ± 5,2

Печень 25 (66%) 256 ±5,0 12 (80%) 254 ± 5,7

Легкие 6(16%) 253 ±9,1 1 (7%) 274

Яичник - - 1 (7%) 279

Сравнительный анализ частоты и сроков обнаружения индуцированных опухолей у нокаутных животных и мышей дикого типа не выявил значительных различий (табл 4)

Для макроскопической оценки степени поражения преджелудка и печени у мышей нами была разработана шкала, учитывающая размеры и множественность опухолевых узлов Существенных различий между группами исследуемых мышей в выраженности канцерогенеза преджелудка и печени при воздействии ДЭНА отмечено не было

Отсутствие различий в частоте и сроках обнаружения опухолей преджелудка и печени у нокаутных животных и мышей одикого типа» связано, возможно, с большой дозой канцерогена и высокой чувствительностью мышей линии 129/8у к ДЭНА, так как суммарная частота опухолей была близка к 100%

Сведения о морфологическом спектре опухолей у животных, получавших ДЭНА, представлены в таблицах 5 и 6

При гистологическом исследовании новообразования преджелудка мышей оказались папилломами и плоскоклеточным раком на разных стадиях роста В группе РАЯР-Га 100% исследованных опухолей инвазировали все слои стенки преджелудка (в группе РАИР-14/+ - только 81% новообразований) По сравнению с животными дикого типа, у мышей РАММ7" несколько чаще (27% против 7%) и раньше (через 231 и 274 суток, соответственно) обнаруживали метастазы рака преджелудка в печени и легких Таким образом, у нокаутных животных были более агрессивными опухоли преджелудка, по сравнению с контрольной группой, что свидетельствует о большей чувствительности мышей РА11Р-ГЛ к индукции злокачественных новообразований этого органа

Таблица 5

Сведения о развитии опухолей преджелудка различного гистологического типа у мышей РАКР-1и РАКР-1+/+ при воздействии ДЭНА

Тип опухоли * РАШ>-Г/+ РАИР-Г'"

Количество мышей с опухолямиа Средний латентный период, сутки Количество мышей с опухолями' Средний латентный период, сутки

Папилломы 1 (4%) 229 - -

Рак:

С инвазией подслизистого слоя 3(11%) 230 ±3,1 - -

С инвазией мышечного слоя 1 (4%) 268 - -

С инвазией всей стенки - без метастазов 20(74%) 254 ±6,1 8 (73%) 260 ± 9,0

с метастазами в печень и легкие 2 (7%) 274 ±36,9 3 (27%) 231 ±6,9

Примечание

* - в контрольной труппе гистологически исследованы 27 животных, в подопытной группе - 11 мышей, у всех животных обнаружены опухоли преджелудка, а - в скобках - частота опухолей в процентах ло отношению к количеству гистологически исследованных мышей

У мышей РА1У-Г/" и РАКР-1+/+ развивались различные опухоли печени сосудистые новообразования (ангиосаркомы, гемангиоэндотелиомы, кавернозные гемангиомы), гепатоцеллюлярные опухоли (аденомы и рак), холангиолярные опухоли (цистохолангиомы и холангиокарциномы) (табл 6) По данным ИН Швембергер (1965), при введении ДЭНА у мышей линии СЗНА развивались лишь доброкачественные опухоли печени, а злокачественные новообразования не возникали,

У нокаутных животных по сравнению с контролем наблюдалась тенденция к увеличению частоты наиболее агрессивно растущих злокачественных опухолей печени, в частности, низкодифференцированных ангиосарком и холангиокарцином В контрольной группе среди 20 мышей с сосудистыми новообразованиями ангиосаркомы обнаружены в 2 случаях (10%), тогда как среди 11 нокаутных мышей - в 3 случаях (27%). Сроки обнаружения опухолей печени различного гистологического строения у мышей дикого типа и нокаутных животных существенно не различались.

Таблица 6

Сведения о развитии опухолей печени различного гистологического типа у мышей РАШМ^'и РАЯР-1+ + при воздействии ДЭНА

Гистологические типы РАШМ+/+ РАШМ"'"

опухолей * Количество Средний Количество Средний

мышеи с латентный мышей с латентный

опухолямиа период, сутки опухолями а период,сутки

Кавернозная - - 1 (9%) 273

гемангиома

Гемангиоэндотелиома 18(67%) 260 ±5,1 7 (64%) 247 ±9,0

Ангиосаркома 2 (7%) 248 ± 4,4 3 (27%) 242 ± 6,5

Гепатоцеллюлярная 1 (4%) 238 - -

аденома

Гепатоцеллюлярный 10 (37%) 268 ± 7,6 5 (45%) 262 ± 10,6

рак

Цистохолангиома 10(37%) 256 ± 10,3 5 (45%) 259 ± 11,9

Холангиокарцинома 1 (4%) 263 1 (9%) 284

Примечание

* - в контрольной группе гистологически исследованы 27 животных, в подопытной группе - 11 мышей, опухоли печени выявлены у 25 мышей РАЯР-1+'+ (93%) и у 11 животных РАКР-1(100%),

а - в скобках - частота опухолей в процентах по отношению к количеству гистологически исследованных мышей

Наши наблюдения согласуются с большинством экспериментальных работ, выявивших большую чувствительность нокаутных мышей РАКР-1"/" к действию Л-нитрозосоединений (Твийшш М е1 а!, 2001, Иогак! Т е1 а1, 2003)

В целом, проведенный анализ показал, что мыши, нокаутные по гену РАЛР-Г'", представляют собой удобную модель для изучения механизмов спонтанного канцерогенеза и его связи со старением У нокаутных мышей, по сравнению с животными дикого типа, выявлены признаки ускорения старения, обнаружено увеличение скорости популяционного старения, отмечено статистически достоверное уменьшение показателей продолжительности жизни, укорочение латентного периода обнаружения спонтанных опухолей, их более агрессивный характер, большая чувствительность мышей к возникновению спонтанных и индуцированных злокачественных новообразований

На основании полученных экспериментальных данных можно сделать предположение о том, что лица со снижением активности фермента РАЕ1Р-1 представляют группу риска преждевременного старения и развития рака С этим согласуются результаты недавно проведенных молекулярно-эпидемиологических исследований, показавших, что некоторые полиморфизмы гена РА1УМ, в особенности полиморфизм Уа1762А1а,

сопровождающиеся снижением активности фермента, связаны с повышенной предрасположенностью к развитию отдельных видов рака (легкого, желудка, предстательной железы, мочевого пузыря и пищевода) у людей (Lockett К L et al., 2004, Zhang X et al, 2005, Miao X et al, 2006, Wang X.G et al., 2007)

ВЫВОДЫ

1 У мышей PARP-Г' с увеличением возраста происходит более быстрое нарастание массы тела, раньше наступает половое созревание и более выражены возрастные нарушения астральной функции, а также жироуглеводного обмена, характерные для процесса ускоренного старения

2 Средняя продолжительность жизни мышей PARP-rA была на 13% меньше, продолжительность жнзни последних 10% подопытных животных -на 15% меньше, а скорость популяционного старения - на 17% больше, чем у мышей PARP-1+/+ (р<0,05)

3 У мышей обеих групп возникали, в основном, новообразования матки, яичников, легких и печени Частота спонтанных опухолей у мышей PARP-1"'" и PARP-1+/+ была сходной (73% и 77%, соответственно), однако, новообразования у нокаутных мышей обнаруживали на 3,1 мес раньше, чем в контроле (р<0,001)

4 Фатальные злокачественные опухоли у нокаутных мышей развивались чаще, чем у контрольных (67% и 47%, соответственно, р<0,05) У нокаутных мышей-опухоленосителей чаще и раньше развивались злокачественные новообразования матки, легких и печени

5. Частота и средний латентный период обнаружения опухолей, индуцированных диэтилнитрозамином (в основном, новообразований преджелудка и печени), у подопытных мышей PARP-l"'" и контрольных животных PARP-1+/+ были сходными (88% и 95%, 253 и 248 суток, соответственно)

6 При индукции опухолей ДЭНА у нокаутных мышей по сравнению с животными «дикого типа» чаще развивались злокачественные опухоли преджелудка с глубокой инвазией и метастазами в печени и легких (100% и 81%, соответственно), а также ангиосаркомы печени (27% и 7%) и холангиокарциномы (9% и 4%).

7. Дефицит поли(АДФ-рибоза) полимеразы-1 приводит к ускорению старения, укорочению продолжительности жизни и повышению чувствительности мышей к возникновению злокачественных спонтанных и индуцированных новообразований, что подтверждает представления о важной роли репарации ДНК в механизмах старения и канцерогенеза

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные данные можно использовать в работе с мышами, имеющими нарушения в генах репарации ДНК Полученные данные могут быть использованы для обоснования формирования групп риска

преждевременного старения и развития рака среди лиц со снижением активности фермента поли(АДФ-рибоза) полимеразы-1

Благодарности

Выражаю искреннюю признательность научному руководителю, профессору Владимиру Николаевичу Анисимову

Приношу глубокую благодарность за помощь в работе всем сотрудникам НИИ онкологии им Н Н Петрова Росмедтехнологий, особенно сотрудникам лабораторий канцерогенеза и старения, онкоэкологии и молекулярной онкологии

Список работ, опубликованных По теме диссертации

1 Пискунова Т С Спонтанные опухоли у самок нокаутных мышей PARP // Тез докл VI научно-практической конференции с международным участием «Санкт-Петербургские научные чтения» - СПб - 2004 - С 52

2 Пискунова Т С Особенности канцерогенеза и старения у нокаутных мышей р53, PARP, и трансгенных мышей HER-2/ием / Пискунова Т С , Юрова М Н // Тез докл XII Международной научн конф студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» - Москва - 2005 - С 467

3 Пискунова Т С. Особенности старения и канцерогенеза у мышей-самок, нокаутных по гену PARP / Пискунова Т С , Юрова М Н, Забежинский М А и др // Материалы Региональной научно-практической конференции Северо-Западного федерального округа «Геронтология от кардиологии к социально-экономическим аспектам». - Сыктывкар. - 2005 - С 46-47

4 Пискунова Т С Особенности старения и канцерогенеза у нокаутных мышей PARP и трансгенных мышей HER-2/neu / Пискунова Т С, Юрова М Н // Тез докл Всеросс конф молодых ученых «Физиология и медицина» - СПб - 2005 - С 90

5 Пискунова ТС Особенности спонтанного канцерогенеза у мышей PARP-/- / Пискунова ТС , Юрова М Н , Попович ИГ и др // Вопр онкол -2005 -Т 51 (приложение) - С 14

6 Пискунова ТС Ускоренное старение мышей PARP"'" с дефектом репарации ДНК / Пискунова Т С , Юрова М Н , Овсянников А И и др // Тез докл Всеросс конф «Перспективы фундаментальной геронтологии» -СПб -2006 - С 130

7 Пискунова Т С Возрастные особенности поведенческих реакций и гуморального статуса у мышей PARP-/- / Юрова М Н, Пискунова Т С У/ Тез докл девятой Всеросс медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» - СПб - 2006 - С 411-412

8 Пискунова Т.С Старение и продолжительность жизни у нокаутных мышей с нарушениями репарации ДНК / Пискунова Т С , Юрова М Н // Тез докл научн конф молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы геронтологии» —Киев -2006 - С 150.

9 Пискунова Т С Возрастные особенности биохимических показателей сыворотки крови у мышей PARF7" / Пискунова Т С., Юрова М Н // Тез докл научн конф молодых ученых с международным участием «Биологические основы развития старческой патологии». - Киев 2007 - С 110-111

10 Пискунова Т С Особенности спонтанного канцерогенеза и продолжительности жизни у мышей-самок PARP-1"'' / Пискунова Т С, Юрова М.Н., Семенченко А В и др // Вопр онкол - 2007 Т 54, № 1 -С 66-70

11 Пискунова Т С Поли(АДФ-рибоза) полимераза - связь с продолжительностью жизни и канцерогенезом / Пискунова Т С, Юрова М Н, Забежинский М А , Анисимов В Н // Успехи геронтол. -2007 Т 20, №2 -С 82-90

12 Пискунова ТС Воздействие канцерогена окружающей среды диэтилнитрозамина на мышей PARP-1-/- и PARP-1+/+ / Пискунова Т С , Забежинский М А, Юрова М Н и др // Вестник Российской Военно-медицинской академии - 2008 — Т 23, №3 (приложение) - С. 475-476

13 Piskunova T.S Peculiarities of aging and carcinogenesis m PARP knockout mice / Piskunova T S , Zabezhinski M A , Popovich IG // Gerontology -2007 - Vol. 53, Supplement.-P. 121-122

14 Piskunova T S Acceleration of agmg and spontaneous carcinogenesis in poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1 )-deficient mice / Piskunova T S, Yurova M N , Ovsjannikov A I et al // Adv Gerontol - 2007 - Vol 20, №3 -P 62-63.

15 Piskunova TS Deficiency in Poly(ADP-nbose) Polymerase-1 (PARP-1) accelerates aging and spontaneous carcinogenesis m mice / Piskunova T.S , Yurova M N, Ovsjannikov AI et al // Current Gerontology and Geriatrics Research - 2008 - Volume 2008 11 pages (in press)

Формат 60x84 1/16. Объем усл. печ. л 1,0 Тираж 120 экз. Заказ 01-08. Бесплатно.

Подписано в печать 13.08.08 Отпечатано с готового оригинал-макета. Издательство «Система».

Актуальность проблемы. В механизмах старения и ассоциированных с ним заболеваний, включая рак, важную роль играет возрастное накопление генетических нарушений, обусловленных эндогенными, в, том числе наследственными факторами, и действием экзо- и эндогенных повреждающих ДНК агентов (Vijg J., 2000, 2004; Burkle A. et al., 2004; Анисимов B.H., 2003; Хавинсон В.Х. и соавт., 2003). Нарушение систем репарации ДНК и геномная нестабильность могут способствовать многостадийному канцерогенезу, особенно на ранних стадиях (Masutani М. et al., 2003; Имянитов Е.Н., Хансон К.П., 2007). Поэтому большое значение придается возрастным изменениям эффективности систем репарации ДНК, защищающих геном клетки от подобных воздействий (Butler R.N. et al., 2003).

Одним из важных участников системы репарации ДНК является поли(АДФ-рибоза) полимераза (PARP) - семейство ферментов, восстанавливающих структуру ДНК в местах одно- или двуцепочечных разрывов, вызываемых алкилирующими агентами, ионизирующей радиацией или оксидативным стрессом (Tong W.-M. et al., 2001, Wang M. et al., 2006). Наиболее изучена поли(АДФ-рибоза) полимераза-1 (PARP-1). В ряде работ показана роль этого фермента во многих клеточных процессах, включая репликацию ДНК, репарацию, рекомбинацию, генную транскрипцию, клеточную пролиферацию и гибель (Herceg Z., Wang Z-Q., 2001, D'Amours D. et al., 1999, Beneke S., Burkle A., 2007). Выявлена прямая корреляция между продолжительностью жизни разных видов млекопитающих и способностью их клеток к поли(АДФ-рибоз)илированию (Grube К., Burkle А., 1992; Beneke A. et al., 2000).

Для изучения функции PARP-1 применяют экспериментальные модели in vitro и in vivo, где ингибируется активность PARP-1 или нокаутируется ген PARP-1. В качестве ингибиторов PARP-1 используют бензамид, 3-аминобензамид, никотинамид и другие соединения (Woon Е.С., Threadgill M.D., 2005). Созданы линии мышей, нокаутных по гену PARP-1, в которых инактивация гена производилась по 1-му, 2-му или 4-му экзону (Wang Z-Q. et al., 1995; de Murcia J.M. et al., 1997; Masutani M. et al., 1999; Tong W.-M. et al., 2000).

В опытах in vitro снижение активности PARP (путем добавления к культурам клеток лабораторных грызунов ингибиторов PARP или использования культур клеток нокаутных мышей PARP-l"/) вызывало геномную нестабильность (анеуплоидию, генную амплификацию и делецию, увеличение частоты сестринских хроматидных обменов) (Simbulan-Rosenthal С.М. et al., 2000; Masutani М. et al., 2003; Wang Z-Q. et al., 1997) и увеличивало чувствительность клеток к действию мутагенов (Meyer R.etal., 2000).

В экспериментах in vivo влияние ингибиторов PARP на продолжительность жизни и спонтанный канцерогенез не изучалось. В ряде работ отмечено, что подавление PARP может стимулировать химический и радиационный канцерогенез у лабораторных грызунов (Epstein J. Н., Cleaver J. Е., 1992; Tsutsumi М. et al., 2001; Nozaki Т. et al., 2003).

У нокаутных по гену PARP-1 мышей детальное изучение особенностей спонтанного канцерогенеза ранее не проводилось. Лишь в одной работе у нокаутных мышей линии 129/Sv, дефектных по 2-му экзону гена PARP-r7", была выявлена более высокая частота спонтанных опухолей в возрасте 12-24 месяцев, по сравнению с потомством мышей дикого типа PARP-1 (Tong W.-M. et al., 2001). Однако авторы не представили данных о сроках обнаружения, частоте, локализации и множественности новообразований различного гистологического строения.

Сведения об индукции опухолей у мышей PARP-l"" немногочисленны и противоречивы. Так, в опытах с канцерогенами

Ы-нитрозобис(2-гидроксипропил)амином и азоксиметаном частота и множественность опухолей у нокаутных животных была выше, чем у мышей дикого типа (Tsutsumi М., 2001; Nozaki Т. et al., 2003), тогда как в экспериментах на нокаутных мышах с 4-нитрохинолин 1-оксидотут и 2-амино-З-метилимидазо [4,5-f] хинолином не отмечено влияния выключения гена PARP-1 на канцерогенез, вызванный этими соединениями (Gunji A. et al., 2006; Ogawa К. et al., 2006). Чувствительность нокаутных мышей ко многим широко распространенным канцерогенам окружающей среды, в частности, к N-диэтилнитрозамину (ДЭНА), не изучалась.

С учетом представленных выше данных о наличии корреляции между поли(АДФ-рибоз)илированием и продолжительностью жизни млекопитающих, актуальными представляются исследования динамики гибели и скорости популяционного старения у нокаутных мышей PARP-l"7" . Однако, подобные сведения в литературе отсутствуют. Для изучения особенностей старения у животных в качестве биомаркеров используются такие показатели, как возрастная динамика веса тела, потребления корма и воды, температуры тела, эстральной функции, биохимических показателей крови и т.д. (Anisimov V.N. et al., 2007). Эти параметры у нокаутных мышей PARP-l"7" также не изучались. Исследования особенностей канцерогенеза и старения у мышей PARP-l"7" позволят расширить представления о роли системы репарации ДНК в этих процессах.

Цель исследования

Целью диссертационного исследования является изучение особенностей канцерогенеза и старения у самок мышей с выключенным геном поли(АДФ-рибоза) полимеразы-1.

Задачи исследования

В сравнительных экспериментах на нокаутных мышах-самках PARP-l"7" и мышах-самках дикого типа PARP-1+/+ изучить:

1. Показатели гомеостаза и биологического возраста (масса ^ела, потребление корма и воды, температура тела, эстральная функция, биохимические показатели сыворотки крови).

2. Параметры продолжительности жизни и скорости популяционного старения.

3. Особенности спонтанного канцерогенеза.

4. Чувствительность мышей к канцерогенному действию ДЭНА.

Научная новизна

Исследована возрастная динамика биомаркеров старения (масса тела, потребление корма и воды, температура тела, эстральная функция, биохимические показатели сыворотки крови) у нокаутных мышей PARP-l"7", по сравнению с животными дикого типа; изучены параметры продолжительности жизни у мышей PARP-l"7"; детально исследованы особенности спонтанного канцерогенеза у нокаутных мышей PARP-Г "; изучен канцерогенез у нокаутных мышей PARP-l"7", вызванный ДЭНА.

Практическая значимость работы

Впервые выявленные в работе особенности канцерогенеза (более раннее развитие спонтанных опухолей и их большая злокачественность) и старения (уменьшение продолжительности жизни, увеличение скорости старения, более выраженные возрастные изменения массы тела, нарушения эстральной функции и метаболического гомеостаза) у нокаутных мышей свидетельствуют о важной роли поли(АДФ-рибоза) полимеразы-1 в механизмах канцерогенеза и старения. Полученные данные могут быть использованы для обоснования формирования групп риска преждевременного старения и развития рака среди лиц со снижением активности фермента поли(АДФ-рибоза) полимеразы-1. 1

ВЫВОДЫ

1. У мышей PARP-l"7" с увеличением возраста происходит более быстрое нарастание массы тела, раньше наступает половое созревание и более выражены возрастные нарушения астральной функции, а также жироуглеводного обмена, характерные для процесса ускоренного старения.

2. Средняя продолжительность жизни мышей PARP-l"7" была на 13% меньше, продолжительность жизни последних 10% подопытных животных - на 15% меньше, а скорость популяционного старения - на 17% больше, чем у мышей PARP-1+/+ (р<0,05).

3. У мышей обеих групп возникали, в основном, новообразования матки, яичников, легких и печени. Частота спонтанных опухолей у мышей PARP-1" и PARP-1+/+ была сходной (73% и 77%, соответственно), однако, новообразования у нокаутных мышей обнаруживали на 3,1 мес. раньше, чем в контроле (р<0,001).

4. Фатальные злокачественные опухоли у нокаутных мышей развивались чаще, чем у контрольных (67% и 47%, соответственно, р<0,05). У нокаутных мышей-опухоленосителей чаще и раньше развивались злокачественные новообразования матки, легких и печени.

5. Частота и средний латентный период обнаружения опухолей, индуцированных диэтилнитрозамином (в основном, новообразований преджелудка и печени), у подопытных мышей PARP-l"7" и контрольных животных PARP-1+/+ были сходными (88% и 95%; 253 и 248 суток, соответственно).

6. При индукции опухолей ДЭНА у нокаутных мышей по сравнению с животными «дикого типа» чаще развивались злокачественные опухоли преджелудка с глубокой инвазией и метастазами в печени и легких (100% и 81%, соответственно), а также ангиосаркомы печени (27% и 7%) и холангиокарциномы (9% и 4%).

7. Дефицит поли(АДФ-рйбоза) полимеразы-1 приводит к ускорению старения, укорочению продолжительности жизни и повышению чувствительности мышей к возникновению злокачественных спонтанных и индуцированных новообразований, что подтверждает представления о важной роли репарации ДНК в механизмах старения и канцерогенеза.

1.8. Заключение

Анализ литературных данных показывает, что проблема связи канцерогенеза и старения с процессом поли(АДФ-рибоз)илирования и PARP-1 интенсивно изучается. Показано, что при небольшом генотоксическом повреждении происходит репарация ДНК при активном участии PARP-1. При более сильном повреждении ДНК запускается процесс апоптоза, а при обширном повреждении ДНК обнаружили сверхактивацию PARP, приводящую к некрозу и патологии.

При подавлении PARP нарушается процесс репарации ДНК, что приводит к геномной нестабильности; увеличению частоты злокачественных новообразований (как индуцированных, так и спонтанных), а также сокращению латентного периода их образования; уменьшению продолжительности жизни. Однако, дефект PARP также препятствует некрозу и связанному с ним патологиям. Предполагается, что при дефиците PARP, приводящему к клеточной гибели путем некроза или нарушению репарации ДНК, может запускаться апоптоз.

Таким образом, PARP играет двойственную роль в организме. С одной стороны, она участвует в репарации ДНК и апоптозе, тем самым, препятствуя процессам канцерогенеза и старения, с другой стороны, ее сверхактивация приводит к различным патологиям, ухудшающим качество жизни и сокращению продолжительность жизни организма.

Раскрытию связи механизмов канцерогенеза и старения в значительной мере способствуют исследования на животных. В последние годы с этой целью успешно используют различные линии генетически модифицированных, в том числе, нокаутных мышей.

При наблюдении за мышами, дефектными по гену PARP-1 в одной из работ установлено, что у нокаутных мышей развиваются предопухолевые изменения кожи в ранние сроки опыта, а во второй работе в поздние сроки опыта была выявлена более высокая частота спонтанных опухолей, по сравнению с потомством контрольных мышей PARP-1+/+. В последней работе не были представлены данные о сроках обнаружения, частоте, локализации и множественности спонтанных опухолей различных гистологических типов.

Что касается индуцированных опухолей у нокаутных мышей PARP"7", то сведения о них немногочисленны и противоречивы, а чувствительность нокаутных мышей ко многим широко распространенным канцерогенам окружающей среды, в частности, к диэтилнитрозамину не изучена.

С учетом представленных выше данных о наличии корреляции между поли(АДФ-рибоз)илированием и продолжительностью жизни животных, актуальными представляются исследования динамики гибели и скорости популяционного старения у нокаутных мышей PARP-Г7". Однако, подобные сведения в литературе отсутствуют. Для изучения особенностей старения у животных в качестве биомаркеров используют такие показатели, как возрастная динамика веса тела, потребления корма и воды, температуры тела, эстральной функции, биохимических показателей крови и т.д. (Anisimiv V.N. et al., 2007). Эти показатели у нокаутных мышей PARP-l"'" также не изучались. Исследования особенностей канцерогенеза и старения у мышей PARP-l"7" позволят расширить представления о роли системы репарации ДНК в механизмах канцерогенеза и старения. Исследованию этих вопросов и посвящена данная работа.

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Животные

В экспериментах использованы нокаутные мыши PARP-1 которые были первоначально получены в Международном агентстве по изучению рака (МАИР, Лион, Франция) путем разрыва 2-го экзона в гене PARP-1 у мышей линии 129/Sv (Tong W.-M., 2001). Мыши этой линии и, соответственно, мыши дикого типа (PARP-1+/+) поддерживались в лаборатории канцерогенеза и старения НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова. Животные содержались по 6-10 особей в полипропиленовых клетках размером 350x225x100 мм при стандартном режиме освещения (12 часов — свет, 12 часов — темнота) и температуре 22 ± 2°С. Они получали стандартный гранулированный корм для животных, который представляет собой готовый полнорационный корм (протеин - более 25%, жир - 6-12%, кальций и фосфор - 1-1,4%, лизин-метионин — 0,7-1,5%, микроэлементы и витамины - 3-4%) («Паппи-дог»; производитель - ЗАО «Волосовский комбикормовый завод»), а также водопроводную воду без ограничений.

2.2. Схема исследования

В соответствии с задачами исследования было проведено 2 серии экспериментов.

В первой серии экспериментов изучались параметры старения, продолжительность жизни и динамика развития спонтанных опухолей у мышей. Всего было исследовано 93 мыши PARP-1"a (подопытная группа) и 123 животных PARP-1+/+ (контроль), из них, соответственно, 73 и 103 мыши прослежены до конца жизни, а 40 животных (по 20 в каждой группе) были убиты для биохимического анализа сыворотки крови. Дополнительно исследовали по 34 самца от каждой группы мышей на хромосомные аберрации и уровень гормонов в крови.

У животных, за которыми наблюдали в течение всей жизни, исследовали биомаркеры гомеостаза и старения, включавшие массу тела, поглощение корма и воды, репродуктивную функцию и температуру тела. В экспериментах исследовали также динамику гибели животных, продолжительность жизни и различные параметры канцерогенеза. Кроме того, у убитых самок изучалась возрастная динамика биохимических показателей сыворотки крови. В дополнительных исследованиях для изучения роли PARP-1 сравнивали биохимические показатели сыворотки крови и хромосомные перестройки у мышей-самцов PARP-Г7" и PARP-1+/+.

Во второй серии экспериментов изучали чувствительность мышей к канцерогенному действию диэтилнитрозамина (ДЭНА). С этой целью было использовано 16 самок-мышей PARP-l"7" и 37 животных PARP-1+/+. Мыши в возрасте 2 мес. были рандомизированы по массе тела и подразделены на две сходные по этому параметру на 2 группы. Животным обеих групп на протяжении всей жизни, вводили с питьевой водой N-нитрозодиэтиламин (ДЭНА), синтезированный в лаборатории органического синтеза НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова путем нитрозирования диэтиламина. ДЭНА давали с питьевой водой мышам в концентрации 0,01 мг/мл. Такая доза канцерогена, по литературным данным (Швембергер И.Н., 1965), достаточна для индукции опухолей у значительной части животных (опыт проводился на мышах линии СЗНА). Свежеприготовленный раствор разливали в поилки (бутылочки из темного стекла во избежание фотолиза), раствор препарата меняли раз в неделю.

На протяжении опыта изучали динамику гибели животных, продолжительность жизни и различные показатели канцерогенеза.

2.3. Оценка динамики массы тела

Всех мышей ежемесячно взвешивали на электронных весах (ПВ — 6). В каждой группе находили среднее значение массы тела животных и ошибки среднего.

2.4. Оценка потребления корма и воды

Один раз в месяц, одновременно с взвешиванием мышей, производили определение суточного количества потребляемого корма (насыпая по 100 гр корма в каждую клетку) из расчета массы съеденного корма в граммах на одну мышь. Также изучали количество выпитой воды (наливая по 100 мл воды) из расчета объема выпитой жидкости в миллилитрах на одну мышь.

2.5. Оценка репродуктивной функции (полового созревания, фертилыюсти и астрального цикла)

Предварительно, во время разводки животных, изучали фертильность самок в возрасте от 3 мес. до 8 мес. (80 пометов мышей-самок PARP-1 и 82 помета животных

В основном эксперименте анализировали время полового созревания (по сроку открытия влагалища) у исследуемых мышей-самок обеих групп.

Для анализа астральной функции, один раз в три месяца у животных, начиная с возраста 2-3 месяцев, в течение 2 недель ежедневно цитологически исследовали содержимое влагалищных мазков. Оценивались следующие параметры: длительность эстрального цикла, соотношение фаз эстрального цикла, рассчитывалось относительное число коротких (менее 5 дней) и длинных (более 7 дней) эстральных циклов, относительное число животных с регулярными циклами, с персистирующим эструсом и анэструсом.

Известно, что в различные фазы овуляторного цикла у грызунов влагалищное содержимое имеет неодинаковый состав, легко определяемый при микроскопии. Весь овуляторный цикл мыши условно делят на следующие стадии (фазы): 1) диэструс, или стадия покоя; 2) проэструс, или стадия подготовки к течке (предтечка); 3) эструс, или стадия течки; 4) метаэструс, или стадия послетечки. Соответственно этим фазам изменяется и состав влагалищного содержимого (таблица 1).