Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Особенности иммунного статуса у больных раком предстательной железы до и после радикальной простатэктомии

На правах рукописи

БЕСПАЛОВ НИКОЛАЙ ЛЕОНИДОВИЧ

ОСОБЕННОСТИ ИММУННОГО СТАТУСА У БОЛЬНЫХ РАКОМ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ДО И ПОСЛЕ РАДИКАЛЬНОЙ ПРОСТАТЭКТОМИИ.

14.01.12 - Онкология 14.01.23 - Урология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

г 1 АВГ 2014

Москва -2014

005551841

Работа выполнена на кафедре урологии с курсом онкоурологии факультета повышения квалификации медицинских работников Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН

доктор медицинских наук, профессор

Каприн Андрей Дмитриевич Костин Андрей Александрович

Официальные оппоненты:

Амосов Александр Валентинович — доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделением ультразвуковой диагностики ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Самсонов Юрий Владимирович — кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник отдела онкоурологии ФГБУ «Научно-исследовательский институт урологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Ведущая организация: Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Московской области «Московский областной научно-исследовательский клинический институт имени М.Ф. Владимирского» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится «23» сентября 2014г. в _часов на

заседании диссертационного совета Д 208.047.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 125284, г. Москва, 2-й Боткинский проезд, д.З

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте www.mnioi.ru ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» Минздрава России

Автореферат разослан «_»_2014 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук Немцова Елена Романовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

В структуре онкологических заболеваний рак предстательной железы опережает такие грозные заболевания, как рак легкого и желудка, занимая 23 место. В то же время, в США оно выходит на первое место, являясь причиной смерти мужчин от онкологического заболевания в 30% случаев [81, 93]. Существующие проблемы в диагностике и лечении онкологических заболеваний говорят о незаконченности современных положений об их этиологии и патогенезе. Известно, что дисбаланс гормональных факторов играет одну из ведущих ролей в развитии РПЖ [188]. Не последнюю роль в патогенезе РПЖ играют иммунодефицитные состояния. Например, у больных страдающих врожденными иммунодефицитными состояниями, онкологические заболевания встречаются в 150 раз чаще, чем у пациентов без этих расстройств. Процесс канцерогенеза тесно связан с расстройствами иммунного ответа [74, 160]. Кроме того, длительное индолентное течение, характерное для РПЖ, также указывает на тонкие нарушения в механизмах естественной защиты, которые на уровне рутинных методов при скрининг -диагностике выявить не возможно.

Таким образом, тот факт, что опухолевый рост связан с нарушениями иммунных реакций, сегодня уже не вызывает сомнений. В очагах опухолевого роста определяются дефектные иммунокомпетентные клетки с резко сниженной защитной функцией. Снижение и прогрессирующее подавление иммунологического контроля можно обнаружить уже на начальных стадиях РПЖ [136]. Угнетение активности Т-клеточного звена иммунитета, функций NK-клеток, активизация гуморального звена иммунитета при прогрессии заболевания - вот только часть изменений, которые наблюдаются у больных РПЖ [31, 102, 192].

Иммунологические расстройства у больных РПЖ изучались и ранее,

однако целесообразность использования результатов мониторинга

иммунологических показателей с целью коррекции тактики лечения,

з

окончательно не решен до сих пор. В основе концепции иммунологического надзора лежит клонально-селекционная теория: злокачественная опухоль -источник чужеродной информации, являющийся объектом защитной реакции со стороны иммунной системы. Признаком адекватно развитой иммунной системы являлось обратное развитие опухоли, а прогрессия последней рассматривалась, как признак выраженного иммунодефицитного состояния.

В 90-е годы интенсивно развивалась клеточная и молекулярная иммунобиология. Пристального внимания заслуживало изучение функций Т-клеток и роли цитокинов в канцерогенезе. В основе новой концепции, рассматриваемые иммунологические параметры имели прогностическое значение и являлись предикторами клинического ответа [74,166].

Как известно, функционирование клеток иммунной системы осуществляется посредством тесного взаимодействия системы цитокинов, которые сегодня подвергаются глубокому анализу и широко применяются в иммунотерапии новообразовании. В то же время, функциональные резервы противоракового иммунитета мало изучены. Имеются лишь немногочисленные ссылки в литературных источниках, описывающие клеточное и гуморальное звенья иммунитета у больных РПЖ [74,123].

Стали формироваться представления о том, что на процесс канцерогенеза можно оказывать биологическое воздействие применяя не только методы иммунореабилитации, но и направленной иммунотерапии.

На сегодняшний день, некоторые особенности иммунного статуса у пациентов, страдающих онкологическими заболеваниями и РПЖ в частности, известны, но практически все они носят описательный характер. Это создает необходимость оценки в динамике иммунного статуса больных РПЖ с учетом клинико-морфологических показателей т.к. полученные результаты могут иметь диагностическую значимость. Кроме того, широкое использование гормональной, лучевой, химиотерапии, а также их сочетаний в лечении больных РПЖ происходит без учета иммунного статуса, что безусловно ведет к потери качества диагностики и, как следствие, ухудшения

4

результатов лечения больных РПЖ. Таким образом, исследование иммунного статуса и его изменений у больных РПЖ представляется актуальным. В то же время, в литературе неоправданно мало публикаций посвящено изучению иммунного статуса при РПЖ, и акцент сделан в сторону разработок в скрининг-диагностике и новых подходов комбинированного лечения. Не исключено, что оценка иммунного статуса в сочетании с традиционными подходами активной диагностики позволит отдифференцировать РПЖ индолентного и агрессивного течения. Все вышеперечисленное свидетельствует о сложных реципрокных взаимодействиях опухоли и иммунной системы. Это объясняет актуальность и необходимость комплексного количественно — качественного анализа иммунной системы больных РПЖ до и на этапах лечения.

Цель исследования Улучшение результатов диагностики и лечения больных РПЖ путем качественно — количественного анализа отдельных показателей иммунного статуса до и после РПЭ.

Задачи исследований

1) Исследовать количественные показатели клеточного и гуморального иммунитета у больных РПЖ, в сравнении с больными ДГПЖ.

2) Исследовать функциональную активность клеточных субпопуляций врожденного иммунитета (нейтрофилов и моноцитов) у больных РПЖ, в сравнении с больными ДГПЖ.

3) Исследовать функциональную активность основных субпопуляций Т-клеточного звена иммунитета - С04+Т-хелперов и С08+Т-цитотоксических эффекторов у больных РПЖ, в сравнении с больными ДГПЖ.

4) Путем корреляционного анализа и статистической обработки выявить значимые изменения иммунного статуса у исследуемых категорий больных.

Разработать алгоритм индивидуального иммунологического обследования для больных РПЖ, с целью раннего выявления иммуносупрессии, прогнозирования постоперационных осложнений и изменения тактики предоперационной подготовки. Сформировать по иммунологическим показателям группы риска.

Научная новизна Впервые разработан индивидуальный комплексный алгоритм функциональной оценки противоопухолевого иммунитета у больных РПЖ до и после РПЭ.

Впервые для оценки функциональной активности врожденного иммунитета при РПЖ, помимо исследования функциональной активности нейтрофилов, нами было внедрено исследование минорной субпопуляции моноцитов СЭ14+С016+, которые по данным литературы, обладают способностью к выработке воспалительных интерлейкинов и характеризуются свойствами тканевых макрофагов. В нашей работе впервые было показано стабильное увеличение процентного содержания этой субпопуляции в крови больных РПЖ, по сравнению с контрольной группой.

При оценке Т-клеточного иммунитета методом проточной цитометрии, нами было внедрено исследование активированных субпопуляций Т-хелперов и Т-цитотоксических: С04+/С038 и СБ4+/НЬА-ОЯ+, а также С08+/С038+ и С08+/НЬА-0{1+. Было показано увеличение в крови больных РПЖ, в отличие от контрольной группы, активированных С08+/С038+Т-лимфоцитов эффекторов, которые выявлялись у этих больных, как до операции, так и после нее. Однако, помимо этих исследований, учитывая пластичность активированных клеток и возможность их перехода в состояние иммуносупрессии при РПЖ, было проведено диагностическое исследование Т-клеточного иммунитета и активности ЫК-клеток у обследуемых по продукции интерлейкинов. Для этих целей нами была применена достаточно

простая оценка продукции IL-2, IFNy, IL-10, вырабатываемых лимфоцитами больного в системе in vitro через 24 часа после стимуляции поликлональным Т-кпеточным активатором ФГА. Об активации Т-клеточного иммунитета судили по определению в культуральном супернатанте методом твердофазного ИФА концентрации IL-2 и IFNy, о супрессии — по снижению выработки IL-2 и IFNy, с нарастанием концентрации IL-10. Исследование интерлейкинов в супернатанте является более чувствительным и специфичным, по сравнению с оценкой их в сыворотке. На основании определения концентрации IL-2 в супернатанте активированных лимфоцитов больных РПЖ, до и после операции, обследуемые были разделены на группы: с иммуносупрессией и без нее.

• В разработанный алгоритм было включено определение в сыворотке больных провоспалительных IL-ip, TNFa и IFNy, также было проведено исследование противовоспалительного иммуносупрессорного IL-10.

• Для клинико-иммунологического мониторинга за состоянием больных после РПЭ, нами был составлен еще один упрощенный алгоритм иммунологического обследования. При этом предлагается оценивать:

a) функциональную активность нейтрофилов, исследовать относительное содержание в крови минорной субпопуляции моноцитов CD14+CD16+;

b) функциональную активность Т-клеточного иммунитета, а также NK-клеток - по выработке IL-2, IFNy и IL-10 в системе in vitro, с последующим определением их концентрации в тест-системах ИФА;

c) в случае выявления снижения выработки IL-2, IFNy и IL-10, необходимо проводить развернутое клинико-иммунологическое обследование.

Практическая значимость работы

Была показана важность иммунологического дооперационного обследования больных РПЖ, в связи с прогнозированием послеоперационных осложнений, связанных с развитием иммуносупрессии. Разработан алгоритм иммунологического обследования до и после РПЭ.

Была предложена методическая основа для осуществления функциональных исследований показателей иммунитета, с целью ранней диагностики иммуносупрессии.

Были количественно охарактеризованы показатели иммунитета, предполагающие наличие или развитие иммуносупрессии после операции. Состояние иммуносупрессии у больных РПЖ до операции, сопровождалось снижением функциональной активности нейтрофилов (снижение стимулированного НСТ менее 40%), повышением в циркуляции минорной субпопуляции моноцитов CD14+CD16+ (9,9%(+\-3,5), повышением концентрации сывороточного IL-ip (до 0,44пг\мл), снижением выработки лимфоцитами больных в системе in vitro - IL-2 (9,9 - 15пг\мл), IFNy (0,99 -60пг\мл), с некоторым повышением концентрации IL-10 (1,5 - 30пг\мл). На 10-е сутки после операции у больных этой группы развивалась послеоперационная супрессия, которая сопровождалась низкой выработкой IL-2 (9,9 - 15пг\мл), IFNy (0,99 - 60пг\мл) в системе in vitro, снижением абсолютного содержания NK-клеток (<100 кл\мкл), повышенным содержанием в сыворотке IL-ip и сниженной концентрацией IFNy. Среди пациентов II группы, с умеренной выработкой в системе in vitro IL-2 (50 -80пг\мл), IFNy (60 - 100пг\мл) до операции, также могла развиваться на 10-е сутки после операции иммуносупрессия, со сниженными показателями в супернатанте культур лимфоцитов IL-2 (9,9 - 15пг\мл), IFNy (20 - 80пг\мл), кроме того у них выявлялось повышение сывороточного IL-ip, с одновременным снижением IFNy. Все эти данные, полезны для выработки адекватной тактики диагностических и лечебных мероприятий. Кроме того,

они используются для клинико-иммунологического мониторинга за состоянием больных после операции.

При РПЖ Т2Ь - ТЗаШМО целесообразно исследовать содержание ЫК/ЫКТ-клеток и [РИу в качестве дополнительных факторов прогноза течения заболевания.

Основные положения выносимые на защиту

1) Развитие РПЖ сопровождается рядом существенных изменений врожденного и адаптивного иммунитета, приводящих к иммуносупрессии, в том числе и постоперационной, следствием которой могут является инфекционные осложнения и метастазирование опухоли. Выявлены новые дополнительные показатели иммунитета, включенные в алгоритм иммунологического обследования больных до операции.

2) Результаты индивидуального тестирования развития иммуносупрессии на 3-й и 10-е сутки у больных РПЖ после операции, путем сравнительного анализа показателей индивидуальных иммунограмм, выполненных до и после операции.

3) Результаты клинико-иммунологического мониторинга за состоянием иммуносупрессированных больных после операции, с использованием разработанного алгоритма.

Апробация материалов диссертации н публикации Апробации диссертации состоялись на заседании межкафедральной конференции факультета повышения квалификации медицинских работников ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» 23 декабря 2013г. и на заседании межотделенческой конференции ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» Минздрава России 7 февраля 2014г.

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 3 в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 3 глав, включающих обзор литературы, собственные данные и их обсуждение, заключение, выводов, практических рекомендаций и списка литературы включающего 89 отечественных и 118 зарубежных источников. Диссертация изложена на 178 страницах машинописного текста включает 1 рисунок и 67 таблиц результатов основных исследований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Всего обследовано 159 пациентов. Из них: 109 больных РПЖ составивших основную группу, 40 больных ДГПЖ составивших группу контроля и 10 пациентов составивших группу условно здоровых доноров. Все пациенты находились на стационарном лечении с февраля 2010г. по ноябрь 2013г.

Работа была выполнена на следующих клинических базах: ГБУЗ ГКБ №20 ДЗМ (г. Москва), ГБУЗ ГКБ №40 ДЗМ (г.Москва), ГБУЗ ГКБ №47 ДЗМ (г.Москва), МООД №1 ДЗМ (г.Москва). Основная часть лабораторно -технической работы проводилась на базе ГБУЗ «БСК ДЗМ» (г. Москва).

Обследование больных основной и контрольной групп не отличалось от применяемой стандартной диагностики больных РПЖ и ДГПЖ. Изменения стандартного перечня диагностических методик коснулись иммунодиагностики составивших основу работы.

Методы иммунодиагностики

В данном разделе представлены методы исследования иммунного статуса больных РПЖ, результаты которых составили основу текущей научной работы. Целью иммунодиагностики являлся сравнительный анализ изменений клеточного и гуморальных звеньев иммунитета у больных РПЖ до РПЭ, а также в раннем (на 3-й сутки после операции) и позднем (спустя 10 суток после операции) послеоперационных периодах.

ю

В качестве материала исследования была использована венозная кровь, доставляемая в лабораторию не позднее 4-х часов с момента забора, в контейнерах при температуре +1...+4. Материал собирался в пробирки Vacutainer содержащих гель и ЭДТА. Забор крови производился натощак.

Перед проведением исследования клеточного иммунитета пробирки для каждого пациента маркировались по следующей схеме:

A) CD45/CD14 - для идентификации популяций лейкоцитов, моноцитов, лимфоцитов и «выделения» последних для анализа .

B) IgGl/IgG2- контроль неспецифического связывания лимфоцитов.

C) CD3/CD19 - определение количества Т- и В-лимфоцитов (CD3+ и CD19+).

D) CD3/CD4 - для определения количества CD3+CD4+ (Т-хелперов)

E) CD3/CD8 - для определения количества CD3+CD8+ (Т-цитотоксических лимфоцитов).

F) CD3/CD16CD56 - для определения количества CD37CD16+CD56+ (NK-клеток); CD3+/CD16+CD56+ (NKT-клеток).

G) CD3/HLA-DR - для определения активированных Т-лимфоцитов (CD3/HLA-DR+) и активированных иммунокомпетентных клеток, в состав которых входят В-лимфоциты, NK-клетки, моноциты.

Данные анализировались по следующим направлениям:

1) Количественное определение субпопуляций лимфоцитов методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител (ФИТЦ, ФЭ, ФЭ/Ц5).

2) Исследование активированных субпопуляций Т-хелперов и Т-цитотоксических лимфоцитов, методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител.

3) Исследование функциональной активности Т-клеточного звена иммунитета in vitro.

4) Определение содержания Т-регуляторных клеток в сыворотке крови, с использованием моноклональных антител.

5) Определение функциональной активности моноцитов методом проточной цитометрии, с использованием моноклональных антител, меченых флюоресцентными метками.

6) Оценка функциональной активности нейтрофилов в реакции восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест).

7) Определение концентрации иммуноглобулинов М, G и А в сыворотке крови методом количественного твердофазного ИФА.

8) Определение цитокинового профиля (IL-2, IL-lp, IL-10, TNFa, IFNy)

В нашей работе иммунофенотипирование проводили на двухлазерном проточном цитофлюориметре FACS Calibur (Becton Dickinson).

Полученные в ходе исследований данные подвергались компьютерному анализу на базе программного пакета CellQUEST (BD Biosciences). Перед началом работы аппарат проходил калибровку с применением коммерческого набора калибровочных микросфер CalibrateBeads.

Методы лечения больных

Пациенты были разделены на две основные группы: 109 больных РПЖ (100%) после РПЭ и 40 (100%) больных ДГПЖ после ТУР предстательной железы, составивших контрольную группу. Количество пациентов соответствовало распределению больных по формам исследуемого заболевания (табл.1)

Таблица 1

Распределение больных основной и контрольной групп по возрасту и

ПСА

Группы пациентов п Возраст ПСА

Основная 109 65,1 (54-72) 7,0 (4,97-13,7)

Контрольная группа 40 62,3 (57-71) 6,0 (4,3-8,1)

Предоперационная подготовка пациентов основной и контрольной групп производилась в соответствии с принятыми нормами и правилами подготовки больных для открытых операций на органах малого таза. С целью профилактики гнойно-воспалительных процессов, в пред- и послеоперационном периодах проводилась антибактериальная терапия преимущественно препаратами группы цефалоспоринов (цефтриаксон 2,0г. х 1 раз сутки, цефотаксим 1,0г. х 2 раза в день).

Техника выполнения ТУР предстательной железы не отличалась от общепринятой.

Радикальная простатэктомия выполнялась в двух вариантах: с сохранением сосудисто-нервного пучка и с щироким его иссечением.

К нервосберегающей операции прибегали в следующих случаях: -сохраненная эректильная функция и/или желание ее сохранить; -отсутствие инвазии в сосудисто-нервный пучок и пальпируемого узла с его стороны;

-отсутствие интраоперационно пальпируемого узла в области верхушки предстательной железы;

Статистическая обработка результатов

Данные, характеризующие пациентов, представлены с применением методов описательной статистики. Совокупности значений, не подчиняющиеся нормальному распределению (возраст, уровень иммуноглобулинов, ПСА и т. д.) представлены в виде медианы, 5 и 95 перцентиля с целью наиболее объективного представления совокупности. Кроме того были использованы следующие параметры при описании иммунного статуса:

- % случаев в анализируемой группе больных со значением показателя выше верхней границы или ниже нижней границы условной нормы

- среднее значение показателя в анализируемой группе

-стандартное отклонение показателя в анализируемой группе

Значимыми были признаны различия при уровне критерия (Р) <0,05. Результаты, полученные в ходе проведенного исследования, были обработаны с применением методов описательной статистки с помощью прикладного пакета программ SPSS Statistics IBM Company (версия 21).

Основные результаты исследования и обсуждение При анализе формулы крови, у больных РПЖ до операции, не было отмечено значимых изменений в количественных показателях этих клеток. В связи с чем, были проведены функциональные исследования. Изучение функциональной активности нейтрофилов до операции проводили в системе in vitro, на основе НСТ-теста. Было установлено, что у 70 - 95% больных РПЖ наблюдалось снижение показателей стимулированного теста НСТ(<40%), как при нормальных показателях спонтанного НСТ(<15%), так и при повышенных (НСТ>15%). Снижение показателей стимулированного НСТ свидетельствует о подавлении окислительно-восстановительной функции нейтрофилов в процессе фагоцитоза, то есть об угнетении врожденного иммунитета. У пациентов контрольной группы, без признаков воспалительного процесса, таких изменений выявлено не было.

Оценивая моноцитарное звено иммунитета, акцент был сделан на изучение минорной субпопуляции моноцитов, который, ранее у больных РПЖ не описывался. Следует отметить, что в нашем исследовании отмечено повышение относительного содержания минорной субпопуляции у больных РПЖ при всех изучаемых категориях «Т». У контрольной группы данный параметр находился на уровне здоровых лиц. Полученные данные свидетельствуют о том, что при наличии РПЖ имеется угнетение дифференцировки моноцитов в АПК, с преобладанием тканевых макрофагов указывая на наличие иммуносупрессии.

Т-регуляторные клетки способны контролировать иммунный ответ, за счет секреции иммуносупрессорных цитокинов (IL-10). Было показано, что у больных РПЖ наблюдается повышение Т-регуляторных клеток на стадиях Т2ЫМ0М0 у 40% больных и у 70% на стадиях T2cN0M0 и T3aN0M0.

14

Учитывая факт активации Т-клеточиого звена иммунитета на ранних стадиях, была предпринята попытка анализа активированных субпопуляций Т-хелперов и ЦТЛ. Установлено, что уже на ранних этапах канцерогенеза появляются активированные субпопуляции вышеуказанных клеток. В тоже время, их содержание на более поздних стадиях (T2cN0N0 и T3aN0M0) снижается.

Оценка функции Т-клеточного звена производилась по степени секреции интерлейкинов IL-2, IL-10, IFNy в системе in vitro, под действием ФГА в культуре лимфоцитов методом твердофазного ИФА. По результатам исследования были сформированы три группы: I группа - включала иммуносупрессированных больных (25% больных на стадии «Т2Ь» и по 93% больных на стадии «ТЗа»): низкая выработка IL-2, IFNy и повышенная секреция IL-10. У II группы (5% больных на стадии «Т2а» и 75% на стадии «Т2Ь») была зафиксирована «средняя выработка» интерлейкинов, однако учитывая сохраняющуюся выработку IL-2 и IFNy данная группа не была отнесена к иммуносупрессированным больным, равно как и III группа (по 95% больных на стадии «Tic» и «Т2а» соотвественно) с нормальной секрецией интерлейкинов по сравнению с I и II группами.

Анализируя содержание NK-клеток применительно к вышеуказанным группам было отмечено снижение абсолютного содержания NK-клеток у I группы, тогда как в группах II и III данный параметр укладывался в границы условной нормы. Кроме того, была выявлена зависимость содержания NKT-клеток от концентрации ПСА и суммарного балла Глисона. Отмечено увеличение NKT-клеток до 30%, при условной норме до 10%, тогда как у больных II и III групп эти значения находились в пределах 12%. Необходимо заметить, что увеличение процентного содержания этих клеток в крови больных РПЖ расценивается как признак иммунопатологии. При оценке таких параметров, как содержание B-лимфоцитов и гуморальное звено иммунитета не было получено убедительных данных для диагностики иммуносупрессии.

В качестве маркеров иммуносупрессии в нашей работе изучалась степень секреции следующих интерлейкинов: 11,-2, 1Ь-1 р, 1Ь-10,1РЫу, ТЫРа. На основании раннее выполненных и полученных при изучении цитокинового профиля данных был разработан алгоритм сравнительного иммунологического обследования больных РПЖ (табл. 2)

Таблица 2

Алгоритм сравнительного иммунологического обследования больных РПЖ

Параметры иммунном системы Здоровые доноры Контрольная группа РПЖ, т-к-л сточная иммуносупрессия

I.Функциональная активность показателей врожденного иммунитета: А) Нейтрофилов -спонтанный НСТ в % <15 <15 или >15 <15 или >15

-стимулированный НСТ в % >40 >40 Снижен(< 40)

Б) Моноцитов -содержание СШ-ГНЬЛШГ в % 18,0 17,5 Снижено(<10,0)

-содержание С014+С016+ в % 6,5 5,3 Повышено(>9,7)

В) ТМКТ-клеток в % <10 <10 Повышено(>15)

Г) ЫК-клеток 0,15-0.6 0,15-0,6 Снижено (<0,15)

2.Субпопуляции С04+Т-хелперов: -содержание Т-регуляторных в % 5,7 5,0 Повышено(>7,5)

-содержание СБ4+Т-активированных в %: С04+/НЬА-Ш1+ 0,7 0,9 <1,3

С04+С038+ -содержание С08+Т-активированных в %: СЭ8+/НЬА-ОЯ+ 1,2 14,8 1,2 16,5 <1,7 <6,0

С08+СЭ38+ 19,9 20,2 <6,8

З.Функциональные исследования Т-клеточного иммунитета в культуре лимфоцитов in vitro: 1Ь-2(пг\мл) 0-9,9 9,9-15,5 Концентрация снижается при прогрессии РПЖ (9,9-20)

1ГЫу(пг\мл) 0-0,99 0,99-55,8 Концентрация снижается при прогрессии РПЖ (0,99-60)

1Ь-10(пг\мл) 0-1,5 0-1,5 Концентрация повышается при профессии РПЖ (50-300)

4.Исследование концентрации интерлейкинов в сыворотке: 1Ь-1(пг\мл) 0,0 0,0 Концентрация повышается при прогрессии РПЖ (0,5 - 0,97)

1РЫу(пг\мл) <0,99 1,4-4,4 Концентрация снижается при прогрессии РПЖ (30-2,3)

1Ь-10(пг\мл) 0,0 0,0 Концентрация повышается при прогрессии РПЖ (3,8-20,0)

ТЫРа(ш\мл) 0 0 Концентрация повышается при прогрессии РПЖ (0-7,1)

Разработанный «Алгоритм» позволяет осуществлять раннюю иммунодиагностику подавления функциональной активности противоопухолевого иммунитета, еще до количественных и функциональных изменений эффекторных ЦТЛ и ЫК-клеток.

С целью изучения влияния хирургического лечения РПЖ на функциональные характеристики врожденного и адаптивного иммунитета, приводящего к развитию постоперационной иммуносупрессии, анализ изменений иммунного статуса проводили в раннем (на 3-й сутки после РПЭ) и позднем (после 10-ти суток) послеоперационных периодах, с учетом данных предоперационного обследования.

Стимулированный НСТ в контрольной группе был в норме и составлял более 40%. У больных РПЖ после операции, данный показатель оставался сниженным, как и до нее, и составлял менее 40%. Полученный данные свидетельствуют о стойком подавлении функциональной активности нейтрофилов у больных РПЖ как до операции, так и после нее, и соответственно, могут расцениваться как показатели иммуносупрессии врожденного иммунитета.

Поскольку до операции в крови больных РПЖ, было показано увеличение относительного содержания минорной субпопуляции моноцитов, было проведено их исследование на 10-е сутки после операции. При этом отмечено повышенное содержание этой субпопуляции моноцитов у больных РПЖ, на различных стадиях заболевания, на 10-е сутки после РПЭ, которое достоверно не отличалось от показателей до операции.

Функцию Т-клеточного звена как и до операции, определяли по степени продукции цитокинов IL-2, IFNy и IL-10 стимулированными лимфоцитами in vitro. У больных I группы, на 10-й день после РПЭ, так же как и до операции, выявлялись сниженные показатели выработки IL-2, IFNy и повышенные IL-10.

Среди пациентов II группы, были выявлены постоперационные различия. У всех пациентов II группы, при категории «Т2а», а также у 40% больных при категории «Т2Ь» не наблюдалось постоперационного снижения выработки лимфоцитами в системе in vitro IL-2, IFNy, а также повышения IL-10. Значения, были близки к полученным до операции, т.е. у них не развивалась иммуносупрессия.

В тоже время, у 60% пациентов II группы, при категории «Т2Ь», было выявлено снижение выработки лимфоцитами in vitro IL-2, IFNy и повышение IL-10. Эти данные были расценены как иммуносупрессия выявленная на 10-е сутки послеоперационного периода. Таким образом, в общую группу риска постоперационных осложнений, кроме I группы, вошло 60% больных РПЖ на стадии заболевания T2bN0M0. Эта группа больных была обозначена IIA.

Кроме того, у больных IIA группы, относительное содержание Т-регуляторных клеток, достоверно увеличилось, по сравнению с дооперационным обследованием. Известно, что увеличение в крови больного Т-регуляторных лимфоцитов, служит маркером хирургического стресса. Однако определено судить о механизме повышения Т-регуляторных клеток нельзя.

При изучении популяции NK-клеток были получены следующие результаты: у больных I группы на 10-й день после РПЭ выявлены сниженные показатели абсолютного содержания этих клеток (менее 100кл/мкл) у 50% больных при категориях «Т2с» и «ТЗа» и у 20% при категории «Т2Ь». У больных IIA группы, послеоперационное снижение NK-клеток менее 100кл/мкл, наблюдалось в 10%. Полученные данные свидетельствуют о том, что снижение выработки IL-2, IFNy Thl, которые подавлены в I и IIA группах, приводит к снижению функциональной активности NK-клеток в интра- и постоперационном периодах. Это является плохим прогностическим признаком развития иммуносупрессии и причиной ряда с ней связанных осложнений (рецидив, метастазирование).

Среди больных I и IIA групп были выявлены пациенты с высоким ответом по IL-lb, как до (0,3 - 0,44 пг/мл), так и на 3-й и 10-е сутки после РПЭ (0,5 - 0,97 пг/мл). У больных III группы, IL-lb не определялся на 10-е сутки после РПЭ. TNFa у обследованных нами больных на 10-е сутки после операции выявлялся у 1% больных, на поздних стадиях РПЖ, что является неблагоприятным прогностическим признаком.

На 10-е сутки после операции, концентрация IFNy в сыворотке крови больных РПЖ I и IIA групп, была достоверно ниже, по сравнению с пациентами III группы, что является еще одним подтверждением существования послеоперационной иммуносупрессии.

На основании полученных данных, можно сделать заключение о том, что состояние больных I и IIA групп на 10-е сутки после операции, было более тяжелым, по сравнению с пациентами III и II групп, у которых не было выявлено снижения выработки IL-2, IFNy, по сравнению с дооперационным периодом.

Таким образом, в результате оценки иммунного статуса больных РПЖ, с использованием разработанного нами алгоритма (табл.2), как до, так и после операции, были выявлены две группы риска: а) в I группу вошли больные РПЖ на стадиях заболевания T2bN0M0, T2cN0M0 и T3aN0M0, отобранные по результатам до операционного иммунологического обследования; б) во IIA группу вошли больные РПЖ на стадии T2bN0M0, по результатам послеоперационного обследования.

Выводы

1) У больных РПЖ на стадиях заболевания Tic - T3aN0M0, по сравнению с контрольной группой, были зарегистрированы изменения на уровне врожденного иммунитета, которые сопровождались не только снижением функциональной активности нейтрофилов, но и, впервые обнаруженном в нашей работе, относительным увеличением субпопуляции CD14+CD16+ моноцитов, предположительно тканевых макрофагов, возможно, ранним иммунологическим маркером РПЖ.

2) В ходе проведения исследования методом проточной цитометрии, было выявлено достоверное увеличение относительного содержания активированных: CD8+/HLA-DR+ и CD8+/CD38+- Т-эффекторных лимфоцитов у больных РПЖ, на стадиях TlcNOMO, T2aN0M0 и T2bN0M0, что свидетельствует о развитии противоопухолевого

иммунитета, с появлением активированных клонов цитотоксических Т-лимфоцитов и Т-клеток памяти.

3) На основе результатов функционального исследования Т-клеточного иммунитета у больных РПЖ, на различных стадиях заболевания как до, так и после РПЭ, все обследуемые были разделены по группам, в зависимости от концентрации вырабатываемых в культуре in vitro IL-2, IFNy и IL-10. Пациенты с самой низкой концентрацией IL-2 и IFNy были включены в группы иммуносупрессированных, с повышенным риском постоперационных осложнений.

4) Иммуносупрессия у больных РПЖ подтверждается существованием положительной корреляции между сниженной индукцией интерлейкинов Thl и повышенной Т-регуляторных клеток, а также уменьшением абсолютного и относительного содержания в крови обследуемого цитотоксических NK-клеток и CD8+/HLA-DR+ и CD8+/CD38+ - Т-эффекторов и клеток памяти, как на поздних стадиях РПЖ, так и на 10-е сутки после операции

5) Была выявлена положительная корреляция у иммуносупрессированных больных между снижением выработки в культуре лимфоцитов in vitro IL-2, IFNy, повышением IL-10, и увеличением относительного содержания Т-регуляторных лимфоцитов, на стадиях РПЖ: T2bN0M0, T2cN0M0 и T3aN0M0. В послеоперационном периоде относительное содержание этих клеток у иммуносупрессированных пациентов может повышаться.

6) У иммуносупрессированных больных РПЖ, была выявлена положительная корреляция между снижением выработки в культуре лимфоцитов in vitro IL-2, IFNy, повышением IL-10 и повышением концентрации сывороточного IL-lb, а также повышением воспалительной активности нейтрофилов (по результатам НСТ-теста), что может свидетельствовать о затяжном воспалительном процессе в организме обследуемого.

7) Разработан «Алгоритм сравнительного иммунологического обследования больных РПЖ», для раннего выявления иммуносупрессии и профилактики связанных с ней постоперационных осложнений.

8) Разработанный «Алгоритм сравнительного иммунологического обследования больных РПЖ» позволяет диагностировать иммуносупрессию не только в группах пациентов на поздних стадиях РПЖ (T2cN0M0, T3aN0M0), но и среди больных РПЖ на более ранних стадиях заболевания (T2aN0M0, T2bN0M0).

Практические рекомендации

1) Больным ДГПЖ, вне зависимости от уровня ПСА, при отрицательных результатах биопсии, в качестве дополнительной дифференциальной диагностики, рекомендовано проводить иммунологическое обследование по разработанному «Алгоритму сравнительного иммунологического обследования больных РПЖ», включающему обязательную оценку функциональных показателей врожденного и адаптивного иммунитета.

2) Внедрить в практику подготовки больных РПЖ к РПЭ иммунологическое обследование по разработанному «Алгоритму сравнительного иммунологического обследования больных РПЖ». При выявлении иммуносупрессии назначать иммунотропную терапию. При подготовке к операции, и выборе анестетиков и наркоза, учитывать негативное влияние последних на противоопухолевый иммунный ответ, обусловленный Thl.

3) С целью прогнозирования рисков послеоперационных осложнений, связанных с развитием иммуносупрессии, всем больным РПЖ, независимо от стадии заболевания, до операции и на 10-е сутки после хирургического лечения, проводить исследование функциональной активности Т-клеточного иммунитета в системе in vitro, с

тестированием через 24 часа после стимуляции ФГА, выработки IL-2, IFNy и IL-10.

4) Проводить комплексный клинико-иммунологический

послеоперационный мониторинг больным из групп риска, с исследованием количественных и функциональных показателей иммунитета, по разработанному для этих целей «Алгоритму».

Список работ опубликованных по теме диссертации ¡.Беспалов H.JI. - Влияние эндокринной системы на процесс каецерогенеза / Н.Л. Беспалов, А.Д. Каприн, A.A. Костин, Е.В. Боякова, Д.С. Кобзев, А.А Быстрое, В.В. Алексеев - Вопросы урологии и андрологии. Москва. -2012г. - Т. 1 - № 1. - с.23 - 27.

2. Беспалов Н.Л. - Интерфероны в процессах онкогенеза / Н.Л. Беспалов, А.Д. Каприн, A.A. Костин, Е.В. Боякова, Д.С. Кобзев, A.A. Быстрое, В.В. Алексеев — Вопросы урологии и андрологии. Москва. — 2013г. - Т.2 - №1. - с.35 -37.

3. Беспалов Н.Л. - Канцерогенез. Влияние иммунной системы / Н.Л. Беспалов, А.Д. Каприн, A.A. Костин, Е.В. Боякова, Д.С. Кобзев, A.A. Быстрое, В.В. Алексеев - Клинический опыт «Двадцатки». Москва. -2013г. - Т.17 - №1. - с.56 - 61.

4. Беспалов Н.Л. - Особенности участия эндокринной системы в развитии рака предстательной железы / Н.Л. Беспалов, А.Д. Каприн, A.A. Костин, Е.В. Боякова, Д.С. Кобзев, A.A. Быстрое, В.В. Алексеев -Клинический опыт «Двадцатки». Москва. — 2013г. - Т.17 - №1. - с.69 - 72.

5. Беспалов Н.Л. - Особенности иммунного ответа у больных раком предстательной железы до и после радикальной иростатэктомни / НЛ. Беспалов, А.Д. Каприн, A.A. Костин, Е.В. Боякова, А.Р. Алиев -Клинический опыт «Двадцатки». Москва. - 2013. - №2 (18)

Подписано в печать 21.07.2014 Заказ №21083 Тираж 50 экз. Объем 2 п.л.

Формат 60x90/16 Отпечатано: ООО «ВП24» г. Москва, ул. Трубная, д. 21 Телефон 651-64-48 www.vp24.ru