Автореферат и диссертация по медицине (14.01.11) на тему:Особенности иммунного статуса и TNF-α при нестабильности генома у больных ранней резидуальной стадией детского церебрального паралича

На правах рукописи

Гайсина Лейсан Закиевна

ОСОБЕННОСТИ ИММУННОГО СТАТУСА И TNF- а ПРИ НЕСТАБИЛЬНОСТИ ГЕНОМА У БОЛЬНЫХ РАННЕЙ РЕЗИДУАЛЬНОЙ СТАДИЕЙ ДЕТСКОГО ЦЕРЕБРАЛЬНОГО

ПАРАЛИЧА

14.01.11 - нервные болезни

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

11 АПР 2013

005051583

Казань 2013

005051583

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Дина Дамировна Гайнетдинова Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Резеда Фидаиловна Хакимова Официальные оппоненты:

Прусаков Владимир Федорович доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий кафедрой детской неврологии;

Богданов Энвер Ибрагимович доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий кафедрой неврологии и реабилитации;

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится «_»_2013 г. в _____ часов на

заседании Диссертационного совета Д.208.033.02 в Государственном бюджетном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования «Казанская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 420012, г. Казань, ул. Муштари, д. 11

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГБОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Автореферат разослан «_»__2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, доцент

Е.К. Ларюкова

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АГ - антиген

ВУИ — внутриутробная инфекция

ГЭБ — гематоэнцефалический барьер

ДЦП - детский церебральный паралич

ИС - иммунная система

ИФ-у - интерферон-гамма

КТ - компьютерная томография

JIT - лимфотоксин

МДА — малоновый диальдегид

МРТ - магнитно - резонансная томография

НСБ - нейроспецифический белок

НСГ - нейросонография

ОБМ - основной белок миелина

ПВЛ — перивентрикулярная лейкомаляция

ПВО - перивентрикулярная область

ПВР — преждевременные роды

ПГК — программированная гибель клеток

СОД — супероксидцисмутаза

ЦНС - центральная нервная система

ЭМ — эритроциты с микроядрами

Ig (А, М, G) - иммуноглобулин (А, М, G)

IL - интерлейкин

TNF-a — фактор некроза опухолей-альфа

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Проблема изучения перинатальной патологии нервной системы у детей раннего возраста остается актуальной, что обусловлено прогрессирующим ростом частоты церебральных нарушений у новорожденных (Гузева В.И., 2009; Белоусова Е.Д., 2010; Барашнев Ю. И., 2011; Clark S.M., 2008). Среди детей, впервые признанных инвалидами, 57% составляют больные детским церебральным параличом (ДЦП). Результаты популяционно-эпидемиологических исследований свидетельствуют о высокой частоте ДЦП (от 1,9 до 2,7 случаев на 1000 живорожденных детей) в индустриально развитых странах (Никанорова М.Ю., 2009; Hemminki К., 2008; O'Callaghan. М.Е., 2009).

В патогенезе ДЦП, наряду с непосредственным поражением моторной зоны коры головного мозга, подкорковых образований и пирамидного тракта, большое значение имеет поражение перивентрикулярной области (ПВО), как результат гипоксического воздействия (Ониангет Е.П., 2006; Семенова К.А., 2007; Blumenthal I., 2009; Christos P., 2009; Folkerth R.D., 2011). Многочисленные исследования показали, что генетические программы и средовая регуляция формообразования нервной системы контролируются, прежде всего, матричной перивентрикулярной областью. С нею связаны митоз, миграция нейронов к коре и подкорковым структурам, а также, что, особенно важно в период онтогенеза, аксональный синаптогенез с клетками мишенями и формирование функциональных систем (Скворцов И.А. и др., 2008; Левченкова В.Д., 2012; Deng Y., 2008; Cans С. et al., 2009; Folkerth R.D., 2011).

Гипоксические и ишемические изменения в ПВО приводят чаще к деструктивным, нередко обратимым, процессам, реже - к выраженной деструкции мозгового вещества и лейкомаляции с необратимыми последствиями (Власюк В.В., 2012; Левченкова В. Д., 2012; Nelson К.В., 2008; Folkerth R.D., 2009; Kaur С. et al., 2009). Несмотря на то, что перивентрикулярная лейкомаляция (ПВЛ) изучена достаточно хорошо, до сих пор четко не определены ее исходы. В ряде исследований указывается, что последствиями ПВЛ могут быть детский церебральный паралич, судорожные состояния, задержка психического развития. Однако данные о частоте ДЦП при перивентрикулярной лейкомаляции варьируют в широких пределах - от 38 до 100% (Белоусова Е.Д., 2010; Folkerth R.D., 2011; Kinney Н.С., 2012).

Имеющиеся данные об ассоциированности ДЦП с антигеном В-13 у больных с перивентрикулярной лейкомаляцией, отводят решающую роль в реализации потенциально патогенного воздействия на плод генетически детерминированной индивидуальной реактивности организма ребенка, проявляющейся в виде особой восприимчивости структур перивентрикулярной области к иммунопатологическим реакциям (Гайнетдинова Д.Д., 2010). Изучение состояния генома у больных ДЦП, показывает, что у подавляющего большинства обследованных детей происходит дестабилизация генома -повышается уровень хромосомных аберраций в лимфоцитах и количество эритроцитов с микроядрами в периферической крови (Гайнетдинова Д.Д., и др., 2004; Гайнетдинова Д.Д., 2010; Hemminki К. et al., 2008; Nelson К.В., 2008; Wu

D., 2011).

В последнее десятилетие широко изучается состояние иммунной системы, изменение энзиматической активности иммунокомпетентных клеток, нейробиохимические маркеры нейродеструктивных и репаративных механизмов при заболеваниях у детей (Окунева М.А., 2008; Громада Н.Е., 2009; Hemminki К., 2008; Blumenthal I., 2009). Среди маркеров воспаления, исследуемых в последнее время, обращается внимание на цитокины (Громада Н.Е., 2009; Okazaki К. et al., 2006; Schmitz Т., 2008; Schmid М, 2012). Исследования подтверждают гипотезу о том, что провоспалительные цитокины IL-lß и TNF-a, быстро появляющиеся в поврежденном мозге, ответственны за прогрессирующее повреждение нейронов, и что эти медиаторы являются важными пусковыми факторами в нейропротективной интервенции после острого периода повреждения мозга (Громада Н.Е., 2009; Khwaja О., 2008; Kadhim Н., 2009; Schmid М., 2012).

Как показывают исследования последних лет, не у каждого ребенка, развивающегося в неблагоприятных внутриутробных условиях, формируется ПВЛ (Скворцов И.А., 2008). Очевидно, решающую роль в реализации потенциально патогенного воздействия на плод играет генетически детерминированная индивидуальная реактивность организма ребенка, определяющая повышенную "восприимчивость" структур перивентрикулярной области и других отделов головного мозга плода и новорожденного к гипоксии. В литературе имеются доказательства того, что одним га провоцирующих моментов стойкости двигательного дефицита при ДЦП, является нестабильность генома, проявляющаяся повышением уровня эритроцитов с микроядрами и лимфоцитов с перестройками хромосом в периферической крови (Гайнетдинова Д.Д. и соавт., 2004; Гайнетдинова Д. Д. 2010; Hemminki К., 2008; Nelson К.В., 2008; Kaur С., 2009; Wu D., 2011; Nuk M., 2012). Предполагается, что в основе этого явления лежит интенсификация в организме больных ДЦП процессов мутагенеза, за счёт усиленной генерации эндомутагенов. В то же время, как сами механизмы дестабилизации генома, так и процессы, их поддерживающие, остаются неясными. Изучение некоторых патогенетических звеньев заболевания поможет уточнить механизмы, поддерживающие тяжесть заболевания и препятствующие эффективности лечебных мероприятий. Это позволит целенаправленно воздействовать на выявленные процессы, обоснованно назначать медикаментозную терапию и улучшать качество жизни пациента, больного ДЦП.

Цель работы. Исследовать особенности неврологических и иммунологических нарушений при нестабильности генома у больных спастическими формами детского церебрального паралича в исходе перивентрикулярной лейкомаляции.

Задачи исследования:

1. Изучить факторы риска, структуру и клинические особенности течения ДЦП у детей, перенесших перивентрикулярную лейкомаляцию, с использованием оценочных шкал спастичности Ashworth, Клуба Моторики и Ривермид, адаптированных к детскому возрасту.

2. Установить взаимосвязь тяжести ДЦП и уровня цитогенетических нарушений в периферической крови детей, перенесших перивентрикулярную лейкомаляцию.

3. Оценить показатели иммунного статуса и содержания ТЫР-а в периферической крови и слюнной жидкости в зависимости от степени тяжести ДЦП в исходе перивентрикулярной лейкомаляции.

4. Выявить взаимосвязь уровня нестабильности клеточного генома и иммунологических показателей.

Научная новизна. Впервые для оценки степени тяжести ранней резидуальной стадии ДЦП использованы шкалы спастичности АвЬ^уогЛ, Клуба Моторики и Ривермид, адаптированные к детскому возрасту. Рассмотрена взаимосвязь иммунологических показателей, количественного содержания ЮТ-а и нестабильности генома у больных ДЦП различной степени тяжести, неиндуцированного внутриутробной инфекцией. Выдвинута гипотеза участия цитокина ТОТ-а в механизмах нейроиммунного взаимодействия у больных ДЦП с нестабильностью генома. Оценена возможность использования метода количественного определения ЮТ-сс в слюнной жидкости для использования в клинических условиях.

Практическая значимость. По результатам проведенного исследования определены факторы, влияющие на формирование повреждений центральной нервной системы, которые являются управляемыми и могут быть предупреждены при дальнейшем развитии перинатальных технологий.

Использование адаптированных к детскому возрасту шкал балльной оценки спастичности двигательных нарушений АбЬу/оПЬ, Клуба Моторики и Ривермид у больных ДЦП, позволит объективизировать степень тяжести заболевания у детей раннего возраста. Более объективной является шкала Ривермид.

Практическую значимость для неонатологов, педиатров, неврологов перинатальных центров, организаторов здравоохранения имеют:

- выявленные особенности иммунных реакций, показатели уровня Т№-а и определение степени дестабилизации клеточного генома позволят педиатрам и неврологам объективно оценить, прогнозировать неврологические исходы у детей с ДЦП, разработать индивидуальные схемы наблюдения и профилактику заболеваний у указанного контингента детей;

- определение уровня ТОТ-а в слюнной жидкости может быть использовано как альтернатива инвазивному методу определения ЮТ-а в сыворотке крови.

Внедрение в практику. Результаты исследования внедрены в практику неврологических отделений ГАУЗ «Детская Республиканская клиническая больница МЗ РТ», ГАУЗ «Республиканский детский психоневрологический санаторий», ГБУ РМЭ «Параньгинская центральная районная больница», а также используются в учебном процессе кафедры неврологии с курсом медицинской генетики ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались на ежегодной научно-практической конференции молодых ученых ГБОУ ВПО «Казанский государственный

медицинский университет» (Казань, 2009, 2010, 2011, 2012), научно-практической конференции «Актуальные проблемы управления здоровьем населения» (Нижний Новгород, 2009), научно-практической конференции неврологов Северо-западного федерального округа «Актуальные проблемы неврологии» (Сыктывкар, 2009), республиканской научно-практической конференции со всероссийским участием, посвященной 5-летию организации Центра экстрапирамидной патологии г. Казани «Дегенеративные и сосудистые заболевания экстрапирамидной нервной системы. Высокие технологии в диагностике и лечении» (Казань, 2009), VI Съезде Российского общества медицинских генетиков «Молекулярные основы наследственной патологии» (Ростов-на-Дону, 2010), всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 1000-летию г. Ярославля «Актуальные вопросы медицинской науки» (Ярославль, 2010), заседании сотрудников кафедры неврологии, нейрохирургии и медицинской генетики ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» (г.Казань, 2012), заседании сотрудников кафедры иммунологии с курсом аллергологии ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» (г.Казань, 2012), II ежегодной междисциплинарной научно-практической конференции с международным участием «Детский церебральный паралич и другие нарушения движений у детей» (г. Москва, 2012), Х-м Всероссийском съезде неврологов с международным участием (г. Нижний Новгород, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 5 работ опубликованы в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК Министерства образования и науки РФ. Положения, выносимые на защиту:

1. Степень тяжести клинических проявлений ДЦП обусловлена структурными нарушениями в ПВО, уровнем нестабильности генома и иммунопатологическими реакциями.

2. У детей с ПВЛ ТЫР-а является важным показателем, отражающим участие иммунной системы в патогенезе ДЦП.

3. Дестабилизация генома у детей с ПВЛ происходит на фоне повышенной продукции ЮТ-а. В условиях повышения выработки ТЫР-а возрастает его мутагенное действие на геном организма в целом и кроветворных клеток в частности.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Общая характеристика больных и методов исследования Материал исследования. Для решения поставленных задач нами обследовано 145 детей (92 мальчиков и 53 девочек) в возрасте от 1 до 4 лет.

В основную группу включено 125 детей с ранней резидуальной стадией ДЦП. В исследование включались дети, у которых на основании клинических и лабораторных данных исключены ВУИ в неонатальном периоде и отсутствовал инфекционный процесс за 30 дней до и в момент исследования. Контрольная группа состояла из 20 практически здоровых детей аналогичного возраста. Основную группу составили дети с двойной гемиплегией — 21 чел.,

спастической диплегией - 60 чел., гемипаретической формой - 44 чел. В соответствии с целью и задачами исследования основная группа была разделена на 3 группы в зависимости от наличия патологии перивентрикулярной области при нейровизуализации: первая - 46 детей с ПВЛ, вторая - 29 с кистами на противоположной гемипарезу стороне до 4-6 мм в диаметре, третья — 50 детей с ДЦП без каких-либо нейровизуализационных находок в головном мозге, в том числе и в ПВО. Патология перивентрикулярной области устанавливалась на основании НСГ исследования в возрасте до одного года (по имеющимся протоколам в амбулаторной карте) и после установления диагноза ДЦП (в возрасте старше 1 года) по результатам KT или МРТ исследований.

Методы исследования. Клинико-анамнестический метод включал изучение анамнестических данных, сведений из наследственного и акушерского анамнеза, периода новорожденное™, первого года жизни и всех этапов онтогенеза, данные клинических и инструментальных методов исследования. Степень неврологического дефицита у больных ДЦП оценивалась по шкалам: спастичности Ashworth (Ashworth, 1964); Клуба Моторики (по A. Ashburn, 1982; D. Wade, 2000); Ривермид (по F. Collen и соавт., 1990; D. Wade, 2000), адаптированным к детскому возрасту. Степень тяжести ДЦП оценивалась по сумме баллов каждой шкалы [Белова А.Н., 2002].

Для выявления цитогенетических аномалий в соматических клетках использовался метод учета микроядер в эритроцитах периферической крови. Забор крови для исследования производился в первый день поступления больного в стационар до начала лечения. Регистрация эритроцитов с микроядрами (ЭМ) в периферической крови осуществлялось согласно методике микроядерного теста (Shmid W., 1975).

Исследование иммунного статуса проводилось с использованием иммунологических методов. Методом проточной цитофлуориметрии производилось фенотипирование популяций и субпопуляций лимфоцитов; методом радиальной иммунодиффузии в геле (по Manchini D., 1965) изучалось содержание иммуноглобулинов А, М, G; фагоцитарная и окислительно-восстановительная активность нейтрофилов определялась в тесте фагоцитоза и HCT-тесте; количественное определение TNF-a в сыворотке крови и слюне изучалось методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием набора реактивов «а-ФНО-ИФА-Бест» (ЗАО «Вектор-Бест», Россия) [Хаитов P.M., 2009].

Статистическая обработка результатов производилась с использованием пакета программ STATISTICA 6.0 (StatSoft Inc, США). Производился подсчет среднего арифметического значения, стандартного отклонения, параметрического t-критерия Стьюдента, непараметрического U-критерия Манна-Уитни и коэффициента корреляции (R) по Пирсону. Различия считались статистически значимыми при р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

В результате изучения анамнеза, особенностей течения беременности и родов матерей у 94 (82%) обследованных детей с ДЦП были выявлены

гипоксические факторы, являющиеся ведущими факторами риска ДЦП. Число детей, родившихся в срок (28%), оказалось меньше, чем родившихся преждевременно (72%). Большинство детей, родившихся на сроке гестации до 37 недели, страдали спастической диплегией (96%) и двойной гемиплегией (86%), тогда как среди детей, родившихся в срок - преобладали дети с гемипаретической формой заболевания (68%). При спастической диплегии и двойной гемиплегии число детей, родившихся с массой ниже 2500 гр. достоверно преобладало над числом пациентов, родившихся с массой выше 2500 гр (р<0,05). Низкая масса тела при спастической диплегии и, особенно, при двойной гемиплегии доказывает, что дети, страдающие этими формами ДЦП, в основном, рождаются незрелыми, что в совокупности с внутриутробной гипоксией является высоким риском формирования ПВЛ.

Оценка степени тяжести клинической картины ДЦП по использованным шкалам позволила заключить, что тяжесть неврологического дефицита у детей основной группы при всех формах достоверно отличалась. Легкая степень двигательных нарушений преобладала при гемипаретической форме, а у больных с двойной гемиплегией не наблюдалась вовсе. Средняя степень тяжести чаще выявлена у пациентов со спастической диплегией. Тяжелая степень неврологического дефицита при оценке всеми использованными шкалами выявлена только у детей с двойной гемиплегией. Наиболее достоверные данные получены при использовании шкалы Ривермид (табл. 1).

Таблица 1

Распределение обследованных детей по степени тяжести ДЦП, _ оцененной шкалой Ривермид_

Формы ДЦП Тяжесть клинической картины ДЦП

легкая (27-35 бал.) средняя (13-26 бал.) тяжелая (0-12 бал.)

абс. % абс. % абс. %

двойная гемиплегия(п=21) - - 6 10* 15 100

спастическая диплегия (п=60) 8 17** 52 77* - -

гемипаретическая (п=44) 37 83** 7 13* - -

Итого (п=125) 45 100 65 | 100 15 100

Примечание: *р <0,005; **р<0,05

Как было отмечено ранее, в исследование были отобраны дети без клинических и лабораторных признаков внутриутробного инфицирования и инфекционно-воспалительных проявлений при рождении и в период новорожденности.

В то же время в исследование включались дети с указанием на однократное обострение хронической соматической патологии или однократное ОРЗ во

время беременности у матери. Хроническая соматическая патология и ОРЗ, даже однократные, могут стать факторами риска развития ПВЛ и, как следствие ее исхода, различных синдромов ДЦП. Принимая во внимание выше изложенное, все обследованные дети основной группы были разделены на 2 группы: группу обследованных, у которых в анамнезе не было указаний на какие-либо заболевания матери во время беременности и группу больных ДЦП с однократным ОРЗ, либо однократным обострением хронической соматической патологии у матери во время беременности ребенком с ДЦП. Тяжесть неврологических нарушений у детей этих групп представлена в табл. 2.

Таблица 2

Распределение детей по данным акушерского анамнеза и степени тяжести ДЦП, оцененной шкалами спастичности А$1тогй1, Клуба Моторики и Ривермид

Указания на однократные ОРЗ во время беременности Тяжесть заболевания (средний балл по шкалам)

Ashworth Клуб моторики Ривермид

отсутствуют (п=35) 1,7±0,4* 36±7* 23±7*

имеются (п=90) 3±0,5* 22±12,8* 14±9,9*

контроль (п=20) 0 50* 35*

Примечание: * р<0,05 (по вертикали)

У детей, родившихся от беременности с указаниями на однократный эпизод респираторного заболевания или обострение хронического соматического заболевания во время беременности, неврологический дефицит достоверно чаще проявляется тяжелой и среднетяжелой степенью выраженности (р<0,05) по сравнению с детьми, родившимися от неотягощенной беременности.

Следовательно, тяжесть клинических проявлений ДЦП, сформированного в исходе ПВЛ у детей с соматической отягощенностью беременности более выражена, чем у больных ДЦП, родившихся от неотягощенной беременности. Следовательно, в организме детей с ДЦП, например, в ПВО, могут протекать неизвестные патогенетические механизмы, приводящие к тяжелому неврологическому дефициту.

У 37 % (46 чел.) детей со спастической диплегией и двойной гемиплегией имела место патология перивентрикулярной области (ПВЛ). В зависимости от нейровизуализационных находок в перивентрикулярной области, обнаруженных при НСГ, КТ/МРТ, дети с ДЦП распределены на 3 группы: I группа - дети с ПВЛ, степень тяжести которой оценивалась согласно критериям de Vries L.S. (1994). У всех обследованных детей обнаружена первая или вторая степень тяжести ПВЛ, проявлявшаяся повышением перивентрикулярной эхоплотности в сочетании с мелкими локальными фронтопариетальными кистами диаметром 2-3 мм.

II группа — дети с гемипаретической формой ДЦП, у которых выявлялись КТ/МРТ признаки кисты на противоположной гемипарезу стороне до 4-6 мм в диаметре.

III группа — дети с ДЦП без каких-либо нейровизуализационных находок в головном мозге, в том числе и в ПВО (табл. 3).

Таблица 3

Распределение детей с ДЦП в зависимости от нейровизуализационных

находок

Форма ДЦП Изменения в ПВО

ПВЛ кисты в ПВО без изменений Итого

абс. % абс. % абс. % абс. %

двойная гемиплегия 21 100 - - - - 21 100

спастическая диплегия 25 41 35 59 60 100

гемипаретическая - - 29 65 15 35 44 100

Всего: 46 37 29 23 50 40 125 100

ПВЛ при нейровизуализации выявлена у 37% (46 чел.) обследованных, а именно: у всех детей с двойной гемиплегией (21 чел. - 100%) и у 41% (25 чел.) обследованных со спастической диплегией. Кисты в ПВО обнаруживались только при гемипаретической форме ДЦП (у 29 чел. - 65%) и составили 23% от всех обследованных детей с ДЦП. У 59% детей со спастической диплегией и у 35% больных гемипаретической формой ДЦП нейровизуализация не обнаружила какие-либо изменения в головном мозге. При изучении исходов ПВЛ у 48% обследованных детей с ДЦП развилась двойная гемиплегия, у 52% больных - спастическая диплегия. У 40% обследованных нами детей нейровизуализация не обнаружила какие-либо структурные изменения в ПВО.

Среди детей этой группы 69% составили больные со спастической диплегией и 31% с гемипаретической формой ДЦП. Таким образом, при развитии ПВЛ у детей с ДЦП наиболее чаще формируются спастическая диплегия и двойная гемиплегия. Одностороннее кистообразование в ПВО первостепенно приводит к развитию гемипаретических форм ДЦП.

Среди детей, матери которых во время беременности перенесли однократные ОРЗ или отмечали обострение хронической соматической патологии, ПВЛ выявлена у 48% детей, патологии в ПВО не обнаружено у 52% обследованных. Вышеизложенное позволяет предположить, что даже легкопротекающие ОРЗ или обострения хронических заболеваний у матери во время беременности являются фактором риска формирования у ребенка ПВЛ и, как следствие, двойной гемиплегии или спастической диплегии. В то же время, у более половины детей с указаниями на однократные респираторные заболевания или обострения хронических заболеваний, каких-либо

нейровизуализационных признаков патологии ПВО обнаружено не бьшо, что не исключает наличие у этой группы больных неизвестных патологических процессов на микроуровне, возможно, иммунопатологических.

Анализ тяжести неврологического дефицита, оцененного по шкалам АгЬгуогЛ, Клуба Моторики, Ривермид обнаружил достоверное преобладание тяжести картины ДЦП у детей с патологией ПВО (табл. 4).

Таблица 4

Распределение детей с нейровгоуалнзационными находками в

перивентрикулярной области по тяжести клинической картины ДЦП

Наличие патологии в ПВО Степень тяжести ДЦП (баллы по шкалам)

Аз1і\ігоі1:Ь Клуб моторики Ривермид

без патологии в ПВО (п=79) 1,7±0,4* 38±5,8** 26±6,8**

патология в ПВО (п=46) 2,5±0,5* 22±9,6** 13±5,3**

Примечание: *р <0,05; **р<0,001 (по вертикали)

У детей с патологией в ПВО обнаружена достоверно более тяжелая степень проявлений, по сравнению с группой больных ДЦП без патологии в ПВО. При оценке неврологического дефицита по всем используемым шкалам оценки тяжести шкала Ривермид продемонстрировала наибольшую чувствительность: клинические проявления заболевания достоверно отличались от тяжести ДЦП у детей без ПВЛ (р<0,001).

Таким образом, в результате проведенного анализа, можно утверждать, что дети со спастическими формами заболевания, родившиеся от матерей, перенесших во время беременности однократные ОРЗ или обострения хронической соматической патологии, а также с наличием структурных изменений в перивентрикулярной области, имеют более тяжелые клинические проявления и большую выраженность тяжести течения болезни. Гемипаретическая форма по сравнению со спастическими формами оказалась более благоприятной в своих клинических проявлениях. Тяжесть состояния больных со спастическими формами может объясняться недоношенностью и наличием ПВЛ. Но если сравнивать тяжесть течения заболевания в зависимости от отягощенности беременности, то дети от здоровой беременности также имеют тяжелые формы заболевания. Возможно, это может быть связано с течением определенных неспецифических, возможно, иммунопатологических процессов в перивентрикулярной области, инициированных внутриутробной или интранатальной гипоксией.

Цитогенетическое исследование выявило достоверное повышение среднего число эритроцитов с микроядрами (ЭМ) в в группе детей с ДЦП по сравнению с показателями спонтанного мутагенеза (0,79±0,21% и 0,29±0,18%, соответственно; р<0,05). Показатель цитогенетических нарушений в

эритроцитах колеблется от минимальных (0,56±0,19%) при гемипаретической форме до максимальных - (0,98±0,25%) при двойной гемиплегии (р<0,05) (табл. 5).

Таблица 5

Распределение детей по числу эритроцитов с микропдрами по полу и

формам ДЦП

Группы обследованных детей Число эритроцитов с микроядрами, %

мальчики девочки среднее значение в группе

контроль (п = 20) 0,24±0,09* 0,35±0,02* 0,29±0,18*

двойная гемиплегия (п = 21) 1,39±0,13* 0,43±0,21* 0,98±0,25*

спастическая диплегия (п = 60) 0,71±0,09* 0,40±0,14* 0,62±0,16*

гемипаретическая (п = 44) 0,68±0,08* 0,38±0,22* 0,56±0,19*

Итого (п=125) 1,0±0,01** 0,41±0,28** 0,79±0,21*

Примечание: *р<0,05 (по горизонтали и по вертикали); **р<0,01 (по горизонтали)

Выявленные цитогенетические нарушения свидетельствуют о дестабилизации генома обследованных больных. Нестабильность генома может возникнуть в условиях повышенной генерации эндомутагенов, приводящих к повреждению метаболических циклов анеугенеза и, как следствие к увеличению числа клеток с цитогенетическими перестройками.

Для более детального изучения возможных генераторов активных процессов эндомутагенеза у детей с ДЦП, исследованы показатели нестабильности генома в зависимости от нейровизуализационных находок в ПВО. Установлено, что у больных, перенесших ПВЛ, число ЭМ достоверно выше показателей с кистами в ПВО (0,94±0,15% и 0,43±14% соответственно, р<0,05) (табл. 6). Показатель активности эндомутагенеза у детей с ПВЛ оказался достоверно выше по сравнению с детьми без каких-либо изменений в ПВО и детей с кистообразованием (0,94±0,15%; 0,59±0,06% и 0,43±0,М% соответственно; *р<0,05). Выявлено достоверное превышение уровня ЭМ у детей с двойной гемиплегией в исходе ПВЛ над показателем детей со спастической диплегией, развившейся в результате ПВЛ (0,98±0,25% и 0,89±0,17%, соответственно; р<0,05). Сравнение показателей нестабильности генома у больных со спастической диплегией в зависимости от изменений в ПВО выявило достоверное преобладание цитогенетических нарушений при ПВЛ (0,89±0,17%) по сравнению с показателями детей без изменений в ПВО (0,76±0,12%; р<0,05).

Полученные данные могут свидетельствовать о наличии процессов (возможно, иммунопатологических), усиливающих дестабилизацию клеточного генома в организме у детей с ПВЛ с исходом в спастические формы ДЦП.

Таблица б

Число эритроцитов с микроядрами у детей с ДЦП с различными _изменениями в перивентрикулярной области_

Изменения в перивентрикулярной области Число ЭМ (%) у детей с различными формами ДЦП Всего

двойная гемиплегия (п=21) спастическая диплегия (п=60) гемштаре-тическая форма (п=44)

перивентрику-лярная лейко-маляция (п=46) 0,98±0,25* 0,89±0,17* - 0,94±0,15*

кисты (п=29) - - 0,43±0,14* 0,43±0,14*

без изменений (п=50) - 0,76+0,12* 0,42±0,12* 0,59±0,06*

контроль (п=20) 0,29±0,13*

Примечание: *р<0,05 (по вертикали)

Между степенью тяжести двигательных нарушений, оцененной различными адаптированными к детскому возрасту шкалами, и уровнем нестабильности клеточного генома, оцененного микроядерным тестом, существует корреляционная зависимость. Наиболее чувствительной оказалась шкала Ривермид, убедительно продемонстрировавшая изучаемую взаимосвязь: чем тяжелее неврологический дефицит, тем более выраженные процессы эндомутагенеза протекают у больных ДЦП.

Таким образом, у детей с ПВЛ имеет место дестабилизация генома, коррелирующая с тяжестью клинических проявлений ДЦП. Следовательно, существуют неизвестные механизмы, провоцирующие цитогенетические нарушения в клетках периферической крови и усиливающие спонтанный эндомутагенез. Наиболее вероятным генератором эндомутагенеза у детей с ПВЛ может быть иммунопатологический процесс.

Анализ результатов иммунологических исследований показал, что у детей с ДЦП имел место выраженный дефицит основных популяций лимфоцитов в целом, и субпопуляций Т-лимфоцитов. Сравнительный анализ показателей клеточного звена иммунитета у детей с ДЦП в зависимости от изменений в ПВО выявил наиболее низкие показатели СБ 19+ лимфоцитов и СБЗ+С04+ лимфоцитов (0,87х109 /л и 0,66х109 /л, соответственно; р<0,05) у детей, перенесших ПВЛ, по сравнению с контрольной группой (1,18х109 /л и 1,77x109/л, соответственно р<0,05).

Установлены достоверные различия между содержанием лимфоцитов (СБЗ+; СЭ19+; СПЗ+С08+) у детей со спастической диплегией и таковыми у

детей с гемипаретической формой: в первой группе показатели значительно ниже, чем во второй (1,43x10® /л , 0,63*109 /л , 0,56хЮ9 /л и 2,08x10 /л , 0,69* 109 /л , 1,06x109 /л , соответственно; р<0,01; р<0,05), и при этом все показатели оказались достоверно ниже по сравнению с показателями контрольной группы (р<0,01; р<0,05) (табл. 7).

Таблица 7

Содержание субпопуляций лимфоцитов в зависимости от формы ДЦП

Форма ДЦП

спастическая диплегия (п=25)

Популяции и субпопуляции лимфоцитов

лимф.(абс.) ( хЮ9/л)

2,42±1,15*

СОЗ+ ( хЮ9/л)

1,43±0,64**

СО 19+ ( х Ю9/л)

0,63±0,48*

С03+С08+ ( хЮ9/л)

0,56±0,24*

гемипаретическая форма (п=20)

3,58±0,94

2,08±0,46

0,69±0,19*

1,06±0,15*

контроль (п=20)

4,58±1,76*

2,74±1,19*

1,18±0,37*

1,77±0,78*

Примечание: *р<0,01; **р<0,05 (по вертикали)

Наряду с этим, выявлено, что при среднетяжелой и тяжелой степени ДЦП (по шкалам спастичности АбЬ\¥ог1Ь, Клуба Моторики, Ривермид) также отмечались достоверно более низкие уровни содержания лимфоцитов по сравнению с контрольной группой (р<0,01; р<0,05).

Изучение окислительно-восстановительной активности нейтрофилов в НСТ -тесте обнаружило превышение НСТ-спонт. и ИАН-спонт. более, чем в 2 раза у детей с ДЦП (27,7±19,9% и 0,34±0,28 усл. ед.) по сравнению со здоровыми детьми (11,0±12,5% и 0,12±0,08 усл. ед. , соответственно; р<0,05). При изучении показателей окислительно-восстановительной активности нейтрофилов у обследованных в зависимости от нейровизуализационных изменений в ПВО у детей с ДЦП с верифицированной ПВЛ показатели достоверно превышали уровень здоровых (соответственно 30,8±17,5% и 0,39±0,28 усл. ед. против 11,0±12,5% и 0,12±0,08 усл. ед. в контрольной группе; р<0,01) (табл.8).

Данные показатели достоверно превышали аналогичные и у детей со спастической диплегией по сравнению у детей контрольной группы (36,8±16,4% и 0,42±0,2 усл.ед. против 11,0±12,5% и 0,12±0,08 усл.ед., соответственно; р<0,01).

Принимая во внимание, что показатели НСТ-теста являются отражением окислительно-восстановительной активности нейтрофилов, полученные высокие показатели НСТ-спот. могут свидетельствовать о наличии у детей с ДЦП факторов, способствующих активации нейтрофилов, например, наличие поврежденных астроцитов в ПВО. В результате исследования установлено, что у детей с ПВЛ и тяжелым течением ДЦП снижение содержания популяций и субпопуляций лимфоцитов сопровождается достоверным повышением функциональной активности фагоцитарного звена иммунной системы. Возможно, этот феномен можно рассматривать как компенсаторный.

Таблица 8

Показатели окислительно-восстановительной активности нейтрофилов у детей с ДЦП в зависимости от изменений в перивентрикулярной области

Изменения в перивентрикулярной области Показатели окислительно-восстановительной активности нейтрофилов

НСТ спон. % ИАН спон. (усл.ед.)

перивентрикулярная лейкомаляция (п=23) 30,8±17,5* 0,39±0,28**

кисты (п=15) 25,7±32,7 0,31±0,42

без изменений (п= 7) 21±16,1 0,24±0,2

контроль (п=20) 11,0±12,5* 0,12±0,08**

Примечание: * р<0,05; ** р<0,01

Анализ результатов, полученных нами при изучении содержания ТЫР-а, выявил некоторые различия у обследованных: у детей с ДЦП уровень ТЫР-а в сыворотке крови составил 8,17±6,99 пг/мл, в слюнной жидкости - 27,54±17,44 пг/мл, достоверно выше, чем у здоровых (соответственно 0,74±0,87пг/мл и 1,99±1,11 пг/мл; р<0,05). Кроме того, наличие или отсутствие в анамнезе у матерей однократных ОРЗ во время беременности не влияло на уровень Т№-а: независимо от данного фактора показатели в исследованных биологических жидкостях достоверно превышали уровень здоровых детей. Наиболее высокое содержание ШИ-а выявлено у детей со спастической диплегией и составил соответственно в сыворотке крови 11,7±7,79 пг/мл, в слюнной жидкости -27,4±19,64 пг/мл (р<0,01). В то же время у детей с гемипаретической формой отмечался достоверно высокий уровень ТЫР-а в слюнной жидкости по сравнению с показателем у здоровых детей. При изучении содержания ТЫР-а в зависимости от степени тяжести ДЦП, оцененной по шкалам спастичности АбЬугоПЬ, Клуба Моторики и Ривермид выявлено достоверное повышение изученного цитокина у детей со средней и тяжелой степенью заболевания. Анализ содержания ТЫР-а в зависимости от наличия ПВЛ выявил достоверное (р<0,05) повышение уровня ТЫР-а сыворотки крови у детей с ПВЛ с исходом в ДЦП по сравнению с группой детей с ДЦП без признаков перенесенной ПВЛ (соответственно 13,2±4,85 пг/мл и 7,04±6,08 пг/мл).

Можно предположить, что деструктивные процессы в ПВО приводят к формированию неспецифического воспаления аутоиммунного характера, а синтез ТЫР-а приводит к развитию самоподдерживающегося процесса, обусловливающего его хроническое течение.

Установлена сильная положительная корреляционная зависимость между уровнем ТЫР-а в сыворотке крови и слюнной жидкости и абсолютным содержанием лимфоцитов в периферической крови (соответственно 11=0,71 и

11=0,67) (рис. 1, 3) у детей, перенесших ПВЛ. У детей без изменений в ПВО имела место отрицательная корреляционная связь между аналогичными показателями (К= - 0,83 и И= - 0,38 соответственно) (рис.2,4), как и у детей контрольной группы (11= - 0,45).

в 20 -|

§

Й 15 -1

Си о с;

со -£10 -

о с

а

£ 5 -

Н 0 -

11=0,71

а

20 л 15 |ЮН

и

е 5 Н

о

-5

4)

- 0,83

X

абсолютное содержание лимфоцитов тыс. в мкл

Рис. 1 Кривая зависимости уровня ТЬТ-а сыворотки крови и абсолютного содержания

лимфоцитов в группе детей, перенесших ПВЛ

Рис. 2 Кривая зависимости уровня ТТчТ-а сыворотки крови и абсолютного содержания

лимфоцитов в группе без патологии перивентрикулярной области

11=0,67

а ■

£ Н

60 • 50 " 40 • 30 20 10 0

Я= - 0,37

абсолютное содержание лимфоцитов тыс. в мкл

Рис. 3 Кривая зависимости ТЫР-а слюнной жидкости и абсолютного содержания лимфоцитов в группе детей, перенесших ПВЛ

Рис. 4 Кривая зависимости ТЫБ-а слюнной жидкости и абсолютного содержания лимфоцитов в группе без патологии перивентрикулярной области

2

2

О

О

О

1

2

О

40

TNF-a слюны в пг/мл

TNF-а сыворотки кровив пг/мл

Рис. 6 Кривая зависимости уровня TNF-a слюны и ЭМ (%) в группе с

Рис. 5 Кривая зависимости уровня

ПВЛ

ТОТ-а сыворотки крови и ЭМ в группе с ПВЛ

Наряду с этим у детей без ПВЛ аналогично группе контроля выявлена средняя отрицательная корреляционная связь (11= - 0,29) между содержанием ТОТ-а сыворотки крови и ЭМ.

Таким образом, у детей с ДЦП в исходе ПВЛ выявлены два значимых звена патогенеза: с одной стороны нестабильность клеточного генома, выражающаяся в увеличении числа клеток с цитогенетическими нарушениями, с другой стороны - иммунные нарушения, характеризующиеся снижением абсолютного количества лимфоцитов, высокой окислительно-восстановительной активности нейтрофилов и увеличением содержания цитокина ЮТ-а в сыворотке крови и слюнной жидкости. Не исключено, что эти звенья взаимосвязаны и свидетельствуют об активных биохимических процессах, текущих в организме детей с ДЦП. С этих позиций патология в ПВО может рассматриваться как текущий, возможно, иммунопатологический процесс, инициированный внутриутробной гипоксией и продолжающийся в ранней резидуальной стадии ДЦП.

1. Структура клинических синдромов ДЦП, сформированного в исходе ПВЛ характеризуется развитием спастического тетрапареза (двойной гемиплегии - 48%, спастической диплегии - 52%). Одностороннее кистообразование сопровождается у 65% детей формированием гемипаретической формы. Степень тяжести нарушений двигательной сферы при оценке шкалами спастичности Ashworth, Клуба Моторики и Ривермид достоверно преобладает у детей с ДЦП, сформированным в исходе ПВЛ. Достоверно объективной и более расширенной является шкала Ривермид.

Выводы

2. Тяжесть клинических проявлений ДЦП, сформированного в исходе перивентрикулярной лейкомаляции, взаимосвязана с уровнем анеугенеза в эритроцитах периферической крови: чем тяжелее клинические проявления ДЦП, тем достоверно выше уровень цитогенетических нарушений (11=0,82). При легкой степени ДЦП в исходе перивентрикулярной лейкомаляции число клеток с цитогенетическими нарушениями составляет - 0,56±0,19%, при средней степени - 0,62±0,16%, при тяжелой - 0,98±0,25%.

3. У детей со спастическими формами ДЦП, сформированного в исходе перивентрикулярной лейкомаляции обнаружены иммунные нарушения. При перивентрикулярной лейкомаляции с исходом в спастические формы ДЦП констатировано достоверное перераспределение иммунокомпетентных клеток со снижением уровня абсолютного содержания лимфоцитов, активацией фагоцитарного звена и повышенным синтезом ТНР-а.

4. Уровень ТКФ-а в сыворотке крови и слюнной жидкости коррелирует с показателем дестабилизации клеточного генома, что свидетельствует о существовании активных иммунопатологических процессов в организме больных ДЦП, сформированного в исходе ПВЛ.

Практические рекомендации

1. Детям с ДЦП рекомендована оценка тяжести двигательных нарушений с использованием оценочной шкалы Ривермид, адаптированной к детскому возрасту.

2. При оценке состояния детей с ДЦП, сформированного в исходе ПВЛ, и при прогнозировании ДЦП целесообразно учитывать совокупность информативных иммунологических показателей с параметрами цитогенетических нарушений в клетках периферической крови.

3. Рекомендовано использование неинвазивного метода определения уровня ТКР-а у детей с ДЦП в слюнной жидкости.

Список опубликованных работ

1. Гайнетдинова Д. Д. Цитогенетические нарушения в клетках периферической крови новорожденных с менингоэнцефалитом / Д.Д. Гайнетдинова, Л.З. Гайсина, Ф.М. Казакова // Тезисы докладов УИ-ого Российского конгресса "Современные технологии в педиатрии и детской хирургии". - Москва, 2008. - С. 35-36

2. Гайсина Л.З. Анализ дестабилизации генома и неврологических нарушений у новорожденных с внутриутробной инфекцней/ Л.З. Гайсина, Д.Д. Гайнетдинова // тезисы докладов научно-практической Поволжской конференции. - Казань. - 2009. - С. 67-68.

3. Гайсина Л.З. Цитогенетические нарушения в периферической крови новорожденных с гипоксически - ишемическим поражением головного мозга / Л.З. Гайсина, Д.Д. Гайнетдинова // Сб. трудов науч.-практич. конфер. Неврологов Северо - западного федерального округа "Актуальные проблемы неврологии - Сыктывкар, 2009. - С. 15-16.

4. Гайсина Л.З. Клинико - цитогенетическое сопоставление у новорожденных с внутриутробным инфицированием / Л.З. Гайсина // Материалы XIV

Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые в медицине»,- Казань. - 2009.- С. 143 - 144.

5. Гайсина Л.З. Клинический и микроядерный анализ новорожденных с внутриутробным менингоэнцефалитом / Л.З. Гайсина, Д.Д. Гайнетдинова, С.А. Степанова // тезисы Респ. научно - практической конф. с всероссийским участием, посвященной 5-летию организации Центра экстрапирамидной патологии «Дегенеративные и сосудистые заболевания экстрапирамидной нервной системы. Высокие технологии в диагностике и лечении». - Казань -

2009. - С.7-8.

6. Гайсина Л.З. Цитогенетические нарушения в клетках периферической крови у новорожденных с внутриутробным инфицированием / Л.З. Гайсина, Д.Д. Гайнетдинова // Сб. научн трудов конгресса "Актуальные проблемы управления здоровьем населения". - Нижний Новгород, 2009. - С. 38-39.

7. Гайсина Л.З. Исследование нестабильности генома у новорожденных при внутриутробном инфицировании с вовлечением центральной нервной системы / Л.З. Гайсина // Сборник научных работ студентов и молодых ученых Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 1000-летию г. Ярославля «Актуальные вопросы медицинской науки».-Ярославль.-2010.-С. 238.

8. Гайсина Л.З. Уровень эритроцитов с микроядрами у новорожденных с гипоксически - ишемическим поражением центральной нервной системы / Л.З. Гайсина // Материалы XV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые в медицине»,- Казань.- 2010-С.35-36.

9. Гайнетдинова Д.Д. Механизмы, дестабилизирующие геном у детей с перивентрикулярной лейкомаляцией, больных детским церебральным параличом» «Молекулярные основы наследственной патологии»/Д.Д. Гайнетдинова, Д.В. Айзатулина, Э.Ф. Юсупова, Л.З. Гайсина //Материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков. - Ростов -на-Дону -

2010,- С.42

10. Гайнетдинова Д.Д. Клинико - эпидемиологическая характеристика и анализ некоторых факторов риска детского церебрального паралича по данным госпитального регистра Республики Татарстан / Д.Д. Гайнетдннова, Л.З. Гайсина // Казанский медицинский журнал.- 2011,-С.328-332.

11. Гайсина Л.З. Нейроиммунологические аспекты патогенеза детского церебрального паралича/ Л.З. Гайсина, Д.Д. Гайнетдинова, Р.Ф.Хакимова// Медицинская иммунология.- 2011,- том 13.- № 2-3.- С.115-120.

12. Гайнетдинова Д.Д. Клинико-иммунологические и цитогенетические аспекты патогенеза спастических форм детского церебрального паралича / Д.Д. Гайнетдинова, Л.З. Гайсина, Р.Ф.Хакимова// Медицинская иммунология.- 2012.- том 14.- № 6. - С.507-512.

13. Гайсина Л.З. Особенности процессов дестабилизации клеточного генома у новорожденныхс внутриутробным инфицированием центральной нервной системы / Л.З. Гайсина // Материалы XVII Всероссийской научно-практической

конференции с международным участием «Молодые ученые в медицине». -Казань.-2012.-С.56.

14. Гайсина Л.З. Оценка тяжести неврологических проявлений у детей с перивентрикулярной лейкомаляцией с исходом в детский церебральный паралич / Л.З. Гайсина, Д.Д. Гайнетдинова // Материалы Х-ого Всероссийского съезда неврологов с международным участием. - Нижний Новгород. - 2012. -С.516-517.

15. Гайнетдинова Д.Д. Динамика уровня каталазы и малонового диальдегида на фоне ионотерапии кортексином у детей со спастической диплегией в исходе перивентрикулярной лейкомаляции / Д.Д. Гайнетдинова, Д.В. Айзатулина, Э.Ф. Юсупова, Л.З. Гайсина // Материалы Х-ого Всероссийского съезда неврологов с международным участием. - Нижний Новгород.-2012. - С.516.

16. Гайнетдинова Д.Д. Феномен нестабильности клеточного генома в патогенезе детского церебрального паралича / Д.Д. Гайнетдинова, Л.З. Гайсина // Журнал неврологии и психиатрии имени С.С. Корсакова. - 2012. — том 112. - №10. — С.49-51.

17. Гайнетдинова Д.Д. Содержание ТОТ-а у детей со спастическими формами детского церебрального паралича в исходе перивентрикулярной лейкомаляции / Д.Д. Гайнетдинова, Л.З. Гайсина// Материалы II ежегодной междисциплинарной научно-практической конференции с международным участием «Детский церебральный паралич и другие нарушения движения у детей».-Москва, —2012. —С.51.

18. Гайнетдинова Д.Д. Клишпсо-иммунологическое обследование больных со спастическими формами детского церебрального паралича / Д.Д. Гайнетдинова, Л.З. Гайсина // Неврологический вестник. Журнал им. В.М. Бехтерева. - 2012. - Т. ХЫУ. - вып. 4. - С.9-15.

Подписано в печать 10.03.2013. Форм. бум. 60x84 1/16. Печ. л. 1. Тираж 100. Заказ Лг»1103/3. Отпечатано с готового оригинал - макета в типографии «Вестфалика» (ИП Колесов В Н.) 420111, г. Казань, ул. Московская, 22. Тел.: 292-98-92 e-mail: westfalika@inbox.ru