Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Особенности иммунитета у больных меланомой и эффективность применения интерферона-альфа в комплексном лечении

На правах рукописи

Иванов Евгений Александрович

ОСОБЕННОСТИ ИММУНИТЕТА У БОЛЬНЫХ МЕЛАНОМОЙ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИНТЕРФЕРОНА-АЛЬФА В КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск - 2004

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения Российской Федерации» и в Челябинском областном онкологическом диспансере.

Научный руководите.1ь:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук,

профессор Теплова Светлана Николаевна

Научный консультант:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук,

профессор Важенин Андрей Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Аклеев Александр Васильевич

доктор медицинских наук,

профессор Фёдоров Игорь Анатольевич

Ведущая организация: Российский государственный

медицинский университет;

2004 г. в

г. Москва

Защита диссертации состоится « /¿Г» часов на заседании Диссертационного совета Д2ш. 117. 03 приГосуцар-ственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения Российской Федерации», по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения Российской Федерации»

Автореферат разослан « ^^» & 2004 г.

Учёный секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук,

профессор Телешева Л.Ф.

¿LfrOï-ï <F<f<?<?OÔ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность изучения меланомы кожи определяется стремительными темпами роста заболеваемости (Kuhn С.A., Hanke C.W., 1997), высокой агрессивностью этой опухоли и отсутствием удовлетворительных результатов лечения. Особое внимание привлекают иммунологические аспекты данной проблемы. Согласно современным представлениям, меланома кожи является одной из наиболее иммуногенных опухолей (Брондз Б.Д., Балашов К.Е., 1991). Это положение основано на клинических наблюдениях и результатах многочисленных экспериментальных ' работ (Носов Д.А., 2001). Непредсказуемое течение заболевания, отме-

ченные в литературе случаи спонтанных регрессий меланомы издавна наводили на мысль о способности организма к контролю опухолевого роста В последние годы открыт ряд меланома-ассоциированных антигенов, которые способны вызывать развитие иммунного ответа. К ним относятся Melan A/MART-1, антигены групп MAGE, В AGE, GAGE, LAGE / NY-ESO-1, TRP-1, TRP-2, gpl00/pmell7, распознаваемые Т-лимфоцита-ми (Балдуева И А., 2001; Москалева Е.Ю., Северин С.Е., 2002; Aarnoudse С.A et al, 1999; Labarriere N et al. 1998; Rosenberg S.A., 1996) и гангли-озидные антигены GM2, GM3, GD2, GD3, служащие мишенью для антител (Cebón J. et al., 1997; Takahashi T. et al., 1999). Вместе с тем, в клинике довольно часто наблюдается быстрое развитие диссеминации процесса, когда иммунная система не в состоянии контролировать опухоль. Это связано со способностью меланомы уходить от иммунного ответа - и механизмы данного явления охарактеризованы далеко не полностью. Цельного представления о месте иммунной системы и ее медиаторов в контроле опухолевого роста при меланоме, как и при других новообразованиях, до сих пор не выработано. Во многом это обусловлено тем, что в доступной литературе практически отсутствуют работы, посвященные комплексному изучению иммунной системы у пациентов с разными стадиями меланомы кожи. Активационные маркеры лимфоцитов периферической крови и процессы их апоптоза. дающие существенную информацию о состоянии иммунной системы, при меланоме остаются малоисследованными. Слабо освещены вопросы, касающиеся системы комплемента. » Получение таких сведений имеет значение для лучшего понимания слож-

ных взаимоотношений меланомы и иммунной системы в ходе развития опухолевого процесса, постижения основных причин неэффективности противоопухолевого ответа in vivo, осмысления механизмов формирования иммунодепрессии, индуцированной меланомой.

Иммунозависимость меланомы наряду с известной устойчивостью

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯj БИБЛИОТЕКА [

этой опухоли к химио- и радиотерапии определяет необходимость оценки возможностей иммунотропнъгх агентов в лечении больных. Ввиду частого развития метастазов меланомы после ее адекватного хирургического иссечения особого внимания заслуживает исследование эффективности адъ-ювантных режимов иммунотерапии, используемых для воздействия на клетки опухоли, оставшиеся в организме после радикальной операции Согласно клиническим и экспериментальным исследованиям, из всех доступных на сегодняшний день иммуномодуляторов наибольшим противоопухолевым потенциалом при меланоме обладает интерферон-альфа (ИФНа). Этот цитокин стимулирует экспрессию на клетках меланомы антигенов гистосовместимости I класса (ОееПяеп Я. С. й а1., 1998), улучшая распознавание опухоли Т-лимфопитами, активирует естественные киллеры, стимулирует противоопухолевую цитотоксичность макрофагов ИФНа угнетает неоангиогенез в опухоли (.ТопаясЬ Е , На1ияЬка Кв., 2001), лишая ее кислорода и питательных веществ Экспериментальные исследования показали, что ИФНа оказывает также прямое ингибирующее действие на пролиферацию опухолевых клеток, и в отношении клеток меланомы настоящий эффект выражен лучше всего (Молчанов О.Е. и соавт., 2001).

Окончательной ясности в отношении использования адъювантной иммунотерапии при меланоме пока нет, хотя положительный опыт применения интерферона в лечении пациентов с этой опухолью к настоящему времени уже накоплен (Демидов Л В., Харкевич ГЮ , 2001, Кдгк\уоос1 I М е1 а1, 2000, 2001) Существенная токсичность эффективных высо-кодозных режимов и недостаточная результативность хорошо переносимых низкодозных схем адъювантной иммунотерапии затрудняют выбор стандарта лечения.

Все вышесказанное свидетельствует об актуальности проблемы меланомы для современной науки и практики и убеждает в необходимости изучения иммунологических аспектов этого вопроса.

Цель исследования: анализ особенностей иммунитета у больных меланомой и эффективности адъювантной иммунотерапии низкими дозами реаферона для выявления патогенетически значимых нарушений иммунитета и оптимизации лечения.

Задачи исследования:

1. Выявить иммунологические особенности при меланоме в сопоставлении с донорами и больными, имеющими немеланомные опухоли кожи.

2 Оценить характер изменений иммунитета у пациентов на разных стадиях первичной меланомы и при вторичной меланоме

3. Провести ретроспективный анализ клинической эффективности низких доз реаферона после оперативного лечения больных меланомой кожи (по материалам Челябинского областного онкологического диспансера за последние 10 лет).

Научная новизна. Впервые при меланоме кожи на разных стадиях заболевания проведено комплексное исследование показателей клеточного и гуморального иммунитета, включающее определение субпопуля-ционного состава лимфоцитов с широким спектром дифференцировоч-ных и активационных маркеров, морфологическую оценку апоптоза им-муноцитов, изучение системы комплемента. Новыми являются данные о динамике численности С016' и СТ)22' лимфоцитов на разных стадиях меланомы кожи, о количестве клеток, экспрессирующих маркеры активации: С025, С071, СЮ95 и НЬА-ЕЖ, а также о состоянии системы комплемента при меланоме.

Теоретическое значение работы состоит в уточнении механизмов формирования иммунных дисфункций при меланоме и разработке схемы иммунологических аспектов ее патогенеза на основе собственных и литературных данных.

Практическая значимость работы. Впервые оценена клиническая результативность варианта адъювантной иммунотерапии (АИТ) реа-фероном (по 3 млн. МЕ в сутки в течение 10 дней, интервал между курсами 3-4 недели) при первичной меланоме кожи на разных стадиях заболевания и при вторичной меланоме. Впервые получены данные об эффективности указанной схемы АИТ при вторичной меланоме в форме метастазов в регионарные лимфоузлы. Эти данные будут способствовать индивидуализации подхода к использованию иммунотерапии в лечении пациентов с меланомой кожи.

Внедрение результатов исследования в практику.

Результаты исследования внедрены в практику работы Челябинского областного онкологического диспансера и в учебный процесс кафедры иммунологии и аллергологии ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия МЗ РФ» и кафедры онкологии и радиологии ГОУ ДПО «Уральская государственная медицинская академия дополнительного образования МЗ РФ»

Положения, выносимые на защиту.

1 Характер изменений иммунитета у пациентов с меланомой кожи зависит от стадии опухолевого процесса' повышение численности естественных киллеров и В-лимфоцитов периферической крови при I стадии

меланомы сменяется сокращением этих популяций, а также популяции Т-цитотоксических клеток при II стадии и дальнейшим снижением числа естественных киллеров - при III стадии заболевания. Прогрессирование опухолевого процесса при меланоме сопровождается нарушениями активации лимфоцитов периферической крови и снижением их пролифера-тивного потенциала.

2. Уменьшение численности естественных киллеров и нарушение процессов активации лимфоцитов при прогрессировании заболевания являются ключевыми механизмами снижения иммунного контроля опухолевого роста у больных меланомой.

3. Тестируемая схема адъювантной иммунотерапии способствует увеличению безрецидивной выживаемости после хирургического лечения пациентов с вторичной меланомой в форме метастазов в регионарные лимфоузлы.

Апробация диссертации.

Материалы работы были представлены в докладах и обсуждались на 55-ой Студенческой конференции ЧелГМА (Челябинск, 2001), Третьей Российской Межрегиональной Конференции «Новые технологии и фундаментальные исследования в медицине» (Челябинск, 2002), Первой конференции молодых онкологов Уральского федерального округа (Челябинск, 2003), региональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы лекарственной терапии и терапии сопровождения злокачественных новообразований» (Челябинск, 2003).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 187 страницах машинописного текста, иллюстрирована 43 рисунками и 44 таблицами. Состоит из введения, шести глав (одна из которых - обзор литературы), заключения, выводов, практических рекомендаций, списка аббревиатур и библиографического указателя. Последний включает 214 источников, из них 75 отечественных и 139 иностранных

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Работа была проведена на базе Челябинского областного онкологического диспансера (ЧООД) и включала ретроспективный анализ эффективности низкодозовой адъювантной иммунотерапии реафероном при меланоме кожи и иммунологическое обследование пациентов.

Изучение особенностей иммунитета было проведено у 123 человек. При поступлении в стационар с октября 2001 по апрель 2003 года было иммунологически обследовано 55 больных с меланомой кожи (36 с первичной и 19 с вторичной), 6 пациентов с увеальной меланомой, а также 27 больных с немеланомными новообразованиями кожи, не склонными к метастазированию (доброкачественные опухоли и базалиомы), которые составили группу контроля. В группу контроля были включены пациенты с новообразованиями, потребовавшими проведения дифференциального диагноза с меланомой кожи. В качестве второй контрольной группы использовали показатели 35 условно здоровых доноров После лечения в стационаре было проведено иммунологическое обследование 22 лиц. 11 пациентов после оперативного лечения, и также 11 больных после хирургического лечения, дополненного иммунотерапией.

В ретроспективное исследование эффективности адъювантной иммунотерапии реафероном вошли 270 больных с первичной меланомой кожи 1-Ш стадии и 76 пациентов с вторичной меланомой, проходивших обследование и лечение в Челябинском областном онкологическом диспансере с января 1993 по апрель 2003 года. Пациенты получали один из двух вариантов лечения.

Первый вариант - радикальное хирургическое удаление первичной опухоли и/или метастазов (в зависимости от эпизода заболевания и стадии). Данный подход использовался у 215 больных с первичной меланомой кожи и у 40 пациентов с вторичной меланомой

Второй вариант - после радикального иссечения первичного очага и/или метастазов проводилась адъювантная иммунотерапия реафероном (рекомбинантным интерфероном-альфа) по следующей схеме- по 3 млн. МЕ внутримышечно, 1 раз в сутки в течение 10 дней Количество курсов определялось индивидуально, интервал между курсами составлял 3-4 недели Этот вариант лечения получали 55 больных с первичной меланомой кожи и 36 пациентов с вторичной меланомой.

Стратификацию больных первичной меланомой осуществляли согласно объединенной классификации ТТММ/1ЛСС/А1СС 1997 года (Демидов Л.В., Харкевич Г.Ю , 2003) Под вторичной меланомой подразумевали рецидивы и/или метастазы меланомы, возникшие после ранее проведенного радикального лечения (Фрадкин С 3., Залуцкий И.В , 2000).

Диагноз «меланома» у всех больных был подтвержден гистологическим исследованием опухоли. В работе также использовали результаты рентгенологического и ультразвукового исследований, данные магнитно-резонансной и компьютерной томографии (для обнаружения метастатических очагов).

Анализ популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови проводили непрямым иммунофлюоресцентным методом с использованием моноклональных антител производства НПО «Препарат» (Н Новгород) к дифференцировочным антигенам CD3, CD4, CD8, CD16, CD22 и активационным антигенам HLA-DR, CD25, CD71, CD95, а также к маркеру «наивных» Т-лимфоцитов CD45RA Морфологическую оценку апоптоза осуществляли путем окрашивания флюоресцентным ядерным красителем Hoechst 33342 (Boehringer Mannheim) Содержание иммуноглобулинов A, M, G в сыворотке крови определяли в реакции радиальной иммунодиффузии (реагенты Горьковского НИИ эпи- «

демиологии и микробиологии), общую активность комплемента - по 50% гемолизу, активность Cl - С5 компонентов комплемента - методом молекулярного титрования (реагенты Кировского НИИ гематологии и переливания крови), уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) - методом неспецифической полиэтиленгликоль-преципитации. Определение уровня TNFa в сыворотке крови выполняли непрямым иммуно-ферментным методом с использованием тест-системы «Вектор-Бест»

Обработку данных и их статистический анализ проводили с помощью компьютерных программ Microsoft Access и Microsoft Excel, а также Statistica 6.0. О достоверности отличий иммунологических показателей судили на основании непараметрического критерия Манна-Уитни, корреляционный анализ проводили методом Спирмена. Прогностические факторы изучали с помощью регрессионной модели Кокса Значимость отличий кумулятивной выживаемости по Каплану-Мейеру (безрецидивной и общей) оценивали на основании тестов Гехана-Вилкоксона, Пето-Вилкоксона, Кокса-Ментела, а также логарифмического рангового критерия. При сравнении процентной выживаемости прослеженных пациентов (от однолетней до пятилетней) использовали критерий хи-квад-рат и точный критерий Фишера, а также критерий Ментела-Хенцела для контроля влияния локализации опухолевого процесса на выживаемость Все различия считали существенными при р < 0,05. Результаты исследования и их обсуждение В результате проведенного анализа выяснилось, что при сопоставлении с донорами у больных меланомой кожи наблюдается увеличение 1 относительного и абсолютного числа CD16' и CD22+ лимфоцитов, а также снижение абсолютного количества и доли Fas-позитивных клеток. Что касается показателей гуморального иммунитета, при меланоме в сопоставлении с донорами снижен уровень IgG, повышен уровень IgA, уменьшена активность Cl, С2, С5 компонентов комплемента и общая активность комплемента, повышен уровень ЦИК.

При сравнении с группой немеланомных новообразований кожи у больных меланомой снижена численность С095тсубпопуляции лимфоцитов, уменьшена доля лимфоцитов, экспрессирующих молекулы HLA-DR, а, кроме того, зафиксирована тенденция к более высокой активности СЗ-компонента комплемента.

Таким образом, при меланоме отмечены изменения иммунологических показателей как в сопоставлении с донорами, так и с больными, имеющими немеланомные новообразования кожи.

Следующий этап анализа был посвящен изучению иммунологических показателей у больных меланомой кожи в зависимости от стадии и эпизода заболевания для более глубокого понимания природы и значения выявленных изменений Как показало наше исследование, начало заболевания (I стадия меланомы кожи) характеризуется ответом на опухоль как врожденных, так и приобретенных механизмов иммунитета, о чем свидетельствует повышение относительного и абсолютного количества CD16 и CD22+ популяций лимфоцитов периферической крови - в сопоставлении с условно здоровыми донорами и больными, имеющими немеланомные опухоли кожи (рис 1).

Дальнейшее развитие меланомы (II стадия), выражающееся в усилении ее злокачественности в результате отбора клеток, наиболее устойчивых к действию иммунных эффекторных механизмов, увеличении размеров опухоли и ее проникновении в глубокие слои кожи и в подкожную клетчатку, сопровождается, по нашим данным, значимым снижением численности естественных киллеров (CD16+), B-лимфоцитов (CD22+) а также и Т-цитотоксических клеток (CD8 ) периферической крови в сравнении с I стадией заболевания.

Появление регионарных метастазов на фоне первичной опухоли (III стадия) ассоциируется с усугублением иммунодепрессии, на что указывает дальнейшее снижение численности естественных киллеров, а также активированных клеток, несущих рецепторы к ИЛ-2 (CD25), к Fas-ли-ганду (CD95+) и к трансферрину (CD71+). При III стадии меланомы кожи достоверно выше, по сравнению с I стадией, уровень IgA в сыворотке крови; однако, в связи со слабой опсонизирующей и комплемент-акти-вирующей функцией (Фрейдлин И.С., Тотолян А А., 2001), IgA имеет ограниченный потенциал в противоопухолевой защите при меланоме.

Таким образом, начало заболевания характеризуется формированием иммунного ответа на опухоль как со стороны врожденных (естественные киллеры), так и приобретенных механизмов иммунитета. При прогрессировании опухолевого процесса постепенно возникают призна-

кп/нл

ЦИК, у е

: 80

: бо

п 40

[■ 20

U ' 0

Доноры Прочие Меланома Меланома Меланома опухоли I ст. II ст. Ill ст.

HCD16 C3ICD22 —А—ЦИК

кл/нл

1йА. г/л

Доноры

Прочие опухоли

Меланома Меланома Меланома I ст. II ст. Ill ст

ICD25

CD95

IgA

Рисунок 1

Субпопуляции лимфоцитов, уровни ЦИК и у доноров, у больных с неме-паномными новообразованиями кожи, а также на разных стадиях опухолевого процесса при меланоме

ки меланома-опосредованной иммунодепрессии, на что указывает снижение численности С016* и СП22 лимфоцитов, а также активированных С025+, СЭ71+ и СЭ95+ клеток

Рецидив заболевания в форме метастатического поражения регионарных лимфоузлов после хирургического удаления первичного очага сопровождается существенно меньшими нарушениями иммунитета (по численности С025+ и СО!6+ клеток), нежели появление регионарных

метастазов на фоне первичной опухоли (III стадия), что может указывать на существенный вклад самой первичной опухоли в формирование иммунных дисфункций при меланоме.

В отдельном фрагменте нашей работы мы поставили задачу сравнить характер иммунных изменений у больных с меланомой кожи и с увеалъной меланомой. Согласно нашим данным, иммунный статус при кожной и увеальной меланоме аналогичной распространенности в целом идентичен Отличием является уменьшение популяции моноцитов и увеличение уровня IgM в периферической крови при меланоме, поражающей сосудистую оболочку глаза Природа этих отличий требует изучения в отдельном исследовании.

Результаты проведенного исследования в контексте данных современной литературы позволили нам составить общую схему патогенеза иммунных дисфункций у больных меланомой (наши данные выделены пунктиром) - рис. 2.

Одним из ключевых механизмов меланома-опосредованной имму-носупрессии, по нашим данным, являются нарушения активации имму-нокомпетентных клеток. Обнаруженное снижение численности активированных лимфоцитов может быть отчасти связано с описанными (Pietra G. et al., 2001) при меланоме дефектами созревания дендритных клеток, которые презентирукп антигены опухоли Т-лимфоцитам и инициируют клеточный иммунный ответ. Уменьшение числа лимфоцитов, экспресси-рующих рецептор к ИЛ-2 (CD25), установленное нами, препятствует развитию ИЛ-2-зависимого пути активации и ведет к нарушениям пролиферации лимфоцитов, что проявляется снижением численности CD71+ клеток. Итог этого - нарушение формирования пула специфических противоопухолевых эффекторов.

Снижение численности CD95+ популяции лимфоцитов периферической крови, выявленное нами при меланоме и наиболее выраженное у больных с III стадией, может быть обусловлено не только нарушениями активации лимфоцитов, но и усиленной апоптотической гибелью активированных Fas' лимфоцитов под влиянием Fas-лиганда опухолевых клеток (Andreola G. et al., 2002, Aragane Y. et al, 2000). Тем самым опухоль может способствовать уничтожению активированных лимфоцитов, специфичных к антигенам меланомы, и уходить от их контроля.

Другим возможным механизмом программированной гибели лимфоцитов при меланоме может быть их повышенная чувствительность к апоптозу, индуцированному TNFa, на что указывает обнаруженная положительная корреляция между уровнем этого цитокина в сыворотке крови

Т№а

| ТЫРЯ1 на лимфоцитах

Г* I С095+ ] X-

Усиление апопгоза иммуноцигов

"♦(+) корреляция •

: апоптоз- ТОТа •

«.___-__________________?

| созревания дендритных клеток

Нарушение презентации антигенов опухоли дендритными клетками

Сокращение поп> ляций иммуноцитов

Нарушение активации иммуноцигов

| 1 СБ8+ | | I С016+ | | | СВ22+ }_ !«••««••• * ......* — ■ *

Л,

Ьти м«**»м*

Нарушение В-зависимой презентащш аетигенов (растворимых опухолевых)

^••»••••••••••М*«^ ^•»Н1М«*М**%

" I НЪА-01Г : : I СБ7Г |: 1 С025+ | | | СЭ95+ !

•Н*МЖ*»»*«*»»«^ 2ммм**»н»*1* {»»»«»ММНМ1* {•»Н**»м»»*««*

__!Т_ ^

¡»•••МНМНМИ*«М*М*>Ы»Н««*ННН1%

переключение синтеза АТ с на 1§А (Т 1бА, |

Нарушение пролиферации

^ выработки АТ

^ АТ-зависимой

клеточно-опоередованной циготок сично ста

| АТ-зависимой

ком племена опосредованной циготок сично сги

Нарушение ИЛ-2-зависимой активации

г

Нарушение образования пула специфических противоопухолевых эффекторов

5

Нарушение элиминации опухолевых клеток

к>

Рисунок 2. Механизмы снижения иммунного контроля опухо /евого роста у бочьных мечаномой

больных меланомой и количеством лимфоцитов с морфологическими признаками апоптоза (R=+0,3; р=0,07). У больных с немеланомными новообразованиями кожи данная корреляционная связь отсутствует Допустимый путь реализации этого механизма - усиление экспрессии лимфоцитами больных меланомой рецептора к TNFa - TNFR1.

Еще одной вероятной причиной иммунных нарушений является влияние TGFß (Wojtowicz-Praga S., 1997), на повышение уровня которого косвенно может указывать сочетание роста содержания в сыворотке IgA со снижением IgG, установленное нами при меланоме в сопоставлении с донорами. По данным литературы, трансформирующий фактор росга-бета подавляет формирование Т-цитотоксических лимфоцитов и естественных киллеров, угнетает пролиферацию B-лимфоцитов и вызывает их апоп-тоз, индуцирует переключение синтеза иммуноглобулинов с IgG на IgA (Фрейдлин И.С., Тотолян A.A., 2001; Ярилин A.A., 1999). Выявленный в нашей работе достоверный рост содержания в сыворотке IgA от I стадии меланомы к III стадии (рис 1) может свидетельствовать об усилении влияния TGFß с развитием болезни. Возможно, этот фактор в какой-то мере определяет наблюдаемую иммунодепрессивную динамику от I к III стадии опухолевого процесса при меланоме.

Не исключено, что снижение числа естественных киллеров может быть обусловлено влиянием высокого уровня ЦИК (рис. 1, 2): нами обнаружена отрицательная корреляционная связь между этими показателями при меланоме (R = -0,4; р<0,05), что представляет интерес в свете имеющихся литературных данных о связи функциональной активности NK-клеток с уровнями ЦИК (Ярилин A.A., 1999).

Уменьшение численности основных эффекторных популяций лимфоцитов при прогрессии меланомы может иметь существенное значение в развитии заболевания. Так, зафиксированное нами падение числа естественных киллеров от стадии к стадии опухолевого процесса крайне неблагоприятно, учитывая тот факт, что метастатические меланомы должны быть наиболее чувствительны к литическому действию NK-клеток в силу отмеченного во многих работах (Брондз Б.Д., Балашов К.Е , 1991; Grover R. et al., 1996; Geertsen R.C. et al., 1998) снижения экспрессии HLA-I -основного блокатора активности естественных киллеров при осуществлении «летального удара». Полученные нами данные о динамике численности NK и литературные материалы об изменении экспрессии HLA-I меланомными клетками и, следовательно, о потенциальной чувствительности опухолей к действию естественных киллеров в процессе заболевания схематично представлены на рисунке 3.

Ранние стадии

Метастатические

г §

„ _ С* Е 50 1 2 ¡2

30

0 -

.....».....■■■ ЫК-клетки

А - Чувствительные к 1ЧК меланомы

Рисунок 3

Динамика численности ЫК-клеток и потенциальной чувствительности ме-ланом к их действию при развитии опухолевого процесса

Следует подчеркнуть, что утрата метастатическими меланомами антигенов НЬА-1 делает их «незаметными» для Т-лимфоцитов, и в этой ситуации естественные киллеры остаются единственной эффекторной популяцией, способной распознать опухоль. Наблюдаемое снижение их числа от I к 111 стадии фактически делает организм беззащитным против меланомы. Данный феномен, по-видимому, является одним из основных механизмов ухода опухоли от иммунного ответа при меланоме Следует также предположить, что подъем числа естественных киллеров на первой стадии заболевания недостаточно эффективен для обеспечения элиминации опухолевых клеток, так как на ранних стадиях меланомы ее клетки к действию ЫК практически не чувствительны, поскольку теряют про-тективные молекулы - НЬА-1 - лишь в 10% случаев.

Снижение численности В-лимфоцитов с развитием болезни наряду с характерным, по нашим данным, уменьшением популяции НЬА-ОК' клеток при меланоме, может вести к нарушению В-зависимой презентации антигенов и, как следствие, к недостаточному синтезу антител и дефектам антителозависимой клеточно- и комплемент-опосредованной цитотоксичности, в том числе и в отношении клеток опухоли.

К нарушению антителозависимых реакций, опосредуемых комплементом и клетками-эффекторами, приводит также наблюдаемое при меланоме снижение уровня иммуноглобулина в на фоне роста иммуноглобулина А, поскольку 1§А в отличие от большинства субклассов ^О не

способен активировать комплемент по классическому пути и имеет низкую опсонизирующую функцию.

Таким образом, по мере профессии меланомы кожи у больных возникают нарушения всех звеньев противоопухолевого иммунного ответа' системы естественных киллеров, Т-цитотоксических лимфоцитов, В-лим-фоцитов, происходит снижение численности активированных клеток и развиваются дефекты гуморальных литических механизмов.

Признание важной роли иммунной системы в противоопухолевой защите и выявление ее дефектов являются основанием для внедрения в клиническую практику методов адекватной иммунокоррекции. Наиболее подходящим средством для восстановления основных механизмов контроля опухолевого роста при меланоме представляется в современных условиях применение интерферона-алъфа. Согласно литературным данным, ИФНа способен стимулировать активность Т-цитотоксических лимфоцитов, макрофагов и естественных киллеров (Демидов J1.B., Харке-вич Г.Ю., 2001; Ярилин А А., 1999; Jonasch Е., Halushka F.G., 2001), повышать экспрессию на них апоптоз-индуцирующего лиганда TRAIL (Kemp Т J et al, 2003; Nguyen T et al., 2000), участвовать в формировании дендритных клеток, обладающих высокой функциональной активностью (Moschella F et al, 2003). Интерферон-альфа (реаферон) уже более 10 лет применяется в комплексном лечении больных меланомой в Челябинском областном онкологическом диспансере по схеме, описанной в методической части нашей работы. Нами было выполнено изучение иммунологических параметров после 10 дня лечения реафероном в указанных выше дозах в сравнении с показателями больных, подвергнутых только оперативному лечению, а также в сопоставлении с дооперационными показателями. Проведенный анализ показал, что реаферон после окончания первого курса лечения вызывает достоверные изменения преимущественно в лейкоформуле пациентов, способствуя снижению числа лейкоцитов, увеличению количества палочкоядерных и уменьшению - сег-ментоядерных форм, а также вызывая рост доли моноцитов и лимфоцитов, не влияя на популяционный спектр последних и другие показатели иммунограммы

Важнейшими компонентами противоопухолевого действия интерфе-рона-альфа являются его прямые эффекты на опухолевые клетки, а также антиангиогенное действие.

Анализ особенностей патогенеза меланомы показывает, что одним из ключевых онкогенов на всех его этапах является с-Мус (что представлено нами на рис. 4), а наиболее часто утрачиваемым антионкогеном -р!61Ж4а.

ХРОМОСОМНЫЙ ЛОКУС 9р21 (Делеция при меланоме)

Делеция 9р21

Деградация р53

Б

1. ИММОРТАЛИЗАЦИЯ

2. НЕОПЛАСТИ11ЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ

Проопухолевое воздействие ^ активация онкогенных событий

- ->

- Противоопухолевые воздегктвия

активация ^ \ гнетение онкогенов и

антионкогснов ^ онкогенных событий

супрессоры опухоли

Рисунок 4. Возможные механизмы патогенеза меланомы и роль ИФН-а в их контро че

Как известно, экспрессия с-Мус контролируется интерферонами а и ß (Wadler S., Schwartz E.L , 1997; Kanamori T et al, 1986), гены которых находятся в непосредственной близости от антионкогена pI6INK4a в хромосомном локусе 9р21 -9р22 (Демидов Л В , Харкевич Г Ю., 2000; Einhorn S , Heyman М , 1993). Этот локус часто подвергается делениям при ме-ланоме (Behrmann I et al.. 2003; Holland E.A. et al., 1994). Таким образом, мутации, затрагивающие p!6INK4a, и в особенности его делении, могут повреждать также гены интерферонов (Zhang Н. et al., 1996), следствием чего будет снятие контроля экспрессии с-Мус со стороны интерферона Постоянно стимулируемая мутантным ß-катенином и не ограниченная интерфероном активность с-Мус на фоне утраты антионкогена p]6INK4a, как видно из рисунка 4, может приводить к иммортализации, неопластической трансформации и опухолевой прогрессии, выражающейся в усилении роста, метастазирования и уходе от контроля иммунной системы В свете этих данных использование интерферона-альфа представляется патогенетически обоснованным и необходимым в лечении ме-ланомы. Данная теоретическая предпосылка находит свое подтверждение в экспериментальных работах и клинических исследованиях. Интерферон-альфа в эксперименте вызывает снижение активности с-Мус и ассоциированные с этим события' (1) уменьшение активности теломеразы (Akiyama М. et al, 1999), что в меланомных клетках приводит к остановке клеточного деления и индукции апоптоза (Biroccio А et al., 2003), (2) повышение экспрессии молекул гистосовместимости I класса (Geertsen R С. et al, 1998) и (3) снижение ангионеогенеза в опухоли (Jonasch Е , Halushka F.G, 2001).

В клинических исследованиях, обобщенных в ряде обзорных работ (Демидов Л.В., Харкевич Г.Ю , 2001; Jonasch Е., Halushka F.G , 2001; Sabel M.S., Sondak VK 2003), показана эффективность использования интерферона-альфа для профилактики развития рецидивов и метастазов меланомы после адекватного хирургического лечения в различных режимах при II и III стадиях заболевания.

Неясным остается вопрос о том, способны ли низкодозные схемы адъювантной интерферонотерапии влиять на общую выживаемость пациентов. Нет данных об использовании АИТ при I стадии меланомы. Группа больных с вторичной меланомой в форме метастазов в регионарные лимфоузлы в подобных исследованиях четко не выделена.

Мы выполнили ретроспективное изучение клинической эффективности адъювантной иммунотерапии реафероном при меланоме в режиме, использовавшемся в Челябинском областном онкологическом диспан-

сере в течение десяти лет Анализ отдаленных результатов лечения (общей и безрецидивной выживаемости пациентов) при использовании реа-ферона и без него был проведен нами дифференцированно, с учетом стадии опухолевого процесса и основных прогностических факторов Группы сравнения были сбалансированы по главным прогностическим признакам

По данным нашего исследования, к числу наиболее важных факторов, определяющих прогноз в отношении безрецидивной и общей выживаемости больных меланомой кожи, следует отнести уровень инвазии первичной опухоли, ее локализацию и проведение профилактической лимфаденэктомии. Увеличение уровня инвазии ассоциируется с ухудшением выживаемости (р<0,001) Расположение меланомы на коже конечностей связано с лучшим прогнозом, локализация ее на коже головы, шеи и туловища - с худшим (р<0,05). Проведение профилактической лимфаденэктомии можно расценивать как благоприятный прогностический признак (р<0,05) Определение показаний к использованию профилактической лимфаденэктомии в лечении пациентов с первичной меланомой кожи должно стать предметом отдельного исследования

Как показал анализ результатов лечения пациентов с первичной меланомой кожи, анализируемая схема адъювантной иммунотерапии реа-фероном обладает ограниченной эффективностью в профилактике рецидивов заболевания после хирургического иссечения меланом I стадии и не влияет на выживаемость прооперированных больных с II и III стадиями. При этом у больных с I стадией процесса отмечено достоверное увеличение лишь одного показателя однолетней безрецидивной выживаемости до 73% при использовании реаферона по сравнению с 48% - в контроле (без иммунотерапии) Более того, проведение анализа с поправкой на локализацию первичной опухоли (тест Ментела-Хенцела) говорит о том, что это изменение является тенденцией, не достигающей С1епени статистической значимости (р=0,056)

При вторичной меланоме в форме метастатического поражения регионарных лимфоузлов нами отмечено улучшение результатов лечения в группе пациентов, получавших после лечебной лимфаденэктомии (ЛАЭ) адъювантную иммунотерапию реафероном в указанном режиме (рисунок 5) в сравнении с больными, подвергавшимися только хирургическому лечению.

Как видно из рисунка, это проявилось в достоверном увеличении безрецидивной выживаемости по Каплану-Мейеру (р' 0,05), а также в увеличении однолетней безрецидивной выживаемости до 57% против 23%

Безрецидивная выживаемость (Kaplan-Meier)

100%

S g 80%

Достоверность согласно тестам

Гехан-Вилкоксон р=0 014 Пето-Вил коксон р=0,014 Лог-ранговый р=0,044 Кокс-Ментел р=0,041

С; £

II "О* £ а

20%

_______

0%

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

Врыт жизни, дни

Ш ЛАЭ + реаферои ЕЗ ЛАЭ

Рисунок 5

Безрецидивиая выживаемость пациентов с вторичноймеланомой в форме метастатического поражения регионарных лимфоузлов при использовании реаферона и без него (анализ по Каплану-Мейеру)

в контроле (р=0,021), в том числе при использовании поправки на локализацию метастатических лимфоузлов в тесте Ментела-Хенцела (р=0,03). Этот факт свидетельствует в пользу проведения адъювантной иммунотерапии реафероном у пациентов данной группы. В то же время, отсутствие отличий трех- и пятилетней безрецидивной выживаемости, а также общей выживаемости убеждают в необходимости поиска новых режимов использования интерферона-альфа с целью повышения эффективности лечения.

В результате проведенного исследования получено патогенетическое обоснование целесообразности использования адъювантной иммунотерапии реафероном у больных с вторичной меланомой в форме метастазов в регионарные лимфоузлы и клиническое подтверждение эффективности этого препарата в профилактике развития у них новых метастатических очагов Отвечаемость этой группы пациентов на адъювантную иммунотерапию реафероном может быть обусловлена относительной сохранностью у них популяции естественных киллеров (CD16+) и активированных CD25+ клеток (в сравнении, в частности, с больными первичной меланомой III стадии). Таким образом, вторичная меланома в форме метастатического поражения регионарных лимфоузлов может быть показанием к проведению адъювантной иммунотерапии в протестированном нами режиме.

Полученные данные свидетельствуют также в пользу поиска новых, более эффективных режимов адъювантной иммунотерапии пациентов с

первичной меланомой кожи. Результаты международных рандомизированных исследований последних лет показывают, что достоверного увеличения безрецидивной выживаемости при II стадии меланомы можно добиться проведением длительного непрерывного курса адъювантной иммунотерапии интерфероном-а (3 млн. ME 3 раза в неделю на протяжении 12-18 месяцев), а при III стадии - увеличением доз интерферона-а (Демидов Л.В., Харкевич Г.Ю, 2001). Использование разовых доз интерферона-а порядка 10 млн. МЕ/м2 в течение года с вводным месячным курсом [20 млн. МЕ/м2|х5 раз в неделю, по данным Sabel M.S., Sondak VK. (2003), позволяет достигнуть достоверного увеличения не только безрецидивной, но и общей выживаемости пациентов С другой стороны, следует иметь в виду токсичность (существенные побочные эффекты) и значительную стоимость высокодозных режимов интерферонотера-пии, что обусловливает необходимость изыскания новых подходов к использованию этого цитокина.

ВЫВОДЫ

1 У пациентов с меланомой кожи выявлены существенные отличия иммунологических показателей в сопоставлении с донорами и больными, имеющими немеланомные новообразования кожи

2 По сравнению с донорами, у больных меланомой кожи в целом повышена численность популяций естественных киллеров и В-лимфоци-тов периферической крови, снижена численность CD95+ субпопуляции лимфоцитов, уменьшена общая активность комплемента и активность его компонентов С1, С2, С5, увеличено содержание ЦИК, снижение уровня IgG сочетается с повышением уровня IgA в сыворотке крови.

3. Иммунологические особенности пациентов с меланомой в соизмерении с больными, имеющими немеланомные опухоли кожи, заключаются в снижении абсолютного числа Fas+ и доли HLA-DR1 лимфоцитов периферической крови при меланоме

4 Характер изменений иммунитета у больных меланомой кожи зависит от стадии опухолевого процесса и имеет отличия при первичных и вторичных формах заболевания.

5 I стадия меланомы кожи отличается формированием ответной реакции со стороны врожденных и приобретенных механизмов противоопухолевой защиты, что выражается в повышении численности естественных киллеров и В-лимфоцитов периферической крови.

6. II стадия меланомы кожи характеризуется снижением численности естественных киллеров и В-лимфоцитов, а также более низким, в сравнении с I стадией, содержанием Т-цитотоксических клеток.

7 III стадия меланомы отличается дальнейшим снижением количества естественных киллеров в циркуляции и сопровождается нарушениями процессов активации лимфоцитов, а также снижением их пролифе-ративного потенциала, о чем свидетельствует уменьшение численности CD25+, CD95" и CD71+ субпопуляций в кровотоке

8 У пациентов с вторичной меланомой в форме регионарных метастазов обнаружены меньшие нарушения иммунитета (по численности CD16+ и CD25+лимфоцитов), чем у больных, имеющих первичную опухоль и регионарные метастазы (III стадия), что может указывать на существенный вклад первичной опухоли в формирование иммунодепрес-сии при меланоме.

9 При вторичной меланоме в форме метастазов в регионарные лимфоузлы используемая схема адъювантной иммунотерапии достоверно увеличивает безрецидивную выживаемость по Каплану-Мейеру, а также однолетнюю безрецидивную выживаемость до 57% по сравнению с 23% в группе больных, не получавших адъювантную иммунотерапию.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Ретроспективный анализ клинической эффективности варианта адъювантной иммунотерапии реафероном (по 3 млн. ME 1 раз в сутки в течение 10 дней с перерывами между курсами длительностью в 3-4 недели), применявшегося в течение 10 лет в ЧООД для лечения пациентов с меланомой кожи, показал достоверное улучшение показателей безрецидивной выживаемости у больных с отдельными формами меланомы, и, в частности, при вторичной (рецидивной) меланоме в виде метастатического поражения регионарных лимфоузлов, что позволяет рекомендовать использование данного режима в лечении этой группы пациентов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Иванов Е.А. Изучение эффективности иммунотерапии в комбинированном лечении больных меланомой кожи / Е.А. Иванов // Актуальные вопросы медицины Тезисы докладов 55-й итоговой студенческой научной конференции. - Челябинск, 2001. - С. 33-34.

2. Привалов A.B. Оценка эффективности использования реаферона в адъювантном лечении меланомы кожи / A.B. Привалов, A.B. Важенин, Е.А. Иванов, Х.Я. Гюлов, Б.И. Алпеев, С.Н. Васильев // Паллиативная медицина и реабилитация. - 2002. - № 1. - С. 35-36

3. Иванов Е.А. Показатели иммунитета у больных меланомой кожи / Е.А. Иванов // Новые технологии и фундаментальные исследования в

медицине' Материалы III Российской Межрегиональной конференции, посвященной 60-летнему юбилею Челябинской государственной медицинской академии. - Под ред. проф Т.Ф.Мироновой. - Челябинск: Изд-во «Челябинская государственная медицинская академия», 2002. - С 3132.

4 Иванов Е.А. Фенотипическая характеристика дифференцировоч-ных и активационных маркеров лимфоцитов у больных меланомой / Е.А. Иванов // Актуальные вопросы медицины и новые технологии - 2003: Сборник научных статей молодых ученых и специалистов Российской Федерации, посвященный конференции им. академика Б.С. Гракова. -Красноярск, 2003. - С. 118-122.

5. Иванов Е А. Гуморальный иммунитет у больных меланомой. / Е А Иванов // ЛЕЧЕНИЕ РАКА В XXI ВЕКЕ: Сборник научных работ молодых онкологов Уральского федерального округа. - Челябинск, 2003

- С. 29-30.

6. Иванов Е А. Анализ экспрессии дифференцировочных и активационных антигенов лимфоцитов при меланоме и других новообразованиях кожи. / Е.А Иванов // ЛЕЧЕНИЕ РАКА В XXI ВЕКЕ' Сборник научных работ молодых онкологов Уральского федерального округа - Челябинск, 2003. - С. 30-31.

7 Иванов Е.А. Компьютерное прогнозирование заболеваемости меланомой кожи в Челябинской области. / Е.А. Иванов // ЛЕЧЕНИЕ РАКА В XXI ВЕКЕ' Сборник научных работ молодых онкологов Уральского федерального округа. - Челябинск, 2003 - С. 31-32.

8. Иванов Е. А. Некоторые клинико-морфологические черты мела-номы кожи / Е А Иванов, И. С. Анищенко, А В. Важенин, X. Я. Полов, В. И. Сычёв, И. Р. Ахметов // Паллиативная медицина и реабилитация. -2003. - № 2. - С. 74

9 Иванов Е.А. Характеристика клеточного и гуморального иммунитета у больных меланомой кожи / Е.А. Иванов, С.Н. Теплова // Иммунология Урала Материалы III конференции иммунологов Урала -2003.

- № 1(3). - С. 32.

10. Иванов Е.А. Состояние клеточного и гуморального иммунитета у пациентов с меланомой / Е.А. Иванов, С Н Теплова, A.B. Важенин, Х.Я. Гюлов, В И. Сычёв, И.Р. Ахметов // Паллиативная медицина и реабилитация. - 2003. - № 3. - С. 15-17

Иванов Евгений Александрович

ОСОБЕННОСТИ ИММУНИТЕТА У БОЛЬНЫХ МЕЛАНОМОЙ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИНТЕРФЕРОНА-АЛЬФА В КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск - 2004

Отпечатано в издательстве «Челябинская государственная медицинская

академия». Лицензия № 01906. Подписано к печати 12.10.04 г. Объем 1 п.л. Формат 64x84. Гарнитура «Times New Roman суг». Бумага для офисной техники, 80 мг/м2. Тираж 100 экз.

1И893 1

РНБ Русский фонд

2005-4 16213

Актуальность проблемы.

Не входя в число самых распространенных злокачественных новообразований и не имея большого удельного веса в смертности от них, меланома является одной из наиболее важных и актуальных проблем современной онкологии. Стремительные темпы роста заболеваемости (Kuhn С.А., Hanke C.W., 1997), высокая агрессивность, непредсказуемое поведение и известная устойчивость к традиционным методам лечения определяют всё возрастающий интерес исследователей к этой злокачественной опухоли. Большое внимание уделяется иммунологическим аспектам данной проблемы. Согласно современным представлениям, меланома кожи является одной из наиболее иммуноген-ных опухолей (Брондз Б.Д., Балашов К.Е., 1991). Это положение основано на клинических наблюдениях и результатах многочисленных экспериментальных работ (Носов Д.А., 2001). Непредсказуемое течение заболевания, отмеченные в литературе случаи спонтанных регрессий меланомы издавна наводили на мысль о способности организма к контролю опухолевого роста. В последние годы открыт ряд меланома-ассоциированных антигенов, которые могут вызывать развитие иммунного ответа. К ним относятся Melan A/MART-1, антигены групп MAGE, BAGE, GAGE, LAGE/NY-ESO-1, TRP-1, TRP-2, gpl00/pmell7, распознаваемые Т-лимфоцитами (Балдуева И.A., 2001; Москалева Е.Ю., Северин С.Е., 2002; Aarnoudse С.А. et al., 1999; Labarriere N. et al. 1998; Rosenberg S.A., 1996) и ганглиозидные антигены GM2, GM3, GD2, GD3, служащие мишенью для антител (Cebon J. et al., 1997; Takahashi Т. et al., 1999). Вместе с тем, в клинике довольно часто наблюдается быстрое развитие диссеминации процесса, когда иммунная система не в состоянии контролировать опухоль. Это связано со способностью меланомы уходить от иммунного ответа - и механизмы данного явления охарактеризованы далеко не полностью. Цельного представления о месте иммунной системы и ее медиаторов в контроле опухолевого роста при меланоме, как и при других новообразованиях, до сих пор не выработано. Во многом это обусловлено тем, что в доступной литературе практически отсутствуют работы, посвященные комплексному изучению иммунной системы у пациентов с разными стадиями меланомы кожи. Активаци-онные маркеры лимфоцитов периферической крови и процессы их апоптоза, дающие существенную информацию о состоянии иммунной системы, при меланоме остаются малоисследованными. Слабо освещены вопросы, касающиеся системы комплемента. Получение таких сведений имеет значение для лучшего понимания сложных взаимоотношений меланомы и иммунной системы в ходе развития опухолевого процесса, постижения основных причин неэффективности противоопухолевого ответа in vivo, осмысления механизмов формирования иммунодепрессии, индуцированной меланомой.

Иммунозависимость меланомы наряду с известной устойчивостью этой опухоли к химио- и радиотерапии определяет необходимость оценки возможностей иммунотропных агентов в лечении больных. Ввиду частого развития метастазов меланомы после ее адекватного хирургического иссечения особого внимания заслуживает исследование эффективности адъювантных режимов иммунотерапии, используемых для воздействия на клетки опухоли, оставшиеся в организме после радикальной операции. Согласно клиническим и экспериментальным исследованиям, из всех доступных на сегодняшний день имму-номодуляторов наибольшим противоопухолевым потенциалом при меланоме обладает интерферон-альфа (ИФНа). Этот цитокин стимулирует экспрессию на клетках меланомы антигенов гистосовместимости I класса (Geertsen R.C. et al., 1998), улучшая распознавание опухоли Т-лимфоцитами, активирует естественные киллеры, стимулирует противоопухолевую цитотокснчность макрофагов. ИФНа угнетает неоангиогенез в опухоли (Jonasch Е., Halushka F.G., 2001), лишая её кислорода и питательных веществ. Экспериментальные исследования показали, что ИФНа оказывает также прямое ингибирующее действие на пролиферацию опухолевых клеток, и в отношении клеток меланомы настоящий эффект выражен лучше всего (Молчанов О.Е. и соавт., 2001).

Окончательной ясности в отношении использования адъювантной иммунотерапии при меланоме пока нет, хотя положительный опыт применения интерферона в лечении пациентов с этой опухолью к настоящему времени уже накоплен (Демидов JI.B., Харкевич ГДО., 2001; Kirkwood J.M. et al.5 2000, 2001). Существенная токсичность эффективных высокодозных режимов и недостаточная результативность хорошо переносимых низкодозных схем адъювантной иммунотерапии затрудняют выбор стандарта лечения.

В Челябинском областном онкологическом диспансере в дополнение к хирургическому иссечению первичного очага и/или метастазов меланомы более 10 лет (с 1993 года) применялась следующая схема адъювантной иммунотерапии: реаферон (рекомбинантный интерферон-альфа) использовался по 3 млн. ME внутримышечно 1 раз в сутки в течение 10 дней; количество курсов определялось индивидуально. Необходимо изучить действенность этого режима лечения, выявить контингенты больных, в отношении которых доказана эффективность указанного способа адъювантной иммунотерапии реафероном и, исходя из этого, определить показания к ее использованию и сформулировать рекомендации к лечению.

Всё вышесказанное свидетельствует об актуальности проблемы меланомы для современной науки и практики и убеждает в необходимости изучения иммунологических аспектов этого вопроса.

Цель исследования: анализ особенностей иммунитета у больных мелано-мой и эффективности адъювантной иммунотерапии низкими дозами реаферо-на для выявления патогенетически значимых нарушений иммунитета и оптимизации лечения.

Задачи исследования:

1. Выявить иммунологические особенности при меланоме в сопоставлении с донорами и больными, имеющими немеланомные опухоли кожи.

2. Оценить характер изменений иммунитета у пациентов на разных стадиях первичной меланомы и при вторичной меланоме.

3. Провести ретроспективный анализ клинической эффективности низких доз реаферона после оперативного лечения больных меланомой кожи (по материалам Челябинского областного онкологического диспансера за последние 10 лет).

Научная новизна.

Впервые при меланоме кожи на разных стадиях заболевания проведено комплексное исследование показателей клеточного и гуморального иммунитета, включающее определение субпопуляционного состава лимфоцитов с широким спектром дифференцировочных и активационных маркеров, морфологическую оценку апоптоза иммуноцитов, изучение системы комплемента. Новыми являются данные о динамике численности CD16+ и CD22+ лимфоцитов на разных стадиях меланомы кожи, о количестве клеток, экспрессирующих маркеры активации: CD25, CD71, CD95 и HLA-DR, а также о состоянии системы комплемента при меланоме.

Теоретическое значение работы состоит в уточнении механизмов формирования иммунных дисфункций при меланоме и разработке схемы иммунологических аспектов ее патогенеза на основе собственных и литературных данных.

Практическая значимость работы. Впервые оценена клиническая результативность варианта адъювантной иммунотерапии (АИТ) реафероном (по 3 млн. ME в сутки в течение 10 дней, интервал между курсами 3-4 недели) при первичной меланоме кожи на разных стадиях заболевания и при вторичной меланоме. Впервые получены данные об эффективности указанной схемы АИТ при вторичной меланоме в форме метастазов в регионарные лимфоузлы. Эти данные будут способствовать индивидуализации подхода к использованию иммунотерапии в лечении пациентов с меланомой кожи.

Внедрение результатов исследования в практику.

Результаты исследования внедрены в практику работы Челябинского областного онкологического диспансера и в учебный процесс кафедры иммунологии и аллергологии ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия МЗ РФ» и кафедры онкологии и радиологии ГОУ ДПО «Уральская государственная медицинская академия дополнительного образования МЗ РФ».

Положения, выносимые на защиту.

1. Характер изменений иммунитета у пациентов с меланомой кожи зависит от стадии опухолевого процесса: повышение численности естественных киллеров и В-лимфоцитов периферической крови при I стадии меланомы сменяется сокращением этих популяций, а также популяции Т-цитотоксических клеток при II стадии и дальнейшим снижением числа естественных киллеров -при III стадии заболевания. Прогрессирование опухолевого процесса при ме-ланоме сопровождается нарушениями активации лимфоцитов периферической крови и снижением их пролиферативного потенциала.

2. Снижение численности естественных киллеров и нарушение процессов активации лимфоцитов при прогрессировании заболевания являются ключевыми механизмами снижения иммунного контроля опухолевого роста у больных меланомой.

3. Тестируемая схема адъювантной иммунотерапии способствует увеличению безрецидивной выживаемости после хирургического лечения пациентов с вторичной меланомой в форме метастазов в регионарные лимфоузлы.

Апробация диссертации.

Материалы работы были представлены в докладах и обсуждались на 55-ой Студенческой конференции ЧелГМА (Челябинск, 2001), Третьей Российской Межрегиональной Конференции «Новые технологии и фундаментальные исследования в медицине» (Челябинск, 2002), Первой конференции молодых онкологов Уральского федерального округа (Челябинск, 2003), региональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы лекарственной терапии и терапии сопровождения злокачественных новообразований» (Челябинск, 2003).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Структура и объем диссертации.

ВЫВОДЫ

1. У пациентов с меланомой кожи выявлены существенные отличия иммунологических показателей в сопоставлении с донорами и больными, имеющими немеланомные новообразования кожи.

2. По сравнению с донорами, у больных меланомой кожи в целом повышена численность популяций естественных киллеров и В-лимфоцитов периферической крови, снижена численность С095+субпопуляции лимфоцитов, уменьшена общая активность комплемента и активность его компонентов С1, С2, С5, увеличено содержание ЦИК, снижение уровня IgG сочетается с повышением уровня IgA в сыворотке крови.

3. Иммунологические особенности пациентов с меланомой в соизмерении с больными, имеющими немеланомные опухоли кожи, заключаются в снижении абсолютного числа Fas+ и доли HLA-DR+ лимфоцитов периферической крови при меланоме.

4. Характер изменений иммунитета у больных меланомой кожи зависит от стадии опухолевого процесса и имеет отличия при первичных и вторичных формах заболевания.

5. I стадия меланомы кожи отличается формированием ответной реакции со стороны врожденных и приобретенных механизмов противоопухолевой защиты, что выражается в повышении численности естественных киллеров и В-лимфоцитов периферической крови.

6. II стадия меланомы кожи характеризуется снижением численности естественных киллеров и В-лимфоцитов, а также более низким, в сравнении с I стадией, содержанием Т-цитотоксических клеток.

7. III стадия меланомы отличается дальнейшим снижением количества естественных киллеров в циркуляции и сопровождается нарушениями процессов активации лимфоцитов, а также снижением их пролиферативного потенциала, о чем свидетельствует уменьшение численности CD25+, CD95+ и CD71+ субпопуляций в кровотоке.

8. У пациентов с вторичной меланомой в форме регионарных метастазов обнаружены меньшие нарушения иммунитета (по численности CD16+ и CD25+ лимфоцитов), чем у больных, имеющих первичную опухоль и регионарные метастазы (III стадия), что может указывать на существенный вклад первичной опухоли в формирование иммунодепрессии при меланоме.

9. При вторичной меланоме в форме метастазов в регионарные лимфоузлы используемая схема адъювантной иммунотерапии достоверно увеличивает безрецидивную выживаемость по Каплану-Мейеру, а также однолетнюю безрецидивную выживаемость до 57% по сравнению с 23% в группе больных, не получавших адъювантную иммунотерапию.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Ретроспективный анализ клинической эффективности варианта адъювантной иммунотерапии реафероном (по 3 млн. ME 1 раз в сутки в течение 10 дней с перерывами между курсами длительностью в 3-4 недели), применявшегося в течение 10 лет в ЧООД для лечения пациентов с меланомой кожи, показал достоверное улучшение показателей безрецидивной выживаемости у больных с отдельными формами меланомы, и, в частности, при вторичной (рецидивной) меланоме в виде метастатического поражения регионарных лимфоузлов, что позволяет рекомендовать использование данного режима в лечении этой группы пациентов.

Выражаю искреннюю благодарность главному врачу Челябинского областного онкологического диспансера, члену-корреспонденту РАМН, доктору медицинских наук, профессору, Заслуженному врачу РФ Важенину Андрею Владимировичу за предоставленную возможность выполнения настоящего исследования и помощь в его проведении, а также за консультации и генные замечания по поводу ретроспективного анализа клинической эффективности адъювантной иммунотерапии реафероном при меланоме.

Изъявляю глубокую признательность коллективу Челябинского областного онкологического диспансера за оказанное содействие.