Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Особенности ИЛ-8-продуцирующей способности нейтрофильных гранулоцитов в норме и при патологии

На правах рукописи

Быковская Екатерина Юрьевна

ОСОБЕННОСТИ ИЛ-8-ПРОДУЦИРУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ

14.00.36- аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 2009

003474284

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Российский цен функциональной хирургической гастроэнтерологии Федерального агентства по здравоохраи нию и социальному развитию»

Научный руководитель-

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Нестерова Ирина Вадимовна

доктор медицинских наук, профессор

Симбирцев Андрей Семенович

доктор медицинских наук, профессор

Сенников Сергей Витальевич

Ведущая организация - ГНЦ «Институт иммунологии ФБА России»

Защита состоится "_"_2009 г. в_час. на заседании диссертационно]

совета Д 001.001.01 УРАМН Института клинической иммунологии СО РАМН по адрес 630047, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИКИ СО РАМН

Автореферат разослан "_"_2009 года

Ученый секретарь

диссертационного совета ,

доктор биологических наук — О Т. Кудаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время нейтрофильные гранулоциты (НГ) рассматриваются как совокупность достаточно иммунокомпетентных и иммунорегуляторных клеток, участвующих в межклеточных контактах и взаимодействиях, обладающих регуляторными возможностями на другие клетки и принимающих активное участие в поддержании системного гомеостаза [И.И. Долгушин, О.В. Бухарин, 2001; И В. Нестерова, 2004; И.В. Нестерова, Н.В. Колесникова, 1999; S.S. Cheng, S.L. Kunkel, 2003; S. Culshaw et al., 2008; Y. Kobayashi, 2008; M.D. Morgan et al., 2005; S. Yamashiro et al., 2001].

Установлено, что активированные НГ способны синтезировать de novo цитокины и приобретать новые функциональные свойства в зависимости от локального микроокружения [F. А1-Mohanna et al., 2002; М.А. Cassatella, 1995; E.Y. Denkers et al., 2003; T.N. Ellis, B.L. Beaman, 2002; F. Ethuin et al., 2001, 2004; T. Kasama et al., 2005; E.A. Kurt-Jones et al., 2002; E. Lome et al., 2008; E.J. Sohn et al., 2008; A.Yoshimura et al., 1997]. Цитокины являются наиболее универсальной системой регуляции функций организма и формируют в нем сложную полиморфную по структуре сеть [С.А. Кетлинский и др., 1992; В.А. Козлов, 2002; C.B. Сенников и др., 2002; C.B. Сенников, А.Н. Силков, 2005; A.C. Симбирцев, 2002, 2004; J. Oppenheim, M. Feldman, 2000]. Одним из основных цитокинов, продуцируемых НГ, является интерлейкин-8 (ИЛ-8) [J. Altstaedt et al., 1996; Cassatella M. et al., 1992; R.M. Strieter et al., 1992]. Синтез и секреция НГ ИЛ-8 приводит в результате к быстрой амплификации острого воспалительной процесса, что имеет чрезвычайно большое значение, как в его благополучном разрешении, так и в его хрони-зации [ S.S. Cheng, S.L. Kunkel, 2003; P. Scapini et al., 2000].

Известно, что НГ являются одним из ведущих патогенетических факторов при воспалительных заболеваниях пищеварительной системы, таких как острые и хронические панкреатиты [E.H. Жукова, 1999; A.S. Gukovskaya et al., 2002; С. Kyriakides et al., 2001], Helicobacter pylori-ассоциированные заболевания желудка [L.-A. H. Allen, 2001, 2005; D. Danielsson et al., 2000; 1. Mizuki et al., 2000], a также обуславливают гнойно-септические хирургические осложнения (ГСО) [Н.М. Антропова, 2007; Н.М. Калинина и др., 2005]. Так как острый воспалительный ответ является как протективным, так и потенциально опасным для окружающих тканей, лучшее понимание взаимоотношений НГ и ИЛ-8, лежащих в основе нейтрофильного рекрутирования, активации и последующих лейкоцитарных замещений, способствует развитию новых терапевтических подходов в лечении многих заболеваний.

В этой связи достаточно актуальным вопросом является изучение влияния различных иммунотропных препаратов на функции НГ, и на секреторную, в частности. Среди лекарственных препаратов чрезвычайно перспективны для использования в клинике соединения пептидной природы. Глюкозаминилмурамилдипептид (ГМДП), является активным компонентом пи-копида - высокоэффективного лекарственного иммуномодулятора, применяемого в комплексной терапии вторичных иммунодефицитных состояний. Главная мишень действия ГМДП -нейтрофилы и макрофаги [Т.М. Андронова, Б.В. Пинегин, 1999; В.Т. Иванов, 1996]. Другой синтетический дипептид - у-О-глутаминил-Ь-триптофан (бестим, БС) проявляет выраженную иммуномодулирующую активность в отношении клеток лимфоидного и нелимфоидного ряда и используется для лечения вторичных ИДС, связанных с неадекватной Т-клеточной регуляцией [A.A. Колобов, 1997; Н.В. Пигарева и др., 2000]. Показано также, что БС влияет на различные стороны нейтрофильной активности [В.А. Зурочка, И.И. Долгушин, 2004; И.В. Нестерова и др., 1999а, 19996, 2002, 2004, 2006].

¡•есмотря на то, что в последнее десятилетие активно исследуется цитоки! продуцирующая активность НГ, эта область иммунологии остается все еще малоизученно Практически не известно, как изменяется способность НГ секретироватъ цитокины при патол гии. В связи с этим представляется актуальным исследование данной проблемы, что, несомне! но, послужит расширению сведений о функционировании НГ, разработке новых диагностич ских методов и способов иммунокоррекции. Учитывая вышеизложенное, сформулирована не; работы и задачи исследования.

Цель исследования: Изучить особенности ИЛ-8-продуцирующей активности нейгр фильных гранулоцитов в норме и при заболеваниях пищеварительной системы, установить зн чимость выявленных дисфункций при патологии и оценить возможность их пептидной корре ции в системе in vitro.

Задачи исследования.

1. Изучить спонтанную и липополисахарид (ЛПС)-индуцированную продукцию ИЛ-8 нейтр| фильными гранулоцитами здоровых лиц.

2. Определить характер спонтанной и ЛПС-индуцированной секреции ИЛ-8 нейтрофильным гранулоцитами при воспалительных заболеваниях желудка (хронический активный гастри с установлением особенностей их функционирования (экспрессия рецепторов CD1 lb, CD1 CD95, фагоцитарная и оксидазная активности).

3. Определить характер спонтанной и ЛПС-индуцированной секреции ИЛ-8 нейтрофильным гранулоцитами при гнойно-септических хирургических осложнениях (инфицированно остром деструктивном панкреатите, абсцессах брюшной полости) с установлением особе) ностей их функционирования (экспрессия рецепторов CDlIb, CD 16, CD9S, фагоцитарная оксидазная активности).

4. Исследовать влияние пептидов - у-Э-глутаминил-Ь-триптофана (бестим) и глюкозаминш мурамилдипептида (ГМДП) на секрецию ИЛ-8 нейтрофильными гранулоцитами в норме.

5. Выявить особенности пептидной (у-О-глутаминил-Ь-триптофан и глюкозаминилмурами.1 дипептид) регуляции секреции ИЛ-8 нейтрофильными гранулоцитами при гастроэнтерол< гической патологии.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Высокая спонтанная продукция ИЛ-8 нейтрофильными гранулоцитами при хроническом г: стрите не зависит от типа воспаления и сопряжена с однотипным характером дисфункци нейтрофильных гранулоцитов. В то же время ЛПС-индуцированная секреция ИЛ-8 нейтр< фильными гранулоцитами зависит от поверхностного или деструктивного типа воспаления.

2. Уровень как спонтанной, так и ЛПС-индуцированной продукции ИЛ-8 нейтрофильным гранулоцитами при абсцессах брюшной полости (локальный воспалительный процесс) остром деструктивном панкреатите (системный воспалительный процесс) различен и сопровождается более выраженными дисфункциями нейтрофильных гранулоцитов при остром деструктивном панкреатите.

3. Пептиды у-О-глутаминил-Ь-триптофан (бестим) и глюкозаминилмурамилдипептид (ГМДП), обладая разным механизмом действия, дифференцировано регулируют продукцию ИЛ-8 НГ у здоровых лиц и при различной патологии органов пищеварения.

Научная новизна работы.

Получены новые данные об особенностях спонтанной и ЛПС-индуцированной продукции ИЛ-8 нейтрофильными гранулоцитами при хроническом гастрите: уровень спонтанной продукции ИЛ-8 был значительно повышен как при поверхностном, так и при деструктивном

типе воспаления по сравнению с контролем, в то же время при нагрузке ЛПС были обнаружены значительные различия в ответе в зависимости от типа воспаления.

Впервые показана зависимость выраженности дисфункций нейтрофильных гранулоцитов и особенности характера секреции ими ИЛ-8 у пациентов с гнойно-септическими осложнениями в зависимости от тяжести патологического процесса.

Получены новые данные о возможностях дифференцированной пептидной регуляции ИЛ-8-секретирующей способности нейтрофильных гранулоцитов в норме и при патологии органов пищеварения:

- установлено, что у здоровых лиц у-О-глутаминил-Ь-триптофан (бестим) стимулирует секрецию ИЛ-8 нейтрофилами, предварительно праймированными ЛПС, а глкжозами-нилмурамилдипептид (ГМДП) усиливает продукцию ИЛ-8 нейтрофилами без их предварительной стимуляции ЛПС.

- показано, что при гнойно-септических осложнениях (острый деструктивный панкреатит, абсцессы) бестим снижает ЛПС-индуцированную продукцию ИЛ-8, при этом, при хроническом гастрите бестим уменьшает продукцию ИЛ-8 вне зависимости от праймирования ЛПС.

- продемонстрировано, что ГМДП стимулирует ИЛ-8-секретирующую активность нейтрофильных гранулоцитов при хроническом гастрите и супрессирует ее при остром деструктивном панкреатите, в то же время при абсцессах, - ГМДП препятствует ЛПС-индуцированному усилению секреции ИЛ-8.

Научно-практическая значимость работы.

Получены новые сведения, расширяющие наши представления о роли ИЛ-8-секретирующей активности НГ в иммунопатогенезе хронического гастрита и гнойно-септических хирургических осложнений (абсцесс и острый деструктивный панкреатит), установлено наличие дисфункций ИЛ-8-продуцирующей активности нейтрофильных гранулоцитов при хроническом гастрите и гнойно-септических хирургических осложнениях.

На основании полученных данных об особенностях ИЛ-8-продуцирующей способности НГ при различной патологии органов пищеварения возможна разработка новых диагностических критериев для оценки функционального состояния НГ и уточнения их дисфункций при различных заболеваниях органов пищеварения.

Полученные данные об особенностях ИЛ-8 секретирующей активности при хроническом гастрите (с поверхностным или деструктивным типом воспаления) могут быть использованы для разработки новых диагностических подходов: исследование ИЛ-8-продуцирующей способности НГ для дифференциальной диагностики поверхностного и деструктивного типа воспаления по характеру ответа па ЛПС.

Новые сведения об особенностях спонтанной и ЛПС-индуцированной ИЛ-8 секретирующей активности НГ при гнойно-септических осложнениях могут служить основой для дифференциальной диагностики системного или локального гнойного процесса.

Учитывая полученные позитивные эффекты пептидов на дисфункции ИЛ-8-продуцирующей способности НГ, проведенное исследование может явиться основой для дальнейших клинических испытаний у-О-глутаминил-Ь-триптофан и глюкозамурамилдипептида: бестима при хроническом гастрите и остром деструктивном панкреатите, ГМДП,- при остром деструктивном панкреатите.

Разработанные методические подходы при исследовании влияний иммунотропных препаратов бестима и ГМДП в условиях без и с предварительным праймированием ЛПС могут

служить в качестве моделей в иммунофармакологии для оценки ИЛ-8 секретирующей активности НГ.

Внедрение результатов в практику. Полученные новые данные о ИЛ-{ продуцирующей активности НГ в норме и при патологии ЖКТ используются в научнс исследовательской работе отдела клинической и экспериментальной иммунологии ФГ" «РЦФХГ Росздрава», центральной научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО КГМ1 Росздрава, в учебной и научной работе кафедры клинической иммунологии, аллергологии лабораторной диагностики ГОУ ВПО КГМУ Росздрава.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуж дены на объединенном иммунологическом форуме (3-й съезд иммунологов России, 6-й Нацис нальный конгресс РААКИ и 3-я Российская конференция "Цитокины. Воспаление. Иммуни тет") в г. Екатеринбурге (31 мая - 4 июня 2004 г.), Всероссийском научном симпозиуме "Цитс кины. Стволовая клетка. Иммунитет" в г. Новосибирске (19 - 21 июля 2005 г.), «VI Съезде aj. лергологов и иммунологов СНГ. Российском национальном конгрессе аллергологов и иммунс логов. III Российской конференции по иммунотерапии» в г. Москве (11-13 сентября 2006 г.), «V Всемирном конгрессе по иммунологии и аллергии. V Европейском конгрессе по астме» в г. Москве (22-25 апреля 2007 г.); Объединенном иммунологическом форуме (IV съезд иммуноло гов России, IX Конгресс РААКИ, IV Конференция РЦО, III Конференция по иммунологии репродукции, XII Всероссийский форум «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге») в г. Санкт-Петербурге (30 июня - 5 июля 2008 г.).

Диссертация апробирована на совместном заседании отдела клинической и экспериментальной иммунологии ФГУ «РЦФХГ Росздрава», кафедры клинической иммунологии, аллергологии и лабораторной диагностики ГОУ ВПО КГМУ Росздрава и кафедры патологической анатомии ГОУ ВПО КГМУ Росздрава (2009).

Личный вклад автора в работу. Диссертационная работа является результатом пятилетних (2004-2009 гг.) исследований по изучению ИЛ-8 продуцирующей способности НГ в норме и при патологии ЖКТ. Все результаты получены лично автором или при его непосредственном участии.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 23 работы, 18 работ опубликованы в рецензируемых журналах по перечню ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации, из них 6 статей в журналах определенных ВАК для опубликования результатов соискателей ученой степени кандидата биологических наук.

Объем и структура диссертации.

Работа изложена на 170 страницах и состоит из глав: "Введение", " Обзор литературы", "Материалы и методы", 3 глав собственных исследований, "заключения", "выводов", указателя литературы. Последний содержит 100 работы отечественных и 417 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 8 таблицами и 15 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследования.

Исследования по изучению ИЛ-8-продуцирующей способности НГ при различных условиях были проведены у 35 здоровых добровольцев обоего пола в возрасте от 21 до 50 лет, у которых использовали для анализа периферическую кровь. ИЛ-8-секретирующую активность НГ при воспалении исследовали у лиц с воспалительными заболеваниями желудка (п-20) - хронический неатрофический активный гастрит (ХГ), ассоциированный Helicobacter pylori {Hp). Наличие Hp в слизистой желудка подтверждалось в 70% случаев, и составило в среднем 2,4±0,09

балла. На основании результатов эндоскопического заключения и гистологического исследования по выраженности воспалительного процесса в слизистой оболочке желудка (СОЖ) все больные были разделены на 2 группы: группа 1 (п=10) - поверхностное воспаление; группа 2 (п=10) - деструктивное воспаление - выраженный воспалительный процесс в СОЖ с наличием эрозий и язв. Продукцию ИЛ-8 НГ при ГСО изучали у пациентов с абсцессами брюшной полости (локальный процесс, п=12) и острым деструктивным панкреатитом - панкреонекрозом (ОДП) в фазе развития гнойных осложнений (системный процесс, п=16).

НГ выделяли из ЭДТА-стабилизированной (2,7%) периферической крови с помощью центрифугирования на двойном градиенте фиколла-верографина (1,077:1,093) [И.В. Нестерова и соавт., 1996]. Морфологически определяли чистоту клеточной взвеси (>95-97%). Методом эксклюзии трипанового синего - жизнеспособность клеток (>98%). НГ (1х106 кл/мл) культивировали в полной культуральной среде RPMI 1640 с 2 мМ L-глугамина («DIFCO», USA, ООО «Биолот», Россия), 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки («PAESEL», GmbH & Со, «Bioclot», Южная Америка), 40 мкг/мл гентамицина («Pharmachim», Болгария) и 10 мМ HEPES-буфера в 5% СОг, при 37°С, 20 часов с физиологическим раствором (спонтанная секреция, контроль) или ЛПС Е. coli:055:B5 («DIFCO», USA; SIGMA, Германия) (ЛПС-индуцированная секреция). ЛПС вносили в конечной концентрации 10 нг/мл. Исследовали влияние пептидов (в конечной концентрации 0,1 мкг/мл) - у-О-глутаминил-Ь-триптофана (бестима, ЕС) (ГНЦ ГосНИИ ОЧБ, Россия) и глюкозамурамилдипептида (N-ацетилглкжозаминил-рМ-Ы-ацетилмурамоил-аланин-О-изоглутамин, ГМДП) (Ин-т биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Россия) на спонтанную и ЛПС-индуцированную продукцию ИЛ-8 НГ. При инкубации НГ с ЛПС и пептидами совместно - пептиды вносились через 30 минут после начала инкубации клеток с ЛПС. Концентрацию ИЛ-8 в супернатанте определяли методом ИФА с использованием коммерческих тест-систем согласно инструкции к набору (ООО «Цитокин», Россия). Чувствительность метода - 20 пг/мл. Для определения степени «ответа» на ЛПС рассчитывался индекс стимуляции (ИС) - концентрация ИЛ-8 в спонтанном тесте / концентрация ИЛ-8 в ЛПС-стимулированном.

В работе использован комплекс методов, тестирующих состояние НГ [И.В. Нестерова и др.,1996]. Количество CDllb+-, CD16+- и CD95+-Hr, подсчитывали с помощью непрямого им-мунофлюоресцентного метода с использованием соответствующих моноклональных антител: анти-CDllb, -CD 16, -CD95 (ООО "Сорбент", Москва). Функциональное состояние клетки оценивали в реакциях фагоцитоза опсонизированного зимозана (ОЗ) с определением относительного количества активно фагоцитирующих нейтрофилов (%ФАН). NADPH-оксидазную активность НГ определяли по показателям спонтанного и стимулированного (ОЗ) NBT-теста, подсчитывая клетки с восстановленным формазаном (% формазан-позитивных клеток - % ФПК) и рассчитывали коэффициент мобилизации (КМ): % ФПК в NBTcr / % ФПК в NBTcn. Для всех пациентов и здоровых лиц производился подсчет общего количества лейкоцитов и определение морфологического состава крови по общепринятым методикам.

Статистическая обработка проводилась с использованием методов вариационной статистики с расчетом средних величин (М), ошибок средних величин (±ш), средних квадратичных отклонений (±5). При отсутствии нормальности распределения данных рассчитывали медиану [С. Гланц, 1999]. Достоверность различия между отдельными средними величинами определяли с помощью дисперсионного анализа, параметрического критерия Стьюдента, и критерия Стью-детга с поправкой Бонферроне, непараметрических критериев Крускала-Уоллиса и Дайна для множественных сравнений. Наблюдаемые различия считались не случайными, когда вероят-

ность «р» ошибочного принятия нулевой гипотезы не превышала 0,05. Вычисления проводились с использованием компьютерной программы Biostat 4.0 [Primer of Biostatistics, 4th Edition, S.A.Glantz, McGraw-Hill].

Результаты исследования и обсуждение

Анализ полученных результатов выявил гетерогенность спонтанной продукции ИЛ-8 in vitro НГ здоровых людей. У 4-х человек (11,43%) спонтанная секреция ИЛ-8 НГ была ниже порога чувствительности метода (<20 пг/мл). НГ большинства здоровых лиц - 31 человека, составляющих 88,57% от общего количества принявших участие в исследовании, спонтанно продуцировали ИЛ-8 в количестве 224,0±22,67 пг/мл/106кл. При этом существовал довольно различный разброс индивидуальных показателей: минимальная продукция ИЛ-8 составила 25,04 пг/мл/106кл, а максимальный уровень достигал 470,4 пг/мл/106кл. Таким образом, НГ большинства здоровых лиц секретируюг определенное количество ИЛ-8 без дополнительной стимуляции. Известно, что нестимулированные НГ высвобождают незначительное количество ИЛ-8 [К. Hattar et al., 2001]. Показано, что в нестимулированных НГ существует спонтанный синтез ИЛ-8 [C.J. Furlaneto, A. Campa, 2000]. Возможно, это связано с тем, что даже в здоровом организме циркулирующие НГ представляют собой неоднородную популяцию, имеющие те или иные признаки активированности [В.П. Сапрыкин, С.Л. Кузнецов, 2001; M.B. Hallett, D. Lloyds, 1995]. Кроме того, сам процесс выделения клеток по стандартной методике на градиенте плотности, как известно, ведет к их активации [Hamblin A. et al., 1992; Watson F., 1992], вследствие чего, ИЛ-8, находящийся в быстро мобилизуемых органеллах [S. Pellmé et al., 2006], может выделяться в супернатант. Выявленные различия в уровнях спонтанно секретируемого ИЛ-8 НГ могут быть обусловлены генетическими особенностями секреции самого ИЛ-8 [D.S. Michaud et al., 2006; Е. Renzoni, 2000; В.Н. Rovin et al., 2002]. Кроме того, стимулировать или супрессиро-вать продукцию ИЛ-8 НГ путем ауто/паракринной регуляции могут другие секретируемые НГ цитокины, уровень экспрессии которых также может бьпъ генетически детерминирован.

Взаимодействие ЛПС и НГ человека представляет модельную систему для изучения их активации и функционирования во время грамотрицательной бактериальной инфекции и воспаления [М.В. Fessier et al., 2003]. В результате проведенных предварительных экспериментов [И.Н. Швыдченко и др., 2005], а также принимая во внимание литературные данные [К. Hattar et al., 2001], мы выбрали минимальную концентрацию ЛПС (10 нг/мл), индуцирующую продукцию ИЛ-8 НГ. В исследовании по влиянию ЛПС на секрецию ИЛ-8 НГ приняли участие 29 здоровых добровольцев. Уровень спонтанной секреции в данной группе составил 207,2±21,49 пг/мл/106кл. Добавление ЛПС в инкубационную среду приводило к увеличению концентрации ИЛ-8 в супернатанте в 1,6 раз (р<0,05), которая составила в среднем 323,1±51,61 пг/мл/106кл. Анализируя ответ НГ на ЛПС в исследуемой дозе, мы также выявили наличие существенных индивидуальных различий в ЛПС-индуцированной продукции ИЛ-8 НГ (Рис.1).

В большинстве случаев (58,6%) НГ отвечали на ЛПС увеличением секреции ИЛ-8 -подгруппа А. В данной подгруппе ЛПС-индуцированная продукция достоверно увеличилась по сравнению со значениями спонтанной секреции (229,9±29,35 пг/мл/106кл) и составила в среднем 455,0±70,71 пг/мл/106кл (р<0,01). Индекс стимуляции составил в этой подгруппе 2,25±0,49. В 41,4% случаев (подгруппа Б) НГ здоровых добровольцев не реагировали на ЛПС увеличением секреции ИЛ-8, в результате чего в данной подгруппе концентрация ИЛ-8 в супернатанте после добавления ЛПС составила 136,3±25,86 пг/мл/106кл, и не отличалась от спонтанной продукции ИЛ-8 НГ (175,1±30,4 пг/мл/106кл). Индекс стимуляции в данной подгруппе был меньше единицы - 0,8±0,06.

500

2.5

400 --

200 --

250 --

300 -•

450 --

350 --

150 --

100 --

50 -•

0

-2

-- 1,5

-- 1

-■0,5

0

Группа А

Группа 6

3 Спонтанная ЕЕЕЗППС-стимупированная -------ИС

Рис. 1. Гетерогенность ответа нейтрофильных гранулоцитов здоровых лиц на стимуляцию ЛПС (10 нг/мл). По оси ординат: концентрация ИЛ-8 в т/мл.

Данная гетерогенность ЛПС-индуцированной продукции ИЛ-8 НГ, вероятно, обусловлена различными причинами. Как и спонтанная секреция, это может быть связанно с генетическими особенностями синтеза и секреции ИЛ-8 и других секретируемых НГ цитокинов. Возможны также и различия в лиганд-рецепторном взаимодействии и в проведении сигналов в клетку. Известно, что TLR4 - рецептор ЛПС обладает полиморфной структурой, что влияет на чувствительность клеток к ЛПС [N.C. Arbour et ah, 2000; P. Rallabhandi et al., 2006].

Изучение продукции ИЛ-8 НГ при патологии мы проводили одновременно с определением фенотшшческих и функциональных характеристик НГ для выявления наиболее значимых диагностических маркеров нейтрофильных дисфункций.

С морфологической точки зрения, а также по характеру противоинфекционной иммунобиологической защиты организма нозологические формы воспалительных заболеваний гастро-дуоденапьной зоны, такие как гастриты, дуодениты, гастродуодениты, язвенная болезнь желудка и/или двенадцатиперстной кишки (ДПК), могут быть объединены в зависимости от степени поражения слизистой оболочки, когда определяется либо поверхностное (катаральное), либо деструктивное (эрозивно-язвенное) воспаление [Л И. Аруин и др., 1998; В.А. Исаков, И.В. До-марадский, 2003]. Таким образом, по результатам эндоскопического заключения и гистологического исследования все больные с ХГ были разделены на 2 группы: группу 1 - составили пациенты с поверхностным воспалением СОЖ (п=10); во 2-ю группу (п=10) вошли пациенты с выраженным воспалительным процессом в СОЖ и наличием эрозий и язв - деструктивное воспаление.

В результате проведенного комплексного исследования нами были установлены дефекты в функционировании системы НГ при ХГ. (Табл. 1.). Выявлено повышение (в 1,7 раза в обеих группах, относительно контроля) содержания СЭ16+-НГ. У больных 1-й группы в 1,5 раза по сравнению с контролем увеличено количество CD95+-Hr. В обеих группах отмечаются также выраженные тенденции к увеличению количества CD11Ь-НГ.

Фенотип и функциональная активность нейтрофильных гранулоцитов при хроническом активном гастрите в сравнении со здоровым контролем _

Показатель Контроль Группа 1 Группа 2

(п=29) Поверхностное воспа- Деструктивное воспаление

ление (п=10)

(п=10)

Нейтрофнлы, % 55,9±2,81 58,2±1,07 53,4±3,57

Абсолюта, в мм' 3071 ±203,7 3194±333,8 2738±615,1

CDllb-НГ, % 42,0б±3,4 52,2±5,28 56,8±4,62

Абсолюта, в мм3 1320±223 1627± 169,2 1552±382,5

С016-НГ, % 41,56±3,12 69,2±4,21') 72,6±7,06"

Абсолюта, в мм' 1615±241,б 2179±208,9 1867±324

CD95-Hr, % 22,94±1,76 34,б±4,921) 27,4±4,57

Абсолютн. в мм' 625,1±106,2 106 8± 160,4 747,5±193,9

ФАН, % 51,39±2,55 53,6±4,97 55,4±3,03

NBTcn, %ФПК 2,0 1,0'> 1,0"

NBTct, %ФПК 7,0 1,0IJ 1,0"

КМ, усл. ед. 2,0 1,0" 1,0"

Примечание: достоверность различий между группами оценивалась с помощью критерия Стьюдента с поправкой Бонферрони, для %ФПК и КМ - с использованием непараметрического критерия Крускала- Уоллиса и Данна. -Р<0,05 в сравнении с контрольной группой.

Увеличение содержания НГ, несущих рецепторы адгезии (CDllb), антителозависимой цитошксичности (CD16) и активационного рецептора, способствующего запуску апоптозной программы (CD95), в, можно рассматривать как стереотипное реагирование на имеющийся воспалительный процесс в СОЖ. Ранее установлено, что уровни реагирования рецепторного аппарата при воспалении в слизистой оболочке различных отделов ЖКТ могут в 1,5-2 раза превышать средние параметры нормы [И.В. Нестерова и др., 2004; В.А. Роменская, 2000]. Активация рецепторного аппарата НГ пациентов с ХГ не сопровождалась усилением их функциональных способностей. %ФАН не отличался от уровня контроля, что можно рассматривать как неадекватное реагирование на воспалительный процесс. Наиболее выраженные дефекты функционирования НГ при исследуемой патологии нами были выявлены при анализе активности NADPH-оксидаз. %ФПК у данной категории больных в обеих группах был снижен в 2 раза в спонтанном NBT-тесте (р<0,05). За исключением 2 больных, НГ остальных не были способны адекватно реагировать на.дополнительную нагрузку in vitro: инкубация НГ с 03 (стимулированный NBT-тесг) не приводила к увеличению %ФПК, в результате чего %ФПК в стимулированном NBT-тесте был в 7 раз (р<0,05) ниже аналогичного показателя в контрольной группе (Табл. 1.). Таким образом, изучение фенотипических и функциональных характеристик НГ при ХГ независимо от степени выраженности воспаления в СОЖ выявило однонаправленные изменения исследуемых показателей от контроля с отсутствием достоверных различия между группами больных.

Установлено, что ИЛ-8 играет важную роль в развитии //^-ассоциированных заболеваний [A.B. Кононов, 1999; P.M. Хаитов, Б.В. Пинегин, 2000; J.E. Crabtree et al., 1994]. НГ, пришедшие в места колонизации Hp, также продуцируют ИЛ-8, увеличивая локальный пул этого хемокина в СОЖ и поддерживая, тем самым, интенсивность клеточного ответа на бактериальную обсе-

мененность [P.M. Хаитов, Б.В. Пинегин, 2000; D.A. Реига, 1997]. Анализ полученных результатов выявил значительное повышение как спонтанной, так и ЛПС-ивдуцированной продукции ИЛ-8 НГ при ХГ. Так, уровень спонтанной продукции ИЛ-8 НГ составил 1139±141,3 пг/млЛ06кл., что в 5,5 раз выше, чем у здоровых лиц (р<0,001). Концентрация ИЛ-8 в супернатанте после ЛПС-стимуляции НГ составила 1752±169,9 пг/мл/106кл., что в 5,4 раз выше аналогичного показателя в контрольной группе (р<0,001) и в 1,5 превышает уровень спонтанной продукции ИЛ-8 НГ у данных пациентов (р<0,01). Известно, что способность НГ отвечать на стимулы определяется исходным состоянием клеток, которое обусловлено предварительным воздействием на них в кровотоке различных биологически активных медиаторов. Установлено, что при воспалительных заболеваниях желудка (гастриты, язвенная болезнь) преобладают провоспалительные цитокины [Э.А. Кондрашина и др., 2002; Т. Shimoyama et al., 1998], которые, возможно, и обуславливают значительное усиление ИЛ-8-продуцирующей способности НГ. Повышение секреции провос-палительных цитокинов периферическими НГ отмечается в литературе при воспалительных процессах в слизистой кишечника [S. Nikolaus et al., 1998]. Не исключено, также, что способность к повышенной спонтанной секреции ИЛ-8 НГ может быть генетически детерминирована у этих лиц, что может предрасполагать к развитию ИЛ-8-опосредованных воспалительных заболеваний. Существуют работы, показывающие связь между полиморфизмом гена IL-8 и патологией. Установлено, что комбинация генотипа IL-8-251TT и IL-10-819TT связана с высокой вероятностью персистенции инфекции Hp [D. Hacking et al., 2004; A. Heinzmann et al., 2004; J. Hull et al., 2000; O.A. Ross et al., 2004; A.C. van der Kuyl et al., 2004].

При изучении ИЛ-8-секретирующей активности НГ в зависимости от выраженности воспаления и наличия эрозивно-язвенных повреждений СОЖ было выявлено, что существенно повышенный уровень спонтанной продукции ИЛ-8 НГ по сравнению со здоровыми лицами наблюдается у пациентов, как с поверхностным воспалением СОЖ, так и с деструктивным, не отличаясь между этими группами (Табл. 2).

Таблица 2.

Продукция ИЛ-8 нейтрофильными гранулоцитамн в зависимости от выраженности воспаления при хроническом активном гастрите (М±т)

Наименование Спонтанная Спонтанная лпс- Индекс % ответа

групп продукция пг/мл/106кл продукция Кол-во людей (в %) индуцированная продукция пг/мл/106кл стимуляции на ЛПС

Здоровые (11=29) 207,2±21,49 89,1 323,1 ±51,61 " 1,63±0,3 58,6

Группа 1. 1086±175,3" 100 2088±163,4'AJ) 2,08±0,39 90

Поверхностное

воспаление

(п=10)

Группа 2. 1199±235,9 " 100 1248±230,7i-i4) 0,94±0,21 50

Деструктивное

воспаление

(п=Х0)

Примечание: достоверность различий между группами оценивалась с помощью критерия Стъюдента с поправкой Бонферрони: 11 - р<0,05 в сравнении со спонтанной продукцией ИЛ-8 НГ здоровых лиц; 21 - р<0,05 в сравнении со ЛПС-индуцированной продукцией ИЛ-8 НГ здоровых лиц;3) - р<0,05 в сравнении со спонтанной продукцией ИЛ-8 НГ1-Й группы;41 - р<0,05 в сравнении с ЛПС-индуцированной продукцией НГ1-Й группы.

В то же время нами были показаны статистически значимые различия в ЛПС-индуцированной продукции ИЛ-8 НГ при ХГ в зависимости от наличия эрозивно-язвенных повреждений СОЖ. Установлено, что НГ большинства больных (в 90% случаев) с поверхностным воспалением СОЖ (группа 1) сохраняют способность отвечать на стимуляцию ЛПС, увеличивая концентрацию продуцируемого ИЛ-8 до 2088 пг/мл/106кл., что в 1,9 раз выше спонтанно продуцируемого ИЛ-8 НГ в данной группе и в 6,5 раз выше ЛПС-индуцированной продукции ИЛ-8 НГ здоровых лиц (р<0,05). Индекс стимуляции составил 2,08±0,39. При этом добавление ЛПС в культуральную среду к НГ больных с деструктивным воспалением СОЖ (группа 2) только в 50% случаев незначительно стимулировало увеличение продукции ИЛ-8 НГ, вследствие чего уровень ЛПС-индуцированной продукции ИЛ-8 НГ практически не отличался от спонтанной продукции ИЛ-8 НГ в этой группе - 1248±230,7 и 1199±235,9 пг/мл/10бкл, соответственно.

Отсутствие ответа на ЛПС в данной группе с более выраженным и длительным воспалительным процессом может быть обусловлено гиперактивацией НГ и, как следствие, истощением внутриклеточных запасов ИЛ-8. Известно, что деструктивный характер воспаления очень часто связан с типом патогенного штамма Hp [В.А. Исаков, И.В. Домарадский, 2003; N. Figura, 1996]! Именно при эрозивио-язвенных изменениях СОЖ выявляется высокая частота (79,5%) ульцерогенных штаммов cagA+vacA+-#. Pylori [В.П. Мудров, В.Н. Нелюбин, 2004]. Установлено также, что у лиц с более выраженной воспалительной реакцией, ассоциированой с язвенной болезнью, эрозивными процессами в СОЖ гораздо чаще, чем у больных с ХГ выделяются штаммы Hp с выраженной нейтрофил-активирующей способностью [D. Danielsson et al., 2000; H. Rautelin et al., 1993, 1994].

Изучая способность НГ продуцировать ИЛ-8 и их функциональную активность при ГСО, мы выбрали 2 различных варианта гнойно-септической патологии: ОДП, как модель системного воспаления и абсцессы брюшной полости - локальное воспаление, как модель малой гнойной инфекции. Комплексное исследование периферических НГ у этих больных также выявило наличие различных клеточных дисфункций. У большинства пациентов обеих групп наблюдался выраженный нейтрофилез с достоверным увеличением как процентного, так и абсолютного содержания НГ. У пациентов с ОДП было выявлено повышенное содержание (в 1,5 раза) CD11Ь+-, CD16-, CD95-НГ относительно контроля. Абсолютное количество НГ, экспрессирующих вышеуказанные рецепторы, было значительно выше, чем у здоровых лиц: в 3,4, 3,0 и 3,8 раза, соответственно (р<0,001). У пациентов с абсцессами активация рецепторного аппарата НГ была менее выраженной: наблюдались тенденции к увеличению содержания НГ, несущих CDllb-и CDlô-рецепторы, а абсолютное количество CDllb'1'-, CD16+-, CD95+-Hr было достоверно выше контрольных значений в 2,4, 2,1 и 1,8 раза (pl<0,01, р2,3<0,05), соответственно (Табл. 3.). Активация рецепторного аппарата при ГСО сопровождалась повышенной спонтанной активностью мембранных оксидаз, что проявилось выраженной тенденцией к увеличению %ФПК в спонтанном NBT-тесте у пациентов обеих групп. Несмотря на повышенную экспрессию рецепторов адгезии, цитотоксичности и апоптоза и повышенную спонтанную активность NADPH-оксидаз, НГ пациентов с ГСО обладали более слабыми фагоцитарными способностями по сравнению с НГ здоровых лиц: %ФАН был снижен на 21,6% при ОДП и на 31,9% при абсцессе (р<0,05 и р<0,01, соответственно). Нами выявлены различия в активности кислородзависимых микробицидных систем НГ в нагрузочных тестах in vitro с ОЗ между двумя исследуемыми фу ппами в зависимости от тяжести ГСО.

Фенотип и функциональная активность нейтрофильных гранулоцитов пациентов с гной-

но-септнческимн хирургическими осложнениями в сравнении со здоровым контролем

Показатель Здоровые лица Острый деструктивный Абсцессы брюшной по-

(контроль) панкреатит лости

(п=29) ("= 16) (п=12)

М±ш Р М+ш Р

Нейтрофилы, % 55,9±2,81 76,0±5,4 Р=0.00 2 73,14*5,22 Р=0.005

Абсолюта, в мм' 3071±203,7 7302±1246 Р=0.000.;.;. 7408±2040 Р=0.001

CDlIb-НГ, % 42,06±3,4 61,17±10,79 Р=0.033 55,57*11,16 Р=0.129

Абсолюта, в мм3 1320±223 4429±833,8 Р = 0.000 3166±890,5 Р=0.008

СШ6-НГ, % 41,56±3,12 60,83±б,22 Р=0.006 56,71±12,92 Р>0,05

Абсолюта, в мм3 1615±241,6 478б±935,8 Р=0.000 3333±1142 Р=0.035

СШ5-НГ, % 22,94±1,76 32,67±5,84 Р=0.040 22,71 ¿9,97 Р>0,05

Абсолюта, в мм3 625,1±10б,2 2344±38б,9 Р=0.000 1149±268,1 Р-0.037

ФАН, % 51,39±2,55 40,29±3,74 Р=0.031 35,0±2,74 Р=0.002

NBTcn, %ФПК 3,16±0,42 5,43±1,59 Р=0.061 5,57±1,77 Р=0.063

NBTcr, %ФПК 8,11±1,21 6,2±3,02 Р>0,05 19,57±6,49 Р=0.012

КМ, усл. ед. 3,61±0,76 1,04±0,25 Р>0,05 9,05±5,95 Р>0,05

Примечание: достоверность различий по отношению к контрольной группе оценивалась с помощью (-критерия Стъюдента.

Так, у пациентов с абсцессами (более легкое течение патологического процесса) наблюдалась стимуляция кислородзависимого метаболизма НГ в ответ на 03 (в 2,5 раз по сравнению с контролем, р<0,05).В то же время при ОДП (более тяжелое течение), на фоне повышенной спонтанной продукции супероксиданиона, выявлена значительная депрессия кислородзависи-мых микробицидных систем в ответ на дополнительную стимуляцию НГ in vitro, что количественно отразилось на КМ, который снизился на 71,2% по сравнению с контролем. Таким образом, более тяжелое течение ГСО сопровождалось феноменом дезадаптации НГ, - блокировалась их способность к адекватному ответу на дополнительную нагрузку.

Анализируя ИЛ-8-продуцирующую активность НГ при ОДП, нами была выявлена секреция ИЛ-8 НГ без их дополнительной стимуляции в 100% случаев. При этом у 12 пациентов (75%) средний уровень спонтанной продукции ИЛ-8 НГ составил 378,4±30,69 пг/мл/106кл., что в 1,5 раза превышает аналогичный показатель у здоровых лиц (р<0,001). У 2-х пациентов уровень спонтанной продукции ИЛ-8 был значительно ниже, чем у большинства больных ОДП (58,7 и 63,2 пг/мл/10бкл.), а у еще 2-х - существенно выше (2032 и 2070 пг/мл/106кл.). У U пациентов (91,7%) с абсцессами спонтанная продукция ИЛ-8 НГ не отличалась от контроля -239,9±52,92 пг/мл/106кл., только у 1 больного уровень спонтанной продукции ИЛ-8 НГ составил 2500 пг/млЛ06кл. Однако, в данной группе, как и при ОДП, спонтанная секреция ИЛ-8 НГ наблюдалась в 100% случаев. Возможно, что выявленное повышение спонтанной продукции ИЛ-8 НГ у большинства пациентов с ОДП обусловлено их предварительной активацией в кровотоке как ЛПС, так и провоспалительными цитокинами, так как известно, что ОДП в отличие от абсцесса, где имеется локально-ограниченный воспалительный процесс, сопровождается системным воспалительным ответом.

Кроме различий в спонтанной продукции, наблюдались также различия и в характере ответа НГ на стимуляцию ЛПС между этими группами (Рис. 3).

Контроль ОДП Абсцесс

|Р Спонтанная Я ЛПС-индуцироаанная |

Рис. 3. Изменение продукции ИЛ-8 нейтрофильнымн гранулоцитами под влиянием ЛПС в норме и при гнойно-септических осложнениях. По вертикали: концентрация ИЛ-8 (пг/мл) в супернатанте; ^ - р<0,05; в сравнении со спонтанной продукцией ИЛ-8 НГздоровых лиц; ^ - р<0,05; в сравнении со спонтанной продукцией ИЛ-8 НГ при абсцессе.

Было установлено, что НГ у 80% пациентов с абсцессами и только у 35,7% с ОДП "отвечали" на ЛПС, в отличие от 58,6% в контроле. В связи с этим, средний уровень ЛПС-индуцированной секреции ИЛ-8 НГ у пациентов с абсцессами, превышал спонтанную в 1,7 раз и составил 402,6±47,07 пг/мл/106кл. А так как у большинства пациентов с ОДП НГ реагировали не увеличением продукции ИЛ-8 в ответ на ЛПС, а ее снижением, то средний уровень ЛПС-индуцированного ИЛ-8 при ОДП не отличался от спонтанного у данной категории больных, составив 363±42,33 пг/мл/106кл.

Наши данные совпадают с результатами, полученными ранее Marie С. et al. [1998], где показана сниженная продукция ИЛ-8 НГ в ответ на ЛПС при развитии синдрома системного воспалительного ответа инфекционного и неинфекционного генеза. Установлено, что не инфекционный, а именно воспалительный компонент септического синдрома является существенным для изменения механизма синтеза ИЛ-8 НГ. Предполагают, что одной из причин редуцированного уровня высвобождения ИЛ-8 НГ в ответ на ЛПС при системном воспалении является находящийся в кровотоке ИЛ-10, обладающий супрессирующим воздействием на функционирование НГ [F. Randow et al., 1995].

Одной из задач настоящего исследования входило изучение влияния пептидов: y-D-глутаминил-Ь-триптофана (Бестима, БС) и глюкозаминилмурамилдипептида (ГМДП), являющихся основой эффективных в отношении НГ иммунотропных препаратов, на секрецию ИЛ-8 НГ в норме и при патологии в эксперименте in vitro для возможного предварительного обоснования их применения при дисфункциях НГ, связанных с их цитокин-секретирующей активностью.

Изучая влияние БС на продукцию ИЛ-8 НГ здоровых лиц, мы установили, что добавление пептида в инкубационную среду без предварительной ЛПС-активации НГ не влияло на уровень продуцируемого ИЛ-8 (Рис. 4).

400 350 300 250 200

150

100 50 0

Рис. 4. Влияние Бестима на продукцию ИЛ-8 нейтрофильными гранулоцитами здоровых лиц. По вертикали: концентрация ИЛ-8 в пг/мл/106кл. Контроль — спонтанная продукция ИЛ-8; ЛПС -10 нг/мл; Бестим -0,1 мкг/мл.

В то же время было отмечено увеличение продукции ИЛ-8 НГ при добавлении БС после предварительного 30-минутного праймирования НГ здоровых лиц ЛПС. При этом уровень продуцируемого ИЛ-8 после добавления БС значительно превышал значения, полученные только при добавлении ЛПС в инкубационную среду: концентрация ИЛ-8 возрастала в среднем до 308,2±65,53 пг/мл, что превышало спонтанную продукцию ИЛ-8 НГ в 2,3 раза (р<0,05), а ЛПС-индуцированную продукцию без БС в 1,7 раз. При этом НГ секретировали ИЛ-8 в 100% случаев. Таким образом, БС, не влияя на продукцию ИЛ-8 интактными НГ здоровых лиц, способен оказывать стимулирующее воздействие на ЛПС-индуцированную продукцию ИЛ-8 НГ.

При изучении влияния БС на продукцию ИЛ-8 НГ при патологии установлены следующие особенности (Табл. 4). Аналогично тому, что было отмечено у здоровых лиц (контроль), при ГСО (ОДП, абсцессы) БС проявлял свое действие только после предварительной ЛПС-стимуляции НГ, не оказывая собственного влияния на ИЛ-8-продуцирующую способность клеток. Однако в отличие от контроля, где наблюдалось усиливающее действие БС на ЛПС-индуцированную продукцию ИЛ-8 НГ, при ГСО БС проявлял супрессирующий эффект. У больных ОДП было выявлено снижению продукции ИЛ-8 НГ в 1,9 раз (р<0,05) при добавлении БС после ЛПС. При абсцессах также наблюдалось выраженное и статистически значимое снижение ЛПС-индуцированной продукции ИЛ-8 НГ под влиянием БС: при введении ЛПС в инкубационную среду продукция ИЛ-8 НГ составила 402,6±87,07, что в 1,7 выше спонтанной, а добавление ЕС после ЛПС снижало концентрацию ИЛ-8 в супернатанте до 189,1+41,01 пг/мл/106 (р<0,05).

Контроль

Бестим

ЛПС

ЛПС+Бестим

Влияние бестима на спонтанную и ЛПС-индуцированную продукцию ИЛ-8 нейтрофиль-ными гранулоцитами при патологии (М±ш)

1. 2. 3. 4.

№ Группы Контроль одп Абсцесс Хронический

п/ гастрит

п п-10 11=10 п=11 п=10

1. Спонтанная 1.1 2.1 3.1 4.1

135,6±43,47 369,5+26,26" 239,9+32,92 1228+151,9"

2. ЛПС- 1.2 2.2 3.2 4.2

индуцированная 181,8±48,3 387,7±69,65 402,6±47,073) 1485±371,21,5'

(10 иг/мл)

3. Бестим 1.3 2.3. 3.3. 4.3

(0,1 мкг/мл) 124,2±73,89 447,5+78,04 229,9±61,73 772,3±83,984'5>

4. ЛПС + Бестим 1.4. 2.4. 3.4 4.4.

308,2±65,53!) 199,6+33,07ад 189,1+41,Ol4 1507+536,45)

Примечание: достоверность различий в группах оценивалась с помощью критерия Стьюдента с поправкой Бон-ферроне: 15-р<0,05 в сравнении со спонтанной продукцией ИЛ-8 НГ контрольной группы (группа 1.1.); * -р<0.05 в сравнении со спонтанной продукцией ИЛ-8 НГ при ОДП (группа 2.1.); 3-р<0,05 в сравнении со спонтанной продукцией ИЛ-8 НГ при абсцессе (группа ЗЛ.^^-р-сО^ в сравнении со спонтанной продукцией ИЛ-8 НГ при хроническом гастрите (группа 4.1,); 5)-р<0,05 в сравнении с ЛПС-ицдуцированной продукцией ИЛ-8 НГ контрольной группы (группа 1.2.); 6>-р<0,05 в сравнении с ЛПС-индуцированной продукцией ИЛ-8 НГ при ОДП (группа 2.2.);7)-р<0,05 в сравнении с ЛПС-ивдуцированной продукцией ИЛ-8 НГ при абсцессе (группа 3.2).

В то же время при ХГ, где уровень как спонтанной, так и ЛПС-индуцированной продукции ИЛ-8 НГ значительно превышает аналогичные показатели здоровых лиц, БС без предварительного праймирования ЛПС на 60% супрессирует продукцию ИЛ-8 НГ: 1228+151,9 пг/мл/106 составляла спонтанная продукция ИЛ-8 НГ при ХГ и 772,3+83,98 пг/мл/10 после добавления БС в инкубационную среду (р<0,05). При этом БС не оказывает никакого влияния на ЛПС-индуцированную продукцию ИЛ-8 НГ при данной патологии.

Анализ результатов, полученных при изучении влияния ГМДП на секрецию ИЛ-8 НГ здоровых лиц, позволил выявить различия в механизмах действия двух исследуемых пептидов - ГМДП й БС. В отличие от БС при добавлении в инкубационную среду ГМДП было установлено усиление продукции ИЛ-8 НГ без их предварительной стимуляции ЛПС (Рис. 5). В данном случае регистрировалось повышение уровня ИЛ-8 в среднем до 271,4±35,61 пг/мл/10бкп (максимум 587,7 пг/мл/106кл), что в 2 раза больше контрольных значений. Однако при одновременной инкубации НГ с ГМДП и ЛПС продукция ИЛ-8 не отличалась от показателей ЛПС-индуцированной продукции ИЛ-8 НГ (без ГМДП) и была ниже, чем при инкубации с одним ГМДП. Возможно, это связано с конкуренцией ГМДП с ЛПС за один и тот же рецептор связывания. Известно, что одним из типов поверхностных рецепторов, способных связывать мура-милдипептиды, является рецептор ЛПС - С014 антиген [В. \Veidemarm е1 а1., 1997].

Рис. 5. Влияние ГМДП на продукцию ИЛ-8 нейтрофильными гранулоцитами здоровых лиц. Контроль - спонтанная продукция ИЛ-8; - р<0,05 в сравнении с контролем.

Исследуя влияние ГМДП на способность НГ секретировать ИЛ-8 при патологии, мы, как и в случае с БС, смогли выявить определенные различия в результирующих эффектах ГМДП (Табл. 5).

Таблица 5.

Влияние ГМДП на спонтанную и ЛПС-индуцированную продукцию ИЛ-8 нейтрофильными гранулоцитами при патологии (М±т)

I. г. 3. 4.

X« Группы Контроль ОДП Абсцесс Хронический

п/ гастрит

п п=10 п=12 п=10 п=15

1. Спонтанная 1.1 2.1 3.1 4.1

135,6±43,47 369,5±26,26" 263,1+57,3 1274+155,4"

г. ЛПС- 1.2 2.2 3.2 4.2

индуцированная 181,8±48,3 387,7±49,655) 404,5+43,32,J-5> 1794±136,14)

(10 нг/мл)

3. ГМДП 1.3 2.3. 3.3. 4.3

(0,1 мкг/мл) 271,4±35,61'> 235,5±51,13зд 256,9±52,0б7) 1934±15б,2М)

4. ЛПС + ГМДП 1.4. 2.4. 3.4 4.4.

182,6±41,02 380,8±66,02 207,8+37,S77* 1919±258,8М)

Примечание: достоверность различий в группах оценивалась с помощью критерия Стьюдента с поправкой Бон-ферроне: 1)-р<0,05 в сравнении со спонтанной продукцией ИЛ-8 НГ контрольной группы (группа 1.1.); 3)-р<0,05 в сравнении со спонтанной продукцией ИЛ-8 НГ при ОДП (группа 2.1.); 1>-р<0,05 в сравнении со спонтанной продукцией ИЛ-8 НГ при абсцессе (группа 3.1.); 4)-р<0,05 в сравнении со спонтанной продукцией ИЛ-8 НГ при хроническом гастрите (группа 4.1.); 5)-р<0,05 в сравнении с ЛПС-индуцированной продукцией ИЛ-8 НГ контрольной группы (группа 1.2.); 6)-р<0,05 в сравнении с ЛПС-индуцированной продукцией ИЛ-8 НГ при ОДП (группа 2.2.); 7)-р<0,05 в сравнении с ЛПС-индуцированной продукцией ИЛ-8 НГ при абсцессе (группа З.2.).

Добавление ГМДП в инкубационную среду в 1,6 раз (р<0,05) снижало продукцию ИЛ-8 НГ при ОДП по сравнению со спонтанной продукцией ИЛ-8, приближая ее к спонтанной продукции в группе здоровых лиц. Однако, если к клеткам предварительно добавляли ЛПС, то ГМДП не оказывал такого супрессивного влияния.

При абсцессах, где спонтанная продукция ИЛ-8 НГ по сравнению с контролем была повышена незначительно (р>0.05) добавление ГМДП в инкубационную среду не оказывало никакого эффекта на продукцию ИЛ-8 НГ. В то же время ГМДП препятствовал ЛПС-индуцированному усилению секреции ИЛ-8 НГ при данной патологии, сохраняя концентрацию ИЛ-8 на уровне спонтанной продукции.

Совершенно другая картина наблюдалась при ХГ. В отличие от супрессивного действия ГМДП при ГСО, его влияние на продукцию ИЛ-8 НГ при данной патологии - стимулирующее, сравнимое с эффектом ЛПС. Как и в случае со здоровыми лицами ГМДП не оказывал никакого влияния на ЛПС-стимулированную продукцию ИЛ-8 НГ.

Таким образом, и глюкозомурамилдипептид (ГМДП), и дипептид бестим обладают как сходными, так и во многом различными эффектами на продукцию ИЛ-8 НГ (Табл. 6).

Таблица 6.

Сравнительная оценка влияний у-О-глутаминил-Ь-триптофана (БС) и глюкозому-рамнлднпепгида (ГМДП) на ИЛ-8-продуцирующую активность нейгрофильных грануло-

цитов

Здоровые лица (контроль) ОДП Абсцесс Хронический гастрит

БС _ _ _ 4

ГМДП Г 1 — Т

ЛПС+БС т ; 4

ЛПС+ГМДП _ _ 4 _

Примечание: - отсутствие влияния; Т - стимуляция; 4 - супрессия.

Оба исследуемых пептида способны оказывать как стимулирующее, так и супрессирую-щее влияние на уровень нейтрофильной секреции ИЛ-8. Их действие имеет однонаправленный характер у здоровых лиц (стимуляция) и при ГСО (супрессия), и противоположное направление при ХГ. Они обладают сходными эффектами влияния при абсцессах: оба пептида модулируют уровень ЛПС-индуцированной продукции ИЛ-8 НГ, снижая ее до уровня спонтанной секреции, не оказывая при этом никакого собственного влияния на продукцию ИЛ-8 НГ, без праймирова-ния ЛПС. Во всех остальных случаях действие БС и ГМДП различно. ГМДП проявляет, в основном, собственную активность (исключение абсцессы) без предварительного праймирования ЛПС, стимулируя ИЛ-8-секретирующую активность НГ у здоровых лиц и при ХГ и супресси-руя ее при ОДП. Возможная конкуренция ГМДП с ЛПС за один рецептор связывания может обуславливать ослабление влияний ГМДП при его совместном с ЛПС наличии в культуральной среде. Действие БС направлено преимущественно на НГ, предварительно праймированные ЛПС. Он усиливает ЛПС-индуцированную продукцию ИЛ-8 НГ здоровых лиц, а воздействуя на НГ больных с ГСО (ОДП, абсцессы), БС блокирует стимулирующее влияние эндотоксина на продукцию ИЛ-8 НГ. Исключение составляют только НГ пациентов с ХГ, где БС проявляет собственное влияние, снижая высокий спонтанный уровень ИЛ-8, продуцируемого НГ.

Различия в результирующих эффектах двух исследуемых пептидов могут быть обусловлены как разным механизмом их действия на клетки, так и особенностями патологического процесса. Известно, что при воспалительных заболеваниях желудка преобладают провоспа-лительные цитокины [Э.А. Кондрашина и др., 2002; Т. Shimoyama et al., 1998], а ГСО развиваются на фоне сдвига баланса в сторону противовоспалительных медиаторов [A.A. Останин и др., 2002; А.Д. Толстой, 2003]. Кроме того, различное исходное состояние клеток может обуславливать не только дифференцированные ответы на стимулы, но и детерминировать совершенно различный спектр секретируемых НГ продуктов. Так показано, что супернатанты активированных in vitro НГ крови здоровых доноров обладают моноцитстимулирующей активностью, а супернатанты НГ, выделенных в условиях гнойного раневого процесса - моноцитсу-прессирующей [И.Е. Третьякова, И.И. Долгушин, 2004].

Суммируя в целом полученные результаты, можно сделать заключение о том, что при патологии спонтанная продукция ИЛ-8 НГ является чувствительным индикатором наличия и выраженности воспалительного процесса, а характер ответа на ЛПС, отражающий способность НГ к адекватному функционированию в патологических условиях, может быть использован в качестве диагностического критерия нейтрофильных дисфункций и тяжести патологического процесса. ГМДП и БС способны оказывать как стимулирующее, так и супрессирующее влияние на уровень нейтрофильной секреции ИЛ-8 в зависимости от условий.

ВЫВОДЫ:

1. Нейтрофильные гранулоциты большинства здоровых лиц (88,57%) секретируют ИЛ-8 без дополнительной стимуляции, и в 58,6% случаев они отвечают на ЛПС увеличением секреции данного хемокина.

2. При хроническом гастрите уровень спонтанной продукции ИЛ-8 НГ значительно повышен вне зависимости от типа воспаления, при этом имеет место дезорганизация функциональной активности НГ. ЛПС-индуцированная секреция ИЛ-8 зависит от выраженности воспалительного процесса в слизистой оболочке желудка: при поверхностном типе воспаления отмечается повышение секреции ИЛ-8 в ответ на ЛПС, а при деструктивном (эрозии, язвы), - имеет место блокада индуцированной секреции ИЛ-8.

3. Выраженность дисфункций нейгрофильных гранулоцитов и характер секреции ими ИЛ-8 у пациентов с гнойно-септическими осложнениями зависели от вида воспалительного процесса. При абсцессах брюшной полости (локальный воспалительный процесс), выявлены дисфункции НГ в виде депрессии фагоцитарной функции. При этом уровень как спонтанной, так и ЛПС-индуцированной продукции ИЛ-8 не отличается от контроля. Острый деструктивный панкреатит (системный воспалительный процесс) сопровождается более выраженными комбинированными дисфункциями НГ. Спонтанная продукция ИЛ-8 НГ была выше, чем в группах контроля и с абсцессами брюшной полости, а ответ на индукцию ЛПС отсутствовал.

4. у-О-глутаминил-Ь-триптофан (бестим) не влияет на спонтанную продукцию ИЛ-8 НГ здоровых лиц, но обладает стимулирующим эффектом на секрецию ИЛ-8 при предварительном праймировании ЛПС. Глюкозаминилмурамилдипептид (ГМДП) усиливает продукцию ИЛ-8 нейтрофилами без их предварительного праймирования ЛПС.

5. у-О-глутаминил-Ь-триптофан (бестим) при патологии оказывает супрессирующий эффект на продукцию ИЛ-8 НГ. При гнойно-септических осложнениях (острый деструктивный панкреатит, абсцессы) он снижает ЛПС-индуцированную продукцию ИЛ-8. При хрониче-

ском гастрите бестим уменьшает продукцию ИЛ-8, не влияя на ЛПС-индуцированную продукцию ИЛ-8.

6. Глюкозаминилмурамилдипептид (ГМДП) оказывает стимулирующее влияние на ИЛ-8-секретирующую активность НГ при хроническом гастрите и супрессирующее влияние -при остром деструктивном панкреатите. При абсцессах брюшной полости ГМДП препятствует Л ПС-индуцированному усилению секреции ИЛ-8 НГ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Исходя из полученных данных об особенностях ИЛ-8 продуцирующей способности НГ при патологии и различиях в характере реагирования на ЛПС, можно рекомендовать:

а) определение спонтанной и ЛПС-индуцированной ИЛ-8-секретирующей активности НГ для проведения дифференциальной диагностики типа воспаления в СОЖ при хроническом гастрите, что позволит по характеру ответа на ЛПС судить о наличии поверхностного или деструктивного типа воспаления.

б) исследование спонтанной и ЛПС-индуцированной ИЛ-8-секретирующей активности НГ для проведения дифференциальной диагностики гнойно-септических осложнений (ОДП, абсцесс), характеризующихся различными по тяжести, типами гнойного воспаления,- системное или локальное.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Синельникова Е.Ю. Цитокин-секретирующая функция нейтрофильных гранулоцитов здоровых доноров // Мат. II регион, научно-практ. конфер. мол. уч£н. и студ. Краснодарского кр. «Мед. наука и здравоохр.», Россия, Анапа 21-23 апреля 2004 г.-С. 27-28.

2. Нестерова И.В., Швыдченко И.Н., Синельникова Е.Ю., Фомичева Е.В., Рожкова Г.Г. Влияние дипептида y-D-Glu-L-Тгр ("Бестим") на цитокин-продуцирующую активность нейтрофильных гранулоцитов // Цитокины и воспаление.-2005.-Т4, № 2.-С. 76.

3. Швыдченко И.Н., Синельникова Е.Ю., Нестерова И.В. Влияние пептидных иммуномо-дуляторов на секрецию ИЛ-8 нейтрофильными гранулоцитами // Сб. мат. XIII Росс. нац. Конгр. «Человек и лекарство», Москва, 3-7 апреля 2006 г.-С. 333.

4. Синельникова Е.Ю., Швыдченко И.Н., Нестерова И.В. Пептидная регуляция продукции ИЛ-8 нейтрофильными гранулоцитами в эксперименте in vitro // Russ. J. of Immunol.-2006-Vol. 9, Suppl.3.-P. 132.

5. Швыдченко И.Н., Нестерова И.В., Сннельникова ЕЛО., Роменская В.А., Фомичева Е.В., Рожкова Г.Г., Петренко С.Г. Характер цитокин-продуцирующей активности нейтрофильных гранулоцитов при гнойно-септических осложнениях в хирургической гастроэнтерологии // Аллерг. и иммунол.-2006.-Т.7, №3.-С. 373.

6. Синельникова Е.Ю., Нестерова И.В., Швыдченко И.Н., Фомичева Е.В. Продукция ИЛ-8 нейтрофильными гранулоцитами при гнойно-септических осложнениях в хирургической гастроэнтерологии И Цитокины и воспаление. - 2006. - Т.2 (№2). - С.373.

7. Нестерова И.В., Синельникова Е.Ю., Швыдченко И.Н. Пептидная регуляция продукции ИЛ-8 нейтрофильными гранулоцитами в эксперименте in vitro // Иммунология.-2006.-№5.-С. 274-278.

8. Синельникова Е.Ю., Нестерова И.В., Швыдченко И.Н., Фомичева Е.В., Петренко С.Г. ИЛ-8-продуцирующая способность и дисфункции нейтрофильных гранулоцитов у пациентов с гнойно-септическими хирургическими осложнениями // Росс, иммунол. журн. -2007. - Т. 1 (10), №1,-С. 41-47

9. Нестерова И.В., Швыдченко И.Н., Синельникова ЕЛО. и др. Цитокин-продуцирующая активность нейтрофильных гранулоцитов в норме и при патологии // Аллерг. и иммунол. -

2007.-Т.8, №1.-С.136-137.

10. Швыдченко И.Н., Нестерова И.В., Синельникова Е.Ю. и др. Цитокин-продуцирующая активность нейтрофильных гранулоцитов при гнойно-септических осложнениях в хирургической гастроэнтерологии // Мат. XV Межд. конфер. и дискусс. научн. клуба, Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 31 мая-9 июня 2007.-С. 246-247.

11. Синельникова Е.Ю., Швыдченко И.Н., Фомичева Е.В., Рожкова Г. Г., Нестерова И. В. Пептидная модуляция спонтанной продукции ИЛ-8 нейтрофильными гранулоцитами у больных с гнойно-септическими осложнениями // Росс, аллергол. журн. - 2007,- Ks 3.-С.411.

12. Быковская Е. Ю., Швыдченко И.Н., Нестерова И.В., Рожкова Г.Г. ИЛ-8-секретирующая активность нейтрофильных гранулоцитов и их дисфункции при остром деструктивном панкреатите // Вестн. хирург, гастроэнтерол. - 2007.-№3.-С.52.

13. Нестерова И.В., Швыдченко И.Н., Фомичева Е.В., Синельникова Е.Ю., Роменская В. А., Рожкова Г. Г., Фесенко И. В. Фенотипические и функциональные характеристики нейтрофильных гранулоцитов в норме//НаукаКубани-2007,-№ 4.-С.38-43.

14. Быковская Е. Ю., Нестерова И.В., Швыдченко И. Н, Роменская В.А.. Пептидная регуляция интерлейкин-8 продуцирующей способности нейтрофильных гранулоцитов при хроническом гастрите // Сб. материалов XV нац. конгресса «Человек и лекарство», Москва, 14-18 апреля 2008, С. 61.

15. Швыдченко И. Н., Барышен А.Г., Роменская В.А., Фомичёва Е.В., Ковалёва С В., Быковская Е.Ю., Нестерова И.В. NADPH-оксидазная активность нейтрофильных гранулоцитов при осложненном остром деструктивном панкреатите // Труды межд. конф. «Новые инф. технол. в медицине, биологии, фармакологии и экологии» Крым, Ялта-Гурзуф, 31 мая - 9 июня 2008, С .205-207.

16. Нестерова И.В., Швыдченко И. Н., Быковская Е. Ю. Нейтрофильные гранулоциты как источник цитокинов: фундаментальные и клинические аспекты // Российский иммунол. журнал. - 2008. - Т.2(11), №2-3. - С. 128.

17. Нестерова И.В., Швыдченко И.Н., Роменская В.А., Фомичёва Е.В., Быковская Е.Ю., Рожкова, Капранова Н.П., Расторгуева Е.А. и др. Фенотип и функциональная активность нейтрофильных гранулоцитов в норме и патологии // Российский иммунол. журнал. -

2008. - Т.2(11), №2-3. - С.128.

18. Нестерова И.В., Швыдченко И.Н., Роменская В. А., Фомичёва Е.В., Быковская Е.Ю., Рожкова Г.Г., Петренко С.Г. Фенотипические и функциональные характеристики нейтрофильных гранулоцитов при осложнённом остром деструктивном панкреатите // Российский аллергол. журнал. - 2008. -№1, Прил.1. - С. 203-204.

19. Нестерова И.В., Швыдченко И.Н., Быковская Е.Ю. Интерлейкин-8 продуцирующая способность нейтрофильных гранулоцитов при хроническом активном гастрите // Российский аллергол. журнал. - 2008. - №1, Прил.1. - С. 205-206

20. Нестерова И.В., Швыдченко И.Н., Роменская В.А., Капранова Н.П., Быковская Е.Ю., Рожкова Г.Г. Фенотип поверхностной мембраны нейтрофильных гранулоцитов при воспалительных заболеваниях гастродуоденальной зоны // Российский аллергол. журнал. -2008. - №1, Прил.1. - С.207-208.

21. Нестерова И.В., Швудченко И.H., Роменская В.А., Фомичева Е.В., Быковская ЕЛО., Рожкова Г.Г., Капранова Н.П., Ковалёва C.B. Нейтрофильные гранулоциты - ключевые клетки иммунной системы // Аллергология и иммунология.-2008.- Т.9.-№4,- С.432-435.

22. Нестерова И.В., Швыдченко И.Н., Роменская В.А., Фомичева Е.В., Быковская ЕЛО., Рожкова Г.Г.,, Капранова Н.П., Ковалёва C.B. Фенотипические и функциональные характеристики нейтрофильных гранулоцитов при воспалительных заболеваниях гастродуоде-нальной зоны // Российский иммунол. журнал. - 2008. - Т.2., №4. - С. 433-439.

23. Быковская Е. Ю., Швыдченко И. Н., Роменская В. А., Капранова Н. П., Нестерова И. В. Особенности интерлейкин-8-продуцирующей способности нейтрофильных гранулоцитов в норме и при патологии // Аллергология и иммунология. - 2009. - Т. 10, № 1. - С. 32.

Список сокращений

БС бестим

ГСО гнойно-септические осложнения

ГМДП глюкозаминилмурамилдипептид

дпк двенадцатиперстная кишка

жкт желудочно-кишечный тракт

НДС иммунодефицитное состояние

ИЛ-1,2...(IL-1,2...) интерлейкин-1, 2, и т.д.

КМ коэффициент мобилизации

ЛПС липополисахарид

НГ нейтрофильные гранулоциты

ОДП острый деструктивный панкреатит

ОЗ опсонизированный зимозан

СОЖ слизистая оболочка желудка

ФАН фагоцитарная активность нейтрофилов

ФПК формазан-позитивные клетки

ХГ хронический гастрит

Hp Helicobacter pylori

NBT-тест нитроголубого тетразолия тест (англ. nitroblue tetrazolium test)

Быковская Екатерина Юрьевна

Особенности ИЛ-8-продуцирующей способности нейтрофильных гранулоцитов в норме и при патологии

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 18.05.09 г. Бумага тип. №2. Печать трафаретная Тираж 100 экз. Заказ № 653 от 20.05.09 г. Кубанский государственный университет.

350040, г. Краснодар, ул. Ставропольская, 149. Центр "Универсервис", тел. 21-99-551.

Актуальность темы. В настоящее время система нейтрофиль-ных гранулоцитов (НГ) рассматривается как совокупность достаточно имму-нокомпетентных и иммунорегуляторных клеток, участвующих в межклеточных контактах и взаимодействиях, обладающих регуляторными возможностями на другие клетки и принимающих активное участие в поддержании системного гомеостаза [И.И. Долгушин, О.В. Бухарин, 2001; И.В. Нестерова, 2004; И.В. Нестерова, Н.В. Колесникова, 1999; S.S. Cheng, S.L. Kunkel, 2003; S. Culshaw et al., 2008; Y. Kobayashi, 2008; M.D. Morgan et al., 2005; S. Yama-shiro et al., 2001]. Они играют активную роль в противоопухолевом иммунитете [Е. Di Carlo et al., 2003], влияют на ангиогенез [R. Benelli et al., 2003; Q. Нао et al., 2007].

Установлено, что активированные НГ способны синтезировать de novo цитокины и приобретать новые функциональные свойства в зависимости от локального микроокружения [F. Al-Mohanna et al., 2002; М.А. Cassatella, 1995; E.Y. Denkers et al., 2003; T.N. Ellis, B.L. Beaman, 2002; F. Ethuin et al., 2001, 2004; T. Kasama et al., 2005; E.A. Kurt-Jones et al., 2002; E. Lome et al., 2008; G. Piskin et al., 2003; E.J. Sohn et al., 2008; A.Yoshimura et al., 1997].

Цитокины являются наиболее универсальной системой регуляции функций организма и формируют в нем сложную полиморфную по структуре ( сеть [С.А. Кетлинский и др., 1992; В.А. Козлов, 2002; С.В. Сенников и др., 2002; С.В. Сенников, А.Н. Силков, 2005; А.С. Симбирцев, 2002, 2004; J. Ор-penheim, М. Feldman, 2000].

Одним из основных цитокинов, продуцируемых НГ, является интер-лейкин-8 (ИЛ-8) [J. Altstaedt et al., 1996; Cassatella M. et al., 1992; R.M. Strieter et al., 1992]. Синтез и секреция НГ ИЛ-8 приводит в результате к быстрой амплификации острого воспалительного процесса, что имеет чрезвычайно большое значение, как в его благополучном разрешении, так и в хронизации патологического процесса [S.S. Cheng, S.L. Kunkel, 2003; P. Scapini et al., 2000].

Известно, что НГ являются одним из ведущих патогенетических факторов при воспалительных заболеваниях пищеварительной системы, таких как острые и хронические панкреатиты [Е.Н. Жукова, 1999; A.S. Gukovskaya et al., 2002; С. Kyriakides et al., 2001], Helicobacter pylori-ассоциированные заболевания желудка [L.-A. H. Allen, 2001, 2005; D. Danielsson et al., 2000; I. Mizuki et al., 2000], а также обуславливают гнойно-септические хирургические осложнения [Н.М. Антропова, 2007; Н.М. Калинина и др., 2005].

Так как острый воспалительный ответ является как протективным, так и потенциально опасным для окружающих тканей, лучшее понимание взаимоотношений ИГ и ИЛ-8, лежащих в основе нейтрофильного рекрутирования, активации и последующих лейкоцитарных замещений, способствует развитию новых терапевтических подходов в лечении многих заболеваний.

Достаточно актуальным вопросом также является изучение влияния различных иммунотропных препаратов на функции НГ, и на секреторную, в частности. Среди лекарственных препаратов чрезвычайно перспективны для использования в клинике соединения пептидной природы. Глюкозаминил-мурамилдипептид (ГМДП), является активным компонентом ликопида - высокоэффективного лекарственного иммуномодулятора, применяемого в комплексной терапии вторичных иммунодефицитных состояний (ИДС). Главной мишенью действия ГМДП являются фагоциты — нейтрофилы и макрофаги [Т.М. Андронова, Б.В. Пинегин, 1999; В.Т. Иванов, 1996]. Другой синтетический дипептид - у-О-глутаминил-Ь-триптофан (бестим, БС) проявляет выраженную иммуномодулирующую активность в отношении клеток лимфоидного и нелимфоидного ряда и используется для лечения вторичных ИДС, связанных с неадекватной Т-клеточной регуляцией [А.А. Колобов, 1997; Н.В. Пигарева и др., 2000]. Показано также, что БС влияет на различные стороны нейтрофильной активности [В.А. Зурочка, И.И. Долгушин, 2004; И.В. Нестерова и др., 1999а, 19996, 2002, 2004, 2006].

Несмотря на то, что в последнее десятилетие активно исследуется ци-токин-продуцирующая активность НГ, эта область иммунологии остается все еще малоизученной. Практически не известно, как изменяется способность НГ секретировать цитокины при патологии. В связи с этим представляется актуальным исследование данной проблемы, что, несомненно, послужит расширению сведений о функционировании НГ, разработке новых диагностических методов и способов иммунокоррекции.

Учитывая вышеизложенное, сформулирована цель работы и задачи исследования.

Цель исследования: Изучить особенности ИЛ-8-продуцирующей активности нейтрофильных гранулоцитов в норме и при заболеваниях пищеварительной системы, установить значимость выявленных дисфункций при патологии и оценить возможность их пептидной коррекции в системе in vitro.

Задачи исследования.

1. Изучить спонтанную и липополисахарид (ЛПС)-индуцированную продукцию ИЛ-8 нейтрофильными гранулоцитами здоровых лиц.

2. Установить характер спонтанной и ЛПС-индуцированной секреции ИЛ-8 нейтрофильными гранулоцитами при воспалительных заболеваниях желудка (хронический активный гастрит) с параллельной оценкой особенностей их функционирования (экспрессия рецепторов CD lib, CD 16, CD95, фагоцитарная и оксидазная активности).

3. Определить характер спонтанной и ЛПС-индуцированной секреции ИЛ-8 нейтрофильными гранулоцитами при гнойно-септических хирургических осложнениях (инфицированном остром деструктивном панкреатите, абсцессах брюшной полости) с установлением особенностей их функционирования (экспрессия рецепторов CD lib, CD 16, CD95, фагоцитарная и оксидазная активности).

4. Исследовать влияние пептидов - у-О-глутаминил-Ь-триптофана (Бестима) и глюкозаминилмурамилдипептида (ГМДП) на секрецию ИЛ-8 нейтрофильными гранулоцитами в норме.

5. Выявить особенности пептидной (у-О-глутаминил-Ь-триптофан и глю-козаминилмурамилдипептид) регуляции секреции ИЛ-8 нейтрофильными гранулоцитами при гастроэнтерологической патологии.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Высокая спонтанная продукция ИЛ-8 нейтрофильными гранулоцитами при хроническом гастрите не зависит от типа воспаления и сопряжена с однотипным характером дисфункций нейтрофильных гранулоцитов. В то же время ЛПС-индуцированная секреция ИЛ-8 нейтрофильными гранулоцитами зависит от поверхностного или деструктивного типа воспаления.

2. Уровень как спонтанной, так и ЛПС-индуцированной продукции ИЛ-8 нейтрофильными гранулоцитами при абсцессах брюшной полости (локальный воспалительный процесс) и остром деструктивном панкреатите (системный воспалительный процесс) различен и сопровождается более выраженными дисфункциями нейтрофильных гранулоцитов при остром деструктивном панкреатите.

3. Пептиды у-О-глутаминил-Ь-триптофан (бестим) и глюкозаминилмура-милдипептид (ГМДП), обладая разным механизмом действия, дифференцировано регулируют продукцию ИЛ-8 НГ у здоровых лиц и при различной патологии органов пищеварения.

Научная новизна работы.

Получены новые данные об особенностях спонтанной и ЛПС-индуцированной продукции ИЛ-8 нейтрофильными гранулоцитами при хроническом гастрите: уровень спонтанной продукции ИЛ-8 был значительно повышен как при поверхностном, так и при деструктивном типе воспаления по сравнению с контролем, в то же время при нагрузке ЛПС были обнаружены значительные различия в ответе в зависимости от типа воспаления.

Впервые показана зависимость выраженности дисфункций нейтро-фильных гранулоцитов и особенности характера секреции ими ИЛ-8 у пациентов с гнойно-септическими осложнениями в зависимости от тяжести патологического процесса.

Получены новые данные о возможностях дифференцированной пептидной регуляции ИЛ-8-секретирующей способности нейтрофильных гранулоцитов в норме и при патологии органов пищеварения:

- установлено, что у здоровых лиц у-О-глутаминил-Ь-триптофан (бестим) стимулирует секрецию ИЛ-8 нейтрофилами, предварительно прай-мированными ЛПС, а глюкозаминилмурамилдипептид (ГМДП) усиливает продукцию ИЛ-8 нейтрофилами без их предварительной стимуляции ЛПС.

- показано, что при гнойно-септических осложнениях (острый деструктивный панкреатит, абсцессы) бестим снижает ЛПС-индуцированную продукцию ИЛ-8, при этом, при хроническом гастрите бестим уменьшает продукцию ИЛ-8 вне зависимости от праймирования ЛПС. продемонстрировано, что ГМДП стимулирует ИЛ-8-секретирующую активность нейтрофильных гранулоцитов при хроническом гастрите и супрессирует ее при остром деструктивном панкреатите, в то же время при абсцессах, - ГМДП препятствует ЛПС-индуцированному усилению секреции ИЛ-8.

Научно-практическая значимость работы.

Получены новые сведения расширяющие наши представления о роли ИЛ-8-секретирующей активности НГ в иммунопатогенезе хронического гастрита и гнойно-септических хирургических осложнений (абсцесс и острый деструктивный панкреатит), установлено наличие дисфункций ИЛ-8-продуцирующей активности нейтрофильных гранулоцитов при хроническом гастрите и гнойно-септических хирургических осложнениях. и

На основании полученных данных об особенностях ИЛ-8-продуцирующей способности НГ при различной патологии органов пищеварения возможна разработка новых диагностических критериев для оценки функционального состояния НГ и уточнения их дисфункций при различных заболеваниях органов пищеварения.

Полученные данные об особенностях ИЛ-8 секретирующей активности при хроническом гастрите (с поверхностным или деструктивным типом воспаления) могут быть использованы для разработки новых диагностических подходов: исследование ИЛ-8-продуцирующей способности НГ для дифференциальной диагностики поверхностного и деструктивного типа воспаления по характеру ответа на ЛПС.

Новые сведения об особенностях спонтанной и ЛПС-индуцированной ИЛ-8 секретирующей активности НГ при гнойно-септических осложнениях могут служить основой для дифференциальной диагностики системного или локального гнойного процесса.

Учитывая полученные позитивные эффекты пептидов на дисфункции ИЛ-8-продуцирующей способности НГ, проведенное исследование может явиться основой для дальнейших клинических испытаний y-D-глутаминил-L-триптофан и глкжозамурамилдипептида: бестима при хроническом гастрите и остром деструктивном панкреатите, ГМДП,- при остром деструктивном панкреатите.

Разработанные методические подходы при исследовании влияний им-мунотропных препаратов бестима и ГМДП в условиях без и с предварительным праймированием ЛПС могут служить в качестве моделей в имму-нофармакологии для оценки ИЛ-8 секретирующей активности НГ.

Практические рекомендации. Исходя из полученных данных об особенностях ИЛ-8 продуцирующей способности НГ при патологии и различиях в характере реагирования на ЛПС, можно рекомендовать: а) определение спонтанной и ЛПС-индуцированной ИЛ-8-секретирующей активности НГ для проведения дифференциальной диагностики типа воспаления в СОЖ при хроническом гастрите, что позволит по характеру ответа на ЛПС судить о наличии поверхностного или деструктивного типа воспаления. б) исследование спонтанной и ЛПС-индуцированной ИЛ-8-секретирующей активности НГ для проведения дифференциальной диагностики гнойно-септических осложнений (ОДП, абсцесс), характеризующихся различными по тяжести, типами гнойного воспаления,- системное или локальное.

Внедрение результатов в практику.

Полученные новые данные о ИЛ-8-продуцирующей активности НГ в норме и при патологии ЖКТ используются в научно-исследовательской работе отдела клинической и экспериментальной иммунологии ФГУ «РЦФХГ Росздрава», центральной научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО КГМУ Росздрава, в учебной и научной работе кафедры клинической иммунологии, аллергологии и лабораторной диагностики ГОУ ВПО КГМУ Росздрава.

Апробация работы.

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на объединенном иммунологическом форуме (3-й съезд иммунологов России 6-й Национальный конгресс РААКИ и 3-я Российская конференция "Цито-кины. Воспаление. Иммунитет") в г. Екатеринбурге (31 мая — 4 июня 2004 г.), Всероссийском научном симпозиуме "Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет" в г. Новосибирске (19 — 21 июля 2005 г.), «VI Съезде аллергологов и иммунологов СНГ. Российском национальном конгрессе аллергологов и иммунологов. III Российской конференции по иммунотерапии» в г. Москве (1113 сентября 2006 г.), «V Всемирном конгрессе по иммунологии и аллергии. V Европейском конгрессе по астме» в г. Москве (22-25 апреля 2007 г.), Объединенном иммунологическом форуме (IV съезд иммунологов России, IX Конгресс РААКИ, IV Конференция РЦО, III Конференция по иммунологии репродукции, XII Всероссийский форум «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге») в г. Санкт-Петербурге (30 июня - 5 июля 2008 г.).

Диссертация апробирована на совместном заседании отдела клинической и экспериментальной иммунологии ФГУ «РЦФХГ Росздрава», кафедры клинической иммунологии, аллергологии и лабораторной диагностики ГОУ ВПО КГМУ Росздрава и кафедры патологической анатомии ГОУ ВПО КГМУ Росздрава (2009).

По материалам диссертации опубликовано 23 научные работы, из них 18 в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации.

Работа изложена на 170 страницах и состоит из глав: "Введение", " Обзор литературы", "Материалы и методы", 3 глав собственных исследований, "заключения", "выводов", указателя литературы. Последний содержит 100 работ отечественных и 417 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 8 таблицами и 15 рисунками.

ВЫВОДЫ:

1. Нейтрофильные гранулоциты большинства здоровых лиц (88,57%) сек-ретируют ИЛ-8 без дополнительной стимуляции, и в 58,6% случаев они отвечают на ЛПС увеличением секреции данного хемокина.

2. При хроническом гастрите уровень спонтанной продукции ИЛ-8 НГ значительно повышен вне зависимости от типа воспаления, при этом имеет место дезорганизация функциональной активности НГ. ЛПС-индуцированная секреция ИЛ-8 зависит от выраженности воспалительного процесса в слизистой оболочке желудка: при поверхностном типе воспаления отмечается повышение секреции ИЛ-8 в ответ на ЛПС, а при деструктивном (эрозии, язвы), - имеет место блокада индуцированной секреции ИЛ-8.

3. Выраженность дисфункций нейтрофильных гранулоцитов и характер секреции ими ИЛ-8 у пациентов с гнойно-септическими осложнениями зависели от вида воспалительного процесса. При абсцессах брюшной полости (локальный воспалительный процесс), выявлены дисфункции НГ в виде депрессии фагоцитарной функции. При этом уровень как спонтанной, так и ЛПС-индуцированной продукции ИЛ-8 не отличается от контроля. Острый деструктивный панкреатит (системный воспалительный процесс) сопровождается более выраженными комбинированными дисфункциями НГ. Спонтанная продукция ИЛ-8 НГ была выше, чем в группах контроля и с абсцессами брюшной полости, а ответ на индукцию ЛПС отсутствовал.

4. Y-D-глутаминил-Ь-триптофан (бестим) не влияет на спонтанную продукцию ИЛ-8 НГ здоровых лиц, но обладает стимулирующим эффектом на секрецию ИЛ-8 при предварительном праймировании ЛПС. Глюкозами-нилмурамилдипептид (ГМДП) усиливает продукцию ИЛ-8 нейтрофилами без их предварительного праймирования ЛПС.

5. у-О-глутаминил-Ь-триптофан (бестим) при патологии оказывает супрес-сирующий эффект на продукцию ИЛ-8 НГ. При гнойно-септических осложнениях (острый деструктивный панкреатит, абсцессы) он снижает ЛПС-индуцированную продукцию ИЛ-8. При хроническом гастрите бестим уменьшает продукцию ИЛ-8, не влияя на ЛПС-индуцированную продукцию ИЛ-8.

6. Глюкозаминилмурамилдипептид (ГМДП) оказывает стимулирующее влияние на ИЛ-8-секретирующую активность PIT при хроническом гастрите и супрессирующее влияние - при остром деструктивном панкреатите. При абсцессах брюшной полости ГМДП препятствует ЛПС-индуцированному усилению секреции ИЛ-8 НГ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенная работа посвящена изучению способности нейтрофильных гранулоцитов периферической крови секретировать ИЛ-8 в норме и при различных патологических состояниях. Самостоятельный интерес представляло исследование влияния на ИЛ-8-продуцирующую способность НГ двух пептидных иммуномодуляторов - бестима и глюкозаминилмурамоилдипептида.

Механизмы защитных реакций НГ включают традиционно известный фагоцитоз, бактерицидность, а также доказанные в последние годы регуля-торные функции НГ, связанные с рекрутированием в очаг воспаления дополнительных эффекторных клеток и регуляцию иммунного ответа, посредством секреции различных хемокинов и цитокинов. Сейчас существует мнение, что НГ играют роль своеобразного дирижера в воспалительной реакции, обеспечивая последовательную смену лейкоцитарных популяций, что именно от НГ зависит исход воспалительного процесса: его благополучное разрешение, переход в хроническую стадию или развитие тяжелых гнойно-септических осложнений.

Интерлейкин-8 (ИЛ-8) является ключевым эффектором нейтрофильно-го рекрутирования и активации при остром воспалении. Способность НГ секретировать ИЛ-8 приводит в результате к быстрой амплификации острого воспалительного процесса за счет дополнительного рекрутирования большого количества других НГ и их активации. Мы не случайно сделали свой выбор на таких моделях воспалительного процесса как воспалительные заболевания желудка и гнойно-септические хирургические осложнения (острый деструктивный панкреатит в фазе гнойных осложнений и абсцессы). В патогенезе этих заболеваний, их развитии и исходе важная роль принадлежит НГ и ИЛ-8. Лучшее понимание взаимоотношений НГ и ИЛ-8, лежащих в основе нейтрофильного рекрутирования, активации и последующих лейкоцитарных замещений, будет способствовать развитию новых терапевтических подходов в лечении, как инфекционных заболеваний, так и патофизиологического воспаления.

Проведя исследования по определению количества ИЛ-8, продуцируемого нестимулированными НГ, выделенными от здоровых добровольцев, мы выявили гетерогенность спонтанной продукции ИЛ-8 in vitro нейтрофилами различных людей. Было установлено, что НГ большинства здоровых лиц (88,57%) секретируют определенное количество ИЛ-8 без дополнительной стимуляции, и в 58,6% случаев они отвечают на ЛПС увеличением секреции ИЛ-8 в 2,25±0,49 раза (р<0,01).

Изучение продукции ИЛ-8 НГ при патологии мы проводили одновременное определением фенотипических и функциональных характеристик НГ для выявления наиболее значимых диагностических маркеров нейтрофильных дисфункций.

В результате проведенного комплексного исследования нами были установлены дефекты в функционировании системы НГ при воспалительных заболеваниях желудка (хронический гастрит в стадии обострения). По результатам эндоскопического заключения и гистологического исследования все больные были разделены на 2 группы: группу 1 — составили пациенты с поверхностным воспалением слизистой оболочки желудка (п=10): Во 2-ю группу (п=10) вошли пациенты с выраженным воспалительным процессом в слизистой и наличием эрозий и язв — деструктивное воспаление.

У пациентов обеих групп отмечалась умеренная активация рецепторно-го аппарата НГ наряду с угнетением спонтанной и стимулированной активности мембранных оксидаз. Количество активно фагоцитирующих нейтро-филов (% ФАН) не отличалось от уровня контроля, что можно рассматривать как неадекватное реагирование на воспалительный процесс. Тем не менее, стандартный набор диагностических методов, тестирующих функции НГ, не прзволил выявить достоверные различия между группами по исследуемым параметрам. Наши дальнейшие исследования были направлены на изучение ИЛ-8-продуцирующей активности НГ при хроническом гастрите.

Наличие воспалительного процесса в слизистой желудка влияет на уровень спонтанной и ЛПС-индуцированной продукции ИЛ-8 нейтрофилами периферической крови, который при данной патологии был значительно повышен (в 5,5 раз и 5,4 раза, соответственно, по сравнению с контролем).

При изучении ИЛ-8-секретирующей активности НГ в зависимости от выраженности воспаления и наличия эрозивно-язвенных повреждений слизистой было выявлено, что существенно повышенный уровень спонтанной продукции ИЛ-8 НГ по сравнению со здоровыми лицами наблюдается у пациентов, как с поверхностным воспалением слизистой, так и с деструктивным, не отличаясь между этими группами

В зависимости от выраженности воспалительного процесса, наличия эрозий и язвообразования изменялся характер нейтрофильной секреции ИЛ-8 в ответ на ЛПС. Несмотря на значительно повышенный уровень спонтанной продукции ИЛ-8, НГ 1-й группы сохраняли адекватное реагирование на ЛПС, увеличивая секрецию ИЛ-8 в 1,9 раз выше спонтанно продуцируемого ИЛ-8 НГ в данной группе и в 5,4 раза выше ЛПС-индуцированной продукции ИЛ-8 НГ здоровых лиц (р<0,05). А НГ пациентов с выраженным деструктивным воспалением, спонтанно продуцируя значительное количество ИЛ-8, были не способны отвечать на стимуляцию ЛПС дальнейшим увеличением секреции данного хемокина.

Таким образом, высокая спонтанная продукция ИЛ-8 нейтрофильными гранулоцитами при хроническом гастрите может служить диагностическим критерием наличия активного воспалительного процесса, а характер ответа на ЛПС, адекватный ответ или его блокада, отражает способность НГ к адекватному функционированию в условиях патологического процесса и может служить маркером тяжести патологического процесса.

Изучение ИЛ-8-секретирующей активности НГ у пациентов с гнойно-септическими хирургическими осложнениями при одновременном тестировании их функциональной активности мы проводили на группе пациентов с острым деструктивным панкреатитом - панкреонекрозом, осложненным тяжелой инфекционно-воспалительной системной реакцией, и пациентов с абсцессами брюшной полости - малая гнойная инфекция.

При тестировании экспрессии поверхностных рецепторов НГ периферической крови пациентов группы I (ОДП) было выявлено повышенное содержание CDllb-, CD16-, CD95-позитивных клеток относительно контроля в среднем в 1,5 раза. Абсолютное количество НГ, экспрессирующих вышеназванные рецепторы, было значительно выше, чем у здоровых лиц: в 3,4, 3,0 и 3,8 раз, соответственно (р<0,001). У пациентов с абсцессами брюшной полости (группа И) активация рецепторного аппарата НГ была менее выраженной: наблюдались тенденции к увеличению содержания клеток, несущих CDllb-и С016-рецепторы, хотя в абсолютных значениях количество CDllb+-, CD16+-, CD95+-HT было также достоверно выше контрольных значений в 2,4 (р<0,01), 2,1 (р<0,05) и 1,8 раза (р<0,05), соответственно.

Активация рецепторного аппарата при ГСО сопровождалась повышенной спонтанной активностью NADPH-оксидаз, что проявилось выраженной тенденцией к увеличению количества формазан-позитивных НГ в спонтанном NBT-тесте у пациентов обеих групп.

Несмотря на повышенную экспрессию рецепторов адгезии, цитоток-сичности и апоптоза и повышенную спонтанную активность мембранных ок-сидаз, НГ пациентов с ГСО обладали более слабыми фагоцитарными способностями по сравнению с НГ здоровых лиц: относительное количество активно фагоцитирующих клеток было снижено на 21,6% в 1-ой и 31,9% во И-ой группах (р<0,05 и р<0,01, соответственно).

Нами выявлены различия в активности кислородзависимых микроби-цидных систем НГ в нагрузочных тестах in vitro с опсонизированным зимо-заном между двумя исследуемыми группами в зависимости от тяжести ГСО. Так, у пациентов с абсцессами (более легкое течение патологического процесса) наблюдалась стимуляция кислородзависимого метаболизма НГ в ответ на зимозан (в 2,5 раза по сравнению с контролем, р<0,05). В то же время при панкреонекрозе (более тяжелое течение), на фоне повышенной спонтанной продукции супероксиданиона, выявлена значительная депрессия кислородзависимых микробицидных систем в ответ на дополнительную стимуляцию

НГ in vitro, что количественно отразилось на КМ, который снизился на 71,2% по сравнению с контрольным уровнем. Таким образом, более тяжелое течение ГСО сопровождалось феноменом дезадаптации НГ, - блокировалась их способность к адекватному ответу на дополнительную нагрузку в системе in vitro.

При анализе ИЛ-8-продуцирующей активности НГ, полученных от пациентов с гнойно-септическими хирургическими осложнениями в зависимости от тяжести патологического процесса, связанной с его системным или локальным характером, нами были выявлены различия как в уровне спонтанной продукции хемокина нейтрофилами, так и в характере их реагирования на ЛПС. При абсцессах уровень как спонтанной, так и ЛПС-индуцированной продукции ИЛ-8 нейтрофилами не отличается от контроля, за исключением наличия спонтанной секреции в 100% случаев. При панкреонекрозе у большинства больных наблюдается блокада ЛПС-индуцированной продукции ИЛ-8 нейтрофильными гранулоцитами на фоне повышенной по сравнению с контролем спонтанной секреции. В данной группе, как и при абсцессах, спонтанная секреция ИЛ-8 НГ наблюдалась в 100% случаев. При исследовании ЛПС-индуцированной продукции ИЛ-8 нейтрофилами было установлено, что НГ у 80% пациентов с абсцессами и только у 35,7% с панкреонекрозами "отвечали" на ЛПС, увеличением продукции данного хемокина, в отличие от 58,6% в контроле. Весьма вероятно, что выявленные особенности обусловлены различным исходным функциональным состоянием клеток, во многом зависящим от баланса про- и противовоспалительных медиаторов в сыворотке крови.

Изучение возможностей влияния иммунотропных препаратов на цито-кин-продуцирующую активность НГ может явиться одним из возможных путей воздействия на характер патологического процесса, что перспективно в плане разработки новых имунотерапевтических стратегий. Кроме того, результаты исследований, выполненных в этом направлении, могут принести как практические плоды в плане разработки способов иммунокоррекции нарушений цитокин-продуцирующей активности НГ, так и расширить наши представления о механизмах их развития, а также выявить неизвестные ранее пути действия иммунотропных препаратов.

В нашей работе мы использовали пептиды y-D-гл у там ини л-L-триптофан и глюкозаминилмурамилдипептид, являющиеся основой эффективных в отношении НГ иммунотропных препаратов бестима и ликопида, соответственно.

В результате проведенных исследований было установлено, что у здоровых лиц дипептид БС обладает выраженным усиливающим эффектом на продукцию ИЛ-8 НГ, праймированных малыми дозами ЛПС. Этот эффект полностью зависит от предварительной активации НГ эндотоксином, т.к. без неё БС не влияет на уровень данного цитокина.

В зависимости от вида и тяжести патологического процесса БС проявляет дифференцированные эффекты. Он супрессирует повышенный уровень спонтанной продукции ИЛ-8 НГ при панкреонекрозе после предварительной ЛПС-стимуляции НГ. При гастритах бестим действует без праймирования нейтрофилов ЛПС, снижая повышенный по сравнению со здоровым контролем уровень спонтанной продукции ИЛ-8. При воздействии на НГ больных с ГСО (абсцессы), БС отменяет стимулирующее влияние эндотоксина на продукцию ИЛ-8 нейтрофилами.

Анализ результатов, полученных при изучении влияния ГМДП на секрецию ИЛ-8 НГ здоровых лиц, позволил выявить различия в механизмах действия двух исследуемых пептидов — ГМДП и БС. В отличие от БС при добавлении в инкубационную среду ГМДП было установлено усиление продукции ИЛ-8 НГ без их предварительной стимуляции ЛПС. ГМДП усиливал продукцию ИЛ-8 нейтрофилами даже более эффективно, чем ЛПС в стимулирующей концентрации 10 нг/мл. Предварительная инкубация НГ с ЛПС частично нивелировала этот эффект.

Стимулирующее влияние ГМДП на спонтанную цитокин-секретирующую активность НГ здоровых лиц, сравнимое с действием ЛПС, проявляется и при патологии - хронический гастрит. В то же время при пан-креонекрозе ГМДП обнаруживает сходные эффекты с БС - обладает модулирующим эффектом на высокую спонтанную секрецию ИЛ-8 НГ. При абсцессах, где спонтанная продукция ИЛ-8 НГ практически не отличалась от контроля, добавление ГМДП в инкубационную среду не оказывало никакого эффекта на продукцию ИЛ-8 НГ. В то же время ГМДП препятствовал ЛПС-индуцированному усилению секреции ИЛ-8 НГ при данной патологии, сохраняя концентрацию ИЛ-8 на уровне спонтанной продукции.

Таким образом, и глюкозомурамилдипептид (ГМДП), и дипептид БС, обладают как сходными, так и во многом различными эффектами на продукцию ИЛ-8 НГ. Оба исследуемых пептида способны оказывать как модулирующее, так и стимулирующее влияние на уровень нейтрофильной секреции ИЛ-8, однако механизм их действия различен.

Действие БС направлено преимущественно на НГ, предварительно праймированные ЛПС. Он усиливает ЛПС-индуцированную продукцию ИЛ-8 НГ здоровых лиц, а воздействуя на НГ больных с ГСО (ОДП, абсцессы), БС блокирует стимулирующее влияние эндотоксина на продукцию ИЛ-8 НГ. Исключение составляют только НГ пациентов с хроническим гастритом, где БС действует без предварительного праймирования ЛПС, снижая концентрацию ИЛ-8, продуцируемого НГ, по сравнению со спонтанным уровнем.

ГМДП действует аналогично БС при ГСО - как и БС он модулирует повышенный уровень спонтанной продукции ИЛ-8 НГ при панкреонекрозе и препятствует ЛПС-индуцированному усилению секреции ИЛ-8 НГ при абсцессе (р<0,05). Стимулирующее влияние ГМДП на спонтанную цитокин-секретирующую активность НГ, сравнимое с действием ЛПС, проявляется как в норме, так и при патологии - хронический гастрит. Возможная конкуренция ГМДП с ЛПС за один рецептор связывания обуславливает ослабление стимулирующих влияний указанных веществ при их совместном наличии в культуральной среде.

Итак, анализируя полученные данные в целом, можно сделать заключение о том, что как спонтанная, так и ЛПС-индуцированная продукция ИЛ-8 нейтрофилами является чувствительным индикатором наличия и выраженности патологического процесса, что, возможно, может служить диагностическим маркером. Характер ответа на ЛПС, отражающий способность НГ к адекватному функционированию в условиях патологического процесса, может быть также использован в качестве диагностического критерия нейтрофильных дисфункций. Полученные данные по влиянию пептидов на секрецию ИЛ-8 нейтрофилами в норме и при патологии в эксперименте in vitro могут служить предварительным обоснованием их возможного применения при дисфункциях НГ, связанных с их цитокин-секретирующей активностью.

112