Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Фенотипические и функциональные особенности иммунокомпетентных клеток и клеточной чувствительности к интерферону in vitro у больных почечноклеточным раком

На правах рукописи ШКАПОВА ЕКАТЕРИНА АЛЕКСЕЕВНА

ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК И КЛЕТОЧНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ИНТЕРФЕРОНУ IN VITRO У БОЛЬНЫХ ПОЧЕЧНОКЛЕТОЧНЫМ РАКОМ

14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск - 2005

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Красноярский государственный университет» на кафедре биохимии и физиологии человека и животных

Научные руководители:

доктор медицинских наук доктор медицинских наук

Савченко Андрей Анатольевич Куртасова Людмила Михайловна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор кандидат медицинских наук

Бодиенкова Галина Михайловна Дмитриева Людмила Аркадьевна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Сибирский государственный университет федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

ного совета Д 001.054.01 при ГУ «Восточно-Сибирский научный центр Сибирского отделения РАМН» по адресу: 664003, г Иркутск, ул Тимирязева, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ «Восточно-Сибирский научный центр Сибирского отделения РАМН»

Защита состоится « »

2005 г. в часов на заседании диссертацион-

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

г

Шолохов Л Ф

y¡4 0% i

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы: Широко известно, что иммунная система играет центральную роль в механизмах противоопухолевой защиты организма (Бережная Н.М., 2004). Иммунокомпетентные клетки продуцируют ряд цито-кинов, которые являются регуляторами межклеточных взаимодействий (Авдеева Ж.И., 2002; Зимушко ЕИ, 2001). Кроме того, некоторые популяции клеток иммунной системы способны к цитотоксическому действию на опухолевые клетки (Кетлинский С.А., 1995; Кулаков В.В., 1997; Лаврова B.C., 1992). Однако снижение уровня функциональной активности иммунной системы, а также особенности опухолевых клеток позволяют им не только преодолевать иммунологический барьер, но и оказывать иммуносупрессивное воздействие на организм, а в некоторых случаях использовать медиаторы иммунной системы для собственной прогрессии. В таких случаях могут развиваться онкологические заболевания (Головизнин MB., 2001; Долгих В.Т.,

Одной из актуальных проблем современной онкоурологии является высокий уровень заболеваемости почечноклеточным раком (ПКР), на долю которого приходится около 97% всех опухолей почек (Заридзе Д.Г., 2001). Ведущая роль в лечении ПКР, безусловно, принадлежит хирургическому методу (Bulow Н., 1991; De Riese W , 1994). Однако, более целесообразна комбинированная модель терапии, включающая в себя наряду с хирургическим лечением иммунотерапию препаратами интерферона (ИФН), среди которых широкое распространение получил рекомбинантный интерферон-а2а (Ра-фальский В.В., 1997; Mickisch G.N., 2000). Данный препарат кроме противовирусного и антипролиферативного действия, обладает ярко выраженными иммуномодулируюшими свойствами: стимулирует активность естественных киллерных клеток, процессы фагоцитоза и цитотоксичность нейтрофильных гранулоцитов (Рафальский В.В., 1997; Nests D., 1997). В то же время необоснованное или несвоевременное применение препаратов ИФН может снизить эффективность терапии или даже оказать негативное воздействие на организм в целом (Волкова М.А., 1999; Моисеенко В.М , 1997; Gallin J.I., 1991).

Хорошо известно, что модуляторами функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов являются не только вещества микробного происхождения, иммунные комплексы, медиаторы клеток крови и ткани, но и фар-маколо! ические препараты (Маянский А.Н , 2004; Нестерова И В, 2004)

2001).

Кроме того, нейгрофильные гранулоциты характеризуются высокой мобилизационной активностью и способностью к быстрому и точному отражению изменений гомеостаза (Маянский Д.Н , 2004) Это делает возможным, с помощью хемилюминесцентного (ХЛ) анализа, оценить прямое и опосредованное действие фармакологических препаратов на функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов, что позволит определить чувствительность клеток к данному препарату и, в дальнейшем, судить об эффективности терапии.

Не подлежит сомнению, что изучение состояния иммунной системы, а также модуляции функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов интерфероном in vitro на фоне онкогенеза является одной из актуальных проблем современной биологии и медицины. Кроме того, изучая состояние иммунной системы и клеточную чувствительность к интерферону у больных ПКР, можно не только охарактеризовать патогенез ИКР, но и получить экспериментальное обоснование терапии данным препаратом, а также определить его оптимальную лечебную дозу и объективно оценивать эффективность интерферонотерапии.

Цель исследования: Изучить фенотипические и функциональные особенности иммунокомпетентных клеток и клеточную чувствительность нейтрофильных i-ранулоцитов к интерферону in vitro у больных ПКР до и в динамике после хирургического лечения.

Задачи исследования:

1. Изучить особенности клеточного и гуморального иммунитета у больных ПКР до хирургического вмешательства и через 14 дней после удаления опухоли.

2. Исследовать параметры спонтанной и зимозан-индуцированной хемилюминесцентции нейтрофильных гранулоцитов у больных ПКР в период до хирургического лечения и в динамике после оперативного вмешательства.

3. Оценить показатели сывороточного ИФН, а также уровни спонтанной и стимулированной выработки ИНФ-а и ИФН-у мононуклеарами пе-рефирической крови больных ПКР до и через 14 дней после оперативного лечения.

4 Изучить влияние различных доз рекомбинантного интерферона-а2а т vitro на функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов крови больных ПКР в период до и в динамике после хирургического лечения.

5. Определить хемилюминесцентную активность нейтрофильных гранулоцитов при воздействии различных доз рекомбинантного интерферо-на-а2а in vitro после 1-го курса реаферонотерапии у больных ПКР.

Научная новизна: Впервые на современном методическом уровне проведено комплексное исследование клеточного и гуморального иммунитета, а также функционального состояния иммунокомпетентных клеток у больных ПКР.

Впервые выявлены особенности ИФН статуса у больных ПКР в период до и после оперативного вмешательства. Результаты проведенного исследования показали повышенный уровень общего сывороточного ИФН на фоне сниженной продукции мононуклеарами периферической крови ИФН-а у больных ITKP как до, так и через 14 дней после хирургического лечения. При этом спонтанная продукция ИФН-7 мононуклеарами периферической крови у больных ПКР до и после хирургического лечения значительно превышает контрольные показатели. В то время как стимулированная продукция ИФН этого типа снижена в дооперационном периоде и восстановливается через 14 дней после хирургического лечения.

Впервые изучена функциональная активность нейтрофильных гранулоцитов крови больных ПКР до и в динамике после хирургического лечения, что позволило обнаружить повышенный уровень кислородзависимого метаболизма и сниженные компенсаторные возможности данной клеточной популяции

Впервые установлено, что клеточную чувствительность к препаратам интерферона in vitro можно определять с помощью хемилюминесцентного анализа функционального состояния нейтрофильных гранулоцитов.

Определено оптимальное время для начала интерферонотерапии у больных ПКР - через 1,5 месяца после операции. Поскольку в этот период наиболее широк диапазон клеточной чувствительности к интерферону in vitro.

Доказано, что изменение параметров хемилюминесцентнции нейтрофи-лов крови в ответ на различные дозы реаферона in vitro носит индивидуальный характер.

Впервые установлено, что после 1-ю курса интерферонотерапии клеточная чувствительность изменяется у 85% больных ПКР, что указывает на необходимость оценки индивидуальной чувствительное ги не только до начала лечения, но и перед рециклом.

Практическая значимость: Проведенные исследования установили возможность с помощью XJI анализа реактивности нейтрофильных грануло-цитов крови до начала интерферонотерапии определять индивидуальную чувствительность к препарату, а также осуществлять подбор оптимальной дозы. Это дает возможность корригировать дозу препарата в процессе интерферонотерапии, что позволит оптимизировать схему лечения и повысить клиническую эффективность иммунотерапии

По результатам исследования получены 2 приоритетные справки на изобретения.

Результаты проведенных исследований внедрены в практическую работу Красноярского краевого онкологического центра, клиники ГУ НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН, Красноярского краевого центра по профилактике и борьбе со СПИД и другими инфекционными заболеваниями

Основные положения диссертации используются в учебном процессе на кафедре биохимии и физиологии человека и животных Красноярскою государственною университета и кафедре клинической иммунологии Красноярской государственной медицинской академии.

Работа поддержана ККФН (конкурсный грант 11F0164C, 2002-2003гг.).

Положения, выносимые на защиту:

1. Иммунные нарушения у больных ПКР характеризуются изменением фенотипического спектра лимфоцитов и параметров интерферонового статуса, а также изменением функциональной активности нейтрофильных грану-лоцитов периферической крови.

2 Хемилюминесцснтный а нал и! реактивности нейтрофильных грануло-циюв при воздействии реаферона w vitro позволяет объективно оценить индивидуальную клеточную чувствительность к данному препарату у больных ПКР.

3. После 1-го курса реафероно терапии чувствительность нейтрофильных гранулоцитов больных ПКР к воздействию данного препарата in vitro изменяется в 85% случаев, что необходимо учитывать для повышения клинической эффек1ивности иммунотерапии в каждом конкретном случае

АПРОБАЦИЯ МАТЕРИАЛОВ ДИССЕРТАЦИИ: Основные положения доложены и обсуждены на международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Молодая наука XXI веку» (Иваново, 2001), на V научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001» (Санкт-Петербург, 2001), на научно-практической конференции «Актуальные вопросы урологии» (Кемерово, 2002), на итоговой научно-практической конференции НИИ Медицинских проблем Севера СО РАМН «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири» (Красноярск, 2002), на XI международном симпозиуме «Гомеостаз и экстремальные состояния организма» (Красноярск, 2003), на VII Всероссийском научном форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003), на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Метаболические механизмы иммунореактивности» (Красноярск, 2004), на III конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004), на межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы онкорадиоло-гии» (Красноярск, 2004), на Объединенном иммунологическом форуме (III Съезд иммунологов России и VI Национальный конгресс РААКИ) (Екатеринбург, 2004), на заседании Красноярского регионального отделения РААКИ (Красноярск, 2004).

ПУБЛИКАЦИИ: Основные положения диссертации опубликованы в 23 печатных работах.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ: Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, 2 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 8 рисунками, список литературы включает 176 библиографических издания (97 отечественных и 89 иностранных)

Материалы и методы исследования: На базе Красноярского краевого онкологического центра проведены динамические наблюдения за больными ПКР (T3N0Mü) до хирургического лечения (N-132), через 14 дней после оперативного вмешательства (N=45) и через 1,5 месяца после радикальной неф-рэктомии (N~12), а также за пациентами после 1-ю курса реаферонотерапии

(N 20) в возрасте 40-55 лет. В качестве контрольной группы были обследованы 30 здоровых доноров.

Популяционлый и субпопуляционный состав лимфоцитов крови оценивали с помощью метода проточной цитофлюориметрии, используя FACS Calibur (Becton Dickinson, USA) и реагенты Simul Test IMK-lymphocyte Kit (USA). Изучали содержание CD3\ CD4+-, CD8+-, CD]в'/56'-. CD19+-лимфоцитов и CD3fHLA-DR+- клеток Концентрацию иммуноыобулинов класса А, М и G в сыворотке крови определяли методом радиальной имму-нодиффузии (Mancini G , 1965). Содержание ЦИК в сыворотке крови определяли турбидиметрическим методом (Haskova V., J978) Изучение спонтанной и индуцированной XJT нейтрофииьных 1ранулоцитов крови проводили по методу De Sole et al. (1983) на хемилюминесцснтном анализаторе «CL 3606М» (Россия). В качестве индуктора «дыхательного взрыва» использовали опсо-низированный зимозан 2мг/мл («Sigma», USA). Клеточную чувствительность к ИФН-а2а in vitro определяли с помощью XJI анализа. В супернагзнтах мо-нонуклеаров периферической крови, культивированных в течение 72 часов, оценивали уровень спонтанной и стимулированной продукции ИФН-а и ИФН-у методом твердофазного иммуноферментного анализа, с помощью тест-систем ООО «Протеиновый контур» (С.-Петербург, Россия). Для стимуляции клеток использовали конканавалин А 15мкг/мл («Sigma», USA). Уровень сывороточного ИФН также определят с помощью твердофазного иммуноферментного анализа на гест-системе ООО «Протеиновый контур».

По результатам исследования в пакете электронных таблиц MS Excel 7.0 была сформирована база данных, на основе которой с помощью пакетов прикладных программ SPSS 10,0 и Statistica 6,0 производился статистический анализ. Для всех данных определяли среднее арифметическое значение (X), ошибку средней арифметической (т). Проверку гипотезы о статистической достоверности выборок проводили с помощью критерия Манна-Уитни, использовали ненараметрический критерий Вилкоксона для анализа выборок с попарно связанными вариантами Для исследования ситы взаимосвязей показателей вычислялся коэффициент ранговой корреляции по Спирмену Для решения задач системного анализа использовали нейросетевой классификатор (Горбань А.Н., 1990; Россиев Д.А., 1996).

Результаты исследования и их обсуждение: Результаты исследования иммунологических показателей у больных I (KP представлены в таблице 1

Таблица 1

Динамика показателей клеточного иммунитета больных ПКР (М ± т)

Параметры Контрольная группа N=30 1 Больные до операции N=39 2 Больные после операции N=24 3

Лейкоциты, (109/л) 5,84±0,20 5,88±0,26 7,02±0,55 Рь2<0,05

Лимфоциты, (%) 43,5±1,8 39,2±2,2 Р,<0,05 34,5±2,1 Р,<0,001

Лимфоциты, (109/л) 2,5±0,11 2,28±0,12 Р,<0,05 2,41 ±0,24

CD3\(%) 71,7±0,9 74,2±1,4 75,7±1,9 Р,<0,05

CD3\(10%) 1,46±0,05 1,66±0,09 0,1>Р1>0,05 1,40±0,12

CD4+, (%) 44,8±0,9 43,8±1,2 51,2±1,6 Р,,2<0,001

CD4\ (109/л) 0,90±0,04 0,99±0,0б 0,93±0,08

CDS', (%) 33,4±1,1 34,6±1,9 30,1±1,9 Р,<0,05

CD8+, (109/л) 0,68±0,04 0,74±0,05 0,55±0,06 Р1Г<0,05

CD 19*, (%) 12,1 ±0,6 9,8±0,7 Р,<0,01 11,1±1,2

CD 19\ (109/л) 0,24±0,01 0,21±0,02 0,20±0,03 Р,<0,05

CD16+/56+, (%) 16,4±1,1 16,3±1,1 13,4±1,5 Ри<0,05

CD16+/56+, (109/л) 0,33±0,03 0,38±0,03 0,25±0,04 Р).2<0,01

CD4+/CD8+ 1,39±0,05 1,46±0,11 1,86±0,15 Р,.2<0,01

CD3+HLA-DR+, (%) 6,8^0,8 12,5-Ь2,2 Р,<0,01 9,6±1,7 0,1>Р|>0,05

CD3+HLA-DR+, (109/л) 0,14±0,02 0,22±0,04 Р,<0,05 0,14±0,03

Примечание: Р!-статистически достоверные различия с показателями контрольной группы; Р2-статистически достоверные различия с показателями больных ПКР до хирургического лечения.

и таблице 2 У пациентов в период до кирургическою лечения наблюдалось достоверное снижение абсолютного и относительного содержания лимфоцитов, установлена тенденция к повышению, относительно группы контроля,

количества зрелых Т-лимфоцитов Следует также отметить повышение как

Таблица 2

Динамика показателей гуморадьиого иммунитета у больных ПКР (М ± пт)

Параметры Контрольная фуппа N=30 1 Больные до операции N=39 2 Больные после операции N=24 3

^А, (г/л) 1,73±0,14 2,43±0,18 Р,<0,01 2,254 0,18 Р12<0,01

1ёМ, <г/л) 1,50±0,11 1,49±0,10 1,79±0,18 Р|<0,05

¡В«, (г/л) 13,55^0,76 15,38з 1,06 13,58±0,87

^А/СЭ19, (нг/кл) 7,72=1-0,73 14,31 ±1,81 Р,<0,05 15,47*2,20 Р,<0,05

^М/С019, (нг/кл) 6,32±0,56 8,23±0,82 12,02а1,88 Р1<0,05

^С/СЭ19, (нг/кл) 61,14±5,16 82,89±8,30 Р!<0,05 100,17±13,69 Р,<0,05

ЦИК, (о.е.) 28,60±2,92 27,74±3,00 39,04±6,14 0,1>Р;>0,05

Примечание: то же что для таблицы 1.

относительного, так и абсолютного содержания СОЗ+-клеток, экспресси-рующих активационный маркер НЬА-ВЯ+ и снижение процентного количества С019+-лимфоцитов относительно контрольных параметров. Кроме того, в группе больных ПКР до хирургического лечения обнаружено увеличение концентрации 1цА в сыворотке крови и повышенные относительные уровни синтеза ^А и ^О по сравнению с контрольными величинами, что отражает напряжение гуморального звена иммунной системы.

Анализ иммунологических параметров у больных ПКР через 14 дней после хирургического лечения показал повышение содержания лейкоцитов в периферической крови по сравнению с аналогичным показателем как в до-операционном периоде, гак и в группе контроля Следует отметить, что в группе прооперированных пациентов наблюдается снижение процентного

содержания лимфоцитов периферической крови относительно соответствующих величин контрольной группы.

В то же время, через 14 дней после хирургического лечения у больных ПКР повышается величина иммунорегуляторного индекса за счет увеличения содержания CD4+- и понижения количества СС8^-лимфоцитов. Однако, наряду с этим, в иммунной системе пациентов после радикальной нефрэктомии все же отмечается пониженный уровень лимфоцитов, NK-кпеток, а также тенденция к увеличению экспрессии маркеров активации на Т-лимфоцитах. Гуморальное звено у больных ПКР через 14 дней после хирургического лечения «работает» в усиленном режиме, о чем свидетельствует увеличение по сравнению с контрольными значениями относительного уровня синтеза IgA, IgM и IgG.

Анализ показателей ХЛ ответа нейтрофильных гранулоцитов у больных ПКР представлен в таблице 3. Установлено, что в клетках больных ПКР до хирургического лечения процессы синтеза активных форм кислорода протекают более активно, чем в нейтрофилах контрольной группы, что свидетельствует об исходно повышенных энергетических затратах нейтрофильных гранулоцитов у пациентов с исследуемой патологией. Однако при дополнительной функциональной нагрузке in vitro в нейтрофильных гранулоцитах лиц с ПКР до хирургического лечения не наблюдается адекватного усиления кислородного метаболизма клеток относительно контрольного уровня, что отражает пониженные резервные метаболические возможности данной клеточной популяции.

У больных ПКР через 14 дней после оперативного вмешательства сохраняется повышенный уровень кислородного метаболизма нейтрофильных гранулоцитов периферической крови, но, следует отметить увеличение времени, за которое клетка достигает максимальной интенсивности продукции высокоэнергетических оксиданюв. Это способствует менее быстрому истощению функционально-метаболической активности нейтрофильных гранулоцитов, что, безусловно, является положительным изменением. При изучении функционального ответа нейтрофильных гранулоцитов на стимуляцию опсонизировакным зимозаном выявлено, что «респираторный взрыв», регистрируемый с помощью ХЛ анализа становится еще более выраженным не только по сравнению с уровнем зафиксированным в контрольной группе, но и превышает соответствующие параметры больных ПКР в период до

Таблица 3

Параметры хемилюминеспент нег о ответа нейтрофильных гранулопитов пе-

риферической крови у больных ПКР (М - т)

Показате- Контрольная Больные до Больные через Больные через

ли фуппа операции 14 дней после 1,5 месяца по-

N-26 N-119 операции N=45 сле операции N=12

1 2 3 4

Спонтанная хемилюминесценция

Тшах 1176,08*159,21 665,41*46,26 1079,61*133,15 1866,58*232,78

(сек.) Р,<0,01 Р2<0,01 Р|.2.3<0,01

1шах 32,29±7,24 51,58*3,58 45,29*6,80 56,14*6,93

(о.е.*103) Р,<0,01 Р,<0,05 Р,<0,01

в. 7,91*1,64 18,88*1,43 24,71*3,83 22,62*5,39

(о.е.*105) Р, <0,001 Р,<0,001 Р!<0,01

Зимозан-индуцированная хемилюминесценция

Ттах 834,42±54,12 751,83*27,33 800,43*37,67 919,50*114,23

(сек.)

1тах 133,24±21,31 141,37*9,17 208,31*1,78 179,58*38,55

(о.е.*103) Р,<0,01 Р2<0,001 Р,<0,05

34,40*5,07 58,07*4,99 127,73*22,82 80,33*29,05

(о.е.*105) Р]<0,05 Р,<0,001 Р2<0,01 Р,<0,05

Индекс акт ивации

52/8„ 5,74*0,86 3,70*0,32 6,53*1,04 3,13*0,60

Р] <0,05 Р2<0,01 Р] <0,05

Примечание' Р]-статистически достоверные различия с показателями

контрольной группы; Р2-статистически достоверные различия с показателями больных ПКР до хирургическою лечения; Р3-статистически достоверные различия с показателями больных ПКР через 14 дней после операции

хирургического лечения Это отражает повышенные компенсаторные возможности нейтрофилов крови у прооперированных пациентов Через 1 5 месяца посте радикальной нефрэктомии значимо замедляется скорость синтеза активных форм кислорода за единицу времени, однако уровень продукции высоко энергетических оксидантов остается на прежнем, повышенном относительно фуппы контроля уровне. При проведении функциональных нагрузочных тестов с опсопизированным зимозаном на фоне высокой интенсив-

носги «респираторного взрыва» отмечается значительное снижение компенсаторных возможностей нейтрофильных гранулоцитов в данной группе пациентов.

Корреляционный анализ параметров иммунного статуса и ХЛ ответа нейтрофилов крови показал увеличение числа вщимосвязей у больных ПКР до хирургического лечения и снижение числа коррелирующих между собой параметров у прооперированных пациентов относительно группы контроля. Кроме того, установлено, что в группе больных ПКР до операции преобладают отрицательные корреляционные взаимосвязи, однако после хирургического лечения соотношение положительных и отрицательных корреляций составляет 1:1, как и в группе здоровых доноров Необходимо отметить, что в группе здоровых доноров большинство корреляций выявлено между параметрами спонтанного ХЛ ответа нейтрофилов и 'Г-клеточным звеном иммунной системы. У больных ПКР до хирургического лечения значительно увеличивается число корреляционных взаимосвязей с параметрами индуцированной ХЛ и появляются взаимосвязи с показателями, характеризующими гуморальное звено. Через 14 дней после операции снижается число корреляций с показателями Т-клеточного звена. В то же время выявляются взаимосвязи между содержанием В-лимфоцитов, уровнем ЦИК и параметрами ХЛ ответа нейтрофильных гранулоцитов.

К показателям, характеризующим функциональное состояние иммуно-компетентных клеток относятся параметры ИФН-статуса. В сыворотке крови больных ПКР как до, так и после хирургического лечения отмечалось повышенное, относительно уровня контрольных значений, содержание ИФН. (рис.1). Также, в обеих группах пациентов наблюдалась повышенная спонтанная продукция ИФН-7 мононуклеарами периферической крови относительно контроля (рис.2). Однако уровень индуцированной продукции данного цитокина у пациентов с ПКР различается в зависимости от периода: до или после операции, а именно, мононуклеары больных ПКР до хирургиче-I ского лечения продуцируют ИФН-7 примерно на уровне клеток здоровых до-

норов (статистически значимых огличий между этими группами выявлено не было). В период после оперативного вмешательства мононуклеары периферической крови более интенсивно реагируют на стимул, и как следствие этого, наблюдается повышенный уровень продукции ИФН-7. Кроме того, у больных ПКР через 14 дней после хирур! ическог о лечения наблюдалось

К 6 а

§ §

X

ш

а

Гс

□ Здоровые доноры □ Больные 11КР до операции □ Больные ИКР после операции

Рис.1. Концентрация ИФН в сыворотке у больных ПКР. Примечание Р]-статистически достоверные различия с показателями здоровых доноров.

450

г 400

л

и с 350

«

У 300

я

и 250

я

© 200

м»

К 5 150

Я

У

>1 100

ч

о

а. 40

Ь-а

0

Спонтанный уровень

Индуцированный уровень

I о Здоровые доноры 0Ьольные ПКР ло операции 0 Больные ПКТ мое |е операции I

Рис 2 Продукция ИФН-7мононуклеарами периферической крови. Примечание' Ргстатистически достоверные различия с показателями здоровых доноров, Рг-статистически достоверные ра)личия с показа!елями пациентов до хирургического лечения.

снижение спонтанной продукции ИФН-а по сравнению с соответствующим показателем в группе больных до операции (рис.3 )

40

~ 30-

м

■е

■о

ч

я

а 20 ©

а 10

ч о с.

а

Рг<0,05

Спонтанный уровень

Индуцированный уровень

!"□ Здоровые доноры 0 Больные ПКР до операции д Больные ПКР после операций^

Рис.3. Продукция ИФН-амононуклеарами периферической крови.

Примечание: то же что и для рис. 2.

Уровень стимулированной продукции ИФН-а мононуклеарами больных ПКР снижен относительно контрольных величин. При этом отмечается повышение уровня индуцированной продукции ИФН-а у прооперированных пациентов по сравнению с показателями больных ПКР до хирургического лечения. Вероятно, изменения ИФН-продуцирующей системы у больных ПКР, зарегистрированные в период до хирургического лечения, являются следс I вием опухолевой иммуносупрессии.

Так. у больных ПКР до операции отмечается дисбаланс продукции ИФН-7 мононуклеарами - повышенный спонтанный уровень лот цигокина не сопровождается адекватным увеличением продукции ИФН-7 в ответ на стимуляцию. Вероятно, это обусловлено снижением функционально-метаболических компенсаторных возможностей иммуноцитов. Также это может быть связано с нарушением рецепторного аппарата и/или сигнал-передающих систем клеток Кроме того, у пациентов в период до операции

отмечены нарушения продукции ИФН-а в о i вет на стимуляцию w/ro, хотя усиленной спонтанной продукции ИФН-а по сравнению с контрольным уровнем не было обнаружено.

Необходимо отметить, что через 14 дней после хирургического лечения отмечается положительная динамика изменений параметров ИФН статуса, в час!ноети повышаются резервные возможности мононуклеаров периферической крови к выработке ИФН-7. Однако полного восстановления ИФН-продуцирующей системы не наблюдается. Установлено, чго после удаления опухоли сохраняется повышенным уровень спонтанной продукции ИФН-7 относительно контрольного диапазона.

На фоне относительного восстановления ИФН-т-продуцирующей системы, совершенно другая картина наблюдается при оценке изменений ИФН-а-продуцирующей системы. Выявлен пониженный по сравнению с параметрами в дооперационный период спонтанный уровень ИФН-а Кроме того, несмотря на увеличение индуцированной продукции ИФН-а относительно параметров в группе больных ПКР до хирургического лечения, концентрация ИФН данного класса не достигает уровня контрольной группы. Таким образом, по результатам проведенных исследований можно констатировать дефицит продукции эндогенного ИФН-а у больных ПКР как до, так и через 14 дней после хирургического лечения, что дает основание для проведения иммунотерапии препаратами ИФН-а у данной категории больных.

Результаты исследования клеточной чувствительности к реаферону in vitro установили, что у больных ПКР в период до оперативного вмешательства нейтрофильные гранулоциты периферической крови не реагируют изменением параметров XJI анализа в ответ на присутствие реаферона в реакционной среде.

Через 14 дней после операции нейтрофилы больных ПКР реагируют на реаферон в дозах 4000 ME и 10000 ME (таблица 4.), наблюдается относительное восстановление клеточной чувствительности к реаферону, обусловленное устранением иммуносупрессирующего влияния опухоли. <

У пациентов через 1,5 месяца после хирургического лечения расширяется диапазон клеточной чувствительности' нейтрофильные гранулоциты периферической крови реагируют изменением параметров ХЛ ответа при воздействии реаферона не только в дозах 4000 ME и 10000 ME, но и при наличии в реакционной среде минимальной исследуемой концентрации реаферо-

Таблица 4

Показатели хемитоминесценции нейтрофилов крови у больных ПКР через 14 дней после хирургического лечения при воздействии различных доз реа-ферона т vitro (М -i т) _Больные Г1КР (п 42) __ '

2000МЕ 1 4000МЕ 10000МЕ

2 3 4

Показа- i______

тели Г Контроль

Спонт анная хемилюминесценция

Ттах (сек.)

(max

(о е.*103)

_ __

(о.е.*105)

168,67+114,50 49,42*6,06

22,74*3,05

1101,05*11 imJlujQi] VTJ1 54,39*7, lY 53,78*7,16

18^59*2,12 ~~

20,45*2,48

1073,59^105,50 0,1 ^>0,05

53,83*7ЛЗ 23,50*3^)55

Индуцированная хемилюминесцениця

Ттах (сек.) 1тах (о.е.*10э)

(о.е.*10 )

907,98*47,09

205,28*16,52

107,85*15,58

834,95*36,47

197,69*16,19

120,14*18,28

972,44-164,27

Р?<0,05

198,28*16,66

94,66*13,11

996,56*61,37

211,56*16,71

102,31*13,55 0,1>Р3>0,05

Индекс активации

S2/S,

5,09*0,63

7,73*1,22

5,22*0,67

5,64*0,65

11римечание' Р2- статистически достоверные различия с показателями при воздействии реаферона в дозе 2000 МГ, Рг статистически достоверные различия с показателями при воздействии реаферона в дозе 4000 МЕ

на, составляющей 2000 МЕ (таблица 5.) Учитывая сниженный индекс активации у больных ПКР в данной группе по сравнению с соответствующим показателем группы котроля (Р^0,05) и увеличение данного параметра при воздействии реаферона т хч/го (Р-'0,05), можно констатировать модулирующее действие реаферона на нейтрофильные гранулониты

Таким образом, установлено, что клеточная чувствительность к реком-бинантному ИФН-а2а подавляется иммуносупрессирующим действием олу-^•оли, и восстанавливается после ее удаления Причем чере? 1,5 месяца после хирургического лечения у больных ПКР ктеючная чувствительность к

Таблица 5

Показатели хемилюминесценции нейтрофилов крови у больных ПКР через 1,5 месяца после хирургического лечения при воздействии различных доз __реаферона in vitro (М * т)_ ___

Показа- Больные ПКР (п-12)

тели Контроль 1 2000МЕ 2 4000МЕ 3 10000МЕ 4

Спонтанная хемилюминесценция

Ттах (сек.) 1866,58±232,77 1580,50±255,03 1391,42*207,26 0,1>Р,>0,05 1188,91*154,88 0,1>Р,>0,05

Imax (о.е.*103) 56,14±6,93 54,16*12,25 Pi<0,05 60,66*11,81 Р2<0,05 69,69*13,85 Р2<0,05

S, (о.е.*105) 22,62±5,39 19,41*5,31 Pi<0,05 21,64*5,58 0,1>Р2>0,05 20,92*5,33 Р2<0,05

Индуцированная хемилюминесценция

Ттах (сек.) 919,50±114,23 849,75*79,85 925,36*88,31 0,1>Р2>0,05 980,27*52,10

Imax (о.е.*103) 179,58*38,55 171,35+39,72 178,93*38,18 0,1>Р|>0,05 Р2<0,05 175,76*39,65 0,1>Р2>0,05

S2 (о.е.*105) 80,33±29,05 91,89±29,23 27,51*2,99 Р,<0,05 31,28*8,86 0,1>Р3>0,05

Индекс активации

s2/s, 3,13*0,60 3,66*0,75 Р,<0,05 3,63*0,67 Р,<0,01 4,31*1,07

Примечание: Pi-статистически достоверные различия с контрольными показателями; Рг- статистически достоверные различия с показателями при воздействии реаферона в дозе 2000 ME; Р3-статистически достоверные различия с показателями при воздействии реаферона в дозе 4000 ME.

реаферону in vitro увеличивается относительно уровня пациентов через 14 дней после операции. Данное обстоятельство позволяет рекомендовать реа-феронотерапию именно в этот период, когда наблюдается максимальное восстановление клеточной чувствитепьности к данному препарату

Результаты проведенных исследований убедительно продемонстрировали возможность индивидуальной оценки ч>вствителыюсти к реаферону у па-

циентов с ПКР и, более того, определение оптимальной лечебной дозы препарата.

На базе Красноярского краевого онкологического центра проведены динамические наблюдения за 20 больными ПКР, которым была проведена радикальная нефрэктомия, и через 1,5 месяца после хирургического лечения эти пациенты получили курс иммунотерапии реафероном, с учетом индивидуальной кле!очной чувствительности к данному препарату. Оценка функциональною ответа нейтрофильных гранулоцитов при воздействии различных доз реаферона in vitro осуществлялась до и через 3 недели после курса лечения данным препаратом. При анализе клеточной чувствительности к реаферону у обследуемых пациентов было выявлено четыре типа реакции нейтрофильных гранулоцитов на экзогенный ИФН после курса иммунотерапии (рис.4.).

20%

□ снижение чувствкгслыюеш Ш увеличение чувствительное™

□ прежний уровень чувстаиетпьноста 0 исчезновение чувстеиехпьности

Рис.4. Изменение клеточной чувствительности к реаферону у больных ПКР через 3 недели после 1-го курса интерферонотерапии.

В первом случае клеточная чувствительность к реаферону снижается после 1-го курса лечения данным препаратом. Усиление компенсаторных возможностей нейтрофильных гранулоцитов наблюдается уже при более высо-« кой, чем до лечения, дозе реаферона. Такой ответ наблюдался в 40% случаев.

Второй по частоте встречаемости (25% случаев) тип изменения клеточной чувствительное!и после курса иммунотерапии - когда до лечения нейтрофи-лы реагируют усилением кислородного метаболизма на среднюю из исследуемых нами доз (5 млн. МЕ), а после лечения приобретают способность к модуляции ХЛ 01вега в присутствии более низкой дозы реаферона (3 млн.

МЕ) Третий тип изменения клеточной чувствительности наблюдался нами у 15% от всех обследуемых, спецификой являлось то, что после лечения сохранялась чувствительность нейтрофильных гранулоцитов к дозе реаферона, назначенной на 1-й курс терапии. Четвертый вид клеточного ответа на реа-феронотерапию наблюдался в 20% случаев и заключался в полном исчезновении положительного ответа нейтрофильных гранулоциюв на воздействие всех исследуемых доз реаферона т уЦго через три недели после 1-го курса лечения. Учитывая полученные нами данные, для повышения эффективности комбинированного лечения больных ПКР с использованием реаферонотера-пии следует не только соблюдать режим введения, но и определять индивидуальную клеточную чу ветви гельность к реаферону как до начала терапии, гак и перед началом следующего курса, поскольку высока вероятность (65% случаев) необходимости изменения дозы.

ВЫВОДЫ:

1. Общей закономерностью иммунных нарушений у больных ПКР является повышение содержания зрелых Т-лимфоцитов (СИЗ"). увеличение количества клеток, экспрессирующих НЬА-1Ж\ снижение числа СП 19'-лимфоцитов и повышение относительных уровней синтеза и

2. У больных ПКР после хирургического лечения (через 14 дней) состояние иммунного статуса характеризуется повышением иммунорегуляторного индекса, снижением содержания С Г) 16756л им ф о цито в и увеличенной экспрессией маркеров активации Т-клеток (НЬА-01*+) на фоне повышенного синтеза ^А, ^М и

3. У больных ПКР до операции изменена кинетика и повышен уровень ХЛ ответа нейтрофильных гранулоцитов крови. Через 14 дней после операции при нормализации кинетики сохраняется повышенным уровень спонтанного ХЛ ответа, и резко увеличены показатели индуцированной ХЛ. Через 1,5 месяца наблюдается снижение компенсаторных возможностей нейтрофильных гранулоцитов.

4. У больных ПКР до и после хирургического лечения повышено содержание ИФН в сыворотке крови и увеличена спонтанная продукция ИФН-7 мононуклеарами периферической крови. Через 14 дней после операции наблюдается снижение спонтанной продукции ИФН-а в сочетании с повышенной способностью мононуклеаров периферической крови к индуцированной выработке ИФН-7 и ИФН-а

5 Воздействие реаферона in vitro на нейгрофилы периферической крови больных ПКР до операции не приводит к изменению кинетики и уровня XJT ответа. Через 14 дней после операции отмечается изменение кинетики ХЛ ответа при наличии реаферона в реакционной среде в дозах 4000 ME и 10000 ME, а также площади индуцированной ХЛ кривой при дозе 10000 ME. Через месяца после хирургического лечения расширяется диапазон доз реаферона, в ответ на которые нейтрофипы реагируют изменением параметров ХЛ Появляется чувствительность к низкой дозе реаферона -2000 ME.

6. Установлено, что у больных ПКР через 3 недели после 1-го курса реафе-ронотерапии в 85% случаев изменяется ХЛ ответ нейтрофильных грану-лоцитов крови на реаферон in vitro относительно показателей ХЛ перед началом иммунотерапии.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1 Шкапова, Е.А. Влияние реаферона на функциональную активность лейкоцитов крови онкологических больных (на примере больных почечнокле-точным раком) / Е.А. Шкапова // Материалы XXXIX международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс». - Новосибирск, 2001 .-С.87-88.

2. Шкапова, Е А. Влияние реаферона на функциональную активность лейкоцитов крови больных почечноклеточным раком / Е.А. Шкапова // Тезисы докладов международной научной конференции студентов, аслиранюв и молодых ученых «Молодая наука - XX! веку». - Иваново, 2001.-С.66-67.

3. Шкапова, Е.А Особенности функционального ответа клеток гранулоци-тарно-макрофагалыюй системы больных почечноклеточным раком на воздействие реаферона in vitro /ЕЛ Шкапова, Л.М Куртасова, А А Савченко, И.В. Табарин // Сборник научных статей' материалы декадника «Эпидемия СПИДа — медицинские и социальные аспекты противодействия». - Красноярск, 2001.-С 144-151

4. Шкапова, Е А Оценка хемилюминесцентного ответа нейтрофильных гра-нулоцитов крови больных почечноклеточным раком при влиянии реаферона in vitro / Е А Шкапова // Сборник материалов краевой межвузовской конференции «Интелтект 2002» - Красноярск. 2002 -С 299-300

5 Шкапова, Е.А Клиническая значимость показателей хемилюминесцентного ответа нейтрофильных гранулоиитов крови у больных почечноклеточным раком при воздействии реаферона in vitro / ЕА. Шкапова, Л М

Куртасова, A.A. Савченко, P.A. Зуков, А.О. Суховерхов // Материалы научно-практической конференции «Актуальные вопросы урологии». - Кемерово, 2002.-С.158-159.

6. Шкапова, Е.А. Клиническая значимость функциональной активности гра-нулоцитов крови у больных почечноклеточным раком при воздействии различных доз реаферона / Е.А. Шкапова, JI.M. Куртасова, A.A. Савченко, P.A. Зуков, А.О. Суховерхов // Материалы итоговой научно-практической конференции «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири». - Красноярск, 2002.-С.221-223.

7. Шкапова, Е.А. Особенности клеточного и гуморального иммунитета у больных почечноклеточным раком / Е.А. Шкапова, P.A. Зуков, A.A. Савченко, Л.М. Куртасова // Гомеостаз и экстремальные состояния организма: тезисы докладов XI международного симпозиума. - Красноярск, 2003.-С.55-56.

8. Шкапова, Е.А. Особенности функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов у больных почечноклеточным раком / Е.А. Шкапова // Гомеостаз и экстремальные состояния организма: тезисы докладов XI международного симпозиума. - Красноярск, 2003.-С. 171-172.

9. Шкапова, Е.А. Особенности иммунного статуса и функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов крови у больных почечноклеточным раком / Е.А. Шкапова, Л.М. Куртасова, A.A. Савченко //Актуальные вопросы здравоохранешгя и медицинской науки: сборник научных трудов. -Красноярск, 2003.-С.267-272.

Ю.Зуков, P.A. Особенности функционального ответа нейтрофильных гранулоцитов крови больных почечноклеточным раком на воздействие реаферона in vitro / P.A. Зуков, Е.А. Шкапова // Актуальные вопросы медицинской науки и техники: сборник научных статей молодых ученых и специалистов Российской Федерации посвещенный конференции им. академика Б.С. Гракова. - Красноярск, 2003.-С.114-118

11.Зуков, P.A. Особенности иммунного статуса больных почечноклеточным раком / P.A. Зуков, Е А. Шкапова, Л.М. Куртасова, А А. Савченко// Медицинская иммунология -2003 -Т 5, № 3-4.-С 355-356.

12.Шкапова, Ь.А. Особенности хемилюминесцентной активности нейтрофильных гранулоцитов крови больных почечноклеточным раком / Е.А. Шкапова, Л М. Куртасова, А.А Савченко, Р А. Зуков I1 Медицинская иммунология.-2003 -Т.5, № 3-4.-С 369-370.

И.Кургасова, Л М Особенности иммунною статуса и хемилгоминесценции нейтрофильных гранулоцитов крови у больных почечноклеточным раком до и после хирургическою лечения / Л.М Куртасова, A.A. Савченко, Е.А. Шкапова, Р А. Зуков // Сборник научных трудов, посвященный 10-летию кафедры клинической иммунологии КрасГМА. - Красноярск, 2003 -С 6264.

14.Шкапова, Е.А. Оценка хемилюминесцентной активности нейтрофильных гранулоцитов крови больных почечноклеточным раком до и после оперативного лечения / Е.А. Шкапова, P.A. Зуков, Н.В. Рачкова, Л.М Куртасова, A.A. Савченко, И.В. Габарин // Клиническая онкология.-2003.-№2.-С.15-17.

15.Шкапова, Е.А. Сравнительный анализ функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов крови больных почечноклеточным раком до и после оперативного лечения / Е.А Шкапова, Л.М. Куртасова, А А. Савченко, Р.А Зуков, Г.П. Крылова // Клиническая лабораторная диагностика -2004.-№1.-С.39-41.

16 Шкапова, Е А. Особенности изменения величины показателей иммунного статуса у больных почечноклеточным раком после хирургического лечения / Е.А. Шкапова, Л М. Куртасова, A.A. Савченко, P.A. Зуков // «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» Сборник тезисов III конференции молодых ученых России с международным участием. - Москва, 2004.-С.250-251.

17.Шкапова, Е.А. Хемилюминесцентный ответ нейтрофилов крови у больных раком почек при воздействии реаферона in vitro / Е.А. Шкапова, Н.В. Рачкова, Л.М. Куртасова, А.А Савченко, P.A. Зуков // Материалы межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы онкорадиологии». - Красноярск, 2004.-С.100-101.

18.Шкапова, Е.А Специфика хемилюминесцешного ответа нейтрофильных гранулоцитов крови у больных почечноклеточным раком до и после операции / Е.А. Шкапова, Г'.Н. Крылова, JIM Куртасова, А А. Савченко // Материалы межречиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы онкорадиологии» - Красноярск, 2004 -С 103-104.

19.Зуков, Р А. Иммунный статус у больных местно-распросграненным раком почки /РА Зуков, Е.А. Шкапова // Материалы межрегиональной научно-практической конференции «Актуатьные вопросы онкорадиологии» -Красноярск, 2004 -С 97-98

20 Куртасова, JI.M. Особенности функциональной активности нейтрофиль-ных гранулоцитов в зависимости от 1исюлогического варианта почечнок-леточного рака / JT.M. Куртасова, А А. Савченко, Е.А. Шкапова // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Метаболические механизмы иммунореактивности». -Красноярск, 2004.-С.141-143.

21.Шкапова, Е.А. Особенности клеточного и гуморального иммунитета у больных с различными гистологическими вариантами почечноклеточного рака / Е.А. Шкапова // Материалы итоговой научно-практической конференции «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири». - Красноярск, 2004.-С.205-207.

22.Хват, Н.С Оценка состояния иммунной системы у больных почечнокле-точным раком после хирургического лечения / Н.С Хват, Е.А. Шкапова, А.А. Савченко, JT.M. Куртасова, Р А. Зуков // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Метаболические механизмы иммунореактивности». - Красноярск, 2004.-С.156-159.

23. Kurtasova, L.M The modification of function activity granulocytes at the patients with différent histological versions of RCC / A.A. Savchenko, E.A. Shka-pova // Russian of J.Immunology.-2004.-9, №2-P.290.

Заявки на изобретения:

• Заявка на изобретение №2004121373. Способ прогноза ранних гнойно-септических послеоперационных осложнений у больных почечноклеточ-ным раком / Шкапова Е.А. (РФ), Куртасова Л.М. (РФ), Савченко А.А. (РФ).- Приоритет 12.07.2004 г.

• Заявка на изобретение №2005100610 Способ оценки чувствительности к интерферону у больных раком почки / Куртасова Л.М. (РФ), Шкапова Е.А. (РФ), Крыжановский А.И. (РФ), Савченко А.А. (РФ), Зуков Р.А. (РФ), Рачкова Н.В. (РФ).- Приоритет 17.01.2005 г.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ИФН - интерферон

ПКР - почечноклеточный рак

ХЛ - хемилюминесценция

CD - дифференцировочный антш ен на мембране иммунокомпетентных клеток

Ig - иммуноглбулины

Подписано в печать 05 05 05 Бумага офсетная Формат 62\84 И6 Тираж 100 *хд Заказ 199 Отпечатано ООО РГТБ «Амальгама» I Красноярск, ул Лебедевой, 89 т 23-48-60

РЫБ Русский фонд

2006-4 11081

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ: Широко известно, что иммунная система играет центральную роль в механизмах противоопухолевой защиты организма [8,9]. Иммунокомпетентные клетки продуцируют ряд цитокинов, которые являются регуляторами межклеточных взаимодействий [2,12,21,30,32]. Кроме того, некоторые популяции клеток иммунной системы способны к ци-тотоксическому действию на опухолевые клетки [8,36,49,52,176]. Однако снижение уровня функциональной активности иммунной системы, а также особенности опухолевых клеток позволяют им не только преодолевать иммунологический барьер, но и оказывать иммуносупрессивное воздействие на организм, а в некоторых случаях использовать медиаторы иммунной системы для собственной прогрессии. В таких случаях могут развиваться онкологические заболевания [10,19,25,162].

Одной из актуальных проблем современной онкоурологии является высокий уровень заболеваемости почечноклеточным раком (ПКР), на долю которого приходится около 97% всех опухолей почек [29]. Ведущая роль в лечении ПКР, безусловно, принадлежит хирургическому методу [103,110,115,153,154]. Однако, более целесообразна комбинированная модель терапии, включающая в себя наряду с хирургическим лечением иммунотерапию препаратами интерферона, среди которых широкое распространение получил рекомбинантный интерферон-а2а [74,142,43,147]. Данный препарат кроме противовирусного и антипролиферативного действия, обладает ярко выраженными иммуномодулирующими свойствами: стимулирует активность естественных киллерных клеток, процессы фагоцитоза и цитотоксичность нейтрофильных гранулоцитов [26,104,105,152,157]. В то же время необоснованное или несвоевременное применение препаратов интерферона может снизить эффективность терапии или даже оказать негативное воздействие на организм в целом [14,118].

Важную роль в механизмах противоопухолевой защиты играют ней-трофильные гранулоциты. Хорошо известно, что модуляторами функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов являются не только вещества микробного происхождения, иммунные комплексы, медиаторы клеток крови и ткани, но и фармакологические препараты [1,59,69,70,73]. Кроме того, нейтрофильные гранулоциты характеризуются высокой мобилизационной активностью и способностью к быстрому и точному отражению изменений гомеостаза [34,36,60,61,78]. Это делает возможным оценить прямое и опосредованное действие фармакологических препаратов на функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов, что позволит определить чувствительность клеток к данному препарату и, в дальнейшем, судить об эффективности терапии.

Не подлежит сомнению, что изучение состояния иммунной системы, а также модуляции функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов интерфероном in vitro на фоне онкогенеза является одной из актуальных проблем современной биологии и медицины. Кроме того, изучая состояние иммунной системы и клеточную чувствительность к интерферону у больных ГЖР, можно не только охарактеризовать патогенез ПКР, но и получить экспериментальное обоснование терапии данным препаратом, а также определить его оптимальную лечебную дозу и объективно оценивать эффективность интерферонотерапии.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: Изучить фенотипические и функциональные особенности иммунокомпетентных клеток и клеточную чувствительность нейтрофильных гранулоцитов к интерферону in vitro у больных ПКР до и в динамике после хирургического лечения.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие ЗАДАЧИ:

1. Изучить особенности клеточного и гуморального иммунитета у больных ПКР до хирургического вмешательства и через 14 дней после удаления опухоли.

2. Исследовать параметры спонтанной и зимозан-индуцированной хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов у больных ПКР в период до хирургического лечения и в динамике после оперативного вмешательства.

3. Оценить показатели сывороточного ИФН, а также уровни спонтанной и стимулированной выработки ИНФ-а и ИФН-у мононуклеарами периферической крови больных ПКР до и через 14 дней после оперативного лечения.

4. Изучить влияние различных доз рекомбинантного интерферона-а2а in vitro на функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов крови больных ПКР в период до и в динамике после хирургического лечения.

5. Определить хемилюминесцентную активность нейтрофильных гранулоцитов при воздействии различных доз рекомбинантного интерферо-на-а2а in vitro после 1-го курса реаферонотерапии у больных ПКР.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА: Впервые на современном методическом уровне проведено комплексное исследование клеточного и гуморального иммунитета, а также функционального состояния иммунокомпетентных клеток у больных ПКР.

Впервые выявлены особенности ИФН статуса у больных ПКР в период до и после оперативного вмешательства. Результаты проведенного исследования показали повышенный уровень общего сывороточного ИФН на фоне сниженной продукции мононуклеарами периферической крови ИФН-а у больных ПКР как до, так и через 14 дней после хирургического лечения. При этом спонтанная продукция ИФН-у мононуклеарами периферической крови у больных ПКР до и после хирургического лечения значительно превышает контрольные показатели. В то время как стимулированная продукция ИФН этого типа снижена в дооперационном периоде и восстанавливается через 14 дней после хирургического лечения.

Впервые изучена функциональная активность нейтрофильных гранулоцитов крови больных ПКР до и в динамике после хирургического лечения, что позволило обнаружить повышенный уровень кислородзависимого метаболизма и сниженные компенсаторные возможности данной клеточной популяции.

Впервые установлено, что клеточную чувствительность к препаратам интерферона in vitro можно определять с помощью хемилюминесцентного анализа функционального состояния нейтрофильных гранулоцитов.

Определено оптимальное время для начала интерферонотерапии у больных ПКР - через 1,5 месяца после операции. Поскольку в этот период наиболее широк диапазон клеточной чувствительности к интерферону in vitro.

Доказано, что изменение параметров хемилюминесценции нейтрофи-лов крови в ответ на различные дозы реаферона in vitro носит индивидуальный характер.

Впервые установлено, что после 1-го курса интерферонотерапии клеточная чувствительность изменяется у 85% пациентов с ПКР, что указывает на необходимость оценки индивидуальной чувствительности не только до начала лечения, но и перед рециклом.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ: Проведенные исследования установили возможность с помощью хемилюминесцентного (XJI) анализа реактивности нейтрофильных гранулоцитов крови до начала интерферонотерапии определять индивидуальную чувствительность к препарату, а также осуществлять подбор оптимальной дозы. Это дает возможность корригировать дозу препарата в процессе интерферонотерапии, что позволит оптимизировать схему лечения и повысить клиническую эффективность иммунотерапии.

По результатам исследования получены 2 приоритетные справки на изобретения.

Результаты проведенных исследований внедрены в практическую работу Красноярского краевого онкологического центра, клиники ГУ НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН, Красноярского краевого центра по профилактике и борьбе со СПИД и другими инфекционными заболеваниями.

Основные положения диссертации используются в учебном процессе на кафедре биохимии и физиологии человека и животных Красноярского государственного университета и кафедре клинической иммунологии Красноярской государственной медицинской академии.

Работа поддержана ККФН (конкурсный грант 11F0164C, 2002-2003гг.).

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Иммунные нарушения у больных ПКР характеризуются изменением фенотипического спектра лимфоцитов и параметров интерферонового статуса, а также изменением функциональной активности нейтрофильных грану-лоцитов периферической крови.

2. Хемилюминесцентный анализ реактивности нейтрофильных грану-лоцитов при воздействии реаферона in vitro позволяет объективно оценить индивидуальную клеточную чувствительность к данному препарату у больных ПКР.

3. После 1-го курса реаферонотерапии чувствительность нейтрофильных гранулоцитов больных ПКР к воздействию данного препарата in vitro изменяется в 85% случаев, что необходимо учитывать для повышения клинической эффективности иммунотерапии в каждом конкретном случае.

АПРОБАЦИЯ МАТЕРИАЛОВ ДИССЕРТАЦИИ: Основные положения доложены и обсуждены на международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Молодая наука - XXI веку» (Иваново, 2001), на V научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001» (Санкт-Петербург, 2001), на научно-практической конференции «Актуальные вопросы урологии» (Кемерово, 2002), на итоговой научно-практической конференции НИИ Медицинских проблем Севера СО РАМН «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири» (Красноярск, 2002), на XI международном симпозиуме «Гомеостаз и экстремальные состояния организма» (Красноярск, 2003), на VII Всероссийском научном форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003), на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Метаболические механизмы иммунореактивности» (Красноярск, 2004), на III конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004), на межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы онкорадиоло-гии» (Красноярск, 2004), на Объединенном иммунологическом форуме (III Съезд иммунологов России и VI Национальный конгресс РААКИ) (Екатеринбург, 2004), на заседании Красноярского регионального отделения РААКИ (Красноярск, 2004).

ПУБЛИКАЦИИ: Основные положения диссертации опубликованы в 23 печатных работах.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ: Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, 2 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 8 рисунками, список литературы включает 176 библиографических изданий (97 отечественных и 89 иностранных).

выводы

1. Общей закономерностью развития иммунопатологических состояний у больных ПКР является повышение содержания зрелых Т-лимфоцитов (CD3+), увеличение количества экспрессирующих HLA-DR+ CD3+-клеток, снижение количества С019+-клеток и повышение относительных уровней синтеза IgA и IgG.

2. У больных ПКР после хирургического лечения (через 14 дней) состояние иммунного статуса характеризуется повышением иммунорегуля-торного индекса, снижаем содержания С016+/56+-лимфоцитов, и сохранением увеличенной экспрессия маркеров активации Т-клеток (HLA-DR+), на фоне повышенного синтеза IgA, IgM и IgG.

3. У больных ПКР до операции изменена кинетика и повышен уровень XJI ответа нейтрофильных гранулоцитов крови. Через 14 дней после операции при нормализации кинетики сохраняется повышенным уровень спонтанного ХЛ ответа, и резко увеличены показатели индуцированной ХЛ. Через 1,5 месяца наблюдается снижение компенсаторных возможностей нейтрофильных гранулоцитов.

4. У больных ПКР до и после хирургического лечения повышено содержание ИФН в сыворотке крови и увеличена спонтанная продукция ИФН-у мононуклеарами периферической крови. Через 14 дней после операции наблюдается снижение спонтанной продукции ИФН-а в сочетании с повышенной способностью мононуклеаров периферической крови к индуцированной выработке ИФН-у и ИФН-а.

5. Воздействие реаферона in vitro на нейтрофилы периферической крови больных ПКР до операции не приводит к изменению кинетики и уровня ХЛ ответа. Через 14 дней после операции отмечается изменение кинетики ХЛ ответа при наличии реаферона в реакционной среде в дозах 4000 ME и 10000 ME, а также площади индуцированной ХЛ кривой при дозе 10000 ME. Через 1,5 месяца после хирургического лечения расширяется диапазон доз реаферона, в ответ на которые нейтрофилы реагируют изменением параметров XJI. Появляется чувствительность к низкой дозе реаферона - 2000 ME.

6. Установлено, что у больных ПКР через 3 недели после 1-го курса реа-феронотерапии в 85% случаев изменяется XJI ответ нейтрофильных гранулоцитов крови на реаферон in vitro относительно показателей ХЛ перед началом иммунотерапии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Взаимодействие организма и опухоли является одной из проблем современной иммунологии опухолей. Значение иммунного ответа на развитие опухоли хорошо известно из классической экспериментальной иммунологии опухолей и исследованиям по "иммунологическому надзору" (термин, предложенный Бернетом и сейчас включающий в себя значительно более широкое понятие), а также из современных исследований по механизму естественной противоопухолевой резистентности. За последние годы установлено существенное значение фактора иммунодепрессии в развитии опухолей. Кроме того, большое внимание уделяется исследованию иммунологической реактивности организма и изучению взаимосвязи уровня иммунного ответа с клиническим течением и прогнозом заболевания, т.к. отмечено, что рост большинства злокачественных новообразований сопровождается изменениями показателей различных звеньев иммунного ответа [31].

Активное использование иммуномодуляторов началось в 70-х гг. XX века, когда было показано, что использование ряда различных препаратов способствовало восстановлению иммунологических показателей. Клинические исследования, проведенные в то время, выявили как положительные, так и отрицательные стороны этого вида лечения: наряду с данными об эффективности некоторых иммуномодуляторов было показано, что неадекватное применение препаратов способствовало ускорению опухолевого роста и гибели больного [25]. В настоящее время свыше 40 препаратов, обладающих иммуномодулирующими свойствами, разрешены к применению в России; это в основном цитокины, препараты тимуса и синтетические препараты. Большинство иммуномодуляторов обладает хорошо изученным механизмом действия с преимущественным влиянием на то или иное звено иммунной системы, хотя, в зависимости от различных условий, препарат может оказывать влияние и на другие ее компоненты. Все это указывает на необходимость предварительной оценки параметров иммунной системы в каждом конкретном случае с последующим назначением соответствующего препарата. В последние годы проведено большое количество исследований по использованию иммуномодуляторов для коррекции иммунологических показателей у больных, получающих химиотерапию. Оказалось, что применение этих препаратов способствует уменьшению токсичности химиопрепаратов, сокращению сроков восстановления лейкоцитов, снижению заболеваемости от вирусных инфекций, а в ряде случаев - увеличению продолжительности ремиссии [31,50]. Особое место среди исследуемых препаратов занимают ци-токины; исследования последних лет показали эффективность их использования при некоторых злокачественных новообразованиях, в частности, при ПКР [44].

В связи с этим целью исследования явилось изучение фенотипических и функциональных особенностей иммунокомпетентных клеток и клеточной чувствительности нейтрофильных гранулоцитов in vitro к интерферону у больных ПКР до операции, и в динамике после хирургического лечения.

На базе Краевого онкологического центра проведены динамические наблюдения за больными ПКР(ТзЫоМо) до хирургического лечения (N=132), через 14 дней после оперативного вмешательства (N=45) и через 1,5 месяца после радикальной нефрэктомии (N=12), а также пациенты после 1-го курса реаферонотерапии (N=20) в возрасте 40-55 лет. В качестве контрольной группы были обследованы 30 здоровых доноров.

Популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов крови оценивали с помощью метода проточной цитофлюориметрии, используя FACS-Calibur (Becton Dickinson, USA) и реагенты Simul Test IMK-lymphocyte Kit (USA). Концентрацию иммуноглобулинов класса A, M и G в сыворотке определяли методом радиальной иммунодиффузии [140].Содержание ЦИК в сыворотке определяли турбидиметрическим методом [124]. В супернатантах мононуклеаров периферической крови, культивированных в течение 72 часов, оценивали уровень спонтанной и стимулированной продукции ИФН-а и ИФН-у методом твердофазного иммуноферментного анализа, с помощью тест-систем ООО «Протеиновый контур» (С.-Петербург, Россия). Уровень сывороточного ИФН также определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа на тест-системе ООО «Протеиновый контур». Изучение функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов и определение влияния различных доз ИФН-а2а на реактивность нейтрофилов проводилось с помощью хемилюминесцентного метода.

Исследование иммунологических показателей у больных ПКР показало изменения в клеточном и гуморальном звене иммунной системы. У пациентов в период до хирургического лечения наблюдалась тенденция к повышению, относительно группы контроля, количества зрелых Т-лимфоцитов. Кроме того, в группе больных ПКР до хирургического лечения обнаружено увеличение концентрации IgA в сыворотке крови и повышенные относительные уровни синтеза IgA и IgG по сравнению с контрольными величинами, что отражает напряжение гуморального иммунитета.

Через 14 дней после хирургического лечения наблюдается позитивная динамика иммунологических изменений у больных ПКР. Повышается величина иммунорегуляторного индекса за счет увеличения содержания CD4+- и понижения количества СЭ8+-лимфоцитов. Однако, наряду с этим, в иммунной системе пациентов после радикальной нефрэктомии все же отмечается сниженный уровень лимфоцитов, NK-клеток, а также тенденция к увеличению экспрессии маркеров активации на Т-лимфоцитах. Это свидетельствует о нарушениях в системе противоопухолевой резистентности организма. Гуморальное звено у больных ПКР после хирургического лечения «работает» в усиленном режиме, о чем свидетельствует увеличение по сравнению с контрольными значениями относительного уровня синтеза IgA, IgM и IgG.

Анализ функционального состояния нейтрофильных гранулоцитов у больных ПКР показал, что в клетках больных ПКР до хирургического лечения процессы синтеза активных форм кислорода протекают более активно, чем в нейтрофилах здоровых людей, что свидетельствует об исходно повышенных энергетических затратах нейтрофильных гранулоцитов у пациентов с исследуемой патологией. Однако при дополнительной функциональной нагрузке in vitro в нейтрофильных гранулоцитах лиц с ПКР до хирургического лечения не наблюдается адекватного усиления кислородного метаболизма клеток относительно уровня здоровых доноров, что отражает пониженные резервные метаболические возможности данной клеточной популяции.

У больных ПКР через 14 дней после оперативного вмешательства сохраняется повышенный уровень кислородного метаболизма нейтрофильных гранулоцитов, но, следует отметить увеличение времени, за которое клетка достигает максимальной интенсивности продукции высокоэнергетических оксидантов. Это способствует менее быстрому истощению функционально-метаболической активности клетки, что, безусловно, является положительным изменением. При изучении функционального ответа нейтрофильных гранулоцитов на стимуляцию опсонизированным зимозаном выявлено, что «респираторный взрыв», регистрируемый с помощью XJI анализа становится еще более выраженным не только по сравнению с уровнем, зафиксированном в контрольной группе, но и превышает соответствующие параметры больных ПКР в период до хирургического лечения. Это отражает повышенные компенсаторные возможности нейтрофильных гранулоцитов у прооперированных пациентов.

Через 1,5 месяца после радикальной нефрэктомии в функциональном состоянии нейтрофильных гранулоцитов больных ПКР были зарегистрированы следующие изменения. Значимо замедлилась скорость синтеза активных форм кислорода за единицу времени относительно группы контроля, однако уровень продукции высокоэнергетических оксидантов остался на прежнем, повышенном относительно группы контроля уровне. При проведении нагрузочных проб с опсонизированным зимозаном, на фоне высокой интенсивности «респираторного взрыва» отмечается значительное снижение компенсаторных возможностей нейтрофилов в данной группе пациентов.

Корреляционный анализ параметров иммунного статуса и XJI ответа нейтрофилов показал увеличение числа взаимосвязей у больных ПКР до хирургического лечения и снижение числа коррелирующих между собой параметров у прооперированных пациентов относительно группы контроля. Кроме того, установлено, что в группе больных ПКР до операции преобладают отрицательные корреляционные взаимосвязи, однако после хирургического лечения соотношение положительных и отрицательных корреляций составляет 1:1, как и в группе здоровых доноров. Необходимо отметить, что в группе здоровых доноров большинство корреляций выявлено между параметрами спонтанного XJI ответа нейтрофилов и Т-клеточным звеном иммунной системы. У больных ПКР до хирургического лечения значительно увеличивается число корреляционных взаимосвязей с параметрами индуцированной ХЛ и появляются взаимосвязи с показателями, характеризующими гуморальное звено. Через 14 дней после операции снижается число корреляций с показателями Т-клеточного звена. В то же время выявляются взаимосвязи между содержанием В-лимфоцитов, уровнем ЦИК и параметрами ХЛ ответа нейтрофилов.

К показателям, характеризующим функциональное состояние иммуно-компетентных клеток относятся параметры ИФН-статуса. В сыворотке крови больных ПКР как до, так и после хирургического лечения отмечалось повышенное, относительно уровня контрольных значений, содержание ИФН. Также, в обеих группах пациентов наблюдалась повышенная спонтанная продукция ИФН-у мононуклеарами периферической крови по сравнению с соответствующим параметром здоровых доноров. Однако уровень индуцированной продукции данного цитокина клетками пациентов с ПКР различается в зависимости от периода: до или после операции, а именно, мононуклеары периферической крови больных до хирургического лечения продуцируют

ИФН-у примерно на уровне клеток здоровых доноров (статистически значимых отличий между этими группами выявлено не было). В период после оперативного вмешательства мононуклеары периферической крови более интенсивно реагируют на стимул, и, как следствие этого, наблюдается повышенный уровень продукции ИФН-у. Кроме того, у больных ПКР через 14 дней после хирургического лечения наблюдалось снижение спонтанной продукции ИФН-а по сравнению с соответствующим показателем в группе больных до операции. Уровень стимулированной продукции ИФН-а мононуклеарами периферической крови больных ПКР снижен относительно контрольных величин. При этом отмечается повышение уровня индуцированной продукции ИФН-а у прооперированных пациентов по сравнению с показателями больных ПКР до хирургического лечения.

Вероятно, изменения ИФН-продуцирующей системы у больных ПКР, зарегистрированные в период до хирургического лечения, являются следствием опухолевой иммуносупрессии. Так, у больных ПКР до операции отмечается дисбаланс продукции ИФН-у мононуклеары периферической крови -повышенный спонтанный уровень этого цитокина не сопровождается адекватным увеличением продукции ИФН-у в ответ на стимуляцию. Возможно, это обусловлено снижением функционально-метаболических компенсаторных возможностей иммуноцитов. Также это может быть связано с нарушением рецепторного аппарата и/или сигнал-передающих систем иммунокомпе-тентных клеток. Кроме того, у пациентов в период до операции отмечены нарушения синтеза ИФН-а в ответ на стимуляцию in vitro, хотя усиленного спонтанного синтеза ИФН-а по сравнению с контрольным уровнем не было обнаружено.

Необходимо отметить, что через 14 дней после хирургического лечения отмечается положительная динамика изменений параметров ИФН статуса, в частности повышаются резервные возможности мононуклеары периферической крови к выработке ИФН-у. Однако полного восстановления ИФНпродуцирующей системы не наблюдается. Установлено, что после удаления очага иммуносупрессии сохраняется повышенным уровень спонтанной продукции ИФН-у относительно контрольного диапазона.

На фоне относительного восстановления ИФН-у-продуцирующей системы, совершенно другая картина наблюдается при оценке изменений ИФН-а-продуцирующей системы. Выявлен пониженный по сравнению с параметрами в дооперационный период уровень спонтанной продукции ИФН-а. Кроме того, не смотря на увеличение уровня индуцированной продукции ИФН-а относительно параметров в группе больных ПКР до хирургического лечения, концентрация ИФН данного класса не достигает контрольного уровня. Таким образом, по результатам проведенных исследований можно констатировать дефицит продукции эндогенного ИФН-а у больных ПКР как до, так и через 14 дней после хирургического лечения, что дает основание для проведения иммунотерапии препаратами ИФН-а у данной категории больных.