Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Особенности гуморального иммунного ответа при гепатитах А,С, дельта и их значение для клиники и диагностики

На правах рукописи

Круглое Игорь Вячеславович

ОСОБЕННОСТИ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА ПРИ ГЕПАТИТАХ А, С, ДЕЛЬТА И ИХ ЗНАЧЕНИЕ ДЛЯ КЛИНИКИ И ДИАГНОСТИКИ

14.00.36 — аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

Москва, 2006.

Работа выполнена в ГУ НИИ вирусных препаратов им. О.Г.Анджапаридзе РАМН и в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН.

Научные консультанты: Доктор медицинских наук Николай Васильевич Дорошенко. Доктор биологических наук Юрий Аркадьевич Семилетов.

Официальные оппоненты:

Профессор, доктор медицинских наук Вячеслав Фёдорович Лавров. Профессор, доктор медицинских наук Евгений Петрович Пашков. Профессор, доктор биологических наук Александр Васильевич Пронин.

Ведущее учреждение - ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН.

заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН по адресу: Малый Казённый переулок, д. 5А, 105064, Москва.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН.

Учёный секретарь диссертационн«™ ^пота

Защита диссертации состоится

Автореферат разослан «/?

кандидат биологических наук

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Заболеваемость гепатитами С и дельта является актуальной проблемой для здравоохранения Российской Федерации в связи с высокими показателями инвалидизации и смертности. Не менее 10.000 человек в год умирает в России в результате заболеваний парентеральными гепатитами и их отдалённых последствий, и есть все основания ожидать роста этого показателя в дальнейшем (С.М.Клименко, 1997). Проблема гепатита А (ГА) актуальна в связи с периодическими подъёмами заболеваемости этой инфекцией. Согласно официально регистрируемым данным за период с 1995 по 2005 годы заболеваемость ГА в Российской Федерации находилась в пределах от 28,3 до 123,5 заболевших на 100.000 населения в целом по стране.

В основе диагностики вирусных гепатитов лежит выявление маркёров этих инфекций высокочувствительным методом иммуноферментного анализа. Однако достижение высокой чувствительности современных иммуноферментных тест-систем сопряжено с такими проблемами диагностики, как получение ложноположительных результатов вследствие неспецифических межбелковых взаимодействий, а также расхождения в результатах исследований при использовании тест-систем различных фирм-производителей. Кроме того, генетическая вариабельность вирусов - этиологических агентов гепатитов, также может приводить к различиям в детекции маркёров этих вирусов. Поэтому одним из путей совершенствования серологической диагностики вирусных гепатитов является использование синтетических пептидов, моделирующих конкретные антигенные детерминанты вирусных белков. Знание особенностей строения, предопределяющих активность и специфичность этих участков, позволяет более точно ориентироваться при поиске В-эпитопов в аминокислотной последовательности белка, а также формирует подходы к пониманию патогенеза и саногенеза вирусных инфекций, связанных со сложным взаимодействием между вирусом и иммунной системой человеческого организма.

Трудности анализа антигенных детерминант вируса гепатита А(ВГА, HAV) обусловлены их конформационной структурой, В связи с этим перспективным представляется использование более сложных нелинейных синтетических пептидов, в том числе и являющихся гетерогенными антигенами.

Для диагностики ГС в настоящее время в клинической практике используются иммуноферментные тест-системы III и IV поколений, позволяющие выявлять антитела классов в и М к ВГС. Однако эти тест-системы не позволяют оценить уровень иммунного ответа по отношению к отдельным белкам вируса гепатита С (ВГС, НСУ) и к отдельным эпитопам этих белков. Выявление нуклеиновой кислоты вируса методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) весьма информативно при проведении эпидемиологических исследований, однако будучи отдельно взятым, этот метод недостаточно информативен при оценке течения заболевания у конкретного больного. Таким образом, подход к диагностике ГС в настоящее время принципиально отличается от серологического обследования больных гепатитом В (ГВ) например, которое носит гораздо более комплексный характер. Серологическое обследование больного ГВ - это по сути своей мониторинг различных маркёров, каждый из которых несёт свою информационную нагрузку (НВвАд, апй-НВсог М, апй-НВсог ^ Б, апи-НВв, НВеА^апй-НВе). Предлагаемый нами комплексный подход к серологическому обследованию актуален для больных ГС не менее, чем для больных ГВ, прежде всего потому, что заболевание ГС значительно чаще переходит в хроническую форму, следовательно, патологический процесс носит более сложный, более комплексный характер.

Применение пептидных моделей позволяет определять роль отдельных аминокислотных остатков в составе белков, соответствующих различным генотипам ВГС. Ряд авторов указывает на то, что выявление антител к отдельным антигенным детерминантам (белки и отдельные эпитопы) ВГС коррелирует с определенной фазой течения заболевания и позволяет оценить активность патологического процесса (А.Ю.Афанасьев с соавт., 1997; Е.А.Васильева, 1995; С.Н.Соринсон, 1997; Z.-'X..ZЬ.г^^g е1 а1., 1995). Однако такие исследования, как правило, либо ограничивались сопоставлением частоты выявления ^ б к согс- и Ы34-белкам, либо их титров у различных групп больных, либо проводилось аналогичное сравнительное исследование частоты выявления 1ц О и их уровня к отдельным фрагментам из последовательности структурных белков ВГС. В ходе проведения, нашего исследования была сопоставлена частота выявления антител (как класса в, так и класса М) и их

уровня к отдельным фрагментам вирусных белков у различных групп больных, в том числе было также проведено исследование спектра антител в динамике у больных ГС с различными исходами заболевания.

Специфическая серологическая диагностика гепатита дельта (ГО) также является актуальной проблемой здравоохранения. Первоначально в соответствующих диагностикумах использовался вирусный антиген, - выделяемый из ткани печени умерших от ГТ). Более эффективным и безопасным является использование генноинженерных препаратов или синтетических пептидов, моделирующих иммунодоминантные эпитопы дельта антигена (НОА§). Однако использование рекомбинантного НОА§ имеет свои недостатки. Рекомбинантные белки состоят из целевого протеина и дополнительных полипептидов, из-за которых иммунофермснтная реакция иногда дает ложноположительные результаты. Поэтому одним из путей создания эффективных тест-систем для диагностики дельта-инфекции является использование синтетических пептидов, моделирующих конкретные антигенные детерминанты белка вирусного нуклеокапсида. Кроме того, синтетические пептиды легче и дешевле очистить, чем генноинженерные препараты.

В настоящее время известны нуклеотидные последовательности РНК вируса ГО (ВГО, НОУ) и аминокислотные последовательности НОА§, характерные для различных географических регионов. В соответствии с принятой классификацией, большинство таких последовательностей принадлежит к первому типу НОУ. Второй тип, наряду с первым, встречается в Азии. НОУ третьего типа циркулирует в Южной Америке. Данные о генотипах НОУ, циркулирующих на территории РФ очень ограничены и противоречивы.

По одним данным, расшифрованная нуклеотидная последовательность генома российского изолята НОУ наиболее близка к последовательностям молдавских и болгарского изолятов, относящихся к генотипу 1В. По другим -нуклеотидные последовательности геномов НОУ, кодирующих С-концевую часть HDAg и циркулирующих в Северо-Западном регионе России, относятся к 1А генотипу НОУ.

Вышеизложенные факты свидетельствуют, таким образом, об актуальности использования синтетических пептидов для дальнейшего исследования дельта-

инфекции, в том числе - для разработки соответствующих диагностических препаратов.

ЦЕЛЬЮ диссертационной работы является совершенствование серологической диагностики гепатитов А, С и дельта на основе исследования особенностей гуморального иммунного ответа по отношению к различным антигенным детерминантам соответствующих вирусов.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие ЗАДАЧИ:

1. Исследовать антигенную структуру белков вирусов гепатитов А, С и дельта с помощью пептидных моделей фрагментов аминокислотной последовательности соответствующих вирусных белков.

2. Разработать модификацию иммуноферментного анализа для определения спектра апи-НСУ антител и исследовать особенности сероконверсии антител к антигенным детерминантам структурных и неструктурных белков вируса гепатита С у больных с различными исходами острого гепатита С.

3. Разработать модификацию ИФА для выявления типоспецифических апй-Н01Б4 антител у больных гепатитом С.

4. Разработать новый вариант ИФА для диагностики гепатита Б на основе синтетических пептидных антигенов.

5. Оценить целесообразность использования гетерогенных тетрамерных мультипептидных антигенов при разработке новых тест-систем для выявления серологических маркёров ВГА.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

1. Среди синтезированных Ы85-пептидов в качестве наиболее перспективного с точки зрения диагностики ГС отобран пептид с последовательностью 2295-2317 а.о. Эта последовательность содержит как минимум два эпитопа, имеющих различную природу. Установлены оптимальные условия для проведения реакции с этим пептидом, позволяющие максимально полно использовать потенциал обоих эпитопов в диагностических целях. Полученные результаты позволили использовать пептид 2295-2317 в составе новой антигенной композиции, куда дополнительно был включён синтетический пептид, дублирующий иммунодоминантный участок НСсА£, но более короткий, чем рекомбинантный НСсАд, также используемый. Подобное

дублирование, характерное для тест-систем IV поколения, позволило увеличить чувствительность разработанной тест-системы.

2. Установлена корреляция между спектром антител к отдельным вирусным белкам, представленным различными антигенными детерминантами, и клинико-биохимическим вариантом течения хронической HCV-инфекции. Если сыворотка пациента с хронической HCV-инфекцией не содержит Ig G к какой- либо из антигенных детерминант неструктурных белков вируса, либо к обоим

антигенным детерминантам core белка HCV, использованных в настоящем исследовании, то с высокой степенью вероятности (соответственно, р < 0,05 и р < 0,01) можно полагать, что данный пациент находится в состоянии ПНАТ (хронический гепатит с постоянно нормальным уровнем аланинаминотрансферазы (AJIT)). Особенно выраженный характер данная закономерность имеет для пациентов, в сыворотке которых не содержится Ig G к обоим антигенным детерминантам NS4, а также при сочетании отсутствия Ig G к антигенным детерминантам соге-белка с отсутствием Ig G к какой-либо из антигенных детерминант неструктурных белков вируса (в настоящем исследовании 100 % таких пациентов принадлежали к группе с ПНАТ). Также установлено, что наличие в высоком титре anti-NS4 Ig G (р < 0,05), и особенно сочетание anti-NS4-20 и anti-core-16 Ig G в высоком титре (р < 0,01) характерно для больных хроническим гепатитом С с более активным клинико-биохимическим вариантом течения заболевания (ХГС).

3. Впервые установлены следующие закономерности сероконверсии anti-HCV класса G, характерные для больных ГС с последующей ремиссией: быстрое нарастание уровня anti-core Ig G в течение первых 16 недель заболевания с последующим спадом вплоть до полного исчезновения антител к 52 неделе; уровень anti-NS4 Ig G у таких больных также достигает значений, достоверно превышающих уровень, характерный для первых двух недель желтушного периода, к 4-ому месяцу от начала желтушного периода, затем быстро снижается, и к 9 месяцу оказывается достоверно ниже своих максимальных значений, характерных для 4-го месяца; уровень anti-NS5 Ig G минимален, либо anti-NS5 отсутствуют.

s

4. Впервые установлены следующие закономерности сероконверсии anti-HCV класса G, характерные для больных ГС с последующей хронизацией: менее быстрое нарастание уровня anti-core Ig G в первые 6 месяцев заболевания, чем у больных с последующей ремиссией, затем начинается стремительный рост концентрации антител, и к 13-ому месяцу заболевания уровень anti-core Ig G у больных ХГС оказывается, как правило, значительно выше, чем максимальный уровень anti-core Ig G у больных с последующей ремиссией на 4-ом месяце; концентрация anti-NS4 Ig G достоверно выше относительно первых двух недель уже на втором месяце заболевания и остаётся высокой в дальнейшем; постепенное нарастание уровня anti-NS5 Ig G, который достигает значений, достоверно более высоких, чем в первые две недели заболевания, к 6-му месяцу. Выявленная закономерность характерна как для anti-NS5 Ig G, взаимодействующих с синтетическим пептидом а.о. 2295-2317, так и для anti-NS5 Ig G, взаимодействующих с генноинженерным NS5, но для них она выявлена в более ранний срок - начиная с 4-го месяца заболевания.

5. У больных ГС с последующей ремиссией anti-core Ig М, взаимодействующие с синтетическим пептидом а.о. 19-34, были выявлены только в течение первого месяца заболевания. Anti-NS4 Ig М у некоторых больных ГС с последующей ремиссией выявлялись до 6 месяца заболевания включительно. Тем не менее, снижение уровня anti-NS4 Ig М, взаимодействующих с синтетическим пептидом а.о. 1921-1940, относительно первых двух недель заболевания имеет достоверный характер уже к 4-му месяцу. Anti-NS5 Ig М, взаимодействующих с синтетическим пептидом а.о. 2295-2317, не удалось выявить ни у одного из больных ГС с последующей ремиссией. У больных ГС с последующей хронизацией anti-core, anti-NS4 и anti-NS5 Ig М могут сохраняться в течение неопределённо длительного периода, исчезать и появляться вновь при обострении ХГС.

6. На основе типоспецифических пептидов, моделирующих N- и С-участки вариабельного региона NS4A и NS4B белков вируса гепатита С (а.о. 1683 -1732), была разработана тест-система для выявления типоспецифических антител, появление которых в сыворотке крови больного характерно для ВГС соответствующего типа. В результате проведённого исследования по выявлению

типоспецифических anti-HCNS4 антител у больных гепатитом С с помощью разработанной тест-системы было установлено достоверное различие в циркуляции ВГС разных типов в Москве и Белоруссии (Витебск).

7. В диссертации представлены результаты серотипирования HDV, циркулирующего на территории России, с помощью синтетических Пептидов, моделирующих аминокислотные последовательности иммунодоминантного и

- вариабельного участков HDAg, соответствующих трём известным типам HDV.

Создан и апробирован вариант иммуноферментного анализа для выявления anti-_ delta классов Ig G и Ig М в сыворотках крови, разработанный на основе синтетических пептидов.

8. Наиболее эффективным антигеном с точки зрения скрининга anti-HAV-IgM позитивных сывороток среди использованных в данном исследовании синтетических пептидных антигенов является MAP4(VP1+VP3). Использование MAP4(VP1+VP3) для этой цели более эффективно, чем использование комбинации его составляющих - линейных пептидов VP1 и VP3, или его комбинации с его составляющими. Использование гетерогенных мультипептидных антигенов, в том числе содержащих VP1 (11 а.о. — 25 а.о.) и VP3 (110 а.о. — 121 а.о.), целесообразно при разработке новых тест-систем для ВГА.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Впервые проведено исследование спектра anti-HCV антител и их уровня в процессе развития заболевания у больных ГС с различными исходами. Для этого были выявлены и использованы наиболее значимые с точки зрения поставленной задачи антигенные детерминанты вирусных белков. Установлены достоверные различия частоты выявления anti-HCV антител (как класса G, так и класса М) и их уровня к отдельным фрагментам вирусных белков у различных групп больных ГС. Установлены закономерности сероконверсии anti-HCV антител, имеющие прогностическое значение.

2. Впервые установлено, что сероконверсия anti-NS4 Ig G имеет место во время острой фазы заболевания ГС, в том числе - уже в первые 10 дней желтушного периода. Впервые установлена корреляция между частотой

выявления апи-Ь184 О в первые 10 дней желтушного периода ОГС и степенью риска давнего инфицирования ВГС.

3. В результате проведённого исследования по выявлению . типоспецифических ап11-НСЫ84 антител у больных гепатитом С с помощью

разработанной тест-системы было установлено достоверное различие в циркуляции ВГС разных типов в Москве и Белоруссии (Витебск).

4. Разработаны новые варианты ИФА на основе синтетических пептидов для диагностики гепатита Б.

5. Впервые показана диагностическая значимость модификации ИФА на основе гетерогенных тетрамерных мультипептидных антигенов.

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ определяется полученными новыми знаниями об антигенных свойствах исследованных детерминант вирусных белков, а также исследованием взаимного влияния синтетических пептидных антигенов, которое приводит к изменению их иммунохимических свойств на уровне взаимодействия антиген - антитело. В результате проведённого исследования установлены закономерности развития гуморального иммунного ответа у больных гепатитом С в зависимости от дальнейшего развития заболевания. С помощью разработанной тест-системы на основе типоспецифических пептидов, были установлены статистически достоверные различия в циркуляции ВГС различных типов в Москве и Белоруссии (Витебск). Установлено, что антигенная структура иммунодоминантного региона а.о. 65-80 белка нуклеокапсида НОУ, наиболее широко распространенного на территории Центральной России среди больных гепатитом дельта, соответствует генотипу НОУ I.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ.

• 1. Сконструированы иммуноферментные тест-системы (лабораторный вариант) на основе синтетических пептидных антигенов вируса гепатита С, а также их комбинаций с генноииженерными препаратами.

2. Сконструированы иммуноферментные тест-системы (лабораторный вариант) на основе синтетических пептидных антигенов вируса гепатита дельта.

3. Выявлены различия в клиническом течении и исходах острого гепатита С у больных с различным спектром антител к иммунодоминантным участкам структурных и неструктурных белков вируса гепатита С.

4. Разработан новый подход к серологической диагностике ГС, основанный на динамическом контроле за спектром антител к вирусу гепатита С.

5. Разработаны методические рекомендации на сконструированную тест-систему для контроля за спектром антител к вирусу гепатита С в сыворотках крови НСУ-инфицированных лиц, содержащие дополнительные критерии оценки активности патологического процесса и сроков заболевания, и методические рекомендации на сконструированную тест-систему для типирования антител к вирусу гепатита С в сыворотках крови НСУ-инфицированных лиц, содержащие критерии интерпретации полученных результатов с точки зрения типоспецифичности выявленных антител по отношению к различным генотипам вируса гепатита С.

6. Результаты диссертационной работы позволили обосновать целесообразность дополнительного обследования больных ОГС и острым вирусным гепатитом неустановленной этиологии, включающего раздельное определение антител к антигенам ВГС, использованным в данной работе, для уточнения диагноза и прогнозирования исхода заболевания.

7. Дана оценка принципиальной возможности использования мультипептидных гетерогенных структур для диагностики ГА.

8. Положения диссертационной работы, затрагивающие клинико-лабораторные аспекты прогнозирования исходов ОГС используются при проведении учебных занятий и чтений лекций студентам кафедры инфекционных болезней с курсом эпидемиологии и курсантам ФПДО МГМСУ.

АПРОБАЦИЯ.

Результаты исследований по теме диссертации были доложены на Фальк симпозиуме № 92 "Новые направления в гепатологии", Санкт-Петербург, Россия, 21-22 июня 1996; на 24 симпозиуме Европейского Пептидного Общества, Эдинбург, Великобритания, 1996; на Пятой международной конференции «СПИД, рак и связанные проблемы», Санкт-Петербург, Россия, 25-30 мая, 1997; на II Российской научно-практической конференции "Гепатиты В, С, Э и О -

проблемы диагностики, лечения и профилактики", Москва, Россия, октябрь 1997; на научной конференции "Вирусные инфекции на пороге 21 века: эпидемиология и профилактика», С.-Петербург, Россия, 21-23 апреля 1999; на III Российской научно-практической конференции "Гепатиты B,C,D и G - проблемы диагностики, лечения и профилактики", Москва, Россия, июнь 1999; на научной конференции "Актуальные проблемы медицинской вирусологии», Москва, Россия, ноябрь 1999; на 2-й Объединённой Всероссийской и Всеармейской научной конференции "Санкт-Петербург - Гастро-2000", С.-Петербург, Россия, 20-22 сентября 2000; на научно-практической конференции "Гепатит С (Российский консенсус)", Москва, Россия, 26-27 сентября 2000; на IV Российской научно-практической конференции "Гепатиты В,С и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики", Москва, Россия, июнь 2001; на научно-практической конференции «Неотложная помощь в клинических условиях», Мытищи, Россия, 2002; на XVI конгрессе Международной Эпидемиологической Ассоциации, Монреаль, Канада, 2002; на конференции отдела вирусных гепатитов и клинической вирусологии Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН в 2003 году. В завершённом виде. диссертационная работа была доложена на конференции отдела вирусологии Института вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН в 2006 году.

ПУБЛИКАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.

По материалам диссертационной работы опубликовано 10 научных статей в рецензируемых журналах и 23 сообщения в сборниках тезисов научных симпозиумов и конференций.

ОБЪЁМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использовавшихся материалов и методов, 7 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы, состоящего из 181 работы отечественных и зарубежных авторов.

Диссертация изложена на 208 страницах машинописного текста, иллюстрирована 22 рисунками и 36 таблицами.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1.Матерналы и методы.

Были использованы следующие методы исследования:

моделирование консервативных иммунодоминантных, а также вариабельных типоспецифических эпитопов вирусных белков с помощью синтетических пептидов;

- тестирование серологического материала на маркёры гепатитов А, В, С и дельта;

- иммуноферментное исследование антигенной активности пептидов с помощью сывороток больных различными вирусными гепатитами;

- метод множественного пептидного исследования (Multiple Peptide Assay (Z.-X.Zhang et al„ 1995));

- исследование корреляции между спектром антител к различным вирусным белкам, представленным разными антигенными детерминантами и клинико-биохимическим вариантом течения HCV-инфекции на основе данных иммуноферментного анализа, общих клинических методик и биохимического анализа крови обследуемых больных;

- статистический анализ результатов проводился методом оценки доверительного коэффициента Стьюдента - t; различия признавались достоверными при р < 0,05.

Пептиды были синтезированы в лаборатории антигенных детерминант вирусных белков и пептидного синтеза Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН под руководством д.б.н. Ю. А.Семилетова.

В качестве антигенов при разработке диагностической тест-системы для выявления anti-HCV, а также при исследованиях сероконверсии антител у больных ОГС с различными исходами и спектра антител при разных вариантах течения хронической HCV-инфекции использовались синтетические пептиды core-16, NS4-20 и NS5-23, моделирующие иммунодоминантные участки core, NS4 и NS5 белков ВГС. Аминокислотные последовательности этих пептидов соответствуют нуклеотидной последовательности генома изолята HCV-J субтипа lb (N.Kato et al„ 1990), как это показано в таблице № 1.

При разработке диагностической тест-системы для выявления anti-HCV в состав антигенной композиции был также включён рекомбинантный полипептид, включающий первые 150 аминокислот нуклеокапсидного белка ВГС (Н.В.Петракова с соавт., 1997).

В процессе исследования спектра антител при разных вариантах течения хронической HCV-инфекции в качестве антигенов также были использованы рекомбинантные белки Соге-114 (а.о. 3-116) и NS4-86 (а.о. 16751760), использовавшиеся в коммерческой тест-системе "Гепаскан" для выявления анти-ВГС антител, которые были любезно предоставлены сотрудниками Института вирусных препаратов им. О.Г.Анджапаридзе РАМН ЛЛ.Сухановой и А.А.Гринёвым.

Таблица № 1.

Аминокислотные последовательности синтетических пептидов,

моделирующих иммунодоминантные участки core, NS4 и NS5 белков ВГС.

Пептид Аминокислотная последовательность Соответствующий фрагмент полипептида HCV

Core-16 tf-PQDVKFPGGGQIVGGV-Otf 19-34

NS4-20 //-AFASRGNI IVSPTilYVPESDA-Q// 1921-1940

NS5-23 tf-PPLLESWKDPDYVPPVVHGCPLP-0/7 2295-2317

При исследовании сероконверсии антителу больных ГС в качестве антигенов были также использованы геиноинженерные белки core, NS3, NS4, NS5 ВГС, и синтетические пептиды, соответствующие аминокислотным последовательностям соге-белка ВГС lb а.о. 1-18, 13-33, 61-87. Генноинженерный белок core ВГС — это рекомбинантный полипептид, включающий первые 150 аминокислот HCcAg (НВ.Петракова с соавт., 1997), NS3, NS4 и NS5 — рекомбинантные белки, используемые в диагностической тест-системе IV поколения фирмы «Диагностические системы» (Н.Новгород). Пептиды а.о. 1-18, а.о. 13-33 и а.о. 6187 были синтезированы старшим научным сотрудником лаборатории химии

вирусных нуклеиновых кислот и белков Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, к.х.н. М.Г.Исагулянц.

Для выявления типоспецифических апИ-НС1\Т54 антител у больных гепатитом С был синтезирован набор из 10 типоспецифических пептидов, моделирующих различные участки вариабельного региона №4А и N5413 белков ВГС, ограниченного аминокислотными остатками 1683 - 1732. Этот набор был использован для разработки мультипептидной иммуноферментной , тест-системы, позволяющей выявлять типоспецифические антитела к ВГС 1 типа (генотипы 1а и 1Ь), 2 типа (генотипы 2а и 2Ь) и 3 типа (генотип За). Аминокислотные последовательности синтезированных пептидов соответствовали субтипам 1а («Э.Ь.Отоо е1 а1., 1991), 1Ь (ККа1о е1 а1„ 1990), 2а (Н.Окато1о е1 а1., 1991), 2Ь (Н.ОкахпоЮ а а!., 1992) и За (Р^топск е1 а1., 1993). Каждый из субтипов был представлен двумя пептидами, условно обозначенными "N84 И" и "N84 С" (рис. 1).

1689 N 1707 1711 С 1732

1а «С.КРАШ'РКЕУЬУНЕЕПЕКШЁСЯОНЬРУГЕОСММЬАГОГКОКА

1683 N 1705 1711 С 1732

1Ь УСШ1Ь8СКРАУ1РР1гаУЬУОЕГРЕМЕЕСА8НЬРУ1ЕОСМОЬАЕОРКОКА

1683 N 1705 1711 С 1732

2а IGRLHVNORAWAPDKEVLYEAFDEMEECASRAALIEEGORIAEMLKSKL 1683 N 1705 1711 С .1732

2Ь 1СКЕ1ШЧРКУУУТРРКЕ1ЬУЕАЕРЕМБЕСА8КААГ.1ЕЕООКМАЕМ1Ж$К!, 1683 N 1705 1711 С 1732

За УСНГЕЬССКРАЬУРРЯЕУЕУ00УРЕМЕЕС50ААРУГЕ0А0У1АН0ЕКЕКУ

Рис. 1. Аминокислотные последовательности синтезированных пептидов (подчёркнуты), моделирующих И- и С-участки вариабельного региона N84А и №4В белков ВГС, ограниченного аминокислотными остатками 1683 -1732.

Синтез пептидов для серологического исследования иммунодоминантного участка нуклеокапсидного белка вируса гепатита дельта. На данном этапе работы было синтезировано 5 пептидов. Среди них полноразмерный пептид 65-80

(Gly-Glu-Gly-Ala-Pro-Pro-AIa-Lys-Arg-Ala-Arg-Thr-Asp-Gln-Met-GIu) и его укороченные фрагменты 69-80 и 71-80 соответствовали геномной последовательности, установленной K.S.Wang et al. (1986). 2 других пептида были синтезированы в соответствии с геномной последовательностью, установленной S.Makino et al. (1987), и имели аминокислотные последовательности 71-80+ (Ala-Lys-Lys-Leu-Arg-Met-Asp-Gln-Met-Glu) и 73-80+. Обе данные аминокислотные последовательности соответствуют I типу HDAg.

Исследование антигенных свойств пептидов, соответствующих фрагментам последовательности белка нуклеокапсида HDV различных генотипов. Аминокислотные последовательности выбранных пептидных фрагментов из области 65-80 HDAg соответствовали опубликованным нуклеотидным последовательностям генома HDV I (Y.C.Chao et al., 1990), II (F.Imazeki et al., 1991) и III (J.L.Casey et al., 1993) типов (рис. 2).

генотип I

генотип II

генотип III

65 71 80

GEGAPPAKRARTDRME

t t t с t с с с с t

t t t с t

с с с с t

ED . . .

h с с с t

с с с с t

t с с t t t t с с HDAg t cct tt t cc пептид

. . Р. . .Q . .

t t t t t t t s s HDAg tttttttcc пептид

. . Р. Q ET . . t t t t t h h h h HDAg t t tt t hhhh пептид

Рис. 2. Первичная и предполагаемая вторичная (P.Y.Chou, G.D.Fasman, 1978) структуры фрагментов 65-80 а.о. дельта-антигена, соответствующего I, II и III генотипам HDV. Жирным шрифтом выделен аминокислотный мотив, постоянный для всех известных вариантов последовательностей HDAg.

Вторичная структура изображена с помощью следующих обозначений: t - р-изгиб; с - неупорядоченный клубок; h - а-спираль; s - р-складчатая структура.

Разработка новых иммуноферментных тест-систем для диагностики гепатита D на основе синтетических пептидов. Были синтезированы пептиды (рис. 3), моделирующие фрагменты иммунодоминантной области а.о. 53-94 HDAg - - 53-68, 65-80, 53-80, 71-93, граничащего с ней участка а.о. 89-108, а также вариабельной С-концевой зоны а.о. 201-213. Пептиды 53-68, 65-80 и 201-213 были получены в трех вариантах, соответствующих 3 известным генотипам HDV. Пептиды а.о. 53-80, 71-93 и 89-108 соответствуют HDAg Italy 1 (K.S.Wang et al., 1986), последовательность которого сходна на этих участках с последовательностями молдавского, шведского и болгарского HDAg I типа.

53-68-1 NIKGILGKKDKDGEGA Moldavia 1 (Y.Y.Zhang etaL, 1996) 53-68-2 NILGIIR.KGKDGEGA Taiwan 3 (C.M.Lee et al., 1996) 53-68-3 NVVGLLRRK.KDEDGA Peru 1 (J.L.Casey et al., 1993) 65-80-1 GEGAPPAKRARTDRME Moldavia 1 (Y.Y.Zhang et al., 1996) 65-80-2 GEGAPPAKRPRTDQME Japan 1 (F.Imazeki et al., 1991) 65-80-3 EDGAPPAKRPRQETME Peru 1 (J.L.Casey et al., 1993) 201-213-1 PADPP.FSPQSCRP Moldavia 1 (Y.Y.Zhang et al., 1996) 201-213-2 PPQQR.LPLLECTP Taiwan 3 (C.M.Lee et al., 1996) 201-213-3 PPPPGQQWVPGCTQ Peru 1 (J.L.Casey et al., 1993) 53-80 NIKGILGKKDKDGEGAPPAKRARTDQME (K.S.Wang et al., 1986) 71-93 AKRARTDQMEVDSGPRKRPLRGG (K.S.Wang et al., 1986) 89-108 PLRGGFTDKERQDHRRRKAL (K.S.Wang et al., 1986)

Рис. 3. Аминокислотные последовательности синтезированных пептидных фрагментов HDAg. Точками отмечены делеции а.о. по отношению к последовательности HDAg Italy 1 (K.S.Wang et al., 1986). В пептидах 201-213 Cys2" присутствуют в виде их S-ацетамидометильных (Асш) производных.

Исследование особенностей взаимодействия антиген — антитело при использовании линейных синтетических пептидов и мультипептидного антигена, моделирующих антигенные детерминанты вируса гепатита А.

Пептиды, моделирующие антигенные детерминанты ВГА, были синтезированы старшим научным сотрудником лаб. антигенных детерминант и пептидного синтеза Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН к.б.н. Т.В.Фирсовой в Department of Peptide & Protein Chemistry, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Centro de Investigación y Desarrollo (CID-CSIC), Барселона, Испания. Был синтезирован диэпитопный тетрамер MAP -MAP4(VP3+VP 1) (рис. 4) с двумя ответвлениями каждой из двух аминокислотных последовательностей капсидных белков ВГА: VPl(ll-25) - TVSTEQNVPDPQVGI и VP3(110-121) - FWRGDLVFDFQV.

NHrTVSTEQNVPDPQVGI

\

К

/ \

NHj-FWRGDLVFDFQV \

\

К-А-ОН /

NHj-TVSTEQNVPDPQVGI /

\ / К /

NH2-FWRGDLVFDFQV

MAP4(VP1+VP3) NH2-TVSTEQNVPDPQVGI-0H VPl-15(a.o. 11-25)

NHj-FWRGDLVFDFQV-OH VP3-12(a.o. 110-121)

Рисунок 4. Химическая структура MAP4(VP1+VP3) и линейных пептидов VP1-15 и VP3-12.

В качестве антигенов использовались следующие пептиды и их смеси:

I - линейный пептид УР1(11-25);

II - линейный пептид УРЗ(110-121);

III - МАР4(УР1+УРЗ);

ГУ - комбинация пептидов 1+Н;

V - комбинация пептидов 1+И+Ш;

а также ПАУ Ag - культуральный антигеп ВГА, который был любезно предоставлен старшим научным сотрудником лаб. физиологии вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, к.м.н. А.Б.Быченко.

Серологическое исследование эпитопов белка N85 вируса гепатита С проводилось с двумя группами сывороток крови. Группа Д была сформирована из сывороток, охарактеризованных методом иммуноблотинга (1лаТек НСУ III, О^апоп Текшка), позволяющем выявлять антитела к отдельным белкам вируса гепатита С (ВГС). В состав данной группы вошли сыворотки с наличием апИ-НСУ - 45 образцов, в том числе с наличием антител к Ы55-белку ВГС по данным иммуноблотинга ЫаТек НСУ III, О^апоп Текшка - 15 образцов. В группу Д был также включен 21 апй-НСУ-негативный образец, охарактеризованный методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью коммерческой тест-системы "Гепастрип" и 20 ап^-НСУ-негативных образцов, находящихся в так называемой "серой зоне" по данным ИФА и дополнительно охарактеризованных методом иммуноблотинга.

Группа Е была сформирована из сывороток крови находившихся под нашим наблюдением пациентов с хронической НСУ-инфекцией (51 человек). Срок наблюдения составлял от 2 до 5 лет (ср. 3.5). Г1о клинико-биохимическим показателям, основным из которых являлась активность АЛТ (аланинаминотрансфераза), эти пациенты были разделены на 2 подгруппы. Подгруппу Е1 (п=27) составили лица с картиной клинико-биохимической ремиссии длительностью не менее 1 года (1-5 лет), что подтверждалось нормальными значениями АЛТ. Подгруппу Е2 (п=24) составили пациенты с клинико-биохимической картиной хронического вирусного гепатита С (стойкая или флюктуирующая активность АЛТ). Подгруппы Е1 и Е2 были сопоставимы, по полу, возрасту и длительности наблюдения.

Спектр антител к различным антигенам НСУ при различных вариантах течения хронической НСУ-инфекции. Пациенты. Спектр апП-ПСУ ^

в был исследован у 44 пациентов с хронической НСУ-инфекцией. По клинико-биохимическим показателям, основным из которых являлась активность АЛТ, пациенты были разделены на 2 группы. Группу К (п=25) составили пациенты с ПЛАТ (стойко нормальные показатели АлАТ) от 1 года до 5 лет. Группу Л (п=19) составили пациенты с клинико-биохимической картиной хронического гепатита С (стойкая или флюктуирующая активность АЛТ). Группы К (ПЛАТ) и Л (ХГС) были сопоставимы по полу, возрасту и среднему сроку наблюдения (3,1 и 3,6 года, соответственно). Пациенты, включённые в данное исследование, не были ВИЧ-инфицированными и не имели гепатитов иной этиологии.

Исследование сероконверсии антител у больных ГС с использованием синтетических пептидов, моделирующих иммунодоминантные антигенные детерминанты ВГС. Было обследовано 136 пациентов с желтушной формой острого ГС (ОГС). Больные обследовались в разные сроки с момента начала заболевания - от 1-10 дня желтухи до 6-ти и более месяцев; в том числе 25 человек наблюдались 6 и более месяцев. Пациенты, включённые в данное исследование, не были ВИЧ-инфицированными и не имели гепатитов иной этиологии.

: В исследование сероконверсии антител у больных ГС на основе моделирования антигенов ВГС с использованием синтетических пептидов и генноинженерных полипептидов было включено 20 пациентов с желтушной формой ОГС, при отсутствии тяжёлых соматических и психических заболеваний, а также онкологических и аутоиммунных патологий, иммунодефицитных состояний, и гепатитов иной этиологии. На основании клинико-биохимической картины и выявления РНК ВГС методом ПЦР в сыворотке крови в течение 12 месяцев от начала заболевания эти больные были разделены на 2 группы: у 14 (70 %) из 20 больных заболевание приняло хроническое течение, 6 (30 %) пациентов можно считать реконвалесцентами.

Разработанная для выявления типоспецифических аМ1-НСЫБ4 антител у больных гепатитом С тест-система была апробирована с набором из 42 сывороток от 26 больных хроническим гепатитом С (ХГС) (Москва), которые были отобраны методом случайной выборки и предварительно генотипированы методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров,

специфичных для различных генотипов ВГС. Данный набор сывороток был любезно предоставлен доцентами кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии МГМСУ, кандидатами медицинских наук О.О.Знойко и Е.А.Климовой. Набор был представлен 24 образцами (57%) с РНК ВГС генотипа За, 10 образцами (24%) - с генотипом вируса 1Ь, 3 образцами (7%) - с генотипом 1а, и 2 образцами (5%) от пациентов с коинфекцией 2а/с. 3 образца • были получены от больных ГС, у которых не удалось определить генотип ВГС методом ПЦР.

Серологический материал для исследования иммунодоминантного участка нуклеокапсидного белка вируса гепатита дельта был представлен образцами сывороток 5 больных острым ГД, в том числе 2 больных из города Уральска (Северо-Западный Казахстан - №№ 1583 и 1706), 2 больных из города Ставрополя (Северный Кавказ - №№ 38 и 87) и 1 больного из города Ош (Киргизия - № 66). Наличие анти-дельта антител в данных образцах было установлено ранее методом ИФА на основе антигена, полученного из гомогената печени больного

ГД.

Для дальнейшего исследования иммунодоминантного участка нуклеокапсидного белка вируса гепатита дельта с помощью пептидов, соответствующих аминокислотной последовательности НБУ различных генотипов в Москве и Н.Новгороде были собраны две группы сывороток (группы А и Б), охарактеризованные на присутствие HBsAg (тест-система фирмы "ИмБио", НПО "Диагностические системы", Нижний Новгород), а также специфических анти-дельта антител (тест-система на основе рекомбинантного НЭАд, НПО "Диагностические системы", Нижний Новгород). Сыворотки для проведения данного исследования были предоставлены сотр. Нижегородского Государственного Университета им. Н.И. Лобачевского В.К.Пименовым.

Группа А - 19 сывороток. Из них 17 были получены от больных ГД с неявно выраженной клинической симптоматикой. - Они содержали антитела, взаимодействовавшие с рекомбинантным 1ША£, по данным ИФА, проведённого с тест-системой НПО "Диагностические системы" (Нижний Новгород). По одной

сыворотке от доноров с диагнозом "гепатит А" и "гепатит В" использовалось в качестве отрицательного контроля.

Группа Б - 18 сывороток. Из них 16 были получены от больных ГД с явно выраженной клинической симптоматикой и содержали антитела, взаимодействовавшие с рекомбинантным HDAg (НПО "Диагностические системы", Нижний Новгород). По одной сыворотке от доноров с диагнозом "гепатит А" и "гепатит В" использовалось в качестве отрицательного контроля.

Сыворотки для исследования антигенных свойств синтезированных пептидных фрагментов HDAg в процессе разработки новых иммуноферментных тест-систем для диагностики гепатита D были собраны в Москве (две группы), и охарактеризованы на присутствие HBsAg, а также специфических антидельта антител (диагностикумы фирм НПК "Препарат", «Вектор» и НПО "Диагностические системы", Нижний Новгород"). Группа сывороток В состояла из образцов сывороток крови (п=43), полученных от пациентов с диагнозом "гепатит дельта". В группу Г были включены сыворотки от здоровых лиц без маркеров ГВ, ГС, ГД (п=49).

Особенности взаимодействия антиген — антитело при использовании линейных синтетических пептидов и мультипептидного антигена, моделирующих антигенные детерминанты вируса гепатита А были исследованы на 2 группах сывороток больных острыми вирусными гепатитами, собранных в Москве в 1995 и 1996 гг. Первая группа (М) состояла из 33 сывороток крови больных ГА, 26 сывороток больных ГВ и 22 сывороток больных ГС. Все 33 анти-ВГА позитивные сыворотки содержали anti-HAV Ig М, которые были выявлены как при использовании соответствующей коммерческой тест-системы (Hoffmann La Roche, Switzerland), так и при использовании лабораторной тест-системы, также выявляющей anti-HAV Ig М методом ИФА. Серологические маркёры ГВ и ГС выявлялись, соответственно, с помощью коммерческих диапюстикумов фирмы «Диагностические системы» (Нижний Новгород, Россия) и тест-системы «Гепаскац» фирмы «Биосервис» (Москва, Россия), Вторая группа сывороток (71 образец, группа Н) была исследована на наличие anti-HAV Ig М с помощью коммерческой тест-системы фирмы «Диа-Плюс» (Москва, Россия). Anti-HAV Ig М были выявлены в 17 сыворотках группы Н.

2. ИССЛЕДОВАНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА ПО ОТНОШЕНИЮ К АНТИГЕННЫМ ДЕТЕРМИНАНТАМ ВИРУСА ГЕПАТИТА С.

В результате проведённого исследования было установлено, что среди синтезированных пептидов, моделирующих фрагменты аминокислотной последовательности белка NS5A ВГС, наиболее перспективным с точки зрения « диагностики является пептид с аминокислотной последовательностью 22952317. Это позволило использовать данный пептид в качестве компонента разработанной на уровне лабораторного варианта тест-системы IV поколения для серологической диагностики гепатита С. Разработанная тест-система IV поколения имеет общие компоненты с разработанной ранее тест-системой II поколения — а именно рекомбинантный полипептид, включающий первые 150 аминокислот нуклеокапсидного белка ВГС, и один из двух синтетических пептидов, соответствующий иммунодоминантному участку аминокислотной последовательности NS4 белка ВГС, хотя условия сорбции были при этом изменены. В состав новой антигенной композиции дополнительно был также включён синтетический пептид, дублирующий иммунодоминантный участок нуклеокапсидного белка ВГС, но более короткий, чем рекомбинантный полипептид, также используемый. Подобное дублирование, характерное для тест-систем IV поколения, позволило увеличить чувствительность разработанной тест-системы.

До сих пор в научной литературе было довольно широко распространено мнение, согласно которому anti-NS4 класса G в острую фазу ГС отсутствуют (А.Ю.Афанасьев с соавт., 1995; И.В.Шахгильдян с соавт., 2003). Вопреки этому, при проведении сравнительного исследования спектра анти-ВГС антител у больных ОГС, ХГС и пациентов с постоянно нормальным уровнем АЛТ (ПНАТ), уже в первые 10 дней желтушного периода anti-NS4 класса G были выявлены у 59 % больных ОГС. При этом, хотя в первые 10 дней желтушного периода anti-core класса G выявляются достоверно чаще (73 %), чем anti-NS4 (59 %, р < 0,05) и anti-NS5 (46 %, р < 0,01), наиболее частым вариантом спектра антител уже в это время является одновременное присутствие anti-core, anti-NS4 и anti-NS5 класса G, также как и при ХГС. Однако, если в первые 10 дней желтушного периода этот

вариант спектра был выявлен у 32 % больных, то для ХГС одновременное присутствие вышеупомянутых антител всё же более характерно (85 %, р < 0,01).

Целью следующего этапа нашего исследования было изучение корреляции между наличием того или иного спектра антител к различным вирусным белкам, представленным различными же антигенными детерминантами и клинико-биохимическим вариантом течения хронической HCV-инфекции. В качестве антигенов были выбраны синтетические пептиды core-16, NS4-20 и NS5-23, моделирующие иммунодоминантные участки core, NS4 и NS5 белков и рекомбинантные белки соге-114 и NS4-86. Эти рекомбинантные белки, использовавшиеся в тест-системе "Гепаскан" для выявления анти-ВГС антител в сыворотке крови, были любезно предоставлены для этого исследования сотрудниками Института вирусных препаратов им. О.Г.Анджапаридзе ЛЛ.Сухановой и А.А.Гринёвым.

В результате проведённого исследования установлено, что отсутствие в сыворотке пациента с хронической HCV-инфекцией Ig G к какой-либо из антигенных детерминант неструктурных белков вируса, либо к обоим антигенным детерминантам core белка HCV, более характерно для состояния ПНАТ, чем для ХГС (соответственно, р < 0,05 и р < 0,01). Особенно выраженный характер данная закономерность имеет для пациентов, в сыворотке которых не содержится Ig G к обоим антигенным детерминантам NS4, а также при сочетании отсутствия Ig G к антигенным детерминантам соге-белка с отсутствием Ig G к какой-либо из антигенных детерминант неструктурных белков вируса (100 % таких пациентов принадлежали к группе с ПНАТ). Также установлено, что наличие в высоком титре anti-NS4 Ig G (р < 0,05), и особенно сочетание anti-NS4-20 и anti-core-16 Ig G в высоком титре (р < 0,01) более характерно для больных ХГС, чем для пациентов с ПНАТ.

В тоже время РНК HCV была выявлена методом ПЦР у 64 % пациентов с ПНАТ и у 58 % больных ХГС. Таким образом было установлено, что активность патологического процесса при хронической HCV-инфекции зависит в основном не от активности вирусной репликации, а от антивирусной активности иммунной системы. Антивирусная активность иммунной системы может при этом быть как эффективной, так и неэффективной в том, что касается подавления вирусной

репликации, но и в том, и в другом случае она оказывает прямое воздействие на активность патологического процесса.

Не более 6 мес. 12 мес. и более.

Рис. 5. Частота выявления anti-core, anti-NS4 и anti-NS5 Ig G у больных ОГС в первые 10 дней заболевания в зависимости от длительности внутривенного употребления наркотиков до начала заболевания.

Среди больных ОГС частота выявления anti-NS4 Ig G в первые 10 дней желтушного периода среди пациентов, употребляющих наркотики внутривенно не менее 1 года (п = 17), достоверно выше (р < 0,05) по сравнению с пациентами, начавшими употребление наркотиков в течение 6 месяцев, предшествующих началу заболевания (п = 34). Этот показатель составил соответственно 76 % и 47 % для этих групп больных (рис. 5). Данные клинического и биохимического обследования, а также частота выявления anti-core Ig G (71 % и 76 %, соответственно) и anti-NS5 Ig G (47 % и 44 %) не зависят от степени давности риска инфицирования. Выявленную закономерность можно объяснить более высокой вероятностью суперинфекции различными штаммами HCV пациентов, длительно употребляющих наркотики, которые могли перенести

первичную HCV-инфекцию в безжелтушном варианте. В принципе, полученные данные согласуются с данными Е.А.Васильевой (1995), предлагавшей учитывать высокий титр anti-NS4 Ig G как признак давнего инфицирования ВГС. Давнее инфицирование ВГС, как указывает Е.А.Васильева (1995), может иметь место и как фон при суперинфекции ВГС, и как ХГС после того, как ОГС был перенесён без клинической манифестации. Можно утверждать, что в случае нашего исследования выявленные закономерности связаны именно с суперинфекцией ВГС, так как больные были нами исследованы в первые 10 дней желтушного периода, обострения же ХГС, как правило, не сопровождаются желтухой.

Всё это совпадает с результатами наших дальнейших исследований (рис. 6, 7), которые показали, что уровень anti-NS4 Ig G при развитии заболевания нарастает наиболее быстрыми темпами, и, впоследствии, сохраняется наиболее длительно, в том числе и в случаях ремиссии и реконвалесценции. Были установлены различия в динамике гуморального иммунного ответа, в том числе и в острой фазе, в зависимости от дальнейшего развития заболевания. В качестве антигенов использовались синтетические пептиды core-16, NS4-20 и NS5-23, моделирующие иммунодоминантные участки core, NS4 и NS5 белков. Для больных ГС с последующей ремиссией (рис. 6) характерно быстрое нарастание титра anti-core класса G в течение первых 16 недель заболевания с последующим спадом вплоть до полного исчезновения антител к 52 неделе. Уровень anti-NS4 класса G также достигает значений, статистически достоверно (р < 0,01) превышающих уровень, характерный для первых двух недель желтушного периода, к 4-ому месяцу заболевания. Затем уровень anti-NS4 довольно быстро снижается, и к 9 месяцу заболевания оказывается статистически достоверно (р < 0,01) ниже своих максимальных значений, характерных для 4-го месяца. Уровень anti-NS5 класса G минимален, либо anti-NS5 отсутствуют.

Для больных ГС с последующей хронизацией (рис. 7) характерно менее быстрое нарастание титра anti-core класса G в первые 6 месяцев заболевания. Затем начинается стремительный рост титра антител, и к 13-ому месяцу заболевания уровень anti-core у больных ХГС оказывается, как правило, значительно выше, чем уровень anti-core больных с последующей ремиссией' на

■ АпЫ-НСсоге ДО Ат1-НСЫ$4ДО -Апи-НСН55 ДО

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55

Рис. 6. Сероконверсия анти-ВГС С у больных ОГС с последующей ремиссией. По осям ординат - величины оптической плотности; по осям абсцисс - недели заболевания.

■Апй-НСсоге ДО Апа-НСЫ54 ДО -Апи-НСт5 ДО

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55

Рис. 7. Сероконверсия анти-ВГС ^ О у больных ОГС с последующей хронизацией. По осям ординат - величины оптической плотности; по осям абсцисс - недели заболевания.

" АгШ-НСсоге ^М Ап11-НСЫ84 1ёМ - Ап11-НСЫ85 18М

1 4 7 10 13 16 19 22 25 2в 31 34 37 40 43 46 49 52 55

Рис. 8. Сероконверсия анти-ВГС ^Му больных ОГС с последующей ремиссией. По оси ординат - величины оптической плотности; по оси абсцисс - недели заболевания.

4

3,5 3 2,5 2 1,5 1

0,5 0

■ Апй-НСсоге ^М; АШ1-НСК84 1аМ -Апй-НСЫ85

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55

Рис. 9. Сероконверсия анти-ВГС ^ М у больных ОГС с последующей хронизацией. По оси ординат - величины оптической плотности; по оси абсцисс - недели заболевания.

4-ом месяце. Но уже слишком поздно. Запоздалый иммунный ответ не спасает, и высокие показатели гуморального иммунного ответа в этом случае служат всего лишь индикатором активности патологического процесса. Уровень anti-NS4 класса G у таких больных статистически достоверно (р<0,01) выше относительно первых двух недель уже на втором месяце заболевания и остаётся высоким в дальнейшем. Для больных с последующей хронизацией характерно постепенное нарастание уровня anti-NS5 класса G, который достигает значений, статистически достоверно (р < 0,05) более высоких, чем в первые две недели заболевания, к 6-му месяцу.

У больных ГС с последующей ремиссией (рис. 8) anti-core класса М были выявлены только в течение первого месяца заболевания. Anti-NS4 класса М у некоторых больных ГС с последующей ремиссией выявлялись до 6 месяца заболевания включительно. Тем не менее, снижение уровня anti-NS4 класса М относительно первых двух недель заболевания имеет статистически достоверный характер (р < 0,01) уже к 4-му месяцу. Anti-NS5 класса М не удалось выявить ни у одного из больных ГС с последующей ремиссией. У больных ГС с последующей хронизацией (рис. 9) anti-core класса М могут сохраняться в течение неопределённо длительного периода, исчезать и появляться вновь при обострении ХГС. Тоже самое можно сказать про anti-NS4 и anti-NS5 класса М.

Установленные различия в динамике гуморального иммунного ответа можно сформулировать в виде таблицы № 2. При этом необходимо иметь в виду, что ГС не является типичной инфекцией, а имеет ряд особенностей, которые характерны для медленных инфекций. Поэтому гуморальный иммунный ответ на ту или иную отдельно взятую антигенную детерминанту вируса у отдельно взятого больного может быть нетипичным для того или иного варианта развития заболевания. Поэтому для клинического прогноза имеет значение совокупность нескольких благоприятных или неблагоприятных признаков из перечисленных в таблице № 2, в которой приводятся особенности сероконверсии у больных ГС при типичном благоприятном и типичном неблагоприятном развитии заболевания на основании данных, полученных в ходе настоящего исследования.

30

Таблица №2.

Прогностическое значение особенностей сероконверсии у больных ГС.

Серологические Благоприятные Неблагоприятные

маркёры признаки признаки

Anti-core Ig М Отсутствие anti-core Ig M в Наличие anti-core Ig М в

сыворотке крови больного сыворотке крови больного

после первого месяца после первого месяца

заболевания. заболевания.

Anti-NS4 Ig М Отсутствие anti-NS4 Ig М Наличие anti-NS4 Ig М

после 6 месяца после 6 месяца

заболевания. заболевания.

Anti-NS5 Ig M Отсутствие anti-NS5 Ig М. Наличие anti-NS5 Ig М.

Anti-core Ig G Быстрое нарастание уровня Постепенное нарастание

anti-core Ig G в течение уровня anti-core Ig G

первых месяцев заболевания с в течение первых

достижением 6 месяцев заболевания, с

максимального показателя последующим

к 4 месяцу заболевания и стремительным ростом

последующим спадом уровня anti-core Ig G и их

вплоть до наличием

полного исчезновения в дальнейшем.

антител

к 13 месяцу заболевания.

Anti-NS4 Ig G Достижение максимального Сохранение высокого

уровня anti-NS4 Ig G уровня anti-NS4 Ig G

к 4 месяцу заболевания со и после 6 месяца

снижением заболевания.

после 6 месяца.

Anti-NS5 Ig G Минимальный уровень Невысокий уровень

anti-NS5 Ig G, особенно anti-NS5 Ig G

после первого месяца или их отсутствие

заболевания, в первые месяцы

или их отсутствие. заболевания

с постепенным ростом

уровня к 6 - 9 месяцу.

Необходимо также иметь в виду то, что когда мы говорим об anti-HCcore, anti-HCNS4, anti-HCNS5, речь не идёт о суммарном гуморальном иммунном ответе ко всем антигенным детерминантам вирусных белков core, NS4, NS5. Данные литературы и наших собственных исследований свидетельствуют о том, что для оценки гуморального иммунного ответа на тот или иной вирусный белок может иметь некоторое значение, какие именно антигенные детерминанты данного белка для этого используются (О.В.Масалова с соавт., 2000; И.В.Круглов с соавт., 2002). В настоящем исследовании нами были использованы наиболее значимые с точки зрения поставленной задачи антигенные детерминанты вирусных белков, выявленные в процессе исследования. Актуальность такого подхода оказалась особенно значимой для установленных нами, в процессе настоящего исследования, закономерностей сероконверсии anti-NS4 Ig G. В результате, вопреки довольно широко распространённому в научной литературе мнению, согласно которому anti-NS4 Ig G в острую фазу ГС отсутствуют (А.Ю.Афанасьев с соавт., 1995; И.В.Шахгильдян с соавт., 2003), нами были установлены иные закономерности сероконверсии anti-NS4 Ig G, согласно которым у больных ОГС уровень anti-NS4 Ig G нарастает весьма быстрыми темпами.Было проведено сравнение данных, полученных при исследовании сероконверсии антител у больных ГС с использованием синтетических пептидов, моделирующих иммунодоминантные антигенные детерминанты ВГС (обобщены в таблице № 2), с результатами, полученными при использовании более протяжённых синтетических пептидов и генноинжеперных полипептидов. При использовании последних, anti-core Ig М выявляются в сыворотоках крови в том числе и пациентов с предполагаемой реконвалесценцией, как в первые 10 дней, так и на 4-ом месяце с начала заболевания. Поэтому можно утверждать, что среди спектра anti-HCcore Ig М для клинического прогноза наибольшее значение имеют anti-HCcore-16 Ig М, взаимодействующие с синтетическим пептидом соге-16, которые не удалось выявить в сыворотках крови больных после первого месяца заболевания в тех случаях, когда исход заболевания был благоприятным (табл. № 2).

Что касается anti-core Ig G, то можно говорить о сходных закономерностях сероконверсии, выявленных как при использовании синтетического пептида core-

16, так и при использовании более протяжённых синтетических пептидов и генноинженерного НСсА£. Также как и при сероконверсии агЛ1-НСсоге-16 ^ О, у больных ГС с предполагаемой реконвалесценцией уровень ^ О, взаимодействующих с генноинженерным HCcAg, к 4 месяцу заболевания достоверно выше, чем у больных ГС с последующим развитием: хронического гепатита. Тоже самое можно сказать относительно апй-НСсоге 13-33 1§ О.

В. случае апЦ-Ы55 ^ О имеет место обратная тенденция, и тенденция эта также статистически достоверна (р<0,01) в том, что касается уровня апи-Ы85 Jg в на 4-ом месяце заболевания у больных с последующей хронизацией. Выявленные при использовании . генноинженерного антигена N85 закономерности сероконверсии позволяют считать ап(л-Ы85 ^ О прогностическим маркёром хронизации заболевания. Если же сравнить полученные данные с результатами предыдущего исследования, то можно сказать, что выявленная тенденция характерна также и для ап11-№5-23 в (табл. № 2), но для них она была выявлена в более поздний срок - начиная с 6-го месяца заболевания.

Можно говорить о сходных тенденциях в сероконверсии апй-]М54 I» О в первые 4 месяца заболевания, выявленных как при использовании синтетического пептида N54-20, так и при использовании генноинженерного N84.

Сероконверсия апй-№3 1§ О исследовалась только с использованием соответствующего генноинженерного полипептида. При этом по уровню апй-ЫвЗ 1§ в и апй-ЫЗЗ ^ М, не было выявлено статистически достоверных различий между двумя группами больных с различными исходами заболевания. Поэтому в данном случае можно говорить о значении этого антигена для диагностики в тех тест-системах, в которых он используется, но не для прогнозирования исходов заболевания.

Генотипирование вируса гепатита С в настоящее время проводится с использованием полимеразной цепной реакции. Высокая себестоимость и относительная сложность этого метода не позволяют достаточно широко применять его в практическом здравоохранении. Типирование апй-НСУ более дешёвым методом иммуноферментного анализа позволяет решить эту проблему. Кроме того, данные ИФА позволяют идентифицировать тип ВГС в том числе и в

тех случаях, когда вирус отсутствует в сыворотке крови или лейкоцитарной фракции.

На основе типоспецифических пептидов, моделирующих N- и С-участки вариабельного региона с аминокислотной последовательностью 1683 - 1732 а.о. NS4A и NS4B белков вируса гепатита С, была разработана модификация метода ИФА для выявления типоспецифических антител у больных гепатитом С. С помощью разработанной тест-системы для типирования anti-HCV, в 85% генотипированных сывороток крови московских больных ХГС были обнаружены типоспецифические антитела, соответствующие генотипам,

идентифицированным методом ПЦР. В 3 образцах (8%), полученных от больного с генотипом вируса За по данным ПЦР, были выявлены антитела 1 типа. Так как ПЦР проводилась только с первичной сывороткой данного больного, а типоспецифические антитела были выявлены в каждой из трёх сывороток, с высокими значениями оптической плотности по данным ИФА и отсутствием выраженного перекрёстного реагирования с пептидами других типов, расхождение данных ПЦР и ИФА в случае этого больного мы объясняем технической ошибкой при проведении ПЦР. Также были серотипированы все 3 образца, которые не удалось генотипировать методом ПЦР. Среди них был выявлен 1 серопозитивный образец 1 типа и 2 серопозитивных образца 3 типа. В 3 (8%) из 39 генотипированных образцов выявить типоспецифические антитела не удалось. При этом в одном из этих трёх случаев (сыворотка 06СЗ) выявить типоспецифические антитела удалось в последующей сыворотке (0611), полученной от этого же больного. Только у одного пациента типоспецифические антитела выявить не удалось ни в первичной, ни в последующей сыворотке (сыворотки 06С1, 0617). Таким образом, генотипирование сывороток методом ПЦР было эффективным в 88 % (23/26) случаев, в то время как серотипированис методом ИФА — в 93 % (39/42). Этот показатель сопоставим с эффективностью серотипирования по данным российских и зарубежных источников (88,4% -И.А.Созина (1999), 89% - Zhu-Xu Zhang et al. (1995)). Эффективность же типирования сывороток пациентов при комплексном применении методов ПЦР и ИФА в нашем исследовании составила 100%.

Таким образом, ПЦР и ИФА можно считать взаимодополняющими методами, особенно с учётом того, что данные ИФА позволяют идентифицировать тип ВГС в том числе и в тех случаях, когда вирус отсутствует в сыворотке крови или лейкоцитарной фракции, не прибегая при этом к пункционной биопсии печени.

С помощью разработанной тест-системы было проведено исследование по выявлению типоспецифических антител в сыворотках крови больных ХГС из Белоруссии (Витебск). Группа больных ХГС была собрана в Витебске методом "' случайной выборки, также как и группа больных ХГС в Москве. Однако, витебская и московская группа больных оказались при этом неоднородными по возрастному составу. Это явилось следствием различий в эпидемическом процессе ГС в Москве и Витебске. В Москве в 1995-99 годы по данным Н.В.Садиковой (2001) заражение ГС в результате внутривенного введения наркотических препаратов происходило в 48,9 % случаев и только в 7,2 % в лечебно-профилактических учреждениях. Если же интерпретировать данные вышеупомянутого автора за вычетом случаев ГС с не установленным путём передачи (которые, в свою очередь, с высокой степенью вероятности являются заражением в результате парентерального введения наркотиков и половых контактов), то мы получим долю передачи ВГС в Москве в эти годы за счёт внутривенного введения наркотиков с нарушением стерильности среди случаев с известным путём заражения 60 %. В тоже время в Белоруссии внутривенное введение наркотиков не играло значительной роли в передаче ВГС. Более значительную роль в передаче вируса в Белоруссии продолжал играть такой путь, как заражение при переливании крови и препаратов на основе донорской крови, что связано с недостаточно высокой чувствительностью используемых тест-систем. В тоже время сдерживающим фактором для данного, основного пути передачи вируса в Белоруссии, является недостаточное финансирование "донорства и, как следствие, частое использование в качестве доноров родственников реципиента. В результате уровень заболеваемости ГС в городе Витебске в 1996 — 2000 гг. был значительно ниже уровня заболеваемости в Москве. Различия эпидемического процесса обусловливают, в свою очередь, различную возрастную структуру больных ГС в Москве и в Витебске, что и

отразилось на возрастном составе витебской и московской групп больных ХГС, собранных методом случайной выборки.

Среди витебских больных ХГС типоспецифические антитела 1 типа были выявлены у 81 % серотипопозитивпых больных, антитела 2 типа - у 2 %, и антитела 3 типа — у 29 %. Эти данные были сопоставлены с данными, полученными в ходе описшшого выше исследования московских больных ХГС, согласно которым антитела 1 типа были выявлены у 44% серотипопозитивных больных, антитела 2 типа — у 4%, антитела 3 типа — у 52 %. В результате было установлено статистически достоверное различие (р < 0,01) частоты выявления апй-НСУ 1 типа в Москве и Витебске. Что касается апй-НСУ 3 типа, то хотя с учётом выявленных в Витебске случаев микст-инфекции разными типами вируса (9 %) различие не является достоверным (р > 0,05), однако можно говорить о тенденции к различию (I = 1,86). Таким образом, в результате проведённого нами исследования с помощью разработанной тест-системы для серотипирования, было установлено различие в циркуляции ВГС в Москве и Витебске в 1999 году (период сбора серологического материала). Это различие заключается в том, что ведущая роль в инфицировании больных ХГС в Витебске в этот период принадлежала ВГС 1 типа (81% апй-НСУ-1 позитивных при 29% апИ-НСУ-З позитивных, р < 0,01), в то время как в Москве ведущая роль в инфицировании больных ХГС принадлежала ВГС как 1, так и 3 типа, с незначительным доминированием последнего (44% апй-НСУ-1 позитивных при 52% апи-НСУ-З позитивных, р > 0,05). На основании полученных данных был сделан вывод о том, что в 1998 году в Москве, и, вероятно - в других крупных российских городах уже начался процесс увеличения доли генотипа За ВГС среди циркулирующих генотипов вируса за счёт проникновения ВГС За генотипа в среду внутривенных наркоманов нового, молодого поколения и быстрого распространения вируса в этой среде. В то время процесс этот, также как и процесс распространения внутривенного употребления наркотиков, по видимому ещё не успел с той же степенью интенсивности охватить менее крупные российские города и города стран СНГ. В результате нам удалось в 1999 году выявить это различие на примере Москвы и Витебска.

3. ИССЛЕДОВАНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА ПО ОТНОШЕНИЮ К АНТИГЕННЫМ ДЕТЕРМИНАНТАМ ВИРУСА ГЕПАТИТА О.

! : Методом ИФА было исследовано влияние изменения длины пептидной цепи ' и замен отдельных аминокислот на взаимодействие пептидов, соответствующих участку 65-80, с антителами сывороток больных гепатитом дельта из различных регионов СНГ. В результате проведённого исследования установлена диагностическая ценность пептида 65-80 а.о. При этом полученные результаты позволили сделать предположение о наличии не одного, а нескольких ЙМмунодоминантных эпитопов, в том числе и нелинейной антигенной детерминанты между 65 и 80 а.о. Это предположение основано на •взаимодействии пептидов 71-80 (К.8.\Уап§ ег а1., 1986) и 71-80+ (Б.Макто ег а1., 1987), отличающихся 3 аминокислотными остатками, с одними и теми же антидельта позитивными сыворотками. Это указывает на то, что антигенная детерминанта на этом участке является нелинейной, т.е. детерминантой, в последовательности которой не все аминокислотные остатки важны для ' специфического взаимодействия с антителами, и возможна замена отдельных аминокислотных остатков другими, близкими по свойствам и строению, с полным или частичным сохранением антигенных свойств.

Эти результаты, полученные в ходе предварительного исследования с использованием ограниченного количества апй-НЕ)А§ позитивных сывороток были подтверждены результатами дальнейшего исследования антигенных свойств пептидов, соответствующих фрагментам последовательности белка нуклеокапсида различных генотипов НОУ с большим количеством серологического материала.

С одной стороны, результаты ИФА показали, что полноразмерные пептиды, соответствующие а.о. 65-80, реагировали с большим количеством исследованных серологических образцов группы больных ГО с явно выраженными клиническими симптомами (группа Б), чем "укороченные" варианты 71-80. Эта зависимость, очевидно, обусловлена удалением а.о. из антигенно-активного участка. С другой стороны, в одной из опубликованных ранее работ было установлено, что пептидный фрагмент 61-71 не обладает

существенной антигенной активностью (Ю.А.Семилетов с соавт., 1992). Сопоставление этого факта с полученными нами данными о снижении антигенной активности пептида 65-80 при удалении шести N-концевых а.о., позволяет нам утверждать, что хотя фрагмент 65-71 и не является самостоятельным эпитопом, но содержит аминокислотные остатки, имеющие существенное значение при формировании эпитопа на участке 65-80 а.о.

Пептиды 65-80, соответствующие последовательности HDAg I, II и III типов, прореагировали соответственно с 75, 87.5 и 50% сывороток больных TD с явно выраженными клиническими симптомами, то есть аминокислотные замены в последовательности фрагмента 65-80, характерные для различных генотипов HDV, не являются решающими для полного исключения взаимодействия пептида определённого типа с антителами к HDAg других типов, хотя и влияют на уровень этого взаимодействия. Применять пептидные фрагменты 65-80 а.о. для типирования серологического материала в случае отдельно взятого конкретного больного, таким образом, было бы нецелесообразно, но данные, полученные на группе образцов, позволяют охарактеризовать распространенный на территории Центральной России вариант HDV как близкий I генотипу: интенсивность сигнала в ИФА для пептидов, соответствующих I генотипу вируса, в большинстве случаев преобладала над теми же величинами в случае пептидов, соответствующих HDV других генотипов. Также были получены данные, указывающие на возможность циркуляции на территории России новых, гибридных штаммов HDV, с мозаичной структурой HDAg, отдельные участки которого соответствуют или близки последовательностям различных типов. В сыворотке одного из нижегородских больных нами были выявлены антитела, взаимодействующие с пептидами 65-80 и 71-80 HDAg III типа, но не с пептидами, соответствующими аналогичным аминокислотным последовательностям HDAg двух других типов. В.К.Пименов и соавт. (2001), на основании полученных ими данных при проведении аналогичного исследования в Нижнем Новгороде, утверждают, что антигенная структура С-концевого фрагмента HDAg (201-213 а.о.) в 10 % случаев была близка структуре HDAg III типа. В связи с этим представляет интерес обратиться к нашим данным, полученным при исследовании сыворотки больного 3 из группы московских больных ГТ) (группа

В), иммуноферментная реакция с которой на anti-delta Ig G дала слабопозитивный результатг с пептидом 201-213 П1 . типа, и только с ним. Однако иммуноферментная реакция с этой же сывороткой на anti-delta Ig М имела более выраженный характер с пептидом 53-80, соответствовавшим I типу, что позволяет полагать результат, полученный с пептидом 201-213 III типа либо соответствующим нижегородским данным, либо не вполне специфическим. К сожалению, нижегородские исследователи не проводили исследования серологического материала на anti-delta IgM, что не позволяет в полной мере сопоставить наши данные, полученные при исследовании серологического материала московских больных ID, и их данные. Однако, при исследовании того нижегородского материала, которым располагали мы, в сыворотке одного из нижегородских больных нами были выявлены anti-delta Ig G, взаимодействующие с пептидами 65-80 и 71-80 HDAg III типа, но не с пептидами, соответствующими аналогичным аминокислотным последовательностям HDAg двух других типов. При этом реакция антиген-антитело была достаточно выраженной и превышала уровень cut off более чем в 3,5 раза. Это позволяет полагать, что мы действительно имеем дело с проявлениями циркуляции на территории России гибридных штаммов HDV с мозаичной структурой HDAg, отдельные участки которого соответствуют или близки последовательностям различных типов. Для возникновения таких штаммов необходима определённая вероятность заражения различными типами ВГТ).

Полученные косвенные данные о возможности циркуляции вируса с мозаичной структурой HDAg совпадают с данными J.-C. Wu et al. (1998), обнаружившими на Тайване BID с последовательностью HDAg, сходной с HDAg II типа по обоим концевым фрагментам и с HDAg I типа в центральной части аминокислотной последовательности (субтип ИВ).

■ В результате проведённого нами исследования установлена диагностическая ценность синтетических пептидов, соответствующих иммунодоминантному участку нуклеокапсидного белка HDV, и на основе этих пептидов были разработаны иммуноферментные тест-системы для выявления anti-delta Ig G и Ig М в сыворотках крови (табл. № 3).

Тест-система для выявления Ig G к вирусу гепатита дельта была разработана на основе пептида а.о. 53-80.

Тест-система для выявления антител класса Ig М к вирусу гепатита дельта была разработана на основе пептида а.о. 65-80 I типа. Полученные данные позволяют использовать тест на основе пептида 65-80 I типа в качестве основного теста на anti-delta Ig М, а тест-систему на основе смеси 4 пептидов а.о. 53-80, 5368 и 65-80 I типа, а также 65-80 II типа — в качестве подтверждающего, и направлять на него сыворотки, OD по результатам реакции с которыми в основном тесте составит от 70 % до 100 % уровня cut off (т.н. «серая зона»). Всего

Таблица № 3.

Взаимодействие пептидов, моделирующих фрагменты дельта-антигена, с

анти-дельта классов Ig G и Ig М сывороток крови больных ГТ) (группа сывороток В).

Генотип Последовательность а.о. Количество сывороток больных TD Из них позитивных

G М

N % N %

I 53-68 43 9 21 12 28

II 53-68 43 7 16 18 42

III 53-68 43 2 5 1 2

I 65-80 43 25 58 32 74

65-80 43 35 81 23 53

III 65-80 43 21 49 8 9

I 201-213 43 7 16 6 14

II 201-213 43 0 0 16 37

III 201-213 43 1 2 1 2

I 53-80 43 40 93 19 44

I 71-93 43 26 60 4 9

89-108 43 16 37 1 2

Тест-система для выявления anti-delta Ig М 53-801, 53-68 I, ' 65-801, 65-80 II 43 30 70

N %

При применении разработанных тест-систем выявлено анти-дельта б и ^ М позитивных всего: 43 43 100

такой комбинированный подход позволил выявить anti-delta Ig М в 88 % исследованных сывороток больных гепатитом дельта, в том числе у 9 больных (21 %), в сыворотках которых anti-delta Ig М с помощью соответствующих тест-систем фирм «Вектор» и «НПК Препарат» выявить не удалось. В тоже время, все anti-delta Ig М позитивные сыворотки, выявленные с помощью данных тест-систем, были также выявлены и при применении разработанной нами комплексной диагностики.

Всего разработанные иммуноферментные тест-системы позволили выявить маркёры дельта-инфекции у 100% обследованных больных TD.

4. ИССЛЕДОВАНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АНТИГЕН -АНТИТЕЛО ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ЛИНЕЙНЫХ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ И МУЛЬТИПЕПТИДНОГО АНТИГЕНА, МОДЕЛИРУЮЩИХ АНТИГЕННЫЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ ВИРУСА ГЕПАТИТА А.

В результате проведения ИФА с группой сывороток М было установлено, что наиболее эффективными антигенами, с точки зрения скрининга anti-HAV-IgM позитивных сывороток, среди синтезированных пептидов являются MAP4(VP1+VP3) и комбинация линейных пептидов VP1 и VP3. При этом надо учитывать, что МАР4, в отличие от комбинации линейных пептидов (IV), не давал ложнопозитивных результатов.

Дополнительно проводился сравнительный анализ антигенной активности MAP4(VP1+VP3) и двух пептидных комбинаций при тестировании anti-HAV-IgM-позитивных и anti-HAV-IgM-негативных сывороток (группа Н). Вопреки ожидаемым результатам, комбинация всех трёх пептидов (V) продемонстрировала меньшую антигенную активность по сравнению с MAP4(VP1+VP3) и комбинацией линейных пептидов VP1 и VP3 в обоих постановках.

Специфичность реакции антиген-антитело была подтверждена методом конкурентного ИФА. •

На основании полученных результатов можно утверждать, что не только связь линейных аминокислотных последовательностей в одну молекулу (MAP), но также и их простая комбинация приводит к появлению новых

иммунохимических свойств на уровне взаимодействия антиген - антитело. Это также подтверждают результаты конкурентного ИФА. Например, взаимодействие комбинации всех трёх пептидов (V) с anti-HAV Ig М в наибольшей степени ингибировалось аналогичной комбинацией (V), в то время как MAP и комбинация линейных пептидов, взятые по отдельности, продемонстрировали меньший ингибирующий эффект.

Таким образом, комбинация антигенов, адсорбированных на полистироловой поверхности, может рассматриваться как отдельный антиген со своими собственными антигенными свойствами, которые нетождественны сумме свойств его составляющих. Этот факт взаимного влияния пептидов вероятно можно объяснить некоторым изменением конформации линейных структур, которое приводит к экспозиции новых групп, взаимодействующих с антителами.

При проведении исследования было установлено, что в общей сложности не менее чем в 12 % сывороток больных ГА анти-ВГА класса М были выявлены только при условии использования гетерогенного тетрамерного мультипептидного антигена. Для взаимодействия по крайней мере части anti-HAV Ig М с антигенами ВГА необходима определённая конформация линейных структур этих антигенов. Использование MAP4(VP1+VP3) для этой цели более эффективно, чем использование комбинации его составляющих - линейных пептидов VP1 и VP3, взятых по отдельности, или его комбинации с его составляющими.

Результаты настоящего исследования позволяют утверждать, что при разработке новых тест-систем для выявления анти-ВГА класса М на основе синтетических пептидов, использование гетерогенных мультипептидных антигенов, в том числе содержащих VP1 (11-25) и VP3 (110-121), целесообразно.

ВЫВОДЫ:

1. Разработана оптимальная антигенная композиция для диагностики гепатита С методом иммуноферментного анализа на основе использования рекомбинантного HCcAg, синтетического пептида а.о. 19-34, дублирующего иммунодоминантный участок HCcAg, и синтетических пептидов с

аминокислотной последовательностью 1921-1940 а.о. NS4B белка вируса ГС и 2295-2317 а.о. белка NS5A ВГС.

2. Впервые установлено, что сероконверсия anti-NS4 Ig G имеет место во время острой фазы заболевания ГС, в том числе - уже в первые 10 дней желтушного периода. Anti-core класса G выявляются в первые 10 дней желтушного периода достоверно чаще (73 %), чем anti-NS4 (59 %) и anti-NS5 (46 %), но наиболее частым вариантом спектра антител уже в это время является одновременное присутствие anti-core, anti-NS4 и anti-NS5 класса G, также как и при хроническом ГС. Однако, если в первые 10 дней желтушного периода этот вариант спектра был выявлен у 32 % больных, то при ХГС одновременное присутствие вышеупомянутых антител выявляется достоверно чаще (85 %).

3. Впервые установлена корреляция между частотой выявления anti-NS4 Ig G в первые 10 дней желтушного периода острого ГС и степенью риска давнего инфицирования ВГС. Частота выявления anti-NS4 Ig G в первые 10 дней желтушного периода острого ГС достоверно выше среди пациентов, употребляющих наркотики внутривенно 1 год и более (по сравнению с пациентами, начавшими внутривенное употребление наркотиков в течение 6 месяцев, предшествующих началу заболевания).

4. Установлены различия в динамике гуморального иммунного ответа в зависимости от дальнейшего развития патологического процесса, в том числе и в острой фазе заболевания. Полученные данные представляют интерес с точки зрения их прогностического значения.

5. Установлено, что при хронической ВГС-инфекции активность патологического процесса зависит в основном не от активности вирусной репликации, а от антивирусной активности иммунной системы.

6. Разработана модификация метода ИФА для выявления типоспецифических антител у больных гепатитом С на основе синтетических пептидов, моделирующих N- и С-участки вариабельного региона с аминокислотной последовательностью 1683 - 1732 а.о. NS4A и NS4B белков вируса гепатита С.

7. В результате исследования по выявлению типоспецифических anti-HCNS4 антител у больных гепатитом С, проведённого с помощью разработанной тест-системы, было установлено достоверное различие в циркуляции ВГС различных

типов в Москве и Белоруссии (Витебск). Это различие заключается в том, что ведущая роль в инфицировании больных ХГС в Витебске принадлежала ВГС I типа (81 % анти-ВГС-1 позитивных при 29 % анти-ВГС-3 позитивных), в то время как в Москве ведущая роль в инфицировании больных ХГС принадлежала ВГС как 1, так и 3 типа, с незначительным доминированием последнего (44 % анти-ВГС-1 позитивных при 52 % анти-ВГС-3 позитивных).

8. Установлено, что антигенная структура иммунодоминантного региона а.о. 65-80 белка нуклеокапсида ВГБ, наиболее широко распространенного на территории Центральной России среди больных гепатитом дельта, соответствует генотипу BID I.

9. Установлена диагностическая ценность синтетических пептидов, соответствующих иммунодоминантному участку нуьслеокапсидного белка ВГТЭ, и на основе этих пептидов разработан вариант иммуноферментного анализа для выявления анти-дельта классов Ig G и Ig М в сыворотках крови, позволяющий выявлять маркёры дельта-инфекции у 100% обследованных больных ГО.

10. Показано, что при разработке новых тест-систем для выявления anti-HAV Ig М на основе синтетических пептидов целесообразно использование в том числе гетерогенных мультипептидных антигенов, содержащих а.о. 11-25 VP1 и а.о. 110-121 VP3.

Считаю приятным долгом выразить свою благодарность моим научным консультантам - доктору медицинских наук Н.В.Дорошенко и доктору биологических наук | Ю.А.Семилетову"|, глубокоуважаемым оппонентам и рецензентам, дирекции Института вирусных препаратов им. О.Г.Анджапаридзе РАМН и дирекции Института вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН, учёному секретарю диссертационного совета Института вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН, кандидату биологических наук И.В.Яковлевой, заведующей отделом научно-медицинской информации Института вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН, кандидату медицинских наук М.С.Бектемировой, заведующему отделом клинической вирусологии и вирусных гепатитов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, профессору,

доктору медицинских наук, заслуженному врачу Российской Федерации С.Г.Чешику, заведующей лабораторией диагностики вирусных инфекций Института вирусологии, профессору, доктору медицинских наук

B.М.Стахановой, заведующему лабораторией хронических вирусных инфекций Института . вакцин и сывороток, профессору, доктору медицинских наук

C.Н.Кузину, заведующему лабораторией химии вирусных нуклеиновых кислот и белков Института вирусологии, профессору, доктору химических наук В.Д.Смирнову, доктору биологических наук Н.А.Селиванову, главному врачу 1-ой клинической инфекционной больницы города Москвы, профессору, доктору медицинских наук, заслуженному врачу Российской Федерации Н.А.Малышеву, доценту кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии МГМСУ, кандидату медицинских наук О.О.Знойко, кандидату медицинских наук Е.В.Воропаеву, всем сотрудникам Института вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН, сотрудникам лаборатории антигенных детерминант, лаборатории нуклеиновых кислот и белков, сотрудникам клинического отдела Института вирусологии и 1-ой клинической инфекционной больницы города Москвы, а также кафедры инфекционных болезней МГМСУ и Витебского филиала НИКИ радиационной медицины и эндокринологии, имевшим отношение к выполнению данной работы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Ю.А.Семилетов, И.В.Круглов, В.А.Карпова и др. "Сравнительное исследование диагностической ценности пептидов, соответствующих различным геномным последовательностям ВГД." "Мол. генетика, микробиология и вирусология", 1993, № 4, стр. 34-36.

2. Т.В.Фирсова, И.В.Круглов, О.О.Знойко и др. "Синтез гетерогенного мультивалентного антигена МАР4 (VP1+VP3) вируса гепатита А и перспективы нового метода диагностики." Материалы Фальк симпозиума № 92 "Новые направления в гепатологии". Санкт-Петербург, Россия, Июнь 21-22, 1996, стр. 393.

3. T.Firsova, J.A.Perez, I.V.Kruglov et al "Synthesis of a diepitope multiple antigen peptide containing sequences from VP1 and VP3 proteins of hepatitis A virus

and its use in hepatitis A diagnosis." Theses of 24th symposium of the European Peptide Society, Edinburgh, Great Britain, 1996, p. 104.

4. T.Firsova, J.Perez, F.Righ, I.Kruglov, I.Haro."Synthesis of a diepitope multiple antigen peptide containing sequences from VP1 and VP3 proteins of hepatitis A virus and its use in hepatitis A diagnosis." "Peptides", 1996, N133. R.Ramage and R.Epton (Eds.) EPS, p. 383-384.

5. Dementyeva E.V., Kruglov I.V., Pimenov V.K., Novikov V.V. "Development of the new approaches to diagnostic and serotyping of delta-infection by usage of synthetic peptides." Fifth International conference "AIDS, cancer and related problems." St. Petersburg, May 25-30, 1997, p. 245-246.

6. Ogienko O.L., Znoyko O.O., Kruglov I.V. et al. "Dynamic study of antibodies to immunodominant region of NS4 HCV protein." Fifth International conference "AIDS, cancer and related problems." St. Petersburg, May 25-30, 1997, p. 247.

7. Е.В.Дементьева, И.В.Круглов, В.К.Пименов, Ю.А.Семилетов. "Сравнительное исследование антигенной активности пептидов нуклеокапсидного белка вируса гепатита дельта, соответствующих трём генотипам." Материалы II Российской научно-практической конференции "Гепатиты B,C,D и G - проблемы диагностики, лечения и профилактики", Москва, октябрь 1997, стр. 62-63.

8. О.О.Знойко, О.Л.Огиенко, И.В.Круглов и др. "Клинико-биохимическая картина острой и хронической HCV-инфекции и её связь с наличием антител к различным антигенным детерминантам вируса гепатита С". Материалы II Российской научно-практической конференции "Гепатиты В, С, D и G - проблемы диагностики, лечения и профилактики", Москва, октябрь 1997, стр. 81.

9. ЮЛ.Семилетов, Т.В.Фирсова, И.В.Круглов и др. "Использование синтетических пептидов как дополнительных антигенов для выявления антител к вирусу гепатита С"."Вопросы вирусологии", 1998, № 3, стр. 107-109.

10. Е.В.Дементьева, И.В.Круглов, В.К.Пименов, Ю.А.Семилетов. "Антигенная активность пептидов дельта-антигена, соответствующих трём генотипам вируса гепатита дельта." "Вопросы вирусологии", 1998, № 5, стр. 217220.

11. Н.Д,Ющук, О.О.Здойко, О.Л.Огиенко, Д.М.Брагинский, И.В.Круглов и др. "Спектр антител к антигенным детерминантам HCV у больных гепатитом С." "Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии,". 1998, т. 8, №5, стр. 35-39.

12. И.В.Круглов, О.О.Знойко, М.П.Финогенова и др. "Серологическое исследование. эпитопов белка NS5 вируса гепатита С и их значение для клиники и диагностики." Международная конференция "Вирусные инфекции на пороге 21 века: эпидемиология и профилактика." С.-Петербург, 21-23 апреля, 1999, стр. 174-175.

, . 13. И.В.Круглов, О.О.Знойко, О.Л.Огиенко и др. "Клинические варианты течения хронической HCV-инфекции и их связь с генотипом HCV и наличием антител к различным антигенам HCV." Международная конференция "Вирусные инфекции на пороге 21 века: эпидемиология и профилактика." С.-Петербург, 2123 апреля, 1999, стр. 96-97.

14. О.Л.Огиенко, И.В.Круглов, О.О.Знойко и др. "Частота встречаемости антител к антигенам белков core, NS4, NS5 HCV в сыворотках крови больных ОГС в первые десять дней желтушного периода." Материалы III Российской научно-практической конференции "Гепатиты B,C,D и G - проблемы диагностики, лечения и профилактики", Москва, июнь 1999, стр. 174.

15. Т.В.Фирсова, И.В.Круглов, О.О.Знойко и др. "Синтез диэпитопного мультипептидного антигена, содержащего последовательности VP1 и VP3 белков вируса гепатита А и его применение в диагностике гепатита А." Материалы научной конференции "Актуальные проблемы медицинской вирусологии", Москва, 23-25 ноября 1999, стр. 93.

16. И.В.Круглов, О.Л.Огиенко, О.О.Знойко и др. "Исследование спектра антител класса G у больных различными клиническими формами гепатита С." "Российский гастроэнтерологический журнал", 1999, № 4, стр. 124.

17. И.В.Круглов, О.О.Знойко, М.П.Финогенова и . др. "Серологическое исследование эпитопов белка NS5 вируса гепатита С и их значение для клиники и диагностики." "Вопросы вирусологии", 2000, № 1, стр. 14-17.

18. И.В.Круглов, О.О.Знойко, Е.А.Климова и др. "Серотипирование вируса гепатита С." "Гастробюллетень", 2000, № 1-2. Приложение № 1. Материалы 2-й

Объединённой Всероссийской и Всеармейской научной конференции "Санкт-Петербург - Гастро-2000." 20-22 сентября 2000, стр. 48.

19. Ю.А.Семилетов, И.В.Круглов, О.О.Знойко и др. "Мультипептидная иммуноферментная тест-система для серотипирования вируса гепатита С." "Гепатит С (Российский консенсус)". Материалы научно-практической конференции, 26-27 сентября 2000, Москва, стр. 125-126.

20. Ю.А.Семилетов, И.В.Круглов, О.О.Знойко и др. "Варианты течения хронической HCV-инфекции и их связь с наличием антител к различным антигенам HCV." "Гепатит С (Российский консенсус)". Материалы научно-практической конференции, 26-27 сентября 2000, Москва, стр. 127-128.

21. Н.Д.Ющук, О.Л.Огиенко, И.В.Круглов и др. "Определение антител класса Ig G к антигенам белков core, NS4, NS5 ВГС в дифференциальной диагностике острой и хронической HCV инфекции." "Гепатит С (Российский консенсус)". Материалы научно-практической конференции, 26-27 сентября 2000, Москва, стр. 173-175.

22. Н.Д.Ющук, О.Л.Огиенко, И.В.Круглов и др. "Определение антител класса Ig G к антигенам белков core, NS4, NS5 ВГС у больных желтушной формой ОГС с различным стажем внутривенного употребления наркотических веществ." "Гепатит С (Российский консенсус)". Материалы научно-практической конференции, 26-27 сентября 2000, Москва, стр. 175-176.

23. И.В.Круглов, Ю.А.Семилетов, О.О.Знойко и др. "Серотипирование вируса гепатита С с помощью мультипептидной иммуноферментной тест-системы." "Иммунопатология, аллергология, инфектология", 2000, № 3, стр. 101102.

24. Ю.А.Семилетов, В.К.Пименов, И.В.Круглов и др. "Серотипирование вируса гепатита дельта на основе синтетических пептидов." Материалы IV Российской научно-практической конференции с международным участием "Гепатиты В,С и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики", Москва, июнь 2001, стр. 313-314.

25. Ю.А.Семилетов, В.К.Пименов, И.В.Круглов и др. «Определение типоспецифических антител к ВГТ) на основе синтетических пептидов.» «Вопросы вирусологии», 2001, № 5, стр. 21-25.

26. И.В.Круглов, О.О.Знойко, О.Л.Огиенко и др. "Спектр антител к различным антигенам HCV при разных вариантах течения хронической HCV-инфекции." "Вопросы вирусологии" 2002, № 2, стр. 11 — 16.

27. К.Р.Дудина, О.О.Знойко, И.В.Круглов и др. «Проблемы ранней диагностики острых вирусных гепатитов, актуальные для стационаров хирургического профиля.» «Неотложная помощь в клинических условиях», (под ред. Э.В.Луцевича, Г.Н.Проскурникова) том 9,2002, стр. 138-140.

28. Н.Д.Ющук, О.Л.Огиенко, И.В.Круглов и др. "Диагностическая значимость определения антител к различным антигенам ВГС у пациентов с острой и хронической HCV инфекцией." "Терапевтический архив", 2002, №4, стр. 18-22.

29. O.O.Znoyko, MJ.Michailov, K.R.Dudina, I.V.Kruglov et al. "Etiological Structure of Viral Hepatitis in Moscow." XVI World Congress of Epidemiology International Epidemiological Association, Montreal 2002, WP10.

30. И.В.Круглов, О.Л.Огиенко, О.О.Знойко и др. «Исследование сероконверсии к различным антигенам ВГС у больных ГС с различными исходами». «Вопросы вирусологии», 2003, № 2, стр. 36 — 40.

31. И.В.Круглов, О.О.Знойко, Е.А.Климова и др. «Выявление типоспецифических aHTH-HCNS4 антител у больных ГС методом ИФА». «Вопросы вирусологии», 2003, № 3, стр. 32 - 36.

32. И.В.Круглов, О.О.Знойко, Е.А.Климова и др. «Выявление типоспецифических anti-HCNS4 антител у больных гепатитом С методом иммуноферментного анализа». «Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней» (под ред. А.А.Шапошникова, Г.В.Ющенко), № 7, М.,

2005, стр. 199-203.

33. И.В.Круглов, О.Л.Огиенко, О.О.Знойко и др. «Исследование сероконверсии к различным антигенам вируса гепатита С у больных гепатитом С в процессе развития заболевания». «Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней» (под ред. А.А.Шапошникова, Г.В.Ющенко), № 8, М.,

2006, стр. 403-408. "

Заказ №417. Объем 2 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

Гепатиты С и дельта являются актуальными проблемами для здравоохранения Российской Федерации в связи с высокими показателями инвалиднзации и смертности в результате этих заболеваний и их последствий. Не менее 10.000 человек в год умирает в России в результате заболеваний парентеральными гепатитами и их отдалённых последствий, и есть все основания ожидать роста этого показателя н дальнейшем [17]. Проблема гепатита А (ГА) актуальна в связи с периодическими подъёмами заболеваемости этой инфекцией. Согласно официально регистрируемым данным за период с 1995 по 2005 годы заболеваемость ГА в Российской Федерации находилась в пределах от 28,3 до 123,5 заболевших па 100.000 населения в целом по стране.

В основе диагностики вирусных гепатитов лежит выявление маркёров этих инфекций высокочувствительным методом иммупофермеитного анализа. Однако достижение высокой чувствительности современных иммунофермептных тсст-систем сопряжено с некоторыми проблемами в обеспечении специфичности, что может приводить к появлению ложноноложительпых результатов, а также расхождений в результатах исследований при использовании тест-систем различных фирм-производителей. Кроме того, генетическая вариабельность вирусов - этиологических агентов гепатитов, также может приводить к различиям в детекции маркёров этих вирусов. Поэтому одним из путей создания эффективных диагностических препаратов является использование синтетических пептидов, моделирующих конкретные антигенные детерминанты вирусных белков. Знание особенностей строения, предопределяющих активность и специфичность этих участков, позволяет более точно ориентироваться при поиске В-энитопов в аминокислотой последовательности белка, а также формирует подходы к пониманию патогенеза и саиогепсза вирусных инфекций, связанных со сложным взаимодействием между вирусом и иммунной системой человеческого организма.

Трудности анализа антигенных детерминант вируса гепатита А (ВГА) обусловлены их конформационной структурой. В связи с этим перспективным представляется использование более сложных нелинейных синтетических пептидов, в том числе и являющихся гетерогенными антигенами.

Для диагностики ГС в настоящее время в клинической практике используются иммунофермеитные тест-системы Ш и IV поколений, позволяющие выявлять антитела классов G и М к ВГС. Однако эти тест-системы не позволяют оценить уровень иммунного ответа но отношению к отдельным белкам ВГС и к отдельным эпитопам этих белков. Выявление нуклеиновой кислоты вируса методом полимеразпон цепной реакции (Г1ЦР) весьма информативно при проведении эпидемиологических исследований, однако будучи отдельно взятым, этот метод недостаточно информативен при оценке течения заболевания у конкретного больною. Таким образом, подход к диагностике ГС в настоящее время принципиально отличается от серологического обследования больных гепатитом В (ГВ) например, которое носит гораздо более комплексный характер. Серологическое обследование больного ГВ - это по сути своей мониторинг различных маркеров, каждый из которых несёт свою информационную нагрузку (HBsAg, anti-HBcor Ig М, anti-HBcor Ig G, anti-HBs, HBeAg/anti-HBe). Предлагаемый нами комплексный подход к серологическому обследованию актуален для больных ГС не менее, чем для больных ГВ, прежде всего потому, что заболевание ГС значительно чаще переходит в хроническую форму, следовательно, патологический процесс носит более сложный, более комплексный характер.

Применение пептидных моделей позволяет определять роль отдельных аминокислотных остатков в составе белков, соответствующих различным генотипам вируса гепатита С (ВГС). Ряд авторов указывает па то, что выявление антител к отдельным антигенным детерминантам (белки и отдельные эпитопы) ВГС коррелирует с определенной фазой течения заболевания и позволяет оценить активность патологического процесса [3, 6, 41, 177]. Однако такие исследования, как правило, либо ограничивались сопоставлением частоты выявления Ig G к core- и NS4-6ejiKa\i, либо их титров у различных групп больных, либо проводилось аналогичное сравнительное исследование частоты выявления Ig G и их уровня к отдельным фрагментам из последовательности структурных белков ВГС. В ходе проведения нашего исследования была сопоставлена частота выявления антител (как класса G, так и класса М) и их уровня к отдельным фрагментам вирусных белков у различных групп больных, в том числе было также проведено исследование спектра антител в динамике у больных ГС с различными исходами заболевания.

Специфическая серологическая диагностика вирусного гепатита дельта является актуальной проблемой здравоохранения. Первоначально в соответствующих диагиостикумах использовался вирусный антиген, выделяемый из ткани печени умерших от TD. Более эффективным и безопасным является использование геппонпжеперных препаратов или синтетических пептидов, моделирующих иммунодомипаптные эпитопы HDAg. Однако использование рекомбииаптного HDAg имеет свои недостатки. Рекомбппантпые белки состоят из целевого протеина и дополнительных полииептидов, из-за которых иммупофермситная реакция иногда дает ложноположмтельпые результаты. Поэтому одним из путей создания эффективных тест-систем для диагностики дельта-инфекции является использование синтетических пептидов, моделирующих конкретные антигенные детерминанты белка вирусного иуклеокапсида. Кроме того, синтетические пептиды легче и дешевле очистить, чем геииоинжеперные препараты.

В настоящее время известны пуклеотидпые последовательное™ РНК HDV и аминокислотные последовательности HDAg, полученные из различных географических регионов [53, 57, 58,84,94, 96,97,107,144, 157,169,178]. В соответствии с примятой классификацией, большинство таких последовательностей принадлежит к первому типу HDV. Второй тип, наряду с первым, встречается в Азии. HDV третьего типа циркулирует в Южной Америке. Данные о генотипах HDV, циркулирующих па территории РФ очень ограничены и противоречивы.

По одним данным, расшифрованная нуклеотндная последовательность генома российского изолята HDV наиболее близка к последовательностям молдавских и болгарского изолятов, относящихся к генотипу IB [146]. По другим - нуклеотидные последовательности геномов HDV, кодирующих С-копцевую часть I IDAg и циркулирующих в Северо-Западном регионе России, относятся к IA генотипу IIDV [29].

Вышеизложенные факты свидетельствуют, таким образом, об актуальности использования синтетических пептидов для дальнейшего исследования дельта-инфекции, в том числе - для разработки соответствующих диагностических препаратов. В диссертации представлены результаты ссротниироваиия HDV, циркулирующего на территории России, с помощью синтетических пептидов, моделирующих аминокислотные последовательности иммунодомииаитного и вариабельного участков IIDAg, соответствующих трём известным типам HDV.

ЦЕЛЬЮ диссертационной работы является совершенствование серологической диагностики гепатитов А, С и дельта на основе исследования особенностей гуморального иммунного ответа по отношению к различным антигенным детерминантам соответствующих вирусов.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие ЗАДАЧИ:

1. Исследовать антигенную структуру белков вирусов гепатитов А, С и дельта с помощью пептидных моделей фрагментов аминокислотной последовательности соответствующих вирусных белков.

2. Разработать модификацию иммупофермептного анализа для определения спектра anti-IICV антител и исследовать особенности серокоиверсии антител к антигенным детерминантам структурных и неструктурных белков вируса гепатита С у больных с различными исходами острого гепатита С.

3. Разработать модификацию ИФА для выявления типоспсцифических anti-HCNS4 антител у больных гепатитом С.

4. Разработать новый вариант ИФА для диагностики гепатита D па основе синтетических пептидных антигенов.

5. Оценить целесообразность использования гетерогенных тетрамерных мультннептидиых антигенов при разработке новых тест-систем для выявления серологических маркёров ВГА.

Методами, позволяющими реализовать поставленные задачи, являются: моделирование консервативных иммунодоминантиых, а также вариабельных тнпоспецифическнх эпнтопов вирусных белков с помощью синтетических пептидов;

- тестирование серологического материала на маркёры гепатитов Л, В, С и дельта;

- иммупофермептиое исследование антигенной активности пептидов с помощью сывороток больных различными вирусными гепатитами;

- метод множественного пептидного исследования (Multiple Peptide Assay [179]);

- исследование корреляции между спектром антител к различным вирусным белкам, представленным разными антигенными детерминантами и клинико-биохимическим вариантом течения HCV-ннфекцни па основе данных иммуноферментпого анализа, общих клинических методик и биохимического анализа крови обследуемых больных;

- статистический анализ результатов проводился методом оценки доверительного коэффициента Стыодепта - t; различия признавались достоверными при р < 0,05.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

1. Среди синтезированных Ы85-пептидов в качестве наиболее перспективного с точки зрения диагностики ГС отобран пептид с последовательностью 2295-2317 а.о. Эта последовательность содержит как минимум два эпитопа, имеющих различную природу. Установлены оптимальные условия для проведения реакции с этим пептидом, позволяющие максимально полно использовать потенциал обоих эиитопов в диагностических целях. Полученные результаты позволили использовать пептид 2295-2317 в составе новой антигенной композиции, куда дополнительно был включён синтетический пептид, дублнруюший нммуподомннантный участок HCcAg, но более короткий, чем рекомбинаптиын IICcAg, также используемый. Подобное дублирование, характерное для тест-систем IV поколения, позволило увеличить чувствительность разработанной тест-системы.

2. Установлена корреляция между спектром антител к отдельным вирусным белкам, представленным различными антигенными детерминантами, и клипико-биохимическим вариантом течения хронической IICV-инфскции. Если сыворотка пациента с хронической HCV-ипфекцией не содержит Ig G к какой-либо из антигенных детерминант неструктурных белков вируса, либо к обоим антигенным детерминантам согс белка HCV, использованных в настоящем исследовании, то с высокой стспспыо вероятности (соответственно, р < 0,05 и р < 0,01) можно полагать, что данный пациент находится в состоянии ПНАТ (хронический гепатит с постоянно нормальным уровнем алапинамнпотрапсферазы (AJIT)). Особенно выраженный характер данная закономерность имеет для пациентов, в сыворотке которых не содержится Ig G к обоим антигенным детерминантам NS4, а также при сочетании отсутствия Ig G к антигенным детерминантам согс-бслка с отсутствием Ig G к какой-либо из антигенных детерминант неструктурных белков вируса (в настоящем исследовании 100 % таких пациентов принадлежали к группе с ПНАТ). Также установлено, что наличие в высоком титре anti-NS4 Ig G (р < 0,05), и особенно сочетание anti-NS4-20 и anti-core-16 Ig G в высоком титре (р <0,01) характерно для больных хроническим гепатитом С с более активным клинико-бнохимическим вариантом течения заболевания (ХГС).

3. Впервые установлены следующие закономерности серокопверсии anti-IICV класса G, характерные для больных ГС с последующей ремиссией: быстрое нарастание уровня anti-core Ig G в течение первых 16 педель заболевания с последующим спадом вплоть до полного исчезновения антител к 52 неделе; уровень anti-NS4 Ig G у таких больных также достигает значений, достоверно превышающих уровень, характерный для первых двух педель желтушного периода, к 4-ому месяцу от начала желтушного периода, затем быстро снижается, и к 9 .месяцу оказывается достоверно ниже своих максимальных значений, характерных для 4-го месяца; уровень anli-NS5 Ig G минимален, лнбо anti-NS5 отсутствуют.

4. Впервые установлены следующие закономерности серокопверсии anti-HCV класса G, характерные для больных ГС с последующей хроиизацией: менее быстрое нарастание уровня anti-core Ig G в первые 6 месяцев заболевания, чем у больных с последующей ремиссией, затем начинается стремительный рост концентрации антител, п к 13-ому месяцу заболевания уровень anti-core Ig G у больных ХГС оказывается, как правило, значительно выше, чем максимальный уровень anti-core Ig G у больных с последующей ремиссией па 4-ом месяце; концентрация anti-NS4 Ig G достоверно выше относительно первых двух педель уже на втором месяце заболевания и остаётся высокой в дальнейшем; постепенное нарастание уровня anti-NS5 Ig G, который достигает значений, достоверно более высоких, чем в первые две педели заболевания, к 6-му месяцу. Выявленная закономерность характерна как для anti-NS5 Ig G, взаимодействующих с синтетическим пептидом а.о. 2295-2317, так и для anti-NS5 Ig G, взаимодействующих с генноинженерным NS5, по для них она выявлена в более ранний срок - начиная с 4-го месяца заболевания.

5. У больных ГС с последующей ремиссией anti-core Ig М, взаимодействующие с синтетическим пептидом а.о. 19-34, были выявлены только в течение первого месяца заболевания. Anti-NS4 Ig М у некоторых больных ГС с последующей ремиссией выявлялись до 6 месяца заболевания включительно. Тем не менее, снижение уровня anti-NS4 Ig М, взаимодействующих с синтетическим пептидом а.о. 1921-1940, относительно первых двух недель заболевания имеет достоверный характер уже к 4-му месяцу. Anti-NS5 Ig М, взаимодействующих с синтетическим пептидом а.о. 2295-2317, не удалось выявить ни у одного из больных ГС с последующей ремиссией. У больных ГС с последующей хропизацией anti-core, anti-NS4 и anti-NS5 Ig М могут сохраняться в течение неопределенно длительного периода, исчезать и появляться вновь при обострении ХГС.

6. На основе типоспецмфичсских пептидов, моделирующих различные участки вариабельного региона NS4 белка вируса гепатита С, была разработана тест-система для выявления типоспецмфичсских антител, появление которых в сыворотке крови больного характерно для ВГС соответствующего тина. В результате проведённого исследования по выявлению тииоспецифических anti-HCNS4 антител у больных гепатитом С с помощью разработанной тест-системы было установлено достоверное различие в циркуляции ВГС разных типов в Москве и Белоруссии (Витебск).

7. В диссертации представлены результаты ссротипировапия HDV, циркулирующего па территории России, с помощью синтетических пептидов, моделирующих аминокислотные последовательности иммунодоминантиого и вариабельного участков HDAg, соответствующих трём известным типам HDV. Создай и апробирован вариант иммуноферментпого анализа для выявления anti-delta классов Ig G и Ig M в сыворотках крови, разработанный па основе синтетических пептидов.

8. Наиболее эффективным антигеном с точки зрения скрининга anti-HAV-IgM позитивных сывороток среди использованных в данном исследовании синтетических пептидных антигенов является MAP4(VP1+VP3).

Использование MAP4(VP1+VP3) для этой цели более эффективно, чем использование комбинации его составляющих - линейных пептидов VP1 и VP3, или его комбинации с его составляющими. Использование гетерогенных мультипептидпых антигенов, в том числе содержащих VP1 (11 а.о. - 25 а.о.) и VP3 (110 а.о. - 121 а.о.), целесообразно при разработке новых тест-систем для ВГА.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Впервые проведено исследование спектра anti-HCV антител и их уровня в процессе развития заболевания у больных ГС с различными исходами. Для этого были выявлены и использованы наиболее значимые с точки зрения поставленной задачи антигенные детерминанты вирусных белков. Установлены достоверные различия частоты выявления anti-HCV антител (как класса G, так и класса М) и их уровня к отдельным фрагментам вирусных белков у различных групп больных ГС. Установлены закономерности серокоиверсии anti-HCV антител, имеющие прогностическое значение.

2. Впервые установлено, что сероконверсня anti-NS4 Ig G имеет место во время острой фазы заболевания ГС, в том числе - уже в первые 10 дней желтушного периода. Впервые установлена корреляция между частотой выявления anti-NS4 Ig G в первые 10 дней желтушного периода ОГС и степенью риска давнего инфицирования ВГС.

3. В результате проведённого исследования но выявлению типоспецифичсских anti-HCNS4 антител у больных гепатитом С с помощью разработанной тест-системы было установлено достоверное различие в циркуляции ВГС разных типов в Москве и Белоруссии (Витебск).

4. Разработаны новые варианты ИФЛ па основе синтетических пептидов для диагностики гепатита D.

5. Впервые показана диагностическая значимость модификации ИФА па основе гетерогенных тетрамерпых мультипептидпых антигенов.

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ определяется полученными новыми знаниями об антигенных свойствах исследованных детерминант вирусных белков, а также исследованием взаимного влияния синтетических пептидных антигенов, которое приводит к изменению их нммунохимических свойств па уровне взаимодействия антиген - антитело. В результате проведённого исследования установлены закономерности развития гуморального иммунного ответа у больных гепатитом С в зависимости от дальнейшего развития заболевания. С помощью разработанной тест-системы на основе тиноспецифнческих пептидов, были установлены статистически достоверные различия в циркуляции ВГС различных типов в Москве и Белоруссии (Витебск). Установлено, что антигенная структура иммунодомипантного региона а.о. 65-80 белка нуклеокапсида HDV, наиболее широко распространенного на территории Центральной России среди больных гепатитом дельта, соответствует генотипу HDV I.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ.

1. Сконструированы иммунофсрмснтные тест-енетемы (лабораторный вариант) па осповс синтетических пептидных антигенов вируса гепатита С, а также их комбинаций с геппоннженерными препаратами.

2. Сконструированы иммуноферментные теег-системы (лабораторный вариант) на осповс синтетических пептидных антигенов вируса гепатита дельта.

3. Выявлены различия в клиническом течении и исходах острого гепатита С у больных с различным спектром антител к иммуподоминантпым участкам структурных и неструктурных белков вируса гепатита С.

4. Разработай новый подход к серологической диагностике ГС, основанный па динамическом контроле за спектром антител к вирусу гепатита С.

5. Разработаны методические рекомендации па сконструированную тест-систему для контроля за спектром антител к вирусу гепатита С в сыворотках крови IICV-ипфицироваппых лиц, содержащие дополнительные критерии оценки активности патологического процесса и сроков заболевания, и методические рекомендации па сконструированную тест-систему для типирования антител к вирусу гепатита С в сыворотках крови IICV-ипфицироваппых лиц, содержащие критерии интерпретации полученных результатов с точки зрения типоспсцифичпости выявленных антител по отношению к различным генотипам вируса гепатита С.

6. Результаты диссертационной работы позволили обосновать целесообразность дополнительного обследования больных ОГС и острым вирусным гепатитом неустановленной этнологии, включающего раздельное определение антител к антигенам ВГС, использованным в дайной работе, для уточнения диагноза и прогнозирования исхода заболевания.

7. Дана оценка принципиальном возможности использования мультинеитндных гетерогенных структур для диагностики ГЛ.

8. Положения диссертационной работы, затрагивающие клинико-лабораторные аспекты прогнозирования исходов ОГС используются при проведении учебных занятий и чтений лекций студентам кафедры инфекционных болезней с курсом эпидемиологии и курсантам ФПДО МГМСУ.

АПРОБАЦИЯ.

Результаты исследований по теме диссертации были доложены па Фальк симпозиуме № 92 "Новые направления в гепатологин", Санкт-Петербург, Россия, 21-22 июня 1996; на 24 симпозиуме Европейского Пептидного Общества, Эдинбург, Великобритания, 1996; на Пятой международной конференции «СПИД, рак и связанные проблемы», Санкт-Петербург, Россия, 25-30 мая, 1997; на II Российской научно-практической конференции "Гепатиты В, С, D и G - проблемы диагностики, лечения и профилактики", Москва, Россия, октябрь 1997; на научной конференции "Вирусные инфекции на пороге 21 века: эпидемиология и профилактика», С.-Петербург, Россия, 21-23 апреля 1999; на III Российской научно-практической конференции "Гепатиты B,C,D и G - проблемы диагностики, лечения и профилактики", Москва, Россия, июнь 1999; на научной конференции "Актуальные проблемы медицинской вирусологии», Москва, Россия, ноябрь 1999; на 2-й Объединённой Всероссийской и Всеармейской научной конференции "Санкт-Петербург -Гастро-2000", С.-Петербург, Россия, 20-22 сентября 2000; на научно-практической конференции "Гепатит С (Российский консенсус)", Москва, Россия, 26-27 сентября 2000; на IV Российской научно-практической конференции "Гепатиты В,С и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики", Москва, Россия, июнь 2001; на паучпо-практичсской конференции «Неотложная помощь в клинических условиях», Мытищи, Россия, 2002; па XVI конгрессе Международной Эпидемиологической Ассоциации, Монреаль, Канада, 2002; на конференции отдела вирусных гепатитов и клинической вирусологии Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМП в 2003 году. В завершённом виде диссертационная работа была доложена на конференции отдела вирусологии Института вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН в 2006 году.

ПУБЛИКАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.

По материалам диссертационной работы опубликовано 10 научных статей в рецензируемых журналах и 23 сообщения в сборниках тезисов научных симпозиумов и конференций.

ОБЪЁМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использовавшихся материалов и методов, 7 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы, состоящего из 181 работы отечественных и зарубежных авторов.

Выводы на основании данных, полученных при исследовании ссроконверсии антител у больных ГС с использованием синтетических пептидов, моделирующих пммунодоминаитпые антигенные детерминанты ВГС, можно сформулировать в виде таблицы № 36. Установлены различия в динамике гуморального иммунного ответа в зависимости от дальнейшего развития патологического процесса, в том числе - уже в острой фазе заболевания (рис. 9 - 12). Полученные данные представляют интерес с точки зрения их прогностического значения. При этом необходимо иметь в виду, что ГС не является типичной инфекцией, а имеет ряд особенностей, которые характерны для медленных инфекций (см. Обзор литературы, /./.). Поэтому гуморальный иммунный ответ па ту или иную отдельно взятую антигенную детерминанту вируса у отдельно взятого больного может быть нетипичным для того или иного варианта развития заболевания. Поэтому для клинического прогноза имеет значение совокупность нескольких благоприятных пли неблагоприятных признаков из перечисленных в таблице № 36, в которой приводятся особенности серокоивсрсии у больных ГС при типичном благоприятном и типичном неблагоприятном развитии заболевания иа основании данных, полученных в ходе настоящего исследования.

Необходимо также иметь в виду то, что когда мы говорим об anti-HCcore, anti-IICNS4, anti-HCNS5, речь не идёт о суммарном гуморальном иммунном ответе ко веем антигенным детерминантам вирусных белков core, NS4, NS5. Данные литературы и наших собственных исследований свидетельствуют о том, что для оценки гуморального иммунного ответа на тот пли иной вирусный белок может иметь некоторое значение, какие именно антигенные детерминанты данного белка для этого используются [19, 25]. При этом использование отдельных иммунодоминантных участков вирусных белков может быть предпочтительнее использования более протяжённых фрагментов аминокислотной последовательности или же полноразмерных белков вируса [19]. В настоящем исследовании нами были использованы наиболее значимые с точки зрения поставленной задачи антигенные детерминанты вирусных белков, выявленные в процессе предыдущих исследований.

Актуальность такого подхода оказалась особенно значимой для установленных нами, в процессе настоящего исследования, закономерностей ссроконверснн anti-NS4 Ig G. До сих пор в научной литературе, посвященной этому вопросу, было довольно широко распространено мнение, согласно которому anti-NS4 Ig G в острую фазу ГС отсутствуют [2,44]. Нам удалось показать, что это не так.